CN105765067B - 修饰型β-半乳糖苷酶 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的是能够进一步提高来自环状芽孢杆菌的β-半乳糖苷酶的有用性,能够用于新型用途。在由序列号1~4中任一个氨基酸序列、或者与序列号1~4中任一个表示的氨基酸序列的90%以上相同的氨基酸序列构成的β-半乳糖苷酶中,将选自182位的脯氨酸、187位的酪氨酸、188位的丝氨酸、405位的色氨酸、406位的丙氨酸、407位的谷氨酰胺、449位的酪氨酸、483位的苏氨酸、512位的丝氨酸、531位的丝氨酸、533位的丝氨酸、534位的丝氨酸、550位的天冬酰胺、551位的谷氨酰胺、593位的色氨酸、598位的酪氨酸、602位的脯氨酸、604位的脯氨酸、609位的酪氨酸、612位的赖氨酸以及615位的酪氨酸中的一个或二个以上的氨基酸、或者与其相当的氨基酸置换成其它的氨基酸。

Description

修饰型β-半乳糖苷酶
技术领域
本发明涉及β-半乳糖苷酶。详细而言,涉及来自环状芽孢杆菌的β-半乳糖苷酶的修饰以及修饰型酶的用途等。本申请基于2013年9月30日申请的日本专利申请第2013-205097号要求优先权,参照并引用该专利申请的全部内容。
背景技术
β-半乳糖苷酶(EC3.2.1.23)是水解β-D-半乳糖苷键使D-半乳糖游离的酶,一般广泛存在于微生物和动植物中。β-半乳糖苷酶别名被称为乳糖酶。另外,β-半乳糖苷酶还具有使半乳糖苷键转移的能力,已知有利用该能力制造低聚半乳糖(具有半乳糖残基的低聚糖)的方法。
低聚半乳糖是半乳糖的线性聚合物或者支化聚合物,除末端为葡萄糖以外,由半乳糖构成。报告过低聚半乳糖包含在母乳中,是其各种低聚半乳糖的混合物(非专利文献1)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:国际公开第2010/140435号小册子
非专利文献
非专利文献1:浦岛等,化学和生物50,7,(2012)
非专利文献2:Song等,Biosci.Biotechnol.Biochem.77.73-79.(2013)
发明内容
已知米曲霉(Aspergillus oryzae)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、马克思克鲁维酵母(K.marxinus)、细菌环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)等产生β-半乳糖苷酶。其中,来自环状芽孢杆菌的β-半乳糖苷酶是能够用乳糖生成低聚半乳糖的酶,是工业上制造低聚半乳糖重要的酶(例如,以“BIOLACTA”的商品名销售β-半乳糖苷酶制剂)。用该酶制造的低聚半乳糖的均一性高,另外,即便调整制造条件等,也难以使制造的低聚半乳糖的组成(成分(profile))变化。因此本发明为了进一步提高来自环状芽孢杆菌的β-半乳糖苷酶的有用性,使其能够用于新的用途(例如,用野生型酶无法制造或者制造效率低的低聚糖的制造),以提供任意改变酶的特异性的修饰型β-半乳糖苷酶为主要课题。
目前的研究中,难以获得来自环状芽孢杆菌β-半乳糖苷酶的立体结构信息,难以确定与其功能有关的氨基酸。因此,利用计算机模拟预测立体结构,并且着眼于特有的域结构,选出对特性的变化有用的氨基酸残基。通过对选出的氨基酸残基位置进行变异而设计各种变异体,分析其特性,结果确定出对β-1,6键的水解活性降低或者提高的变异体等酶的特异性明显变化的变异体。即,能够确定对酶的特异性的改变有用且重要的氨基酸残基,成功获得了酶的特异性变化的多个变异体(修饰型酶)。另一方面,着眼于过去的报告(非专利文献2)设计变异体,详细研究了其特性,结果还发现了对酶的特异性的变化有用的其它的氨基酸残基。
然而,通常经验是组合有效的二种氨基酸置换而产生相加或者协同效果的可能性高。因此,确定成功的变异位置并不局限于单一位置,可以说其组合对特性的变化也是有效的。
基于上述成果及考察,提供以下的发明。
[1]一种修饰型β-半乳糖苷酶,由将β-半乳糖苷酶中选自182位的脯氨酸(P182)、187位的酪氨酸(Y187)、188位的丝氨酸(S188)、405位的色氨酸(W405)、406位的丙氨酸(A406)、407位的谷氨酰胺(Q407)、449位的酪氨酸(Y449)、483位的苏氨酸(T483)、512位的丝氨酸(S512)、531位的丝氨酸(S531)、533位的丝氨酸(S533)、534位的丝氨酸(S534)、550位的天冬酰胺(N550)、551位的谷氨酰胺(Q551)、593位的色氨酸(W593)、598位的酪氨酸(Y598)、602位的脯氨酸(P602)、604位的脯氨酸(P604)、609位的酪氨酸(Y609)、612位的赖氨酸(K612)以及615位的酪氨酸(Y615)中的一个或二个以上的氨基酸、或者与其相当的氨基酸置换成其它的氨基酸而得的氨基酸序列构成,其中,上述β-半乳糖苷酶由序列号1~4中任一个氨基酸序列、或者与序列号1~4中任一个表示的氨基酸序列的90%以上相同的氨基酸序列构成。
[2]根据[1]所述的修饰型β-半乳糖苷酶,其中,成为置换的对象的一个或二个以上的氨基酸选自449位的酪氨酸(Y449)、531位的丝氨酸(S531)、593位的色氨酸(W593)、602位的脯氨酸(P602)、604位的脯氨酸(P604)以及612位的赖氨酸(K612)。
[3]根据[1]所述的修饰型β-半乳糖苷酶,其中,成为置换的对象的一个或二个以上的氨基酸选自187位的酪氨酸(Y187)、188位的丝氨酸(S188)、533位的丝氨酸(S533)、602位的脯氨酸(P602)以及612位的赖氨酸(K612)。
[4]根据[1]所述的修饰型β-半乳糖苷酶,其中,成为置换的对象的一个或二个以上的氨基酸选自182位的脯氨酸(P182)、187位的酪氨酸(Y187)、188位的丝氨酸(S188)、405位的色氨酸(W405)、407位的谷氨酰胺(Q407)、449位的酪氨酸(Y449)、483位的苏氨酸(T483)、512位的丝氨酸(S512)、531位的丝氨酸(S531)、550位的天冬酰胺(N550)、602位的脯氨酸(P602)以及604位的脯氨酸(P604)。
[5]根据[1]所述的修饰型β-半乳糖苷酶,其中,成为置换的对象的一个或二个以上的氨基酸选自483位的苏氨酸(T483)、512位的丝氨酸(S512)、551位的谷氨酰胺(Q551)、598位的酪氨酸(Y598)以及615位的酪氨酸(Y615)。
[6]根据[1]所述的修饰型β-半乳糖苷酶,其中,成为置换的对象的一个或二个以上的氨基酸选自405位的色氨酸(W405)、483位的苏氨酸(T483)、531位的丝氨酸(S531)、550位的天冬酰胺(N550)以及598位的酪氨酸(Y598)。
[7]根据[1]所述的修饰型β-半乳糖苷酶,其中,成为置换的对象的一个或二个以上的氨基酸选自182位的脯氨酸(P182)、187位的酪氨酸(Y187)、188位的丝氨酸(S188)、405位的色氨酸(W405)、406位的丙氨酸(A406)、407位的谷氨酰胺(Q407)、449位的酪氨酸(Y449)、483位的苏氨酸(T483)、512位的丝氨酸(S512)、534位的丝氨酸(S534)、550位的天冬酰胺(N550)、551位的谷氨酰胺(Q551)、602位的脯氨酸(P602)、609位的酪氨酸(Y609)、612位的赖氨酸(K612)以及615位的酪氨酸(Y615)。
[8]根据[2]所述的修饰型β-半乳糖苷酶,其中,449位的酪氨酸(Y449)的置换后的氨基酸是天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺或者色氨酸,531位的丝氨酸(S531)的置换后的氨基酸是丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺或者谷氨酰胺,593位的色氨酸(W593)的置换后的氨基酸是苯丙氨酸,602位的脯氨酸(P602)的置换后的氨基酸是谷氨酸或者甘氨酸,604位的脯氨酸(P604)的置换后的氨基酸是丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、色氨酸或者酪氨酸,612位的赖氨酸(K612)的置换后的氨基酸是甲硫氨酸。
[9]根据[3]所述的修饰型β-半乳糖苷酶,其中,187位的酪氨酸(Y187)的置换后的氨基酸是天冬氨酸、谷氨酸或者甘氨酸,188位的丝氨酸(S188)的置换后的氨基酸是脯氨酸或者苏氨酸,533位的丝氨酸(S533)的置换后的氨基酸是甲硫氨酸或者谷氨酰胺,602位的脯氨酸(P602)置换后的氨基酸是半胱氨酸、异亮氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、苏氨酸或者缬氨酸,612位的赖氨酸(K612)的置换后的氨基酸是苯丙氨酸。
[10]根据[4]所述的修饰型β-半乳糖苷酶,其中,182位的脯氨酸(P182)的置换后的氨基酸是亮氨酸,187位的酪氨酸(Y187)的置换后的氨基酸是天冬氨酸或者亮氨酸,188位的丝氨酸(S188)的置换后的氨基酸是异亮氨酸,405位的色氨酸(W405)的置换后的氨基酸是丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、亮氨酸、天冬酰胺、丝氨酸或者苏氨酸,407位的谷氨酰胺(Q407)的置换后的氨基酸是甘氨酸或者精氨酸,449位的酪氨酸(Y449)的置换后的氨基酸是谷氨酸、异亮氨酸、谷氨酰胺、精氨酸或者丝氨酸,483位的苏氨酸(T483)的置换后的氨基酸是谷氨酰胺,512位的丝氨酸(S512)的置换后的氨基酸是苯丙氨酸、苏氨酸或者缬氨酸,531位的丝氨酸(S531)的置换后的氨基酸是脯氨酸,550位的天冬酰胺(N550)的置换后的氨基酸是亮氨酸、精氨酸或者丝氨酸,602位的脯氨酸(P602)的置换后的氨基酸是亮氨酸、天冬酰胺或者谷氨酰胺,604位的脯氨酸(P604)的置换后的氨基酸是异亮氨酸或者甲硫氨酸。
[11]根据[5]所述的修饰型β-半乳糖苷酶,其中,483位的苏氨酸(T483)的置换后的氨基酸是赖氨酸、甲硫氨酸或者精氨酸,512位的丝氨酸(S512)的置换后的氨基酸是甘氨酸或者赖氨酸,551位的谷氨酰胺(Q551)的置换后的氨基酸是天冬酰胺,598位的酪氨酸(Y598)的置换后的氨基酸是天冬酰胺,615位的酪氨酸(Y615)的置换后的氨基酸是苏氨酸。
[12]根据[6]所述的修饰型β-半乳糖苷酶,其中,405位的色氨酸(W405)的置换后的氨基酸是丙氨酸、天冬氨酸、丝氨酸或者苏氨酸,483位的苏氨酸(T483)的置换后的氨基酸是甲硫氨酸,531位的丝氨酸(S531)的置换后的氨基酸是天冬氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、亮氨酸、赖氨酸或者甲硫氨酸,550位的天冬酰胺(N550)的置换后的氨基酸是苯丙氨酸,598位的酪氨酸(Y598)的置换后的氨基酸是苯丙氨酸或者组氨酸。
[13]根据[7]所述的修饰型β-半乳糖苷酶,其中,182位的脯氨酸(P182)的置换后的氨基酸是亮氨酸或者丝氨酸,187位的酪氨酸(Y187)的置换后的氨基酸是天冬氨酸、谷氨酸或者天冬酰胺,188位的丝氨酸(S188)的置换后的氨基酸是谷氨酸、甘氨酸、异亮氨酸或者天冬酰胺,405位的色氨酸(W405)的置换后的氨基酸是组氨酸,406位的丙氨酸(A406)的置换后的氨基酸是脯氨酸,407位的谷氨酰胺(Q407)的置换后的氨基酸是丙氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、赖氨酸或者精氨酸,449位的酪氨酸(Y449)的置换后的氨基酸是谷氨酸或者精氨酸,483位的苏氨酸(T483)的置换后的氨基酸是丝氨酸或者谷氨酰胺,512位的丝氨酸(S512)的置换后的氨基酸是甘氨酸、苏氨酸或者缬氨酸,534位的丝氨酸(S534)的置换后的氨基酸是赖氨酸或者谷氨酰胺,550位的天冬酰胺(N550)的置换后的氨基酸是丙氨酸、甘氨酸、赖氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、精氨酸或者丝氨酸,551位的谷氨酰胺(Q551)的置换后的氨基酸是赖氨酸或者组氨酸,602位的脯氨酸(P602)的置换后的氨基酸是半胱氨酸、天冬氨酸或者天冬酰胺,609位的酪氨酸(Y609)的置换后的氨基酸是天冬氨酸、谷氨酰胺或者苏氨酸,612位的赖氨酸(K612)的置换后的氨基酸是苯丙氨酸或者异亮氨酸,615位的酪氨酸(Y615)的置换后的氨基酸是谷氨酸、异亮氨酸或者苏氨酸。
[14]根据[1]~[13]中任一项所述的修饰型β-半乳糖苷酶,其中,上述β-半乳糖苷酶由序列号1的氨基酸序列构成,上述修饰型β-半乳糖苷酶由在上述置换的基础上将1540位的色氨酸(W1540)置换成其它的氨基酸而得的氨基酸序列构成。
[15]一种修饰型β-半乳糖苷酶,由将β-半乳糖苷酶中选自85位的色氨酸(W85)、91位的苯丙氨酸(F91)、103位的酪氨酸(Y103)、134位的酪氨酸(Y134)、153位的酪氨酸(Y153)、182位的脯氨酸(P182)、186位的色氨酸(W186)、192位的酪氨酸(Y192)、295位的酪氨酸(Y295)、345位的组氨酸(H345)、349位的甘氨酸(G349)、402位的苯丙氨酸(F402)、407位的谷氨酰胺(Q407)、479位的甘氨酸(G479)、480位的谷氨酸(E480)、482位的赖氨酸(K482)、483位的苏氨酸(T483)、484位的精氨酸(R484)、485位的甘氨酸(G485)、486位的天冬氨酸(D486)、487位的赖氨酸(K487)、488位的缬氨酸(V488)、496位的酪氨酸(Y496)、512位的丝氨酸(S512)、513位的谷氨酸(E513)、514位的天冬酰胺(N514)、515位的天冬酰胺(N515)、516位的酪氨酸(Y516)、517位的天冬氨酸(D517)、519位的酪氨酸(Y519)、533位的苏氨酸(T533)、547位的酪氨酸(Y547)、549位的酪氨酸(Y549)、555位的酪氨酸(Y555)、572位的精氨酸(R572)、573位的苏氨酸(T573)、598位的酪氨酸(Y598)、605位的酪氨酸(Y605)、606位的酪氨酸(Y606)、609位的酪氨酸(Y609)、616位的苯丙氨酸(F616)、624位的苯丙氨酸(F624)、648位的色氨酸(W648)以及650位的色氨酸(W650)中的一个或二个以上的氨基酸、或者与其相当的氨基酸置换成其它的氨基酸而得的氨基酸序列构成,其中,上述β-半乳糖苷酶由序列号1~4中任一个氨基酸序列、或者与序列号1~4中任一个表示的氨基酸序列的90%以上相同的氨基酸序列构成。
[16]根据[15]所述的修饰型β-半乳糖苷酶,其中,85位的色氨酸(W85)的置换后的氨基酸是甘氨酸,91位的苯丙氨酸(F91)的置换后的氨基酸是丙氨酸或者异亮氨酸,103位的酪氨酸(Y103)的置换后的氨基酸是甘氨酸,134位的酪氨酸(Y134)的置换后的氨基酸是甘氨酸,153位的酪氨酸(Y153)的置换后的氨基酸是甘氨酸,182位的脯氨酸(P182)的置换后的氨基酸是色氨酸或者酪氨酸,186位的色氨酸(W186)的置换后的氨基酸是甲硫氨酸,192位的酪氨酸(Y192)的置换后的氨基酸是甘氨酸,295位的酪氨酸(Y295)的置换后的氨基酸是甘氨酸,345位的组氨酸(H345)的置换后的氨基酸是甘氨酸,349位的甘氨酸(G349)的置换后的氨基酸是色氨酸,402位的苯丙氨酸(F402)的置换后的氨基酸是甘氨酸,407位的谷氨酰胺(Q407)的置换后的氨基酸是异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸或者酪氨酸,479位的甘氨酸(G479)的置换后的氨基酸是亮氨酸、脯氨酸或者谷氨酰胺,480位的谷氨酸(E480)的置换后的氨基酸是天冬酰胺,482位的赖氨酸(K482)的置换后的氨基酸是甲硫氨酸或者缬氨酸,483位的苏氨酸(T483)的置换后的氨基酸是甘氨酸或者丝氨酸,484位的精氨酸(R484)的置换后的氨基酸是苯丙氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺或者谷氨酰胺,485位的甘氨酸(G485)的置换后的氨基酸是天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺或者苏氨酸,486位的天冬氨酸(D486)的置换后的氨基酸是丙氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、苏氨酸、色氨酸或者酪氨酸,487位的赖氨酸(K487)的置换后的氨基酸是半胱氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、精氨酸、苏氨酸、缬氨酸、色氨酸或者酪氨酸,488位的缬氨酸(V488)的置换后的氨基酸是甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸或者酪氨酸,496位的酪氨酸(Y496)的置换后的氨基酸是甘氨酸,512位的丝氨酸(S512)的置换后的氨基酸是半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、谷氨酰胺或者色氨酸,513位的谷氨酸(E513)的置换后的氨基酸是丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸或者缬氨酸,514位的天冬酰胺(N514)的置换后的氨基酸是谷氨酸、亮氨酸或者赖氨酸,515位的天冬酰胺(N515)的置换后的氨基酸是丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸或者缬氨酸,516位的酪氨酸(Y516)的置换后的氨基酸是色氨酸,517位的天冬氨酸(D517)的置换后的氨基酸是赖氨酸或者色氨酸,519位的酪氨酸(Y519)的置换后的氨基酸是甘氨酸,533位的苏氨酸(T533)的置换后的氨基酸是谷氨酸,547位的酪氨酸(Y547)的置换后的氨基酸是甘氨酸,549位的酪氨酸(Y549)的置换后的氨基酸是甘氨酸,555位的酪氨酸(Y555)的置换后的氨基酸是甘氨酸,572位的精氨酸(R572)的置换后的氨基酸是半胱氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸、色氨酸或者酪氨酸,573位的苏氨酸(T573)的置换后的氨基酸是谷氨酸,598位的酪氨酸(Y598)的置换后的氨基酸是组氨酸或者天冬酰胺,605位的酪氨酸(Y605)的置换后的氨基酸是半胱氨酸、天冬氨酸、组氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、脯氨酸、精氨酸或者苏氨酸,606位的酪氨酸(Y606)的置换后的氨基酸是丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸或者丝氨酸,609位的酪氨酸(Y609)的置换后的氨基酸是谷氨酸、天冬酰胺或者丝氨酸,616位的苯丙氨酸(F616)的置换后的氨基酸是甘氨酸,624位的苯丙氨酸(F624)的置换后的氨基酸是甘氨酸,648位的色氨酸(W648)的置换后的氨基酸是甘氨酸,650位的色氨酸(W650)的置换后的氨基酸是甘氨酸。
[17]一种修饰型β-半乳糖苷酶,由将β-半乳糖苷酶中选自76位的色氨酸(W76)、480位的谷氨酸(E480)、483位的苏氨酸(T483)、485位的甘氨酸(G485)、484位的精氨酸(R484)、487位的赖氨酸(K487)、488位的缬氨酸(V488)、512位的丝氨酸(S512)、514位的天冬酰胺(N514)、515位的天冬酰胺(N515)、569位的甘氨酸(G569)以及596位的苯丙氨酸(F596)中的一个或二个以上的氨基酸、或者与其相当的氨基酸置换成其它的氨基酸而得的氨基酸序列构成,其中,上述β-半乳糖苷酶由序列号1~4中任一个氨基酸序列、或者与序列号1~4中任一个表示的氨基酸序列的90%以上相同的氨基酸序列构成。
[18]根据[17]所述的修饰型β-半乳糖苷酶,其中,76位的色氨酸(W76)的置换后的氨基酸是甘氨酸,480位的谷氨酸(E480)的置换后的氨基酸是谷氨酰胺,483位的苏氨酸(T483)的置换后的氨基酸是色氨酸,485位的甘氨酸(G485)的置换后的氨基酸是脯氨酸或者苏氨酸,484位的精氨酸(R484)的置换后的氨基酸是丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸、酪氨酸或者赖氨酸,487位的赖氨酸(K487)的置换后的氨基酸是甘氨酸或者脯氨酸,488位的缬氨酸(V488)的置换后的氨基酸是脯氨酸,512位的丝氨酸(S512)的置换后的氨基酸是亮氨酸或者甲硫氨酸,514位的天冬酰胺(N514)的置换后的氨基酸是天冬氨酸,515位的天冬酰胺(N515)的置换后的氨基酸是苯丙氨酸、精氨酸、色氨酸、酪氨酸或者赖氨酸,569位的甘氨酸(G569)的置换后的氨基酸是赖氨酸、脯氨酸或者缬氨酸,596位的苯丙氨酸(F596)的置换后的氨基酸是甘氨酸。
[19]一种修饰型β-半乳糖苷酶,是在由序列号1~4中任一个氨基酸序列、或者与序列号1~4中任一个表示的氨基酸序列的90%以上相同的氨基酸序列构成的β-半乳糖苷酶中实施了以下的任一种修饰而成的:
188位的丝氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成异亮氨酸且550位的天冬酰胺或者与其相当的氨基酸被置换成苯丙氨酸(S188I_N550F);
407位的谷氨酰胺或者与其相当的氨基酸被置换成精氨酸且550位的天冬酰胺或者与其相当的氨基酸被置换成苯丙氨酸(Q407R_N550F);
449位的酪氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成谷氨酰胺且598位的酪氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成组氨酸(Y449Q_Y598H);
550位的天冬酰胺或者与其相当的氨基酸被置换成苯丙氨酸且602位的脯氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成谷氨酰胺(N550F_P602Q);
407位的谷氨酰胺或者与其相当的氨基酸被置换成精氨酸且449位的酪氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成谷氨酸(Q407R_Y449E);
550位的天冬酰胺或者与其相当的氨基酸被置换成苯丙氨酸且598位的酪氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成天冬酰胺(N550F_Y598N);
182位的脯氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成亮氨酸且449位的酪氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成谷氨酸(P182L_Y449E);
182位的脯氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成亮氨酸且449位的酪氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成谷氨酰胺(P182L_Y449Q);
187位的酪氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成亮氨酸且407位的谷氨酰胺或者与其相当的氨基酸被置换成精氨酸(Y187L_Q407R);
187位的酪氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成亮氨酸且449位的酪氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成谷氨酸(Y187L_Y449E);
187位的酪氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成亮氨酸且449位的酪氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成谷氨酰胺(Y187L_Y449Q);
