KR20160062155A - 변형된 β-갈락토시다아제 - Google Patents
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Abstract
바실러스·서큐란스 유래의 β-갈락토시다아제의 유용성을 더욱 높이고, 새로운 용도로의 적용을 가능하게 한다. 서열번호 1∼4 중 어느 하나의 아미노산 서열, 또는 서열번호 1∼4 중 어느 하나로 나타내는 아미노산 서열과 90% 이상 동일한 아미노산 서열로 이루어지는 β-갈락토시다아제에 있어서, 182번째 프롤린(P182), 187번째 티로신(Y187), 188번째 세린(S188), 405번째 트립토판(W405), 406번째 알라닌(A406), 407번째 글루타민(Q407), 449번째 티로신(Y449), 483번째 트레오닌(T483), 512번째 세린(S512), 531번째 세린(S531