187位的酪氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成亮氨酸且512位的丝氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成半胱氨酸(Y187L_S512C);
187位的酪氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成亮氨酸且512位的丝氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成天冬酰胺(Y187L_S512N);
187位的酪氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成亮氨酸且512位的丝氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成苏氨酸(Y187L_S512T);
188位的丝氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成异亮氨酸且407位的谷氨酰胺或者与其相当的氨基酸被置换成精氨酸(S188I_Q407R);
188位的丝氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成异亮氨酸且449位的酪氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成谷氨酰胺(S188I_Y449Q);
188位的丝氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成异亮氨酸且483位的苏氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成谷氨酸(S188I_T483E);
407位的谷氨酰胺或者与其相当的氨基酸被置换成亮氨酸且512位的丝氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成缬氨酸(Q407L_S512V);
407位的谷氨酰胺或者与其相当的氨基酸被置换成精氨酸且483位的苏氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成甘氨酸(Q407R_T483G);
407位的谷氨酰胺或者与其相当的氨基酸被置换成精氨酸且449位的酪氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成谷氨酰胺(Q407R_Y449Q);
407位的谷氨酰胺或者与其相当的氨基酸被置换成精氨酸且550位的天冬酰胺或者与其相当的氨基酸被置换成丝氨酸(Q407R_N550S);
449位的酪氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成谷氨酰胺且550位的天冬酰胺或者与其相当的氨基酸被置换成丝氨酸(Y449Q_N550S);
487位的赖氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成色氨酸且512位的丝氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成苏氨酸(K487W_S512T);
487位的赖氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成色氨酸且517位的天冬氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成赖氨酸(K487W_D517K);
487位的赖氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成色氨酸且515位的天冬酰胺或者与其相当的氨基酸被置换成甘氨酸(K487W_N515G);
487位的赖氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成色氨酸且517位的天冬氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成色氨酸(K487W_D517W);
487位的赖氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成脯氨酸且515位的天冬酰胺或者与其相当的氨基酸被置换成精氨酸(K487P_N515R);
91位的苯丙氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成丝氨酸且407位的谷氨酰胺或者与其相当的氨基酸被置换成甲硫氨酸(F91S_Q407M);
180位的苏氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成缬氨酸且187位的酪氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成亮氨酸(T180V_Y187L);
180位的苏氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成缬氨酸且188位的丝氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成异亮氨酸(T180V_S188I);
180位的苏氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成缬氨酸且407位的谷氨酰胺或者与其相当的氨基酸被置换成精氨酸(T180V_Q407R);
180位的苏氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成缬氨酸且449位的酪氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成谷氨酸(T180V_Y449E);
180位的苏氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成缬氨酸且483位的苏氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成甘氨酸(T180V_T483G);
180位的苏氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成缬氨酸且512位的丝氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成缬氨酸(T180V_S512V);
180位的苏氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成缬氨酸且550位的天冬酰胺或者与其相当的氨基酸被置换成苯丙氨酸(T180V_N550F);
180位的苏氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成缬氨酸且615位的酪氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成脯氨酸(T180V_Y615P);
182位的脯氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成亮氨酸且376位的精氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成脯氨酸(P182L_R376P);
182位的脯氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成色氨酸且449位的酪氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成谷氨酰胺(P182W_Y449Q);
187位的酪氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成亮氨酸且487位的赖氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成丙氨酸(Y187L_K487A);
187位的酪氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成亮氨酸且512位的丝氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成丙氨酸(Y187L_S512A);
187位的酪氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成亮氨酸且533位的苏氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成天冬酰胺(Y187L_T533N);
376位的精氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成脯氨酸且407位的谷氨酰胺或者与其相当的氨基酸被置换成亮氨酸(R376P_Q407L);
376位的精氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成脯氨酸且449位的酪氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成谷氨酰胺(R376P_Y449Q);
376位的精氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成脯氨酸且512位的丝氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成缬氨酸(R376P_S512V);
376位的精氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成脯氨酸且550位的天冬酰胺或者与其相当的氨基酸被置换成色氨酸(R376P_N550W);
376位的精氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成脯氨酸且550位的天冬酰胺或者与其相当的氨基酸被置换成酪氨酸(R376P_N550Y);
407位的谷氨酰胺或者与其相当的氨基酸被置换成亮氨酸且533位的苏氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成谷氨酸(Q407L_T533E);
407位的谷氨酰胺或者与其相当的氨基酸被置换成亮氨酸且570位的色氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成酪氨酸(Q407L_W570Y);
407位的谷氨酰胺或者与其相当的氨基酸被置换成亮氨酸且615位的酪氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成亮氨酸(Q407L_Y615L);
407位的谷氨酰胺或者与其相当的氨基酸被置换成精氨酸且615位的酪氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成亮氨酸(Q407R_Y615L);
407位的谷氨酰胺或者与其相当的氨基酸被置换成精氨酸且615位的酪氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成脯氨酸(Q407R_Y615P);
449位的酪氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成天冬氨酸且598位的酪氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成苯丙氨酸(Y449D_Y598F);
449位的酪氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成谷氨酰胺且533位的苏氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成谷氨酸(Y449Q_T533E);
449位的酪氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成谷氨酰胺且615位的酪氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成甘氨酸(Y449Q_Y615G);
449位的酪氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成谷氨酰胺且615位的酪氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成脯氨酸(Y449Q_Y615P);
483位的苏氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成甘氨酸且512位的丝氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成缬氨酸(T483G_S512V);
483位的苏氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成甘氨酸且550位的天冬酰胺或者与其相当的氨基酸被置换成丝氨酸(T483G_N550S);
483位的苏氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成甘氨酸且615位的酪氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成亮氨酸(T483G_Y615L);
483位的苏氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成谷氨酰胺且602位的脯氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成谷氨酰胺(T483Q_P602Q);
484位的精氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成组氨酸且487位的赖氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成组氨酸(R484H_K487H);
484位的精氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成色氨酸且487位的赖氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成天冬氨酸(R484W_K487D);
484位的精氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成色氨酸且575位的苏氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成色氨酸(R484W_T575W);
485位的甘氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成赖氨酸且488位的缬氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成色氨酸(G485K_V488W);
485位的甘氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成赖氨酸且516位的酪氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成色氨酸(G485K_Y516W);
485位的甘氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成赖氨酸且517位的天冬氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成赖氨酸(G485K_D517K);
485位的甘氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成赖氨酸且517位的天冬氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成色氨酸(G485K_D517W);
485位的甘氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成赖氨酸且569位的甘氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成色氨酸(G485K_G569W);
485位的甘氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成赖氨酸且571位的甘氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成赖氨酸(G485K_G571K);
485位的甘氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成赖氨酸且572位的精氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成色氨酸(G485K_R572W);
485位的甘氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成赖氨酸且573位的苏氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成色氨酸(G485K_T573W);
485位的甘氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成色氨酸且516位的酪氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成色氨酸(G485W_Y516W);
485位的甘氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成色氨酸且517位的天冬氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成色氨酸(G485W_D517W);
485位的甘氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成色氨酸且573位的苏氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成赖氨酸(G485W_T573K);
485位的甘氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成色氨酸且573位的苏氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成色氨酸(G485W_T573W);
487位的赖氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成丙氨酸且512位的丝氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成缬氨酸(K487A_S512V);
487位的赖氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成甘氨酸且515位的天冬酰胺或者与其相当的氨基酸被置换成谷氨酰胺(K487G_N515Q);
487位的赖氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成色氨酸且573位的苏氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成赖氨酸(K487W_T573K);
487位的赖氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成色氨酸且593位的色氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成苯丙氨酸(K487W_W593F);
488位的缬氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成赖氨酸且514位的天冬酰胺或者与其相当的氨基酸被置换成赖氨酸(V488K_N514K);
488位的缬氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成赖氨酸且517位的天冬氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成赖氨酸(V488K_D517K);
488位的缬氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成赖氨酸且569位的甘氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成赖氨酸(V488K_G569K);
488位的缬氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成赖氨酸且569位的甘氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成色氨酸(V488K_G569W);
488位的缬氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成赖氨酸且572位的精氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成赖氨酸(V488K_R572K);
488位的缬氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成赖氨酸且573位的苏氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成赖氨酸(V488K_T573K);
488位的缬氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成赖氨酸且573位的苏氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成色氨酸(V488K_T573W);
488位的缬氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成赖氨酸且516位的酪氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成赖氨酸(V488K_Y516K);
488位的缬氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成赖氨酸且516位的酪氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成色氨酸(V488K_Y516W);
488位的缬氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成色氨酸且514位的天冬酰胺或者与其相当的氨基酸被置换成色氨酸(V488W_N514W);
488位的缬氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成色氨酸且573位的苏氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成色氨酸(V488W_T573W);
500位的谷氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成丙氨酸且501位的异亮氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成丙氨酸(E500A_I501A);
512位的丝氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成缬氨酸且550位的天冬酰胺或者与其相当的氨基酸被置换成丝氨酸(S512V_N550S);
533位的苏氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成谷氨酸且550位的天冬酰胺或者与其相当的氨基酸被置换成丝氨酸(T533E_N550S);
533位的苏氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成谷氨酸且615位的酪氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成甘氨酸(T533E_Y615G);
570位的色氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成酪氨酸且615位的酪氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成亮氨酸(W570Y_Y615L);
91位的苯丙氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成缬氨酸且513位的谷氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成甘氨酸(F91V_E513G);
180位的苏氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成缬氨酸且483位的苏氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成赖氨酸(T180V_T483K);
180位的苏氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成缬氨酸且598位的酪氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成天冬酰胺(T180V_Y598N);
180位的苏氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成缬氨酸且615位的酪氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成甘氨酸(T180V_Y615G);
182位的脯氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成亮氨酸且615位的酪氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成亮氨酸(P182L_Y615L);
376位的精氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成脯氨酸且598位的酪氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成天冬酰胺(R376P_Y598N);
407位的谷氨酰胺或者与其相当的氨基酸被置换成亮氨酸且483位的苏氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成赖氨酸(Q407L_T483K);
407位的谷氨酰胺或者与其相当的氨基酸被置换成亮氨酸且487位的赖氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成脯氨酸(Q407L_K487P);
407位的谷氨酰胺或者与其相当的氨基酸被置换成亮氨酸且615位的酪氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成甘氨酸(Q407L_Y615G);
449位的酪氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成谷氨酸且487位的赖氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成丙氨酸(Y449E_K487A);
449位的酪氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成谷氨酸且487位的赖氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成脯氨酸(Y449E_K487P);
483位的苏氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成甘氨酸且487位的赖氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成丙氨酸(T483G_K487A);
483位的苏氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成甘氨酸且533位的苏氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成谷氨酸(T483G_T533E);
483位的苏氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成甘氨酸且615位的酪氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成甘氨酸(T483G_Y615G);
483位的苏氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成甲硫氨酸且487位的赖氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成丙氨酸(T483M_K487A);
483位的苏氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成甲硫氨酸且487位的赖氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成甘氨酸(T483M_K487G);
483位的苏氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成甲硫氨酸且487位的赖氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成脯氨酸(T483M_K487P);
484位的精氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成组氨酸且487位的赖氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成天冬氨酸(R484H_K487D);
484位的精氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成赖氨酸且513位的谷氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成色氨酸(R484K_E513W);
484位的精氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成赖氨酸且514位的天冬酰胺或者与其相当的氨基酸被置换成赖氨酸(R484K_N514K);
484位的精氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成赖氨酸且514位的天冬酰胺或者与其相当的氨基酸被置换成色氨酸(R484K_N514W);
484位的精氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成赖氨酸且515位的天冬酰胺或者与其相当的氨基酸被置换成赖氨酸(R484K_N515K);
484位的精氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成赖氨酸且515位的天冬酰胺或者与其相当的氨基酸被置换成色氨酸(R484K_N515W);
484位的精氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成赖氨酸且517位的天冬氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成色氨酸(R484K_D517W);
484位的精氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成赖氨酸且569位的甘氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成赖氨酸(R484K_G569K);
484位的精氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成赖氨酸且571位的甘氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成赖氨酸(R484K_G571K);
484位的精氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成赖氨酸且572位的精氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成赖氨酸(R484K_R572K);
484位的精氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成赖氨酸且572位的精氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成色氨酸(R484K_R572W);
484位的精氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成赖氨酸且573位的苏氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成赖氨酸(R484K_T573K);
484位的精氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成赖氨酸且573位的苏氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成色氨酸(R484K_T573W);
484位的精氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成赖氨酸且516位的酪氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成赖氨酸(R484K_Y516K);
484位的精氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成色氨酸且515位的天冬酰胺或者与其相当的氨基酸被置换成赖氨酸(R484W_N515K);
485位的甘氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成天冬氨酸且487位的赖氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成组氨酸(G485D_K487H);
485位的甘氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成赖氨酸且487位的赖氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成组氨酸(G485K_K487H);
485位的甘氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成赖氨酸且569位的甘氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成赖氨酸(G485K_G569K);
485位的甘氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成赖氨酸且514位的天冬酰胺或者与其相当的氨基酸被置换成赖氨酸(G485K_N514K);
485位的甘氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成赖氨酸且515位的天冬酰胺或者与其相当的氨基酸被置换成赖氨酸(G485K_N515K);
485位的甘氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成赖氨酸且515位的天冬酰胺或者与其相当的氨基酸被置换成色氨酸(G485K_N515W);
485位的甘氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成精氨酸且487位的赖氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成天冬氨酸(G485R_K487D);
485位的甘氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成色氨酸且513位的谷氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成色氨酸(G485W_E513W);
485位的甘氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成色氨酸且515位的天冬酰胺或者与其相当的氨基酸被置换成赖氨酸(G485W_N515K);
485位的甘氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成色氨酸且515位的天冬酰胺或者与其相当的氨基酸被置换成色氨酸(G485W_N515W);
487位的赖氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成丙氨酸且531位的丝氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成丙氨酸(K487A_S531A);
487位的赖氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成丙氨酸且593位的色氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成苯丙氨酸(K487A_W593F);
487位的赖氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成丙氨酸且615位的酪氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成亮氨酸(K487A_Y615L);
487位的赖氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成色氨酸且514位的天冬酰胺或者与其相当的氨基酸被置换成赖氨酸(K487W_N514K);
487位的赖氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成色氨酸且514位的天冬酰胺或者与其相当的氨基酸被置换成色氨酸(K487W_N514W);
487位的赖氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成色氨酸且516位的酪氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成色氨酸(K487W_Y516W);
487位的赖氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成色氨酸且569位的甘氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成赖氨酸(K487W_G569K);
487位的赖氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成酪氨酸且515位的天冬酰胺或者与其相当的氨基酸被置换成苯丙氨酸(K487Y_N515F);
487位的赖氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成酪氨酸且515位的天冬酰胺或者与其相当的氨基酸被置换成色氨酸(K487Y_N515W);
488位的缬氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成赖氨酸且515位的天冬酰胺或者与其相当的氨基酸被置换成赖氨酸(V488K_N515K);
488位的缬氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成赖氨酸且515位的天冬酰胺或者与其相当的氨基酸被置换成色氨酸(V488K_N515W);
488位的缬氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成色氨酸且515位的天冬酰胺或者与其相当的氨基酸被置换成赖氨酸(V488W_N515K);
488位的缬氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成色氨酸且515位的天冬酰胺或者与其相当的氨基酸被置换成色氨酸(V488W_N515W);
488位的缬氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成酪氨酸且515位的天冬酰胺或者与其相当的氨基酸被置换成色氨酸(V488Y_N515W);
550位的天冬酰胺或者与其相当的氨基酸被置换成丝氨酸且598位的酪氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成天冬酰胺(N550S_Y598N);
550位的天冬酰胺或者与其相当的氨基酸被置换成丝氨酸且615位的酪氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成甘氨酸(N550S_Y615G);
550位的天冬酰胺或者与其相当的氨基酸被置换成丝氨酸且615位的酪氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成亮氨酸(N550S_Y615L);
550位的天冬酰胺或者与其相当的氨基酸被置换成丝氨酸且615位的酪氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成脯氨酸(N550S_Y615P);
484位的精氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成丙氨酸,485位的甘氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成丙氨酸且487位的赖氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成天冬氨酸(R484A_G485A_K487D);
484位的精氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成天冬氨酸,485位的甘氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成天冬氨酸且487位的赖氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成天冬氨酸(R484D_G485D_K487D);
485位的甘氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成精氨酸,486位的天冬氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成精氨酸且487位的赖氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成赖氨酸精氨酸(G485R_D486R_K487R);
484位的精氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成丙氨酸,485位的甘氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成丙氨酸,486位的天冬氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成丙氨酸且487位的赖氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成丙氨酸(R484A_G485A_D486A_K487A);
484位的精氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成丙氨酸,485位的甘氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成丙氨酸,486位的天冬氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成脯氨酸且487位的赖氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成脯氨酸(R484A_G485A_D486P_K487P);
484位的精氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成丙氨酸,485位的甘氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成丙氨酸且487位的赖氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成天冬氨酸(R484A_G485A_K487D);
484位的精氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成半胱氨酸,486位的天冬氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成组氨酸且487位的赖氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成精氨酸(R484C_D486H_K487R);
485位的甘氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成精氨酸,486位的天冬氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成色氨酸且487位的赖氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成色氨酸(G485R_D486W_K487W);
485位的甘氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成精氨酸,486位的天冬氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成丙氨酸且487位的赖氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成丙氨酸(G485R_D486A_K487A);
485位的甘氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成精氨酸,486位的天冬氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成脯氨酸且487位的赖氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成脯氨酸(G485R_D486P_K487P);
484位的精氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成丙氨酸,485位的甘氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成丙氨酸,486位的天冬氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成丙氨酸且487位的赖氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成丙氨酸(R484A_G485A_D486A_K487A);
484位的精氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成丙氨酸,485位的甘氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成丙氨酸,486位的天冬氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成精氨酸且487位的赖氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成精氨酸(R484A_G485A_D486R_K487R);
484位的精氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成天冬氨酸,485位的甘氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成天冬氨酸,486位的天冬氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成精氨酸且487位的赖氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成精氨酸(R484D_G485D_D486R_K487R);
484位的精氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成天冬氨酸,485位的甘氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成天冬氨酸,486位的天冬氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成脯氨酸且487位的赖氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成脯氨酸(R484D_G485D_D486P_K487P);
484位的精氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成天冬氨酸,485位的甘氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成天冬氨酸,486位的天冬氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成丙氨酸且487位的赖氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成丙氨酸(R484D_G485D_D486A_K487A);
484位的精氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成天冬氨酸,485位的甘氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成天冬氨酸,486位的天冬氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成色氨酸且487位的赖氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成色氨酸(R484D_G485D_D486W_K487W);
484位的精氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成脯氨酸,485位的甘氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成脯氨酸,486位的天冬氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成精氨酸且487位的赖氨酸或者与其相当的氨基酸被置换成精氨酸(R484P_G485P_D486R_K487R)。
[20]一种修饰型β-半乳糖苷酶,是在由序列号1~4中任一个氨基酸序列、或者与序列号1~4中任一个表示的氨基酸序列的90%以上相同的氨基酸序列构成的β-半乳糖苷酶中实施了以下的任一种修饰而成的:
(a)484位的精氨酸(R484)~487位的赖氨酸(K487)、或者与其相当的区域的缺失;
(b)在514位的天冬酰胺(N514)与515位的天冬酰胺(N515)之间、或者与其相当的位置的氨基酸的插入;
(c)在604位的脯氨酸(P604)与605位的酪氨酸(Y605)之间、或者与其相当的位置的氨基酸的插入;
(d)在485位的甘氨酸(G485)或者与其相当的氨基酸的缺失的基础上,486位的天冬氨酸(D486)或者与其相当的氨基酸向其它的氨基酸的置换;
(e)在485位的甘氨酸(G485)~486位的天冬氨酸(D486)、或者与其相当的区域的缺失的基础上,487位的赖氨酸(K487)或者与其相当的氨基酸向其它的氨基酸的置换;
(f)在485位的甘氨酸(G485)~486位的天冬氨酸(D486)、或者与其相当的区域的缺失的基础上,484位的精氨酸(R484)或者与其相当的氨基酸向其它的氨基酸的置换,以及487位的赖氨酸(K487)或者与其相当的氨基酸向其它的氨基酸的置换;
(g)在484位的精氨酸(R484)与485位的甘氨酸(G485)之间、或者与其相当的位置的氨基酸的插入;
(h)在485位的甘氨酸(G485)与486位的天冬氨酸(D486)之间、或者与其相当的位置的氨基酸的插入。
[21]根据[20]所述的修饰型β-半乳糖苷酶,其中,关于(d)~(f),484位的精氨酸(R484)的置换后的氨基酸是色氨酸或者脯氨酸,486位的天冬氨酸(D486)的置换后的氨基酸是组氨酸,487位的赖氨酸(K487)的置换后的氨基酸是精氨酸、色氨酸或者脯氨酸,
关于(b)、(c)、(g)、(h),被插入的氨基酸的个数为1~10个。
[22]一种修饰型β-半乳糖苷酶,是在由序列号1的氨基酸序列构成的β-半乳糖苷酶中实施了以下的任一种修饰而成的:
(i)487位的赖氨酸(K487)被置换成甘氨酸或者脯氨酸;
(ii)514位的天冬酰胺(N514)被置换成色氨酸;
(iii)515位的天冬酰胺(N515)被置换成赖氨酸或者色氨酸。
[23]一种基因,编码[1]~[22]中任一项所述的修饰型β-半乳糖苷酶。
[24]一种重组DNA,包含[23]所述的基因。
[25]一种微生物,保有[24]所述的重组DNA。
[26]一种酶剂,包含[1]~[22]中任一项所述的修饰型β-半乳糖苷酶。
[27]一种低聚糖的制造方法,其特征在于,使[1]~[22]中任一项所述的修饰型β-半乳糖苷酶作用于具有β-1,3键、β-1,4键以及β-1,6键中的至少一个的二糖、低聚糖或者多糖。
附图说明
图1是来自环状芽孢杆菌的β-半乳糖苷酶与3GM8(来自普通拟杆菌的β-糖苷酶(beta-glycosidase from Bacteroides vulgatus))的比较(Identities=282/824(34%),Positives=425/824(52%))。
图2是变异体(修饰型β-半乳糖苷酶)的重组表达体系。
图3是对异乳糖的水解活性降低或者提高的变异体。(A)是满足异乳糖分解活性÷1%乳糖分解活性达到50%以下条件的变异体的测定结果。(B)是满足异乳糖分解活性÷1%乳糖分解活性达到150%以上的条件的变异体的测定结果。WT:野生型酶。
图4是生成的低聚半乳糖的组成中的四糖含有率变化了的变异体。WT:野生型酶。
图5是生成的低聚半乳糖的组成中的异乳糖含有率变化了的变异体。WT:野生型酶。
图6是生成的低聚半乳糖的组成中的四糖含有率变化了的变异体。WT:野生型酶。
图7是满足条件3的、实施了1处氨基酸置换的变异体。WT:野生型酶。
图8是满足条件4的、实施了1处氨基酸置换的变异体。WT:野生型酶。
图9是四糖的含有率变多的、实施了1处氨基酸置换的变异体。WT-A:BgaD-A型的野生型酶。
图10是组合了满足条件3的置换和满足条件5的置换的变异体(例1)、组合了满足条件3的置换和满足条件6的置换的变异体(例3)、组合了满足条件4的置换和满足条件5的置换的变异体(例4)、组合了满足条件3的置换彼此的变异体(例5-1)、组合了满足条件4的置换彼此的变异体(例5-2)。WT:野生型酶。
图11是满足条件3的、实施了2处氨基酸置换的变异体(左)和满足条件4的、实施了3处或4处氨基酸置换的变异体(右)。WT:野生型酶。
图12是满足条件3的、实施了3处或4处氨基酸置换的变异体(上)和满足条件4的、实施了3处或4处氨基酸置换的变异体(下)。WT:野生型酶。
图13是满足条件3的插入或者缺失变异体(上)和满足条件4的插入或者缺失变异体(下)。WT:野生型酶。
具体实施方式
为了方便说明,对于本发明使用的用语的一部分如下定义。
(用语)
用语“修饰型β-半乳糖苷酶”是指对特定的β-半乳糖苷酶(为了方便说明,称为“基准β-半乳糖苷酶”)进行修饰或变异而得的酶。基准β-半乳糖苷酶是环状芽孢杆菌生产的β-半乳糖苷酶。根据目前的研究,得知环状芽孢杆菌的β-半乳糖苷酶由分子量不同的4种酶构成。本发明中,将这4种酶中任一种作为基准β-半乳糖苷酶。典型的是具有序列号1~4中任一个氨基酸序列的酶作为基准β-半乳糖苷酶,但具有与序列号1~4中任一个氨基酸序列的90%以上相同的氨基酸序列的酶(显示β-半乳糖苷酶活性的酶)也能够用作基准β-半乳糖苷酶。优选将具有与序列号1~4中任一个氨基酸序列的95%以上相同的氨基酸序列的酶(显示β-半乳糖苷酶活性的酶)、更优选将具有与序列号1~4中任一个氨基酸序列的98%以上相同的氨基酸序列的酶(显示β-半乳糖苷酶活性的酶)、最优选将具有与序列号1~4中任一个氨基酸序列的99%以上相同的氨基酸序列的酶(显示β-半乳糖苷酶活性的酶)用作基准β-半乳糖苷酶。序列号1是分子量195kD的β-半乳糖苷酶(以下,也称为BgaD-A)的氨基酸序列,序列号2是分子量160kD的β-半乳糖苷酶(以下,也称为BgaD-B)的氨基酸序列,序列号3是分子量135kD的β-半乳糖苷酶(以下,也称为BgaD-C)的氨基酸序列,序列号4是分子量86kD的β-半乳糖苷酶(以下,也称为BgaD-D)。另外,将编码BgaD-A、BgaD-B、BgaD-C以及BgaD-D的碱基序列分别表示为序列号5、6、7以及8。
本发明中,作为修饰或变异,进行“氨基酸的置换”。因此,若比较修饰型β-半乳糖苷酶和基准β-半乳糖苷酶,则一部分氨基酸残基存在不同。应予说明,本说明书中,将修饰型β-半乳糖苷酶也称为修饰型酶、变异β-半乳糖苷酶、变异体等。
本说明书中按照惯例,如下,用1个字母表述各氨基酸。
甲硫氨酸:M、丝氨酸:S、丙氨酸:A、苏氨酸:T、缬氨酸:V、酪氨酸:Y、亮氨酸:L、天冬酰胺:N、异亮氨酸:I、谷氨酰胺:Q、脯氨酸:P、天冬氨酸:D、苯丙氨酸:F、谷氨酸:E、色氨酸:W、赖氨酸:K、半胱氨酸:C、精氨酸:R、甘氨酸:G、组氨酸:H
另外,将变异点的氨基酸残基(成为置换的对象的氨基酸残基)用表示氨基酸的种类的上述1个字母和表示氨基酸的位置的数字的组合来表达。例如,如果182位的脯氨酸为变异点,则表达为“P182”。
(修饰型β-半乳糖苷酶)
本发明的第1方面涉及修饰型β-半乳糖苷酶(修饰型酶)。本发明的修饰型酶典型的是具有将由序列号1~4中任一个氨基酸序列、或者与序列号1~4中任一个表示的氨基酸序列的90%以上相同的氨基酸序列构成的β-半乳糖苷酶中选自以下的(1)~(21)中的一个或二个以上的氨基酸置换成其它的氨基酸而得的氨基酸序列。
(1)182位的脯氨酸(P182)
(2)187位的酪氨酸(Y187)
(3)188位的丝氨酸(S188)
(4)405位的色氨酸(W405)
(5)406位的丙氨酸(A406)
(6)407位的谷氨酰胺(Q407)
(7)449位的酪氨酸(Y449)
(8)483位的苏氨酸(T483)
(9)512位的丝氨酸(S512)
(10)531位的丝氨酸(S531)
(11)533位的丝氨酸(S533)
(12)534位的丝氨酸(S534)
(13)550位的天冬酰胺(N550)
(14)551位的谷氨酰胺(Q551)
(15)593位的色氨酸(W593)
(16)598位的酪氨酸(Y598)
(17)602位的脯氨酸(P602)
(18)604位的脯氨酸(P604)
(19)609位的酪氨酸(Y609)
(20)612位的赖氨酸(K612)
(21)615位的酪氨酸(Y615)
如后述的实施例所示,成为置换对象的上述的氨基酸残基是经过立体结构预测和验证实验确定的。在本发明的一个方式中,通过置换这些氨基酸而对酶的结构进行修饰,使β-半乳糖苷酶的特性变化。这里的“特性”是低聚糖合成活性和/或对异乳糖的水解活性。
在具有与序列号1~4中任一个氨基酸序列的90%以上(优选为95%以上,更优选为98%以上,最优选为99%以上)相同的氨基酸序列的基准β-半乳糖苷酶中,通过氨基酸的插入、缺失等,有时在与由序列1~4的任一个氨基酸序列构成的酶之间产生氨基酸位置的偏移。因此,本发明的一个方式中,在基准β-半乳糖苷酶中,与选自上述(1)~(21)中的一个或二个以上的氨基酸相当的氨基酸成为置换的对象。这里,用语“相当”是指在被比较的蛋白质(酶)间对其功能的发挥作出同等贡献。例如,对于相对于基准的氨基酸序列(例如序列号1的氨基酸序列)为比较对象的氨基酸序列,考虑一级结构(氨基酸序列)的部分同源性,同时为了能够进行最佳的比较而在排列时(此时根据需要可以导入间隙,使对比最佳化),可以将与基准的氨基酸序列中的特定的氨基酸对应的位置的氨基酸特定为“相当的氨基酸”。通过代替一级结构彼此的比较或者在此基础上进行立体结构(三维结构)彼此的比较,也可以确定出“相当的氨基酸”。通过利用立体结构信息,得到可靠性高的比较结果。此时,可以采用一边比较多种酶的立体结构的原子坐标,一边进行对比的技术。
置换后的氨基酸的种类没有特别限定。因此,可以为保守性氨基酸置换也可以为非保守性氨基酸置换。这里的“保守性氨基酸置换”是指将某氨基酸残基置换成具有相同性质的侧链的氨基酸残基。氨基酸残基根据其侧链被分类成像碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β支化侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)、芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)几个家族。保守性氨基酸置换典型的是同一家族内的氨基酸残基间的置换。
在本发明的第1方式中,成为置换的对象的一个或二个以上的氨基酸选自449位的酪氨酸(Y449)、531位的丝氨酸(S531)、593位的色氨酸(W593)、602位的脯氨酸(P602)、604位的脯氨酸(P604)以及612位的赖氨酸(K612)。这些氨基酸在后述的实施例所示的实验中,被确定为满足“异乳糖分解活性为50%以下”这样的条件(条件1),与对异乳糖的水解活性的底物特异性有关。因此,可以说该方式的修饰型酶在异乳糖水解活性低这方面有用性高。置换后的氨基酸优选如下。应予说明,第1方式中将成为置换对象的氨基酸称为“第1组氨基酸”。
449位的酪氨酸(Y449)的置换后的氨基酸是天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺或者色氨酸。
531位的丝氨酸(S531)的置换后的氨基酸是丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺或者谷氨酰胺。
593位的色氨酸(W593)的置换后的氨基酸是苯丙氨酸。
602位的脯氨酸(P602)的置换后的氨基酸是谷氨酸或者甘氨酸。
604位的脯氨酸(P604)的置换后的氨基酸是丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、色氨酸或者酪氨酸。
612位的赖氨酸(K612)的置换后的氨基酸是甲硫氨酸。
在本发明的第2方式中,成为置换的对象的一个或二个以上的氨基酸选自187位的酪氨酸(Y187)、188位的丝氨酸(S188)、533位的丝氨酸(S533)、602位的脯氨酸(P602)以及612位的赖氨酸(K612)。这些氨基酸在后述的实施例所示的实验中,被确定为满足“异乳糖分解活性为150%以上”这样的条件(条件2),与对异乳糖的水解活性的底物特异性有关。因此,可以说该方式的修饰型酶在异乳糖水解活性高这方面有用性高。置换后的氨基酸优选如下。应予说明,第2方式中将成为置换对象的氨基酸称为“第2组氨基酸”。
187位的酪氨酸(Y187)的置换后的氨基酸是天冬氨酸、谷氨酸或者甘氨酸。
188位的丝氨酸(S188)的置换后的氨基酸是脯氨酸或者苏氨酸。
533位的丝氨酸(S533)的置换后的氨基酸是甲硫氨酸或者谷氨酰胺。
602位的脯氨酸(P602)的置换后的氨基酸是半胱氨酸、异亮氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、苏氨酸或者缬氨酸。
612位的赖氨酸(K612)的置换后的氨基酸是苯丙氨酸
在本发明的第3方式中,成为置换的对象的一个或二个以上的氨基酸选自182位的脯氨酸(P182)、187位的酪氨酸(Y187)、188位的丝氨酸(S188)、405位的色氨酸(W405)、407位的谷氨酰胺(Q407)、449位的酪氨酸(Y449)、483位的苏氨酸(T483)、512位的丝氨酸(S512)、531位的丝氨酸(S531)、550位的天冬酰胺(N550),602位的脯氨酸(P602)以及604位的脯氨酸(P604)。这些氨基酸在后述的实施例所示的实验中,被确定为满足“三糖以上的含有率为与野生型酶同等的程度、四糖的含有率比野生型酶少”这样的条件(条件3),与四糖的生成量有关。因此,对于该方式的修饰型酶,可以说如果使用它则在使四糖的含量下降这方面有用性高。置换后的氨基酸优选如下。应予说明,第3方式中将成为置换对象的氨基酸称为“第3组氨基酸”。
182位的脯氨酸(P182)的置换后的氨基酸是亮氨酸。
187位的酪氨酸(Y187)的置换后的氨基酸是天冬氨酸或者亮氨酸。
188位的丝氨酸(S188)的置换后的氨基酸是异亮氨酸。
405位的色氨酸(W405)的置换后的氨基酸是丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、亮氨酸、天冬酰胺、丝氨酸或者苏氨酸。
407位的谷氨酰胺(Q407)的置换后的氨基酸是甘氨酸或者精氨酸。
449位的酪氨酸(Y449)的置换后的氨基酸是谷氨酸、异亮氨酸、谷氨酰胺、精氨酸或者丝氨酸。
483位的苏氨酸(T483)的置换后的氨基酸是谷氨酰胺。
512位的丝氨酸(S512)的置换后的氨基酸是苯丙氨酸、苏氨酸或者缬氨酸。531位的丝氨酸(S531)的置换后的氨基酸是脯氨酸。
550位的天冬酰胺(N550)的置换后的氨基酸是亮氨酸、精氨酸或者丝氨酸。
602位的脯氨酸(P602)的置换后的氨基酸是亮氨酸、天冬酰胺或者谷氨酰胺。
604位的脯氨酸(P604)的置换后的氨基酸是异亮氨酸或者甲硫氨酸。
经过研究的结果,作为满足“三糖以上的含有率为与野生型酶同等的程度、四糖的含有率比野生型酶少”这样的条件(条件3)的、置换对象的氨基酸(即,第3组氨基酸),特定出85位的色氨酸(W85)、91位的苯丙氨酸(F91)、103位的酪氨酸(Y103)、134位的酪氨酸(Y134)、153位的酪氨酸(Y153)、182位的脯氨酸(P182)、186位的色氨酸(W186)、192位的酪氨酸(Y192)、295位的酪氨酸(Y295)、345位的组氨酸(H345)、349位的甘氨酸(G349)、402位的苯丙氨酸(F402)、407位的谷氨酰胺(Q407)、479位的甘氨酸(G479)、480位的谷氨酸(E480)、482位的赖氨酸(K482)、483位的苏氨酸(T483)、484位的精氨酸(R484)、485位的甘氨酸(G485)、486位的天冬氨酸(D486)、487位的赖氨酸(K487)、488位的缬氨酸(V488)、496位的酪氨酸(Y496)、512位的丝氨酸(S512)、513位的谷氨酸(E513)、514位的天冬酰胺(N514)、515位的天冬酰胺(N515)、516位的酪氨酸(Y516)、517位的天冬氨酸(D517)、519位的酪氨酸(Y519)、533位的苏氨酸(T533)、547位的酪氨酸(Y547)、549位的酪氨酸(Y549)、555位的酪氨酸(Y555)、572位的精氨酸(R572)、573位的苏氨酸(T573)、598位的酪氨酸(Y598)、605位的酪氨酸(Y605)、606位的酪氨酸(Y606)、609位的酪氨酸(Y609)、616位的苯丙氨酸(F616)、624位的苯丙氨酸(F624)、648位的色氨酸(W648)、650位的色氨酸(W650)。因此在本发明的一个方式中,提供由将β-半乳糖苷酶中选自上述氨基酸组中的一个或二个以上的氨基酸、或者与其相当的氨基酸置换成其它的氨基酸而得的氨基酸序列构成的修饰型酶,其中,上述β-半乳糖苷酶由序列号1~4中任一个氨基酸序列、或者与序列号1~4中任一个表示的氨基酸序列的90%以上相同的氨基酸序列构成。置换后的氨基酸优选如下。
85位的色氨酸(W85)的置换后的氨基酸是甘氨酸。
91位的苯丙氨酸(F91)的置换后的氨基酸是丙氨酸或者异亮氨酸。
103位的酪氨酸(Y103)的置换后的氨基酸是甘氨酸。
134位的酪氨酸(Y134)的置换后的氨基酸是甘氨酸。
153位的酪氨酸(Y153)的置换后的氨基酸是甘氨酸。
182位的脯氨酸(P182)的置换后的氨基酸是色氨酸或者酪氨酸。
186位的色氨酸(W186)的置换后的氨基酸是甲硫氨酸。
192位的酪氨酸(Y192)的置换后的氨基酸是甘氨酸。
295位的酪氨酸(Y295)的置换后的氨基酸是甘氨酸。
345位的组氨酸(H345)的置换后的氨基酸是甘氨酸。
349位的甘氨酸(G349)的置换后的氨基酸是色氨酸。
402位的苯丙氨酸(F402)的置换后的氨基酸是甘氨酸。
407位的谷氨酰胺(Q407)的置换后的氨基酸是异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸或者酪氨酸。
479位的甘氨酸(G479)的置换后的氨基酸是亮氨酸、脯氨酸或者谷氨酰胺。
480位的谷氨酸(E480)的置换后的氨基酸是天冬酰胺。
482位的赖氨酸(K482)的置换后的氨基酸是甲硫氨酸或者缬氨酸。
483位的苏氨酸(T483)的置换后的氨基酸是甘氨酸或者丝氨酸。
484位的精氨酸(R484)的置换后的氨基酸是苯丙氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺或者谷氨酰胺。
485位的甘氨酸(G485)的置换后的氨基酸是天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺或者苏氨酸。
486位的天冬氨酸(D486)的置换后的氨基酸是丙氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、苏氨酸、色氨酸或者酪氨酸。
487位的赖氨酸(K487)的置换后的氨基酸是半胱氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、精氨酸、苏氨酸、缬氨酸、色氨酸或者酪氨酸。
488位的缬氨酸(V488)的置换后的氨基酸是甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸或者酪氨酸。
496位的酪氨酸(Y496)的置换后的氨基酸是甘氨酸。
512位的丝氨酸(S512)的置换后的氨基酸是半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、谷氨酰胺或者色氨酸。
513位的谷氨酸(E513)的置换后的氨基酸是丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸或者缬氨酸。
514位的天冬酰胺(N514)的置换后的氨基酸是谷氨酸、亮氨酸或者赖氨酸。
515位的天冬酰胺(N515)的置换后的氨基酸是丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸或者缬氨酸。
516位的酪氨酸(Y516)的置换后的氨基酸是色氨酸。
517位的天冬氨酸(D517)的置换后的氨基酸是赖氨酸或者色氨酸。
519位的酪氨酸(Y519)的置换后的氨基酸是甘氨酸。
533位的苏氨酸(T533)的置换后的氨基酸是谷氨酸。
547位的酪氨酸(Y547)的置换后的氨基酸是甘氨酸。
549位的酪氨酸(Y549)的置换后的氨基酸是甘氨酸。
555位的酪氨酸(Y555)的置换后的氨基酸是甘氨酸。
572位的精氨酸(R572)的置换后的氨基酸是半胱氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸、色氨酸或者酪氨酸。
573位的苏氨酸(T573)的置换后的氨基酸是谷氨酸。
598位的酪氨酸(Y598)的置换后的氨基酸是组氨酸或者天冬酰胺。
605位的酪氨酸(Y605)的置换后的氨基酸是半胱氨酸、天冬氨酸、组氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、脯氨酸、精氨酸或者苏氨酸。
606位的酪氨酸(Y606)的置换后的氨基酸是丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸或者丝氨酸。
609位的酪氨酸(Y609)的置换后的氨基酸是谷氨酸、天冬酰胺或者丝氨酸。
616位的苯丙氨酸(F616)的置换后的氨基酸是甘氨酸。
624位的苯丙氨酸(F624)的置换后的氨基酸是甘氨酸。
648位的色氨酸(W648)的置换后的氨基酸是甘氨酸。
650位的色氨酸(W650)的置换后的氨基酸是甘氨酸。
在本发明的第4方式中,成为置换的对象的一个或二个以上的氨基酸选自483位的苏氨酸(T483)、512位的丝氨酸(S512)、551位的谷氨酰胺(Q551)、598位的酪氨酸(Y598)以及615位的酪氨酸(Y615)。这些氨基酸在后述的实施例所示的实验中,被确定为满足“三糖以上的含有率为与野生型酶同等的程度、四糖的含有率比野生型酶多”这样的条件(条件4),与四糖的生成量有关。因此,对于该方式的修饰型酶,可以说如果使用它则在使四糖的含量上升这方面有用性高。置换后的氨基酸优选如下。应予说明,第4方式中将成为置换对象的氨基酸称为“第4组氨基酸”。
483位的苏氨酸(T483)的置换后的氨基酸是赖氨酸、甲硫氨酸或者精氨酸。
512位的丝氨酸(S512)的置换后的氨基酸是甘氨酸或者赖氨酸。
551位的谷氨酰胺(Q551)的置换后的氨基酸是天冬酰胺。
598位的酪氨酸(Y598)的置换后的氨基酸是天冬酰胺。
615位的酪氨酸(Y615)的置换后的氨基酸是苏氨酸。
经过研究的结果,作为满足“三糖以上的含有率为与野生型酶同等的程度、四糖的含有率比野生型酶多”这样的条件(条件4)的、置换对象的氨基酸(即,第4组氨基酸),特定出76位的色氨酸(W76)、480位的谷氨酸(E480)、483位的苏氨酸(T483)、485位的甘氨酸(G485)、484位的精氨酸(R484)、487位的赖氨酸(K487)、488位的缬氨酸(V488)、512位的丝氨酸(S512)、514位的天冬酰胺(N514)、515位的天冬酰胺(N515)、569位的甘氨酸(G569)、596位的苯丙氨酸(F596)。因此在本发明的一个方式中,提供由将β-半乳糖苷酶中选自上述氨基酸组中的一个或二个以上的氨基酸、或者与其相当的氨基酸置换成其它的氨基酸而得的氨基酸序列构成的修饰型酶,其中,上述β-半乳糖苷酶由序列号1~4中任一个氨基酸序列、或者与序列号1~4中任一个表示的氨基酸序列的90%以上相同的氨基酸序列构成。置换后的氨基酸优选如下。
76位的色氨酸(W76)的置换后的氨基酸是甘氨酸。
480位的谷氨酸(E480)的置换后的氨基酸是谷氨酰胺。
483位的苏氨酸(T483)的置换后的氨基酸是色氨酸。
485位的甘氨酸(G485)的置换后的氨基酸是脯氨酸或者苏氨酸。
484位的精氨酸(R484)的置换后的氨基酸是丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸、酪氨酸或者赖氨酸。
487位的赖氨酸(K487)的置换后的氨基酸是甘氨酸或者脯氨酸。
488位的缬氨酸(V488)的置换后的氨基酸是脯氨酸。
512位的丝氨酸(S512)的置换后的氨基酸是亮氨酸或者甲硫氨酸。
514位的天冬酰胺(N514)的置换后的氨基酸是天冬氨酸。
515位的天冬酰胺(N515)的置换后的氨基酸是苯丙氨酸、精氨酸、色氨酸、酪氨酸或者赖氨酸。
569位的甘氨酸(G569)的置换后的氨基酸是赖氨酸、脯氨酸或者缬氨酸。
596位的苯丙氨酸(F596)的置换后的氨基酸是甘氨酸。
在本发明的第5方式中,成为置换的对象的一个或二个以上的氨基酸选自405位的色氨酸(W405)、483位的苏氨酸(T483)、531位的丝氨酸(S531)、550位的天冬酰胺(N550)以及598位的酪氨酸(Y598)。这些氨基酸在后述的实施例所示的实验中,被确定为满足“三糖以上的含有率为与野生型酶同等的程度、异乳糖含有率比野生型酶少”这样的条件(条件5),与异乳糖含量有关。因此,对于该方式的修饰型酶,可以说如果使用它则在使异乳糖的比例下降这方面有用性高。置换后的氨基酸优选如下。应予说明,第5方式中将成为置换对象的氨基酸称为“第5组氨基酸”。
405位的色氨酸(W405)的置换后的氨基酸是丙氨酸、天冬氨酸、丝氨酸或者苏氨酸。
483位的苏氨酸(T483)的置换后的氨基酸是甲硫氨酸。
531位的丝氨酸(S531)的置换后的氨基酸是天冬氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、亮氨酸、赖氨酸或者甲硫氨酸。
550位的天冬酰胺(N550)的置换后的氨基酸是苯丙氨酸。
598位的酪氨酸(Y598)的置换后的氨基酸是苯丙氨酸或者组氨酸
在本发明的第6的方式中,成为置换的对象的一个或二个以上的氨基酸选自182位的脯氨酸(P182)、187位的酪氨酸(Y187)、188位的丝氨酸(S188)、405位的色氨酸(W405)、406位的丙氨酸(A406)、407位的谷氨酰胺(Q407)、449位的酪氨酸(Y449)、483位的苏氨酸(T483)、512位的丝氨酸(S512)、534位的丝氨酸(S534)、550位的天冬酰胺(N550)、551位的谷氨酰胺(Q551)、602位的脯氨酸(P602)、609位的酪氨酸(Y609)、612位的赖氨酸(K612)以及615位的酪氨酸(Y615)。这些氨基酸在后述的实施例所示的实验中,被确定为满足“三糖以上的含有率为与野生型酶同等的程度、异乳糖含有率比野生型酶多”这样的条件(条件),与异乳糖含量有关。因此,对于该方式的修饰型酶,可以说如果使用它则在使异乳糖的比例上升这方面有用性高。置换后的氨基酸优选如下。应予说明,第6的方式中将成为置换对象的氨基酸称为“第6组氨基酸”。
182位的脯氨酸(P182)的置换后的氨基酸是亮氨酸或者丝氨酸。
187位的酪氨酸(Y187)的置换后的氨基酸是天冬氨酸、谷氨酸或者天冬酰胺。
188位的丝氨酸(S188)的置换后的氨基酸是谷氨酸、甘氨酸、异亮氨酸或者天冬酰胺。
405位的色氨酸(W405)的置换后的氨基酸是组氨酸。
406位的丙氨酸(A406)的置换后的氨基酸是脯氨酸。
407位的谷氨酰胺(Q407)的置换后的氨基酸是丙氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、赖氨酸或者精氨酸。
449位的酪氨酸(Y449)的置换后的氨基酸是谷氨酸或者精氨酸。
483位的苏氨酸(T483)的置换后的氨基酸是丝氨酸或者谷氨酰胺。
512位的丝氨酸(S512)的置换后的氨基酸是甘氨酸、苏氨酸或者缬氨酸。
534位的丝氨酸(S534)的置换后的氨基酸是赖氨酸或者谷氨酰胺。
550位的天冬酰胺(N550)的置换后的氨基酸是丙氨酸、甘氨酸、赖氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、精氨酸或者丝氨酸。
551位的谷氨酰胺(Q551)的置换后的氨基酸是赖氨酸或者组氨酸。
602位的脯氨酸(P602)的置换后的氨基酸是半胱氨酸、天冬氨酸或者天冬酰胺。
609位的酪氨酸(Y609)的置换后的氨基酸是天冬氨酸、谷氨酰胺或者苏氨酸。
612位的赖氨酸(K612)的置换后的氨基酸是苯丙氨酸或者异亮氨酸。
615位的酪氨酸(Y615)的置换后的氨基酸是谷氨酸、异亮氨酸或者苏氨酸
本发明中,可以置换二个以上的氨基酸。如上所述,被置换的氨基酸被分类成第1组~第6组。被置换的二个以上的氨基酸例如从同一组中选择。该方式中,属于一个组的二个以上的氨基酸被置换,可期待变成该组特征性的特性(例如,第1组的情况是异乳糖分解活性低)增强的修饰型酶。另一方面,可以从二个以上的组选择被置换的二个以上的氨基酸。如果这样选择,则可期待变成兼具选择的氨基酸所属的各组的特性的修饰型酶。以下示出该方式的优选的具体例。应予说明,被置换的氨基酸的组合没有特别限定,但优选不并用显示相反的特性的组(即,第1组和第2组、第3组和第4组、第5组和第6组)的氨基酸。
(例1)
将第3组的氨基酸和第5组的氨基酸成为置换对象。可期待得到的修饰型酶显示四糖的比例和异乳糖的比例均少这样的特征。
(例2)
将第4组的氨基酸和第6组的氨基酸成为置换对象。可期待得到的修饰型酶显示四糖的比例和异乳糖的比例均多这样的特征。
(例3)
将第3组的氨基酸和第6组的氨基酸成为置换对象。可期待得到的修饰型酶显示四糖的比例少但异乳糖的比例多这样的特征。
(例4)
将第4组的氨基酸和第5组的氨基酸成为置换对象。可期待得到的修饰型酶显示四糖的比例多、异乳糖的比例少这样的特征。
(例5)
可以置换多个相同组的氨基酸。通过置换多个相同组的氨基酸,可期待更大的变化。例如,如果将第3组氨基酸的多个氨基酸成为置换对象,则可期待得到的修饰型酶显示四糖的比例更少这样的特征。
作为属于上述的例1的具体例,可举出188位的丝氨酸被置换成异亮氨酸且550位的天冬酰胺被置换成苯丙氨酸的修饰型酶(S188I_N550F)、407位的谷氨酰胺被置换成精氨酸且550位的天冬酰胺被置换成苯丙氨酸的修饰型酶(Q407R_N550F)、449位的酪氨酸被置换成谷氨酰胺且598位的酪氨酸被置换成组氨酸的修饰型酶(Y449Q_Y598H)、550位的天冬酰胺被置换成苯丙氨酸且602位的脯氨酸被置换成谷氨酰胺的修饰型酶(N550F_P602Q)。
作为属于上述例3的具体例,可举出407位的谷氨酰胺被置换成精氨酸且449位的酪氨酸被置换成谷氨酸的修饰型酶(Q407R_Y449E)。
作为属于上述例4的具体例,可举出550位的天冬酰胺被置换成苯丙氨酸且598位的酪氨酸被置换成天冬酰胺的修饰型酶(N550F_Y598N)。
作为属于上述例5的具体例(将第3组氨基酸的多个氨基酸成为置换对象的具体例),可举出182位的脯氨酸被置换成亮氨酸且449位的酪氨酸被置换成谷氨酸的修饰型酶(P182L_Y449E)、182位的脯氨酸被置换成亮氨酸且449位的酪氨酸被置换成谷氨酰胺的修饰型酶(P182L_Y449Q)、187位的酪氨酸被置换成亮氨酸且407位的谷氨酰胺被置换成精氨酸的修饰型酶(Y187L_Q407R)、187位的酪氨酸被置换成亮氨酸且449位的酪氨酸被置换成谷氨酸的修饰型酶(Y187L_Y449E)、187位的酪氨酸被置换成亮氨酸且449位的酪氨酸被置换成谷氨酰胺的修饰型酶(Y187L_Y449Q)、187位的酪氨酸被置换成亮氨酸且512位的丝氨酸被置换成半胱氨酸的修饰型酶(Y187L_S512C)、187位的酪氨酸被置换成亮氨酸且512位的丝氨酸被置换成天冬酰胺的修饰型酶(Y187L_S512N)、187位的酪氨酸被置换成亮氨酸且512位的丝氨酸被置换成苏氨酸的修饰型酶(Y187L_S512T)、188位的丝氨酸被置换成异亮氨酸且407位的谷氨酰胺被置换成精氨酸的修饰型酶(S188I_Q407R)、188位的丝氨酸被置换成异亮氨酸且449位的酪氨酸被置换成谷氨酰胺的修饰型酶(S188I_Y449Q)、188位的丝氨酸被置换成异亮氨酸且483位的苏氨酸被置换成谷氨酸的修饰型酶(S188I_T483E)、407位的谷氨酰胺被置换成亮氨酸且512位的丝氨酸被置换成缬氨酸的修饰型酶(Q407L_S512V)、407位的谷氨酰胺被置换成精氨酸且483位的苏氨酸被置换成甘氨酸的修饰型酶(Q407R_T483G)、407位的谷氨酰胺被置换成精氨酸且449位的酪氨酸被置换成谷氨酰胺的修饰型酶(Q407R_Y449Q)、407位的谷氨酰胺被置换成精氨酸且550位的天冬酰胺被置换成丝氨酸的修饰型酶(Q407R_N550S)、449位的酪氨酸被置换成谷氨酰胺且550位的天冬酰胺被置换成丝氨酸的修饰型酶(Y449Q_N550S)、487位的赖氨酸被置换成色氨酸且512位的丝氨酸被置换成苏氨酸的修饰型酶(K487W_S512T)、487位的赖氨酸被置换成色氨酸且517位的天冬氨酸被置换成赖氨酸的修饰型酶(K487W_D517K)、487位的赖氨酸被置换成色氨酸且515位的天冬酰胺被置换成甘氨酸的修饰型酶(K487W_N515G)、487位的赖氨酸被置换成色氨酸且517位的天冬氨酸被置换成色氨酸的修饰型酶(K487W_D517W)。
同样作为属于上述例5的具体例(将第4组氨基酸的多个氨基酸成为置换对象的具体例),可举出487位的赖氨酸被置换成脯氨酸且515位的天冬酰胺被置换成精氨酸的修饰型酶(K487P_N515R),。
作为二个以上的氨基酸被置换的修饰型酶的进一步的具体例,可举出91位的苯丙氨酸被置换成丝氨酸且407位的谷氨酰胺被置换成甲硫氨酸的修饰型酶(F91S_Q407M)、180位的苏氨酸被置换成缬氨酸且187位的酪氨酸被置换成亮氨酸的修饰型酶(T180V_Y187L)、180位的苏氨酸被置换成缬氨酸且188位的丝氨酸被置换成异亮氨酸的修饰型酶(T180V_S188I)、180位的苏氨酸被置换成缬氨酸且407位的谷氨酰胺被置换成精氨酸的修饰型酶(T180V_Q407R)、180位的苏氨酸被置换成缬氨酸且449位的酪氨酸被置换成谷氨酸的修饰型酶(T180V_Y449E)、180位的苏氨酸被置换成缬氨酸且483位的苏氨酸被置换成甘氨酸的修饰型酶(T180V_T483G)、180位的苏氨酸被置换成缬氨酸且512位的丝氨酸被置换成缬氨酸的修饰型酶(T180V_S512V)、180位的苏氨酸被置换成缬氨酸且550位的天冬酰胺被置换成苯丙氨酸的修饰型酶(T180V_N550F)、180位的苏氨酸被置换成缬氨酸且615位的酪氨酸被置换成脯氨酸的修饰型酶(T180V_Y615P)、182位的脯氨酸被置换成亮氨酸且376位的精氨酸被置换成脯氨酸的修饰型酶(P182L_R376P)、182位的脯氨酸被置换成色氨酸且449位的酪氨酸被置换成谷氨酰胺的修饰型酶(P182W_Y449Q)、187位的酪氨酸被置换成亮氨酸且487位的赖氨酸被置换成丙氨酸的修饰型酶(Y187L_K487A)、187位的酪氨酸被置换成亮氨酸且512位的丝氨酸被置换成丙氨酸的修饰型酶(Y187L_S512A)、187位的酪氨酸被置换成亮氨酸且533位的苏氨酸被置换成天冬酰胺的修饰型酶(Y187L_T533N)、376位的精氨酸被置换成脯氨酸且407位的谷氨酰胺被置换成亮氨酸的修饰型酶(R376P_Q407L)、376位的精氨酸被置换成脯氨酸且449位的酪氨酸被置换成谷氨酰胺的修饰型酶(R376P_Y449Q)、376位的精氨酸被置换成脯氨酸且512位的丝氨酸被置换成缬氨酸的修饰型酶(R376P_S512V)、376位的精氨酸被置换成脯氨酸且550位的天冬酰胺被置换成色氨酸的修饰型酶(R376P_N550W)、376位的精氨酸被置换成脯氨酸且550位的天冬酰胺被置换成酪氨酸的修饰型酶(R376P_N550Y)、407位的谷氨酰胺被置换成亮氨酸且533位的苏氨酸被置换成谷氨酸的修饰型酶(Q407L_T533E)、407位的谷氨酰胺被置换成亮氨酸且570位的色氨酸被置换成酪氨酸的修饰型酶(Q407L_W570Y)、407位的谷氨酰胺被置换成亮氨酸且615位的酪氨酸被置换成亮氨酸的修饰型酶(Q407L_Y615L)、407位的谷氨酰胺被置换成精氨酸且615位的酪氨酸被置换成亮氨酸的修饰型酶(Q407R_Y615L)、407位的谷氨酰胺被置换成精氨酸且615位的酪氨酸被置换成脯氨酸的修饰型酶(Q407R_Y615P)、449位的酪氨酸被置换成天冬氨酸且598位的酪氨酸被置换成苯丙氨酸的修饰型酶(Y449D_Y598F)、449位的酪氨酸被置换成谷氨酰胺且533位的苏氨酸被置换成谷氨酸的修饰型酶(Y449Q_T533E)、449位的酪氨酸被置换成谷氨酰胺且615位的酪氨酸被置换成甘氨酸的修饰型酶(Y449Q_Y615G)、449位的酪氨酸被置换成谷氨酰胺且615位的酪氨酸被置换成脯氨酸的修饰型酶(Y449Q_Y615P)、483位的苏氨酸被置换成甘氨酸且512位的丝氨酸被置换成缬氨酸的修饰型酶(T483G_S512V)、483位的苏氨酸被置换成甘氨酸且550位的天冬酰胺被置换成丝氨酸的修饰型酶(T483G_N550S)、483位的苏氨酸被置换成甘氨酸且615位的酪氨酸被置换成亮氨酸的修饰型酶(T483G_Y615L)、483位的苏氨酸被置换成谷氨酰胺且602位的脯氨酸被置换成谷氨酰胺的修饰型酶(T483Q_P602Q)、484位的精氨酸被置换成组氨酸且487位的赖氨酸被置换成组氨酸的修饰型酶(R484H_K487H)、484位的精氨酸被置换成色氨酸且487位的赖氨酸被置换成天冬氨酸的修饰型酶(R484W_K487D)、484位的精氨酸被置换成色氨酸且575位的苏氨酸被置换成色氨酸的修饰型酶(R484W_T575W)、485位的甘氨酸被置换成赖氨酸且488位的缬氨酸被置换成色氨酸的修饰型酶(G485K_V488W)、485位的甘氨酸被置换成赖氨酸且516位的酪氨酸被置换成色氨酸的修饰型酶(G485K_Y516W)、485位的甘氨酸被置换成赖氨酸且517位的天冬氨酸被置换成赖氨酸的修饰型酶(G485K_D517K)、485位的甘氨酸被置换成赖氨酸且517位的天冬氨酸被置换成色氨酸的修饰型酶(G485K_D517W)、485位的甘氨酸被置换成赖氨酸且569位的甘氨酸被置换成色氨酸的修饰型酶(G485K_G569W)、485位的甘氨酸被置换成赖氨酸且571位的甘氨酸被置换成赖氨酸的修饰型酶(G485K_G571K)、485位的甘氨酸被置换成赖氨酸且572位的精氨酸被置换成色氨酸的修饰型酶(G485K_R572W)、485位的甘氨酸被置换成赖氨酸且573位的苏氨酸被置换成色氨酸的修饰型酶(G485K_T573W)、485位的甘氨酸被置换成色氨酸且516位的酪氨酸被置换成色氨酸的修饰型酶(G485W_Y516W)、485位的甘氨酸被置换成色氨酸且517位的天冬氨酸被置换成色氨酸的修饰型酶(G485W_D517W)、485位的甘氨酸被置换成色氨酸且573位的苏氨酸被置换成赖氨酸的修饰型酶(G485W_T573K)、485位的甘氨酸被置换成色氨酸且573位的苏氨酸被置换成色氨酸的修饰型酶(G485W_T573W)、487位的赖氨酸被置换成丙氨酸且512位的丝氨酸被置换成缬氨酸的修饰型酶(K487A_S512V)、487位的赖氨酸被置换成甘氨酸且515位的天冬酰胺被置换成谷氨酰胺的修饰型酶(K487G_N515Q)、487位的赖氨酸被置换成色氨酸且573位的苏氨酸被置换成赖氨酸的修饰型酶(K487W_T573K)、487位的赖氨酸被置换成色氨酸且593位的色氨酸被置换成苯丙氨酸的修饰型酶(K487W_W593F)、488位的缬氨酸被置换成赖氨酸且514位的天冬酰胺被置换成赖氨酸的修饰型酶(V488K_N514K)、488位的缬氨酸被置换成赖氨酸且517位的天冬氨酸被置换成赖氨酸的修饰型酶(V488K_D517K)、488位的缬氨酸被置换成赖氨酸且569位的甘氨酸被置换成赖氨酸的修饰型酶(V488K_G569K)、488位的缬氨酸被置换成赖氨酸且569位的甘氨酸被置换成色氨酸的修饰型酶(V488K_G569W)、488位的缬氨酸被置换成赖氨酸且572位的精氨酸被置换成赖氨酸的修饰型酶(V488K_R572K)、488位的缬氨酸被置换成赖氨酸且573位的苏氨酸被置换成赖氨酸的修饰型酶(V488K_T573K)、488位的缬氨酸被置换成赖氨酸且573位的苏氨酸被置换成色氨酸的修饰型酶(V488K_T573W)、488位的缬氨酸被置换成赖氨酸且516位的酪氨酸被置换成赖氨酸的修饰型酶(V488K_Y516K)、488位的缬氨酸被置换成赖氨酸且516位的酪氨酸被置换成色氨酸的修饰型酶(V488K_Y516W)、488位的缬氨酸被置换成色氨酸且514位的天冬酰胺被置换成色氨酸的修饰型酶(V488W_N514W)、488位的缬氨酸被置换成色氨酸且573位的苏氨酸被置换成色氨酸的修饰型酶(V488W_T573W)、500位的谷氨酸被置换成丙氨酸且501位的异亮氨酸被置换成丙氨酸的修饰型酶(E500A_I501A)、512位的丝氨酸被置换成缬氨酸且550位的天冬酰胺被置换成丝氨酸的修饰型酶(S512V_N550S)、533位的苏氨酸被置换成谷氨酸且550位的天冬酰胺被置换成丝氨酸的修饰型酶(T533E_N550S)、533位的苏氨酸被置换成谷氨酸且615位的酪氨酸被置换成甘氨酸的修饰型酶(T533E_Y615G)、570位的色氨酸被置换成酪氨酸且615位的酪氨酸被置换成亮氨酸的修饰型酶(W570Y_Y615L)、(以上的修饰型酶满足上述的条件3“三糖以上的含有率为与野生型酶同等的程度、四糖的含有率比野生型酶少”)、91位的苯丙氨酸被置换成缬氨酸且513位的谷氨酸被置换成甘氨酸的修饰型酶(F91V_E513G)、180位的苏氨酸被置换成缬氨酸且483位的苏氨酸被置换成赖氨酸的修饰型酶(T180V_T483K)、180位的苏氨酸被置换成缬氨酸且598位的酪氨酸被置换成天冬酰胺的修饰型酶(T180V_Y598N)、180位的苏氨酸被置换成缬氨酸且615位的酪氨酸被置换成甘氨酸的修饰型酶(T180V_Y615G)、182位的脯氨酸被置换成亮氨酸且615位的酪氨酸被置换成亮氨酸的修饰型酶(P182L_Y615L)、376位的精氨酸被置换成脯氨酸且598位的酪氨酸被置换成天冬酰胺的修饰型酶(R376P_Y598N)、407位的谷氨酰胺被置换成亮氨酸且483位的苏氨酸被置换成赖氨酸的修饰型酶(Q407L_T483K)、407位的谷氨酰胺被置换成亮氨酸且487位的赖氨酸被置换成脯氨酸的修饰型酶(Q407L_K487P)、407位的谷氨酰胺被置换成亮氨酸且615位的酪氨酸被置换成甘氨酸的修饰型酶(Q407L_Y615G)、449位的酪氨酸被置换成谷氨酸且487位的赖氨酸被置换成丙氨酸的修饰型酶(Y449E_K487A)、449位的酪氨酸被置换成谷氨酸且487位的赖氨酸被置换成脯氨酸的修饰型酶(Y449E_K487P)、483位的苏氨酸被置换成甘氨酸且487位的赖氨酸被置换成丙氨酸的修饰型酶(T483G_K487A)、483位的苏氨酸被置换成甘氨酸且533位的苏氨酸被置换成谷氨酸的修饰型酶(T483G_T533E)、483位的苏氨酸被置换成甘氨酸且615位的酪氨酸被置换成甘氨酸的修饰型酶(T483G_Y615G)、483位的苏氨酸被置换成甲硫氨酸且487位的赖氨酸被置换成丙氨酸的修饰型酶(T483M_K487A)、483位的苏氨酸被置换成甲硫氨酸且487位的赖氨酸被置换成甘氨酸的修饰型酶(T483M_K487G)、483位的苏氨酸被置换成甲硫氨酸且487位的赖氨酸被置换成脯氨酸的修饰型酶(T483M_K487P)、484位的精氨酸被置换成组氨酸且487位的赖氨酸被置换成天冬氨酸的修饰型酶(R484H_K487D)、484位的精氨酸被置换成赖氨酸且513位的谷氨酸被置换成色氨酸的修饰型酶(R484K_E513W)、484位的精氨酸被置换成赖氨酸且514位的天冬酰胺被置换成赖氨酸的修饰型酶(R484K_N514K)、484位的精氨酸被置换成赖氨酸且514位的天冬酰胺被置换成色氨酸的修饰型酶(R484K_N514W)、484位的精氨酸被置换成赖氨酸且515位的天冬酰胺被置换成赖氨酸的修饰型酶(R484K_N515K)、484位的精氨酸被置换成赖氨酸且515位的天冬酰胺被置换成色氨酸的修饰型酶(R484K_N515W)、484位的精氨酸被置换成赖氨酸且517位的天冬氨酸被置换成色氨酸的修饰型酶(R484K_D517W)、484位的精氨酸被置换成赖氨酸且569位的甘氨酸被置换成赖氨酸的修饰型酶(R484K_G569K)、484位的精氨酸被置换成赖氨酸且571位的甘氨酸被置换成赖氨酸的修饰型酶(R484K_G571K)、484位的精氨酸被置换成赖氨酸且572位的精氨酸被置换成赖氨酸的修饰型酶(R484K_R572K)、484位的精氨酸被置换成赖氨酸且572位的精氨酸被置换成色氨酸的修饰型酶(R484K_R572W)、484位的精氨酸被置换成赖氨酸且573位的苏氨酸被置换成赖氨酸的修饰型酶(R484K_T573K)、484位的精氨酸被置换成赖氨酸且573位的苏氨酸被置换成色氨酸的修饰型酶(R484K_T573W)、484位的精氨酸被置换成赖氨酸且516位的酪氨酸被置换成赖氨酸的修饰型酶(R484K_Y516K)、484位的精氨酸被置换成色氨酸且515位的天冬酰胺被置换成赖氨酸的修饰型酶(R484W_N515K)、485位的甘氨酸被置换成天冬氨酸且487位的赖氨酸被置换成组氨酸的修饰型酶(G485D_K487H)、485位的甘氨酸被置换成赖氨酸且487位的赖氨酸被置换成组氨酸的修饰型酶(G485K_K487H)、485位的甘氨酸被置换成赖氨酸且569位的甘氨酸被置换成赖氨酸的修饰型酶(G485K_G569K)、485位的甘氨酸被置换成赖氨酸且514位的天冬酰胺被置换成赖氨酸的修饰型酶(G485K_N514K)、485位的甘氨酸被置换成赖氨酸且515位的天冬酰胺被置换成赖氨酸的修饰型酶(G485K_N515K)、485位的甘氨酸被置换成赖氨酸且515位的天冬酰胺被置换成色氨酸的修饰型酶(G485K_N515W)、485位的甘氨酸被置换成精氨酸且487位的赖氨酸被置换成天冬氨酸的修饰型酶(G485R_K487D)、485位的甘氨酸被置换成色氨酸且513位的谷氨酸被置换成色氨酸的修饰型酶(G485W_E513W)、485位的甘氨酸被置换成色氨酸且515位的天冬酰胺被置换成赖氨酸的修饰型酶(G485W_N515K)、485位的甘氨酸被置换成色氨酸且515位的天冬酰胺被置换成色氨酸的修饰型酶(G485W_N515W)、487位的赖氨酸被置换成丙氨酸且531位的丝氨酸被置换成丙氨酸的修饰型酶(K487A_S531A)、487位的赖氨酸被置换成丙氨酸且593位的色氨酸被置换成苯丙氨酸的修饰型酶(K487A_W593F)、487位的赖氨酸被置换成丙氨酸且615位的酪氨酸被置换成亮氨酸的修饰型酶(K487A_Y615L)、487位的赖氨酸被置换成色氨酸且514位的天冬酰胺被置换成赖氨酸的修饰型酶(K487W_N514K)、487位的赖氨酸被置换成色氨酸且514位的天冬酰胺被置换成色氨酸的修饰型酶(K487W_N514W)、487位的赖氨酸被置换成色氨酸且516位的酪氨酸被置换成色氨酸的修饰型酶(K487W_Y516W)、487位的赖氨酸被置换成色氨酸且569位的甘氨酸被置换成赖氨酸的修饰型酶(K487W_G569K)、487位的赖氨酸被置换成酪氨酸且515位的天冬酰胺被置换成苯丙氨酸的修饰型酶(K487Y_N515F)、487位的赖氨酸被置换成酪氨酸且515位的天冬酰胺被置换成色氨酸的修饰型酶(K487Y_N515W)、488位的缬氨酸被置换成赖氨酸且515位的天冬酰胺被置换成赖氨酸的修饰型酶(V488K_N515K)、488位的缬氨酸被置换成赖氨酸且515位的天冬酰胺被置换成色氨酸的修饰型酶(V488K_N515W)、488位的缬氨酸被置换成色氨酸且515位的天冬酰胺被置换成赖氨酸的修饰型酶(V488W_N515K)、488位的缬氨酸被置换成色氨酸且515位的天冬酰胺被置换成色氨酸的修饰型酶(V488W_N515W)、488位的缬氨酸被置换成酪氨酸且515位的天冬酰胺被置换成色氨酸的修饰型酶(V488Y_N515W)、550位的天冬酰胺被置换成丝氨酸且598位的酪氨酸被置换成天冬酰胺的修饰型酶(N550S_Y598N)、550位的天冬酰胺被置换成丝氨酸且615位的酪氨酸被置换成甘氨酸的修饰型酶(N550S_Y615G)、550位的天冬酰胺被置换成丝氨酸且615位的酪氨酸被置换成亮氨酸的修饰型酶(N550S_Y615L)、550位的天冬酰胺被置换成丝氨酸且615位的酪氨酸被置换成脯氨酸的修饰型酶(N550S_Y615P)(以上的修饰型酶满足上述的条件4“三糖以上的含有率为与野生型酶同等的程度、四糖的含有率比野生型酶多”)。
以上的具体例是二个氨基酸被置换的修饰型酶,作为三个或者四个氨基酸被置换的修饰型酶的例子,可举出484位的精氨酸被置换成丙氨酸、485位的甘氨酸被置换成丙氨酸且487位的赖氨酸被置换成天冬氨酸的修饰型酶(R484A_G485A_K487D),484位的精氨酸被置换成天冬氨酸、485位的甘氨酸被置换成天冬氨酸且487位的赖氨酸被置换成天冬氨酸的修饰型酶(R484D_G485D_K487D),485位的甘氨酸被置换成精氨酸、486位的天冬氨酸被置换成精氨酸且487位的赖氨酸被置换成赖氨酸精氨酸的修饰型酶(G485R_D486R_K487R),484位的精氨酸被置换成丙氨酸、485位的甘氨酸被置换成丙氨酸、486位的天冬氨酸被置换成丙氨酸且487位的赖氨酸被置换成丙氨酸的修饰型酶(R484A_G485A_D486A_K487A),484位的精氨酸被置换成丙氨酸、485位的甘氨酸被置换成丙氨酸、486位的天冬氨酸被置换成脯氨酸且487位的赖氨酸被置换成脯氨酸的修饰型酶(R484A_G485A_D486P_K487P)(以上的修饰型酶满足上述的条件3“三糖以上的含有率为与野生型酶同等的程度、四糖的含有率比野生型酶少”),484位的精氨酸被置换成丙氨酸、485位的甘氨酸被置换成丙氨酸且487位的赖氨酸被置换成天冬氨酸的修饰型酶(R484A_G485A_K487D),484位的精氨酸被置换成半胱氨酸、486位的天冬氨酸被置换成组氨酸且487位的赖氨酸被置换成精氨酸的修饰型酶(R484C_D486H_K487R),485位的甘氨酸被置换成精氨酸、486位的天冬氨酸被置换成色氨酸且487位的赖氨酸被置换成色氨酸的修饰型酶(G485R_D486W_K487W),485位的甘氨酸被置换成精氨酸、486位的天冬氨酸被置换成丙氨酸且487位的赖氨酸被置换成丙氨酸的修饰型酶(G485R_D486A_K487A),485位的甘氨酸被置换成精氨酸、486位的天冬氨酸被置换成脯氨酸且487位的赖氨酸被置换成脯氨酸的修饰型酶(G485R_D486P_K487P),484位的精氨酸被置换成丙氨酸、485位的甘氨酸被置换成丙氨酸、486位的天冬氨酸被置换成丙氨酸且487位的赖氨酸被置换成丙氨酸的修饰型酶(R484A_G485A_D486A_K487A),484位的精氨酸被置换成丙氨酸、485位的甘氨酸被置换成丙氨酸、486位的天冬氨酸被置换成精氨酸且487位的赖氨酸被置换成精氨酸的修饰型酶(R484A_G485A_D486R_K487R),484位的精氨酸被置换成天冬氨酸、485位的甘氨酸被置换成天冬氨酸、486位的天冬氨酸被置换成精氨酸且487位的赖氨酸被置换成精氨酸的修饰型酶(R484D_G485D_D486R_K487R),484位的精氨酸被置换成天冬氨酸、485位的甘氨酸被置换成天冬氨酸、486位的天冬氨酸被置换成脯氨酸且487位的赖氨酸被置换成脯氨酸的修饰型酶(R484D_G485D_D486P_K487P),484位的精氨酸被置换成天冬氨酸、485位的甘氨酸被置换成天冬氨酸、486位的天冬氨酸被置换成丙氨酸且487位的赖氨酸被置换成丙氨酸的修饰型酶(R484D_G485D_D486A_K487A),484位的精氨酸被置换成天冬氨酸、485位的甘氨酸被置换成天冬氨酸、486位的天冬氨酸被置换成色氨酸且487位的赖氨酸被置换成色氨酸的修饰型酶(R484D_G485D_D486W_K487W),484位的精氨酸被置换成脯氨酸、485位的甘氨酸被置换成脯氨酸、486位的天冬氨酸被置换成精氨酸且487位的赖氨酸被置换成精氨酸的修饰型酶(R484P_G485P_D486R_K487R)(以上的修饰型酶满足上述的条件4“三糖以上的含有率为与野生型酶同等的程度、四糖的含有率比野生型酶多”)。
以上的修饰型酶是将基准β-半乳糖苷酶的特定氨基酸置换成其它的氨基酸而得到的。经过本发明人等的研究,除了这样的氨基酸置换变异体以外,作为有用的修饰型酶,还发现了在氨基酸序列的特定位置插入氨基酸的变异体(插入变异体)以及氨基酸序列的特定氨基酸缺失的变异体(缺失变异体),进而,对缺失变异体施加氨基酸置换的变异体。因此在本发明的一个方式中,提供对由序列号1~4中任一个氨基酸序列、或者与序列号1~4中任一个表示的氨基酸序列的90%以上相同的氨基酸序列构成的β-半乳糖苷酶进行了以下的修饰而得的修饰型酶。
(a)484位的精氨酸(R484)~487位的赖氨酸(K487)、或者与其相当的区域的缺失
(b)在514位的天冬酰胺(N514)与515位的天冬酰胺(N515)之间、或者与其相当的位置的氨基酸的插入
(c)在604位的脯氨酸(P604)与605位的酪氨酸(Y605)之间、或者与其相当的位置的氨基酸的插入
(d)在485位的甘氨酸(G485)或者与其相当的氨基酸的缺失的基础上,486位的天冬氨酸(D486)或者与其相当的氨基酸向其它的氨基酸的置换
(e)在485位的甘氨酸(G485)~486位的天冬氨酸(D486)、或者与其相当的区域的缺失的基础上,487位的赖氨酸(K487)或者与其相当的氨基酸向其它的氨基酸的置换
(f)在485位的甘氨酸(G485)~486位的天冬氨酸(D486)、或者与其相当的区域的缺失的基础上,484位的精氨酸(R484)或者与其相当的氨基酸向其它的氨基酸的置换、以及487位的赖氨酸(K487)或者与其相当的氨基酸向其它的氨基酸的置换
(g)在484位的精氨酸(R484)与485位的甘氨酸(G485)之间、或者与其相当的位置的氨基酸的插入
(h)在485位的甘氨酸(G485)与486位的天冬氨酸(D486)之间、或者与其相当的位置的氨基酸的插入
关于(d)~(f),优选置换后的氨基酸中,对于R484为色氨酸或者脯氨酸,对于D486为组氨酸,对于K487为精氨酸、色氨酸或者脯氨酸。另一方面,关于(b)、(c)、(g)、(h),被插入的氨基酸的个数例如为1~10个,优选为2~8个。以下,与表述方法一并示出上述(a)~(g)的具体例。
<表述方法>
“N514-F-F-N515”表示在N514与N515之间插入了2个F(苯丙氨酸)的修饰型酶。
“Δ484-487”表示484位氨基酸~487位氨基酸缺失的修饰型酶。
“Δ485-486_K487R”表示485位氨基酸~486位氨基酸缺失且将487位氨基酸置换成R(精氨酸)的修饰型酶。
<修饰型酶的具体例>
(A)满足上述的条件3“三糖以上的含有率为与野生型酶同等的程度、四糖的含有率比野生型酶少”的修饰型酶
Δ484-487
N514-F-F-N515
N514-W-W-N515
P604-W-W-Y605
P604-A-A-A-A-Y605
P604-F-F-F-F-Y605
(B)满足上述的条件4“三糖以上的含有率为与野生型酶同等的程度、四糖的含有率比野生型酶多”的修饰型酶
Δ485_D486H
Δ485-486_K487R
Δ485-486_R484W_K487W
Δ485-486_R484P_K487P
R484-A-A-G485
R484-F-F-G485
R484-K-K-G485
R484-P-P-G485
R484-R-R-G485
R484-S-S-G485
R484-W-W-G485
G485-S-S-S-D486
R484-A-A-A-A-G485
R484-D-D-D-D-G485
R484-F-F-F-F-G485
R484-P-P-P-P-G485
R484-R-R-R-R-G485
R484-S-S-S-S-G485
R484-W-W-W-W-G485
R484-A-A-A-A-A-A-A-A-G485
R484-D-D-D-D-D-D-D-D-G485
R484-F-F-F-F-F-F-F-F-G485
R484-K-K-K-K-K-K-K-K-G485
R484-P-P-P-P-P-P-P-P-G485
这里,如后述的实施例所示,通过与鉴定第1组的氨基酸~第6组的氨基酸的情况不同的研究法,还发现了对酶的特异性的变化有用的其它的氨基酸残基。基于该成果,本发明还提供以下的修饰型β-半乳糖苷酶酶。即,由在用序列号1的氨基酸序列构成的β-半乳糖苷酶中,在上述的置换的基础上,将1540位的色氨酸(W1540)置换成其它的氨基酸而得的氨基酸序列构成的修饰型β-半乳糖苷酶。置换后的氨基酸优选为丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸或者缬氨酸。该方式的修饰型酶除具有由组合的上述的置换带来的特性以外,如果使用它,则还在使四糖的含量增多这方面有用性高。
经过研究的结果,由序列号1的氨基酸序列构成的β-半乳糖苷酶的情况下,作为在使四糖的含量增多这方面有用性特别高的置换对象的氨基酸,确定了487位的赖氨酸(K487)、514位的天冬酰胺(N514)、515位的天冬酰胺(N515)。置换后的氨基酸优选如下。
487位的赖氨酸(K487)的置换后的氨基酸是甘氨酸或者脯氨酸。
514位的天冬酰胺(N514)的置换后的氨基酸是色氨酸。
515位的天冬酰胺(N515)的置换后的氨基酸是赖氨酸或者色氨酸。
然而,在WO2010/098561中公开过来自环状芽孢杆菌的β-半乳糖苷酶的一种。对该β-半乳糖苷酶实施与本说明书公开的氨基酸置换相当的变异,也能够获得修饰型β-半乳糖苷酶。应予说明,编码WO2010/098561公开的β-半乳糖苷酶的序列与编码本申请中的基准β-半乳糖苷酶的一种的序列(序列号5)显示约70%的同一性。
(编码修饰型β-半乳糖苷酶的核酸等)
本发明的第2方面提供与本发明的修饰型酶相关的核酸。即,提供编码修饰型酶的基因、能够用作用于鉴定编码修饰型酶的核酸的探针的核酸、能够用作用于使编码修饰型酶的核酸扩增或者突变等的引物的核酸。
编码修饰型酶的基因典型的是用于制备修饰型酶。采用使用了编码修饰型酶的基因的基因工学的制备法,能够得到更均质的状态的修饰型酶。另外,可以说该方法在制备大量的修饰型酶的情况下也是理想的方法。应予说明,编码修饰型酶的基因的用途不限于修饰型酶的制备。例如,作为以阐明修饰型酶的作用机制等为目的的实验用的工具、或者用于设计或者制作酶的进一步的修饰体的工具,也可以利用该核酸。
本说明书中“编码修饰型酶的基因”是指其在表达时得到该修饰型酶的核酸,具有与该修饰型酶的氨基酸序列对应的碱基序列的核酸当然也包括对这样的核酸附加不编码氨基酸序列的序列而成的核酸。另外,还要考虑密码子的简并。
参考本说明书或者附带的序列表公开的序列信息,通过使用标准的基因工程技术、分子生物学技术、生物化学技术等,可以将本发明的核酸制备成分离的状态。
在本发明的其它方式中,提供与本发明的编码修饰型酶的基因的碱基序列相比较时其编码的蛋白质的功能同等但一部分碱基序列不同的核酸(以下,也称为“同源核酸”。另外,将规定同源核酸的碱基序列也称为“同源碱基序列”)。作为同源核酸的例子,可举出由以本发明的编码修饰型酶的核酸的碱基序列为基准包含1个或多个碱基的置换、缺失、插入、附加或者倒位的碱基序列构成、编码具有修饰型酶特有的酶活性的蛋白质的DNA。碱基的置换、缺失等可以发生在多个部位。这里的“多个”根据该核酸编码的蛋白质的立体结构中的氨基酸残基的位置、种类而不同,例如为2~40个碱基,优选为2~20个碱基,更优选为2~10个碱基。
如上的同源核酸例如通过利用限制性内切酶处理、基于核酸外切酶、DNA连接酶等的处理、定点突变导入法(分子克隆,第三版,第13章,冷泉港实验室出版社,纽约(Molecular Cloning,Third Edition,C hapter 13,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,New York))、随机突变导入法(分子克隆,第三版,第13章,冷泉港实验室出版社,纽约)导入变异等得到。另外,利用紫外线照射等其它的方法也能够得到同源核酸。
本发明的其它方式涉及具有与编码本发明的修饰型酶的基因的碱基序列互补的碱基序列的核酸。本发明的又一方式提供具有与编码本发明的修饰型酶的基因的碱基序列或者与其互补的碱基序列至少约60%、70%、80%、90%、95%、99%、99.9%相同的碱基序列的核酸。
本发明的又一方式涉及在严格的(stringent)条件下具有同与编码本发明的修饰型酶的基因的碱基序列或者其相同碱基序列互补的碱基序列进行杂交的碱基序列的核酸。这里的“严格的条件”是指形成所谓的特异性杂交,不形成非特异性杂交的条件。这样的严格的条件对本领域技术人员而言是公知的,例如可以参照分子克隆(第三版,冷泉港实验室出版社,纽约)(Molecular Cloning(Third Edition,Cold Spring H arbor LaboratoryPress,New York))、现代分子生物学实验技术(由Fr ederick M.Ausubel等人编辑,1987)(Current protocols in molecular b iology(edited by Frederick M.Ausubel etal.,1987))设定。作为严格的条件,例如可举出使用杂交液(50%甲酰胺,10×SSC(0.15MNaCl,15mM柠檬酸钠,pH 7.0),5×登哈特(Denhardt)溶液,1%SDS,10%硫酸葡聚糖,10μg/ml的变性鲑鱼精DNA,50mM磷酸缓冲液(pH7.5))在约42℃~约50℃下培养,其后使用0.1×SSC、0.1%SDS在约65℃~约70℃下清洗的条件。作为更优选的严格的条件,例如,作为杂交液,可举出使用50%甲酰胺,5×SSC(0.15M NaCl,15mM柠檬酸钠,pH 7.0),1×登哈特溶液,1%SDS,10%硫酸葡聚糖,10μg/ml的变性鲑鱼精DNA,50mM磷酸缓冲液(pH7.5))的条件。
本发明的又一方式提供具有编码本发明的修饰型酶的基因的碱基序列或者与其互补的碱基序列的一部分的核酸(核酸片段)。这样的核酸片段可以用于对具有编码本发明的修饰型酶的基因的碱基序列的核酸等进行检测、鉴定和/或扩增等。核酸片段例如被设计成至少包括与编码本发明的修饰型酶的基因的碱基序列中连续的核苷酸部分(例如约10~约100个碱基长,优选为约20~约100个碱基长,更优选为约30~约100碱基长)杂交的部分。用作探针时可以标记核酸片段。标记例如可以使用荧光物质、酶、放射性同位素。
本发明的又一方面涉及含有本发明的基因(编码修饰型酶的基因)的重组DNA。本发明的重组DNA例如以载体的形态提供。本说明书中用语“载体”是指可以将插入其中的核酸向细胞等靶内输送的核酸性分子。
根据使用目的(克隆、蛋白质的表达),另外还要考虑宿主细胞的种类选择适当的载体。作为以大肠杆菌为宿主的载体,可例示M13噬菌体或者其修饰体、λ噬菌体或者其修饰体、pBR322或者其修饰体(pB325,pAT153,pUC8等)等,作为以酵母为宿主的载体,可例示pYepSec1、pMFa、pYES2等,作为以昆虫细胞为宿主的载体,可例示pAc、pVL等,作为以哺乳类细胞为宿主的载体,可例示pCDM8、pMT2PC等。
本发明的载体优选为表达载体。“表达载体”是指能够将插入其中的核酸导入目标细胞(宿主细胞)内且在该细胞内能够表达的载体。表达载体通常包含插入的核酸的表达所需的启动子序列、促进表达的增强子序列等。也可以使用包含选择性标记物的表达载体。使用该表达载体时,利用选择性标记物能够确定表达载体有无导入(及其程度)。
本发明的核酸向载体的插入、选择性标记物基因的插入(必要时)、启动子的插入(必要时)等可以使用标准的重组DNA技术(例如,可以参照分子克隆,第三版,1.84,冷泉港实验室出版社,纽约(Molecular Cloning,Third Edition,1.84,Cold Spring HarborLaborato ry Press,New York),使用限制性内切酶和DNA连接酶的公知的方法)进行。
作为宿主细胞,从操作的容易性的观点考虑,优选使用大肠杆菌(Escherichiacoli)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)等微生物,但只要是重组DNA能够复制且修饰型酶的基因能够表达的宿主细胞就可利用。利用T7系启动子作为大肠杆菌的例子时,可举出大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,除此情况以外,可举出大肠杆菌JM109。另外,作为酿酒酵母的例子,可举出酿酒酵母SHY2、酿酒酵母AH22或酿酒酵母INVSc1(Invitrogen公司)。
本发明的又一方面涉及保有本发明的重组DNA的微生物(即转化体)。本发明的微生物可以通过使用了上述本发明的载体的转染或转化而得到。例如,可以利用氯化钙法(分子生物学杂志(J.Mol.Biol.),第53卷,第159页(1970))、Hanahan方法(分子生物学杂志,第166卷,第557页(1983))、SEM法(基因,第96卷,第23页(1990))、Chung等的方法(美国国家科学院论文集,第86卷,第2172页(1989))、磷酸钙共沉淀法、电穿孔(Potter,H.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81,7161-7165(1984)),脂质转染(Felgner,P.L.et al.,Proc.Na tl.Acad.Sci.U.S.A.84,7413-7417(1984))等来实施。应予说明,本发明的微生物能够用于生产本发明的修饰型酶。
(包含修饰型β-半乳糖苷酶的酶剂)
本发明的修饰型酶例如以酶剂的形态提供。酶剂除含有有效成分(本发明的修饰型酶)以外,还可以含有赋形剂、缓冲剂、悬浮剂、稳定剂、保存剂、防腐剂、生理食盐水等。作为赋形剂,可以使用淀粉、糊精、麦芽糖、海藻糖、乳糖、D-葡萄糖、山梨糖醇、D-甘露醇、白糖、甘油等。作为缓冲剂,可以使用磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐等。作为稳定剂,可以使用丙二醇、抗坏血酸等。作为保存剂,可以使用苯酚、苯扎氯铵、苄醇、氯丁醇、对羟基苯甲酸甲酯等。作为防腐剂,可以使用乙醇、苯扎氯铵、对羟基苯甲酸、氯丁醇等。
(修饰型β-半乳糖苷酶的用途)
本发明的又一方面提供修饰型酶或者酶剂的用途。用途的例子是低聚半乳糖的制造、用于乳糖不耐受症患者的药物、补充剂的制造·加工、乳制品(低乳糖牛奶等加工奶、奶粉(脱脂奶粉、婴儿奶粉等)、酸奶等)的制造·加工、医疗用食品(Medical Food)的制造·加工。
本发明的修饰型酶在制造低聚半乳糖方面特别有用。在低聚半乳糖的制造中,例如,向预先加热溶解的乳糖液(例如30%~50%的乳糖,pH 7.0)加入规定量(例如50U~1000U)的修饰型酶,在40℃左右放置1~10小时,生成低聚半乳糖。应予说明,低聚半乳糖由Gal-(Gal)n-Glc(n为0~5左右)表示(Gal:半乳糖残基,Glc:葡萄糖残基)。结合方式除β1-6、β1-3、β1-4、β1-2以外,还有α1-3、α1-6等。
如果利用特性不同的多种修饰型酶,则可以分别制作各种低聚半乳糖。这样的利用形态例如对于再现母乳中含有的低聚半乳糖的成分(低聚半乳糖的种类和比率)有效。
修饰型酶与野生型酶特性不同。因此,通过并用修饰型酶和野生型酶,能够制造单独的野生型酶无法制造(或者不适合其制造)的低聚半乳糖。如果并用特性不同的多种修饰型酶和野生型酶,能够进一步增加制造的低聚半乳糖的种类。这样修饰型酶(1种或2种以上)和野生型酶的并用对分别制作各种低聚半乳糖也是有效的。
应予说明,使用多种酶(多种修饰型酶的并用、或者野生型酶和1种或者2种以上的修饰型酶的并用)得到低聚半乳糖(多种低聚半乳糖的混合物)的方法大致有:将分别使用各酶制造的低聚半乳糖混合的方法;使多种酶同时作用于原料(乳糖)的方法;以及使多种酶分次作用于原料的方法。
实施例
<有效的变异位置的确定1>
1.目的
来自环状芽孢杆菌的β-半乳糖苷酶在工业的低聚半乳糖制造中是重要的酶,但使用它制造的低聚半乳糖均一性高,即便调整制造条件等,也难以使制造的低聚半乳糖的组成(成分)变化。以往,获取该酶的立体结构信息困难,与其功能有关的氨基酸的确定困难。因此,为了制造出对低聚半乳糖的制造有用的修饰型酶,通过利用计算机模拟尝试了有效的变异位置的确定。
2.方法·结果
(1)立体结构预测和变异体(修饰型β-半乳糖苷酶)的设计
(1-1)来自1级序列的立体结构预测和变异点的设计
来自环状芽孢杆菌的β-半乳糖苷酶进行乳糖的水解和半乳糖基转移反应(低聚半乳糖的制造)。根据目前的研究,已知环状芽孢杆菌生产的β-半乳糖苷酶由分子量不同的4种酶,即分子量195kD的β-半乳糖苷酶(BgaD-A,序列号1)、分子量160kD的β-半乳糖苷酶(BgaD-B,序列号2)、分子量135kD的β-半乳糖苷酶(BgaD-C,序列号3)、以及分子量86kD的β-半乳糖苷酶(BgaD-D,序列号4)构成(专利文献1、非专利文献1)。其中,分子量最小的BgaD-D是具有酶活性的最小尺寸的β-半乳糖苷酶,糖转移活性最高。
如上所述,难以获取来自环状芽孢杆菌的β-半乳糖苷酶的立体结构信息。因此,利用计算机模拟进行立体结构的预测。根据登录在数据库(Protein Data Bank(http://www.pdb.org/))的立体结构信息,提取具有β-半乳糖苷酶活性的酶的立体结构信息,检索与来自环状芽孢杆菌的β-半乳糖苷酶的1级序列具有同源性的立体结构。具体而言,以来自环状芽孢杆菌的β-半乳糖苷酶的1级序列为基准,探索预测同源性高的立体结构。其结果,找到3GM8(来自普通拟杆菌的β-糖苷酶(beta-glycosidase from Bacteroidesvulgatus))这样的结构(图1)。接下来,基于以3GM8为模板而模拟的立体结构,鉴定在活性中心的周围的环状序列。通过使用这样构建的立体结构模型,从构成来自环状芽孢杆菌的β-半乳糖苷酶的底物袋(基質ポケット)的氨基酸中,预测认为与底物接触的氨基酸。并且,着眼于环上的氨基酸来设计变异导入点。
(1-2)质粒构建和变异体的生产
将变异导入点的氨基酸随机置换。实际的变异导入是通过以编码BgaD-D型的DNA的质粒为模板的PCR进行的。对1处的变异导入点设计8~19种置换氨基酸,实际进行变异导入。设计与各变异对应的引物,使用KOD plus Mutagenesis kit(Toyobo公司)利用反向PCR法进行变异导入。根据制品的实验步骤(プロトコール),在使PCR产物自身连接后转化到大肠杆菌DH5alpha。通过小量提取(miniprep)得到质粒后确定序列,确定了变异。进一步转化到大肠杆菌BL21,按照以下的实验步骤使蛋白质(变异体)表达(图2)。
<实验步骤>
1.用1.5mL LB+amp进行预培养(37℃,一夜)
2.将0.06mL预培养后的培养液加入到3mL LB+amp
3.在37℃培养4小时
4.将试验管移到冰上,加入0.75μL 1M IPTG
5.在15℃培养24小时
6.集菌后用磷酸缓冲液(pH7.4)清洗
7.悬浮于0.25mL磷酸缓冲液(pH7.4)中
8.用超声波仪进行超声波粉碎(30秒×3次)
9.通过离心分离回收上清液
使用按照以上的方法制备的大肠杆菌提取液作为变异体(修饰型β-半乳糖苷酶)。
此外,为了确认活性,将变异体纯化。由于各变异体表达成在N端加HIS标签的融合蛋白,所以用镍柱HIS Trap HP1ml(GE Healthcare公司)进行纯化。各操作中使用的缓冲液如下。
结合用缓冲液(20mM磷酸钠,0.2M NaCl,20mM咪唑,pH 7.4)
溶出用缓冲液(10mM磷酸钠,0.1M NaCl,0.25M咪唑,pH 7.4)
用结合用缓冲液使其与柱结合后,用该缓冲液清洗。其后,用溶出用缓冲液将结合成分从柱溶出。以溶出组分为样品进行SDS-PAGE和水解活性的测定,确认酶的纯化度。
(1-3)水解活性的评价
水解测定法参考过去的文献(专利文献1)进行。作为底物,使用邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)、乳糖、异乳糖这3种,按照以下所示的方法测定各自的活性。
(a)LSU活性:ONPG法
使乳糖酶在pH 6.0,40℃下作用于ONPG(终浓度20mM)时,将在反应初始的1分钟内生成1μmol的ONP的酶量记为1LSU。
(b)LU活性:乳糖分解力法
使乳糖酶在pH 6.0,40℃下作用于乳糖(终浓度10%)时,将在反应初始的1分钟内生成1μmol的葡萄糖的酶量记为1LU。
(c)异乳糖分解活性:异乳糖分解力法
使乳糖酶在pH 6.0,40℃下作用于异乳糖(终浓度1%)时,将在反应初始的1分钟内生成1μmol的葡萄糖的酶量记为1U。
(d)1%乳糖分解活性:乳糖分解力法
使乳糖酶在pH 6.0,40℃下作用于乳糖(终浓度1%)时,将在反应初始的1分钟内生成1μmol的葡萄糖的酶量记为1U。
通过以上的测定,探索与野生型相比底物选择性变化的变异点。
(1-4)低聚半乳糖(GOS)合成活性的评价
低聚半乳糖(GOS)合成活性的评价是进行以高浓度乳糖液为底物的低聚糖合成反应,通过HPLC分析反应产物。根据目前的研究,报告过以乳糖为底物时,通过在最终浓度50%左右,pH6附近下进行酶反应,进行高收率的GOS合成(日本特开平11-18763号公报)。基于该报告中记载的方法(实施例2的方法)进行GOS合成。使用以下的柱分析生成的GOS的组成。
凝胶过滤柱:MCIGEL CK04S(三菱化成)
酰胺柱:NH2P-403E(昭和电工)
基于解析的结果,测定总糖量中的四糖的低聚糖的含有率、三糖以上的低聚糖的含有率、异乳糖的含有率并作成表。
(2)使对异乳糖的水解活性的降低或者提高的变异点
关于全变异体和野生型的重组表达酶,测定LSU活性、LU活性、异乳糖分解活性以及1%乳糖分解活性。最初,根据LSU活性和LU活性,除去酶活性消失的变异体。另一方面,根据乳糖的分解活性,异乳糖的分解活性也发生变化,因此利用“异乳糖分解活性÷1%乳糖分解活性”的值来评价对异乳糖的相对底物特异性,与野生型进行比较。
实际测定的结果是野生型酶中,“异乳糖分解活性÷1%乳糖分解活性”为0.02%。因此,选择满足以下条件的变异体作为对异乳糖的底物特异性变化的变异体(图3)。
条件1:异乳糖分解活性为50%以下,即“异乳糖分解活性÷1%乳糖分解活性”为野生型酶的1/2以下。
条件2:异乳糖分解活性为150%以上,即“异乳糖分解活性÷1%乳糖分解活性”为野生型酶的3/2以上。
满足条件1的变异体为以下的28个(图3(A))。
449位的酪氨酸(Y449):变异后的氨基酸(D、E、N、W)
531位的丝氨酸(S531):变异后的氨基酸(A、D、E、F、G、I、M、N、Q)
593位的色氨酸(W593):变异后的氨基酸(F)
602位的脯氨酸(P602):变异后的氨基酸(E、G)
604位的脯氨酸(P604):变异后的氨基酸(A、G、H、I、M、S、T、V、W、Y)
612位的赖氨酸(K612):变异后的氨基酸(M)
满足条件2的变异体为以下的14个(图3(B))。
187位的酪氨酸(Y187):变异后的氨基酸(D、E、G)
188位的丝氨酸(S188):变异后的氨基酸(P、T)
533位的丝氨酸(S533):变异后的氨基酸(M、Q)
602位的脯氨酸(P602):变异后的氨基酸(C、I、N、S、T、V)
612位的赖氨酸(K612):变异后的氨基酸(F)
根据以上的结果,判明了合计9个氨基酸与对异乳糖的水解活性的底物特异性有关。
(3)低聚半乳糖(GOS)的组成变化的变异点
关于全变异体和野生型的重组表达酶进行变异点的评价。选择满足以下条件的变异体作为GOS组成变化的变异体。首先,分析生成的GOS的组成,着眼于其成分的四糖低聚糖的含有率、三糖以上的低聚糖的含有率。实际测定的结果是野生型酶中四糖的含有率为10.8%,三糖以上的低聚糖的含有率为40.0%。因此,选出三糖的含有率为与野生型接近的值(即,低聚糖的合成量与野生型同等),但四糖的含有率有变化的变异点。即,选择满足以下条件的变异点。
条件3:三糖以上的含有率为与野生型酶同等的程度、四糖的含有率比野生型酶少。
条件4:三糖以上的含有率为与野生型酶同等的程度、四糖的含有率比野生型酶多。
满足条件3的变异体为以下的33个(图4(A))。
182位的脯氨酸(P182):变异后的氨基酸(L)
187位的酪氨酸(Y187):变异后的氨基酸(D、L)
188位的丝氨酸(S188):变异后的氨基酸(I)
405位的色氨酸(W405):变异后的氨基酸(A、D、E、G、H、L、N、S、T)
407位的谷氨酰胺(Q407):变异后的氨基酸(G、R)
449位的酪氨酸(Y449):变异后的氨基酸(E、I、Q、R、S)
483位的苏氨酸(T483):变异后的氨基酸(Q)
512位的丝氨酸(S512):变异后的氨基酸(F、T、V)
531位的丝氨酸(S531):变异后的氨基酸(P)
550位的天冬酰胺(N550):变异后的氨基酸(L、R、S)
602位的脯氨酸(P602):变异后的氨基酸(L、N、Q)
604位的脯氨酸(P604):变异后的氨基酸(I、M)
满足条件4的变异体为以下的8个(图4(B))。
483位的苏氨酸(T483):变异后的氨基酸(K、M、R)
512位的丝氨酸(S512):变异后的氨基酸(G、K)
551位的谷氨酰胺(Q551):变异后的氨基酸(N)
598位的酪氨酸(Y598):变异后的氨基酸(N)
615位的酪氨酸(Y615):变异后的氨基酸(T)
根据以上的结果,判明了合计9个氨基酸与四糖的生成量有关。
接下来,着眼于生成的GOS组成中的异乳糖的含有率和三糖以上的低聚糖的含有率。野生型酶中异乳糖含有率为3.58%,三糖以上的低聚糖的含有率为40.2%。因此,探索三糖的含有率为与野生型接近的值,但异乳糖含有率有变化的变异点。即,选择满足以下条件的变异点。
条件5:三糖以上的含有率为与野生型酶同等的程度、异乳糖含有率比野生型酶少。
条件6:三糖以上的含有率为与野生型酶同等的程度、异乳糖含有率比野生型酶多。
满足条件5的变异体为以下的14个(图5(A))。
405位的色氨酸(W405):变异后的氨基酸(A、D、S、T)
483位的苏氨酸(T483):变异后的氨基酸(M)
531位的丝氨酸(S531):变异后的氨基酸(D、F、G、L、K、M)
550位的天冬酰胺(N550):变异后的氨基酸(F)
598位的酪氨酸(Y598):变异后的氨基酸(F、H)
满足条件6的变异体为以下的45个(图5(B))。
182位的脯氨酸(P182):变异后的氨基酸(L、S)
187位的酪氨酸(Y187):变异后的氨基酸(D、E、N)
188位的丝氨酸(S188):变异后的氨基酸(E、G、I、N)
405位的色氨酸(W405):变异后的氨基酸(H)
406位的丙氨酸(A406):变异后的氨基酸(P)
407位的谷氨酰胺(Q407):变异后的氨基酸(A、F、G、K、R)
449位的酪氨酸(Y449):变异后的氨基酸(E、R)
483位的苏氨酸(T483):变异后的氨基酸(S、Q)
512位的丝氨酸(S512):变异后的氨基酸(G、T、V)
534位的丝氨酸(S534):变异后的氨基酸(K、Q)
550位的天冬酰胺(N550):变异后的氨基酸(A、G、K、L、M、R、S)
551位的谷氨酰胺(Q551):变异后的氨基酸(K、H)
602位的脯氨酸(P602):变异后的氨基酸(C、D、N)
609位的酪氨酸(Y609):变异后的氨基酸(D、Q、T)
612位的赖氨酸(K612):变异后的氨基酸(F、I)
615位的酪氨酸(Y615):变异后的氨基酸(E、I、T)
根据以上的结果,判明了合计19个氨基酸与异乳糖含量有关。
(4)BgaD-A型中的变异点
在(1-1)所示的方法中,进行了对活性中心的环结构施加变异这样的设计。然而,关于BgaD-A型,过去报告过与GOS合成相关的氨基酸。特别是报告过通过将1540位的色氨酸(W1540)置换成丙氨酸或者苯丙氨酸,低聚糖合成的最大收量增多(非专利文献1)。着眼于该报告,认为不仅是目前研究的活性中心附近的氨基酸,即便对仅存在于BgaD-A型中的氨基酸施加变异也能够使生成的GOS的组成变化。因此,实际实施了将1540位的色氨酸(W1540)置换成19种氨基酸的饱和变异导入。具体而言,以编码BgaD-A型的DNA(序列号5)的质粒为模板,用与(1-2)同样的技术将W1540置换成全部的氨基酸。另外,将质粒导入大肠杆菌使变异酶表达。此外,用与(1-4)同样的方法进行GOS合成反应,解析生成的GOS的组成中的四糖低聚糖的含有率、三糖以上的低聚糖的含有率。
测定的结果是野生型中四糖的含有率为10.4%,三糖以上的低聚糖的含有率为38.5%。因此,分析全部的变异体中四糖的含有率是否有变化。其结果,可知18个变异体中,四糖的含有率均比野生型酶多(图6)。具体而言,判明了以下所示的变异体中四糖的生成量增加。
1540位的色氨酸(W1540):变异后的氨基酸(A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V)
根据以上的结果,判明了不仅对活性中心的环结构导入变异,即便是对1540位的氨基酸导入变异,也有增加四糖的生成量的效果。
3.总结
(1)变异体中,发现了对具有β-1,6键的糖类的水解活性的降低或者提高(9处氨基酸;42个变异体)
(2)变异体中生产的低聚半乳糖中生成物的聚合度、支链的比例发生变化(四糖变化的变异点:15处氨基酸;41个变异体。支链变化的变异点:19处氨基酸;49个变异体)。
(3)野生型只能制造组成一样的低聚糖,但如果利用变异体,则能分别制作各种种类的低聚半乳糖。变异体例如可用于母乳成分的再现等。
(4)认为通过组合经过上述研究承认有效性的变异点,能够构建有用性更高的变异体。
<有效的变异位置的特定2>
经过进一步研究,结果进一步确定了有效的变异位置,获得了有用的变异体。以下,示出取得成功的变异体(修饰型酶)及其特征。应予说明,(A)、(B)、(D)~(N)是BgaD-D型的β-半乳糖苷酶(序列号4)的变异体,(C)是BgaD-A型的β-半乳糖苷酶(序列号1)的变异体。
(A)满足条件3的、实施了1处氨基酸置换的变异体(图7)
85位的色氨酸(W85)被置换成甘氨酸
91位的苯丙氨酸(F91)被置换成丙氨酸或者异亮氨酸
103位的酪氨酸(Y103)被置换成甘氨酸
134位的酪氨酸(Y134)被置换成甘氨酸
153位的酪氨酸(Y153)被置换成甘氨酸
182位的脯氨酸(P182)被置换成色氨酸或者酪氨酸
186位的色氨酸(W186)被置换成甲硫氨酸
192位的酪氨酸(Y192)被置换成甘氨酸
295位的酪氨酸(Y295)被置换成甘氨酸
345位的组氨酸(H345)被置换成甘氨酸
349位的甘氨酸(G349)被置换成色氨酸
402位的苯丙氨酸(F402)被置换成甘氨酸
407位的谷氨酰胺(Q407)被置换成异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸或者酪氨酸
479位的甘氨酸(G479)被置换成亮氨酸、脯氨酸或者谷氨酰胺
480位的谷氨酸(E480)被置换成天冬酰胺
482位的赖氨酸(K482)被置换成甲硫氨酸或者缬氨酸
483位的苏氨酸(T483)被置换成甘氨酸或者丝氨酸
484位的精氨酸(R484)被置换成苯丙氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺或者谷氨酰胺
485位的甘氨酸(G485)被置换成天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺或者苏氨酸
486位的天冬氨酸(D486)被置换成丙氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、苏氨酸、色氨酸或者酪氨酸
487位的赖氨酸(K487)被置换成半胱氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、精氨酸、苏氨酸、缬氨酸、色氨酸或者酪氨酸
488位的缬氨酸(V488)被置换成甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸或者酪氨酸
496位的酪氨酸(Y496)被置换成甘氨酸
512位的丝氨酸(S512)被置换成半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、谷氨酰胺或者色氨酸
513位的谷氨酸(E513)被置换成丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸或者缬氨酸
514位的天冬酰胺(N514)被置换成谷氨酸、亮氨酸或者赖氨酸
515位的天冬酰胺(N515)被置换成丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸或者缬氨酸
516位的酪氨酸(Y516)被置换成色氨酸
517位的天冬氨酸(D517)被置换成赖氨酸或者色氨酸
519位的酪氨酸(Y519)被置换成甘氨酸
533位的苏氨酸(T533)被置换成谷氨酸
547位的酪氨酸(Y547)被置换成甘氨酸
549位的酪氨酸(Y549)被置换成甘氨酸
555位的酪氨酸(Y555)被置换成甘氨酸
572位的精氨酸(R572)被置换成半胱氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸、色氨酸或者酪氨酸
573位的苏氨酸(T573)被置换成谷氨酸
598位的酪氨酸(Y598)被置换成组氨酸或者天冬酰胺
605位的酪氨酸(Y605)被置换成半胱氨酸、天冬氨酸、组氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、脯氨酸、精氨酸或者苏氨酸
606位的酪氨酸(Y606)被置换成丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸或者丝氨酸
609位的酪氨酸(Y609)被置换成谷氨酸、天冬酰胺或者丝氨酸
616位的苯丙氨酸(F616)被置换成甘氨酸
624位的苯丙氨酸(F624)被置换成甘氨酸
648位的色氨酸(W648)被置换成甘氨酸
650位的色氨酸(W650)被置换成甘氨酸
(B)满足条件4的、实施了1处氨基酸置换的变异体(图8)
76位的色氨酸(W76)被置换成甘氨酸
480位的谷氨酸(E480)被置换成谷氨酰胺
483位的苏氨酸(T483)被置换成色氨酸
485位的甘氨酸(G485)被置换成脯氨酸或者苏氨酸
484位的精氨酸(R484)被置换成丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸、酪氨酸或者赖氨酸
487位的赖氨酸(K487)被置换成甘氨酸或者脯氨酸
488位的缬氨酸(V488)被置换成脯氨酸
512位的丝氨酸(S512)被置换成亮氨酸或者甲硫氨酸
514位的天冬酰胺(N514)被置换成天冬氨酸
515位的天冬酰胺(N515)被置换成苯丙氨酸、精氨酸、色氨酸、酪氨酸或者赖氨酸
569位的甘氨酸(G569)被置换成赖氨酸、脯氨酸或者缬氨酸
596位的苯丙氨酸(F596)被置换成甘氨酸
(C)四糖的含有率变多的、实施了1处氨基酸置换的变异体(BgaD-A型的β-半乳糖苷酶的变异体)(图9)
487位的赖氨酸(K487)被置换成甘氨酸或者脯氨酸
514位的天冬酰胺(N514)被置换成色氨酸
515位的天冬酰胺(N515)被置换成赖氨酸或者色氨酸
(D)组合了满足条件3的置换和满足条件5的置换的变异体(图10)
188位的丝氨酸被置换成异亮氨酸且550位的天冬酰胺被置换成苯丙氨酸(S188I_N550F),
407位的谷氨酰胺被置换成精氨酸且550位的天冬酰胺被置换成苯丙氨酸(Q407R_N550F),
449位的酪氨酸被置换成谷氨酰胺且598位的酪氨酸被置换成组氨酸(Y449Q_Y598H),
550位的天冬酰胺被置换成苯丙氨酸且602位的脯氨酸被置换成谷氨酰胺(N550F_P602Q)
(E)组合了满足条件3的置换和满足条件6的置换的变异体(图10)
407位的谷氨酰胺被置换成精氨酸且449位的酪氨酸被置换成谷氨酸(Q407R_Y449E)
(F)组合了满足条件4的置换和满足条件5的置换的变异体(图10)
550位的天冬酰胺被置换成苯丙氨酸且598位的酪氨酸被置换成天冬酰胺(N550F_Y598N)
(G)组合了满足条件3的置换彼此的变异体(图10)
182位的脯氨酸被置换成亮氨酸且449位的酪氨酸被置换成谷氨酸(P182L_Y449E)
182位的脯氨酸被置换成亮氨酸且449位的酪氨酸被置换成谷氨酰胺(P182L_Y449Q)
187位的酪氨酸被置换成亮氨酸且407位的谷氨酰胺被置换成精氨酸(Y187L_Q407R)
187位的酪氨酸被置换成亮氨酸且449位的酪氨酸被置换成谷氨酸(Y187L_Y449E)
187位的酪氨酸被置换成亮氨酸且449位的酪氨酸被置换成谷氨酰胺(Y187L_Y449Q)
187位的酪氨酸被置换成亮氨酸且512位的丝氨酸被置换成半胱氨酸(Y187L_S512C)
187位的酪氨酸被置换成亮氨酸且512位的丝氨酸被置换成天冬酰胺(Y187L_S512N)
187位的酪氨酸被置换成亮氨酸且512位的丝氨酸被置换成苏氨酸(Y187L_S512T)
188位的丝氨酸被置换成异亮氨酸且407位的谷氨酰胺被置换成精氨酸(S188I_Q407R)
188位的丝氨酸被置换成异亮氨酸且449位的酪氨酸被置换成谷氨酰胺(S188I_Y449Q)
188位的丝氨酸被置换成异亮氨酸且483位的苏氨酸被置换成谷氨酸(S188I_T483E)
407位的谷氨酰胺被置换成亮氨酸且512位的丝氨酸被置换成缬氨酸(Q407L_S512V)
407位的谷氨酰胺被置换成精氨酸且483位的苏氨酸被置换成甘氨酸(Q407R_T483G)
407位的谷氨酰胺被置换成精氨酸且449位的酪氨酸被置换成谷氨酰胺(Q407R_Y449Q)
407位的谷氨酰胺被置换成精氨酸且550位的天冬酰胺被置换成丝氨酸(Q407R_N550S)
449位的酪氨酸被置换成谷氨酰胺且550位的天冬酰胺被置换成丝氨酸(Y449Q_N550S)
487位的赖氨酸被置换成色氨酸且512位的丝氨酸被置换成苏氨酸(K487W_S512T)
487位的赖氨酸被置换成色氨酸且517位的天冬氨酸被置换成赖氨酸(K487W_D517K)
487位的赖氨酸被置换成色氨酸且515位的天冬酰胺被置换成甘氨酸(K487W_N515G)
487位的赖氨酸被置换成色氨酸且517位的天冬氨酸被置换成色氨酸(K487W_D517W)
(H)组合了满足条件4的置换彼此的变异体(图10)
487位的赖氨酸被置换成脯氨酸且515位的天冬酰胺被置换成精氨酸(K487P_N515R)
(I)满足条件3的、实施了2处氨基酸置换的变异体(图11)
91位的苯丙氨酸被置换成丝氨酸且407位的谷氨酰胺被置换成甲硫氨酸(F91S_Q407M)
180位的苏氨酸被置换成缬氨酸且187位的酪氨酸被置换成亮氨酸(T180V_Y187L)
180位的苏氨酸被置换成缬氨酸且188位的丝氨酸被置换成异亮氨酸(T180V_S188I)
180位的苏氨酸被置换成缬氨酸且407位的谷氨酰胺被置换成精氨酸(T180V_Q407R)
180位的苏氨酸被置换成缬氨酸且449位的酪氨酸被置换成谷氨酸(T180V_Y449E)
180位的苏氨酸被置换成缬氨酸且483位的苏氨酸被置换成甘氨酸(T180V_T483G)
180位的苏氨酸被置换成缬氨酸且512位的丝氨酸被置换成缬氨酸(T180V_S512V)
180位的苏氨酸被置换成缬氨酸且550位的天冬酰胺被置换成苯丙氨酸(T180V_N550F)
180位的苏氨酸被置换成缬氨酸且615位的酪氨酸被置换成脯氨酸(T180V_Y615P)
182位的脯氨酸被置换成亮氨酸且376位的精氨酸被置换成脯氨酸(P182L_R376P)
182位的脯氨酸被置换成色氨酸且449位的酪氨酸被置换成谷氨酰胺(P182W_Y449Q)
187位的酪氨酸被置换成亮氨酸且487位的赖氨酸被置换成丙氨酸(Y187L_K487A)
187位的酪氨酸被置换成亮氨酸且512位的丝氨酸被置换成丙氨酸(Y187L_S512A)
187位的酪氨酸被置换成亮氨酸且533位的苏氨酸被置换成天冬酰胺(Y187L_T533N)
376位的精氨酸被置换成脯氨酸且407位的谷氨酰胺被置换成亮氨酸(R376P_Q407L)
376位的精氨酸被置换成脯氨酸且449位的酪氨酸被置换成谷氨酰胺(R376P_Y449Q)
376位的精氨酸被置换成脯氨酸且512位的丝氨酸被置换成缬氨酸(R376P_S512V)
376位的精氨酸被置换成脯氨酸且550位的天冬酰胺被置换成色氨酸(R376P_N550W)
376位的精氨酸被置换成脯氨酸且550位的天冬酰胺被置换成酪氨酸(R376P_N550Y)
407位的谷氨酰胺被置换成亮氨酸且533位的苏氨酸被置换成谷氨酸(Q407L_T533E)
407位的谷氨酰胺被置换成亮氨酸且570位的色氨酸被置换成酪氨酸(Q407L_W570Y)
407位的谷氨酰胺被置换成亮氨酸且615位的酪氨酸被置换成亮氨酸(Q407L_Y615L)
407位的谷氨酰胺被置换成精氨酸且615位的酪氨酸被置换成亮氨酸(Q407R_Y615L)
407位的谷氨酰胺被置换成精氨酸且615位的酪氨酸被置换成脯氨酸(Q407R_Y615P)
449位的酪氨酸被置换成天冬氨酸且598位的酪氨酸被置换成苯丙氨酸(Y449D_Y598F)
449位的酪氨酸被置换成谷氨酰胺且533位的苏氨酸被置换成谷氨酸(Y449Q_T533E)
449位的酪氨酸被置换成谷氨酰胺且615位的酪氨酸被置换成甘氨酸(Y449Q_Y615G)
449位的酪氨酸被置换成谷氨酰胺且615位的酪氨酸被置换成脯氨酸(Y449Q_Y615P)
483位的苏氨酸被置换成甘氨酸且512位的丝氨酸被置换成缬氨酸(T483G_S512V)
483位的苏氨酸被置换成甘氨酸且550位的天冬酰胺被置换成丝氨酸(T483G_N550S)
483位的苏氨酸被置换成甘氨酸且615位的酪氨酸被置换成亮氨酸(T483G_Y615L)
483位的苏氨酸被置换成谷氨酰胺且602位的脯氨酸被置换成谷氨酰胺(T483Q_P602Q)
484位的精氨酸被置换成组氨酸且487位的赖氨酸被置换成组氨酸(R484H_K487H)
484位的精氨酸被置换成色氨酸且487位的赖氨酸被置换成天冬氨酸(R484W_K487D)
484位的精氨酸被置换成色氨酸且575位的苏氨酸被置换成色氨酸(R484W_T575W)
485位的甘氨酸被置换成赖氨酸且488位的缬氨酸被置换成色氨酸(G485K_V488W)
485位的甘氨酸被置换成赖氨酸且516位的酪氨酸被置换成色氨酸(G485K_Y516W)
485位的甘氨酸被置换成赖氨酸且517位的天冬氨酸被置换成赖氨酸(G485K_D517K)
485位的甘氨酸被置换成赖氨酸且517位的天冬氨酸被置换成色氨酸(G485K_D517W)
485位的甘氨酸被置换成赖氨酸且569位的甘氨酸被置换成色氨酸(G485K_G569W)
485位的甘氨酸被置换成赖氨酸且571位的甘氨酸被置换成赖氨酸(G485K_G571K)
485位的甘氨酸被置换成赖氨酸且572位的精氨酸被置换成色氨酸(G485K_R572W)
485位的甘氨酸被置换成赖氨酸且573位的苏氨酸被置换成色氨酸(G485K_T573W)
485位的甘氨酸被置换成色氨酸且516位的酪氨酸被置换成色氨酸(G485W_Y516W)
485位的甘氨酸被置换成色氨酸且517位的天冬氨酸被置换成色氨酸(G485W_D517W)
485位的甘氨酸被置换成色氨酸且573位的苏氨酸被置换成赖氨酸(G485W_T573K)
485位的甘氨酸被置换成色氨酸且573位的苏氨酸被置换成色氨酸(G485W_T573W)
487位的赖氨酸被置换成丙氨酸且512位的丝氨酸被置换成缬氨酸(K487A_S512V)
487位的赖氨酸被置换成甘氨酸且515位的天冬酰胺被置换成谷氨酰胺(K487G_N515Q)
487位的赖氨酸被置换成色氨酸且573位的苏氨酸被置换成赖氨酸(K487W_T573K)
487位的赖氨酸被置换成色氨酸且593位的色氨酸被置换成苯丙氨酸(K487W_W593F)
488位的缬氨酸被置换成赖氨酸且514位的天冬酰胺被置换成赖氨酸(V488K_N514K)
488位的缬氨酸被置换成赖氨酸且517位的天冬氨酸被置换成赖氨酸(V488K_D517K)
488位的缬氨酸被置换成赖氨酸且569位的甘氨酸被置换成赖氨酸(V488K_G569K)
488位的缬氨酸被置换成赖氨酸且569位的甘氨酸被置换成色氨酸(V488K_G569W)
488位的缬氨酸被置换成赖氨酸且572位的精氨酸被置换成赖氨酸(V488K_R572K)
488位的缬氨酸被置换成赖氨酸且573位的苏氨酸被置换成赖氨酸(V488K_T573K)
488位的缬氨酸被置换成赖氨酸且573位的苏氨酸被置换成色氨酸(V488K_T573W)
488位的缬氨酸被置换成赖氨酸且516位的酪氨酸被置换成赖氨酸(V488K_Y516K)
488位的缬氨酸被置换成赖氨酸且516位的酪氨酸被置换成色氨酸(V488K_Y516W)
488位的缬氨酸被置换成色氨酸且514位的天冬酰胺被置换成色氨酸(V488W_N514W)
488位的缬氨酸被置换成色氨酸且573位的苏氨酸被置换成色氨酸(V488W_T573W)
500位的谷氨酸被置换成丙氨酸且501位的异亮氨酸被置换成丙氨酸(E500A_I501A)
512位的丝氨酸被置换成缬氨酸且550位的天冬酰胺被置换成丝氨酸(S512V_N550S)
533位的苏氨酸被置换成谷氨酸且550位的天冬酰胺被置换成丝氨酸(T533E_N550S)
533位的苏氨酸被置换成谷氨酸且615位的酪氨酸被置换成甘氨酸(T533E_Y615G)
570位的色氨酸被置换成酪氨酸且615位的酪氨酸被置换成亮氨酸(W570Y_Y615L)
(J)满足条件4的、实施了2处氨基酸置换的变异体(图11)
91位的苯丙氨酸被置换成缬氨酸且513位的谷氨酸被置换成甘氨酸(F91V_E513G)
180位的苏氨酸被置换成缬氨酸且483位的苏氨酸被置换成赖氨酸(T180V_T483K)
180位的苏氨酸被置换成缬氨酸且598位的酪氨酸被置换成天冬酰胺(T180V_Y598N)
180位的苏氨酸被置换成缬氨酸且615位的酪氨酸被置换成甘氨酸(T180V_Y615G)
182位的脯氨酸被置换成亮氨酸且615位的酪氨酸被置换成亮氨酸(P182L_Y615L)
376位的精氨酸被置换成脯氨酸且598位的酪氨酸被置换成天冬酰胺(R376P_Y598N)
407位的谷氨酰胺被置换成亮氨酸且483位的苏氨酸被置换成赖氨酸(Q407L_T483K)
407位的谷氨酰胺被置换成亮氨酸且487位的赖氨酸被置换成脯氨酸(Q407L_K487P)
407位的谷氨酰胺被置换成亮氨酸且615位的酪氨酸被置换成甘氨酸(Q407L_Y615G)
449位的酪氨酸被置换成谷氨酸且487位的赖氨酸被置换成丙氨酸(Y449E_K487A)
449位的酪氨酸被置换成谷氨酸且487位的赖氨酸被置换成脯氨酸(Y449E_K487P)
483位的苏氨酸被置换成甘氨酸且487位的赖氨酸被置换成丙氨酸(T483G_K487A)
483位的苏氨酸被置换成甘氨酸且533位的苏氨酸被置换成谷氨酸(T483G_T533E)
483位的苏氨酸被置换成甘氨酸且615位的酪氨酸被置换成甘氨酸(T483G_Y615G)
483位的苏氨酸被置换成甲硫氨酸且487位的赖氨酸被置换成丙氨酸(T483M_K487A)
483位的苏氨酸被置换成甲硫氨酸且487位的赖氨酸被置换成甘氨酸(T483M_K487G)
483位的苏氨酸被置换成甲硫氨酸且487位的赖氨酸被置换成脯氨酸(T483M_K487P)
484位的精氨酸被置换成组氨酸且487位的赖氨酸被置换成天冬氨酸(R484H_K487D)
484位的精氨酸被置换成赖氨酸且513位的谷氨酸被置换成色氨酸(R484K_E513W)
484位的精氨酸被置换成赖氨酸且514位的天冬酰胺被置换成赖氨酸(R484K_N514K)
484位的精氨酸被置换成赖氨酸且514位的天冬酰胺被置换成色氨酸(R484K_N514W)
484位的精氨酸被置换成赖氨酸且515位的天冬酰胺被置换成赖氨酸(R484K_N515K)
484位的精氨酸被置换成赖氨酸且515位的天冬酰胺被置换成色氨酸(R484K_N515W)
484位的精氨酸被置换成赖氨酸且517位的天冬氨酸被置换成色氨酸(R484K_D517W)
484位的精氨酸被置换成赖氨酸且569位的甘氨酸被置换成赖氨酸(R484K_G569K)
484位的精氨酸被置换成赖氨酸且571位的甘氨酸被置换成赖氨酸(R484K_G571K)
484位的精氨酸被置换成赖氨酸且572位的精氨酸被置换成赖氨酸(R484K_R572K)
484位的精氨酸被置换成赖氨酸且572位的精氨酸被置换成色氨酸(R484K_R572W)
484位的精氨酸被置换成赖氨酸且573位的苏氨酸被置换成赖氨酸(R484K_T573K)
484位的精氨酸被置换成赖氨酸且573位的苏氨酸被置换成色氨酸(R484K_T573W)
484位的精氨酸被置换成赖氨酸且516位的酪氨酸被置换成赖氨酸(R484K_Y516K)
484位的精氨酸被置换成色氨酸且515位的天冬酰胺被置换成赖氨酸(R484W_N515K)
485位的甘氨酸被置换成天冬氨酸且487位的赖氨酸被置换成组氨酸(G485D_K487H)
485位的甘氨酸被置换成赖氨酸且487位的赖氨酸被置换成组氨酸(G485K_K487H)
485位的甘氨酸被置换成赖氨酸且569位的甘氨酸被置换成赖氨酸(G485K_G569K)
485位的甘氨酸被置换成赖氨酸且514位的天冬酰胺被置换成赖氨酸(G485K_N514K)
485位的甘氨酸被置换成赖氨酸且515位的天冬酰胺被置换成赖氨酸(G485K_N515K)
485位的甘氨酸被置换成赖氨酸且515位的天冬酰胺被置换成色氨酸(G485K_N515W)
485位的甘氨酸被置换成精氨酸且487位的赖氨酸被置换成天冬氨酸(G485R_K487D)
485位的甘氨酸被置换成色氨酸且513位的谷氨酸被置换成色氨酸(G485W_E513W)
485位的甘氨酸被置换成色氨酸且515位的天冬酰胺被置换成赖氨酸(G485W_N515K)
485位的甘氨酸被置换成色氨酸且515位的天冬酰胺被置换成色氨酸(G485W_N515W)
487位的赖氨酸被置换成丙氨酸且531位的丝氨酸被置换成丙氨酸(K487A_S531A)
487位的赖氨酸被置换成丙氨酸且593位的色氨酸被置换成苯丙氨酸(K487A_W593F)
487位的赖氨酸被置换成丙氨酸且615位的酪氨酸被置换成亮氨酸(K487A_Y615L)
487位的赖氨酸被置换成色氨酸且514位的天冬酰胺被置换成赖氨酸(K487W_N514K)
487位的赖氨酸被置换成色氨酸且514位的天冬酰胺被置换成色氨酸(K487W_N514W)
487位的赖氨酸被置换成色氨酸且516位的酪氨酸被置换成色氨酸(K487W_Y516W)
487位的赖氨酸被置换成色氨酸且569位的甘氨酸被置换成赖氨酸(K487W_G569K)
487位的赖氨酸被置换成酪氨酸且515位的天冬酰胺被置换成苯丙氨酸(K487Y_N515F)
487位的赖氨酸被置换成酪氨酸且515位的天冬酰胺被置换成色氨酸(K487Y_N515W)
488位的缬氨酸被置换成赖氨酸且515位的天冬酰胺被置换成赖氨酸(V488K_N515K)
488位的缬氨酸被置换成赖氨酸且515位的天冬酰胺被置换成色氨酸(V488K_N515W)
488位的缬氨酸被置换成色氨酸且515位的天冬酰胺被置换成赖氨酸(V488W_N515K)
488位的缬氨酸被置换成色氨酸且515位的天冬酰胺被置换成色氨酸(V488W_N515W)
488位的缬氨酸被置换成酪氨酸且515位的天冬酰胺被置换成色氨酸(V488Y_N515W)
550位的天冬酰胺被置换成丝氨酸且598位的酪氨酸被置换成天冬酰胺(N550S_Y598N)
550位的天冬酰胺被置换成丝氨酸且615位的酪氨酸被置换成甘氨酸(N550S_Y615G)
550位的天冬酰胺被置换成丝氨酸且615位的酪氨酸被置换成亮氨酸(N550S_Y615L)
550位的天冬酰胺被置换成丝氨酸且615位的酪氨酸被置换成脯氨酸(N550S_Y615P)
(K)满足条件3的、实施了3处或4处氨基酸置换的变异体(图12)
484位的精氨酸被置换成丙氨酸、485位的甘氨酸被置换成丙氨酸且487位的赖氨酸被置换成天冬氨酸(R484A_G485A_K487D)
484位的精氨酸被置换成天冬氨酸、485位的甘氨酸被置换成天冬氨酸且487位的赖氨酸被置换成天冬氨酸(R484D_G485D_K487D)
485位的甘氨酸被置换成精氨酸、486位的天冬氨酸被置换成精氨酸且487位的赖氨酸被置换成赖氨酸精氨酸(G485R_D486R_K487R)
484位的精氨酸被置换成丙氨酸、485位的甘氨酸被置换成丙氨酸、486位的天冬氨酸被置换成丙氨酸且487位的赖氨酸被置换成丙氨酸(R484A_G485A_D486A_K487A)
484位的精氨酸被置换成丙氨酸、485位的甘氨酸被置换成丙氨酸、486位的天冬氨酸被置换成脯氨酸且487位的赖氨酸被置换成脯氨酸(R484A_G485A_D486P_K487P)
(L)满足条件4的、实施了3处或4处氨基酸置换的变异体(图12)
484位的精氨酸被置换成丙氨酸、485位的甘氨酸被置换成丙氨酸且487位的赖氨酸被置换成天冬氨酸(R484A_G485A_K487D)
484位的精氨酸被置换成半胱氨酸、486位的天冬氨酸被置换成组氨酸且487位的赖氨酸被置换成精氨酸(R484C_D486H_K487R)
485位的甘氨酸被置换成精氨酸、486位的天冬氨酸被置换成色氨酸且487位的赖氨酸被置换成色氨酸(G485R_D486W_K487W)
485位的甘氨酸被置换成精氨酸、486位的天冬氨酸被置换成丙氨酸且487位的赖氨酸被置换成丙氨酸(G485R_D486A_K487A)
485位的甘氨酸被置换成精氨酸、486位的天冬氨酸被置换成脯氨酸且487位的赖氨酸被置换成脯氨酸(G485R_D486P_K487P)
484位的精氨酸被置换成丙氨酸、485位的甘氨酸被置换成丙氨酸、486位的天冬氨酸被置换成丙氨酸且487位的赖氨酸被置换成丙氨酸(R484A_G485A_D486A_K487A)
484位的精氨酸被置换成丙氨酸、485位的甘氨酸被置换成丙氨酸、486位的天冬氨酸被置换成精氨酸且487位的赖氨酸被置换成精氨酸(R484A_G485A_D486R_K487R)
484位的精氨酸被置换成天冬氨酸、485位的甘氨酸被置换成天冬氨酸、486位的天冬氨酸被置换成精氨酸且487位的赖氨酸被置换成精氨酸(R484D_G485D_D486R_K487R)
484位的精氨酸被置换成天冬氨酸、485位的甘氨酸被置换成天冬氨酸、486位的天冬氨酸被置换成脯氨酸且487位的赖氨酸被置换成脯氨酸(R484D_G485D_D486P_K487P)
484位的精氨酸被置换成天冬氨酸、485位的甘氨酸被置换成天冬氨酸、486位的天冬氨酸被置换成丙氨酸且487位的赖氨酸被置换成丙氨酸(R484D_G485D_D486A_K487A)
484位的精氨酸被置换成天冬氨酸、485位的甘氨酸被置换成天冬氨酸、486位的天冬氨酸被置换成色氨酸且487位的赖氨酸被置换成色氨酸(R484D_G485D_D486W_K487W)
484位的精氨酸被置换成脯氨酸、485位的甘氨酸被置换成脯氨酸、486位的天冬氨酸被置换成精氨酸且487位的赖氨酸被置换成精氨酸(R484P_G485P_D486R_K487R)
(M)满足条件3的插入或者缺失变异体(图13)
Δ484-487
N514-F-F-N515
N514-W-W-N515
P604-W-W-Y605
P604-A-A-A-A-Y605
P604-F-F-F-F-Y605
(N)满足条件4的插入或者缺失变异体(图13)
Δ485_D486H
Δ485-486_K487R
Δ485-486_R484W_K487W
Δ485-486_R484P_K487P
R484-A-A-G485
R484-F-F-G485
R484-K-K-G485
R484-P-P-G485
R484-R-R-G485
R484-S-S-G485
R484-W-W-G485
G485-S-S-S-D486
R484-A-A-A-A-G485
R484-D-D-D-D-G485
R484-F-F-F-F-G485
R484-P-P-P-P-G485
R484-R-R-R-R-G485
R484-S-S-S-S-G485
R484-W-W-W-W-G485
R484-A-A-A-A-A-A-A-A-G485
R484-D-D-D-D-D-D-D-D-G485
R484-F-F-F-F-F-F-F-F-G485
R484-K-K-K-K-K-K-K-K-G485
R484-P-P-P-P-P-P-P-P-G485
工业上的可利用性
本发明的修饰型酶显示与野生型酶不同的酶学性质。假定有效利用该特性,用于分别制作各种各样的低聚半乳糖。特别是可期待将本发明用于再现单独的野生型酶无法实现的母乳中的低聚糖成分。另外,期待用于低聚糖的制造(合成)。此外,还可将本发明用在针对乳糖不耐受症患者的药物、补充剂的制造·加工、乳制品(低乳糖牛奶等加工奶、奶粉(脱脂奶粉、婴儿奶粉等)、酸奶等)的制造·加工、医疗用食品(Medical Food)的制造·加工等。
该发明不受上述发明的实施方式和实施例的说明的限制。在不脱离专利请求保护的范围的记载、本领域技术人员能够容易想到的范围内各种变形方式也属于该发明。本说明书中明示的论文、公开专利公报以及专利公报等内容通过援引其全部的内容而被引用。
Figure IDA0001001996980000011
Figure IDA0001001996980000021
Figure IDA0001001996980000031
Figure IDA0001001996980000041
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Figure IDA0001001996980000091
Figure IDA0001001996980000101
Figure IDA0001001996980000111
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Figure IDA0001001996980000211
Figure IDA0001001996980000221
Figure IDA0001001996980000231
Figure IDA0001001996980000241
Figure IDA0001001996980000251
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Figure IDA0001001996980000281
Figure IDA0001001996980000291
Figure IDA0001001996980000301
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Figure IDA0001001996980000321
Figure IDA0001001996980000331
Figure IDA0001001996980000341
Figure IDA0001001996980000351

Claims (7)

1.一种修饰型β-半乳糖苷酶,由将β-半乳糖苷酶中的85位的色氨酸(W85)、91位的苯丙氨酸(F91)、103位的酪氨酸(Y103)、134位的酪氨酸(Y134)、153位的酪氨酸(Y153)、182位的脯氨酸(P182)、186位的色氨酸(W186)、192位的酪氨酸(Y192)、295位的酪氨酸(Y295)、345位的组氨酸(H345)、349位的甘氨酸(G349)、402位的苯丙氨酸(F402)、407位的谷氨酰胺(Q407)、479位的甘氨酸(G479)、480位的谷氨酸(E480)、482位的赖氨酸(K482)、483位的苏氨酸(T483)、484位的精氨酸(R484)、485位的甘氨酸(G485)、486位的天冬氨酸(D486)、487位的赖氨酸(K487)、488位的缬氨酸(V488)、496位的酪氨酸(Y496)、512位的丝氨酸(S512)、513位的谷氨酸(E513)、514位的天冬酰胺(N514)、515位的天冬酰胺(N515)、516位的酪氨酸(Y516)、517位的天冬氨酸(D517)、519位的酪氨酸(Y519)、533位的苏氨酸(T533)、547位的酪氨酸(Y547)、549位的酪氨酸(Y549)、555位的酪氨酸(Y555)、572位的精氨酸(R572)、573位的苏氨酸(T573)、598位的酪氨酸(Y598)、605位的酪氨酸(Y605)、606位的酪氨酸(Y606)、609位的酪氨酸(Y609)、616位的苯丙氨酸(F616)、624位的苯丙氨酸(F624)、648位的色氨酸(W648)或650位的色氨酸(W650)置换成其它的氨基酸而得的氨基酸序列构成,其中,所述β-半乳糖苷酶由序列号1~4中任一个氨基酸序列构成,
85位的色氨酸(W85)的置换后的氨基酸是甘氨酸,91位的苯丙氨酸(F91)的置换后的氨基酸是丙氨酸或者异亮氨酸,103位的酪氨酸(Y103)的置换后的氨基酸是甘氨酸,134位的酪氨酸(Y134)的置换后的氨基酸是甘氨酸,153位的酪氨酸(Y153)的置换后的氨基酸是甘氨酸,182位的脯氨酸(P182)的置换后的氨基酸是色氨酸或者酪氨酸,186位的色氨酸(W186)的置换后的氨基酸是甲硫氨酸,192位的酪氨酸(Y192)的置换后的氨基酸是甘氨酸,295位的酪氨酸(Y295)的置换后的氨基酸是甘氨酸,345位的组氨酸(H345)的置换后的氨基酸是甘氨酸,349位的甘氨酸(G349)的置换后的氨基酸是色氨酸,402位的苯丙氨酸(F402)的置换后的氨基酸是甘氨酸,407位的谷氨酰胺(Q407)的置换后的氨基酸是异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸或者酪氨酸,479位的甘氨酸(G479)的置换后的氨基酸是亮氨酸、脯氨酸或者谷氨酰胺,480位的谷氨酸(E480)的置换后的氨基酸是天冬酰胺,482位的赖氨酸(K482)的置换后的氨基酸是甲硫氨酸或者缬氨酸,483位的苏氨酸(T483)的置换后的氨基酸是甘氨酸或者丝氨酸,484位的精氨酸(R484)的置换后的氨基酸是苯丙氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺或者谷氨酰胺,485位的甘氨酸(G485)的置换后的氨基酸是天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺或者苏氨酸,486位的天冬氨酸(D486)的置换后的氨基酸是丙氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、苏氨酸、色氨酸或者酪氨酸,487位的赖氨酸(K487)的置换后的氨基酸是半胱氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、精氨酸、苏氨酸、缬氨酸、色氨酸或者酪氨酸,488位的缬氨酸(V488)的置换后的氨基酸是甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸或者酪氨酸,496位的酪氨酸(Y496)的置换后的氨基酸是甘氨酸,512位的丝氨酸(S512)的置换后的氨基酸是半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、谷氨酰胺或者色氨酸,513位的谷氨酸(E513)的置换后的氨基酸是丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸或者缬氨酸,514位的天冬酰胺(N514)的置换后的氨基酸是谷氨酸、亮氨酸或者赖氨酸,515位的天冬酰胺(N515)的置换后的氨基酸是丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸或者缬氨酸,516位的酪氨酸(Y516)的置换后的氨基酸是色氨酸,517位的天冬氨酸(D517)的置换后的氨基酸是赖氨酸或者色氨酸,519位的酪氨酸(Y519)的置换后的氨基酸是甘氨酸,533位的苏氨酸(T533)的置换后的氨基酸是谷氨酸,547位的酪氨酸(Y547)的置换后的氨基酸是甘氨酸,549位的酪氨酸(Y549)的置换后的氨基酸是甘氨酸,555位的酪氨酸(Y555)的置换后的氨基酸是甘氨酸,572位的精氨酸(R572)的置换后的氨基酸是半胱氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸、色氨酸或者酪氨酸,573位的苏氨酸(T573)的置换后的氨基酸是谷氨酸,598位的酪氨酸(Y598)的置换后的氨基酸是组氨酸或者天冬酰胺,605位的酪氨酸(Y605)的置换后的氨基酸是半胱氨酸、天冬氨酸、组氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、脯氨酸、精氨酸或者苏氨酸,606位的酪氨酸(Y606)的置换后的氨基酸是丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸或者丝氨酸,609位的酪氨酸(Y609)的置换后的氨基酸是谷氨酸、天冬酰胺或者丝氨酸,616位的苯丙氨酸(F616)的置换后的氨基酸是甘氨酸,624位的苯丙氨酸(F624)的置换后的氨基酸是甘氨酸,648位的色氨酸(W648)的置换后的氨基酸是甘氨酸,650位的色氨酸(W650)的置换后的氨基酸是甘氨酸,生成三糖以上的含有率为与野生型酶同等的程度且四糖的含有率比野生型酶少的低聚糖。
2.一种基因,编码权利要求1所述的修饰型β-半乳糖苷酶。
3.一种重组DNA,包含权利要求2所述的基因。
4.一种微生物,保有权利要求3所述的重组DNA。
5.一种酶剂,包含权利要求1所述的修饰型β-半乳糖苷酶。
6.一种低聚糖的制造方法,其特征在于,使权利要求1所述的修饰型β-半乳糖苷酶作用于具有β-1,3键、β-1,4键以及β-1,6键中的至少一个的低聚糖或者多糖。
7.根据权利要求6所述的低聚糖的制造方法,其中,所述低聚糖为二糖。
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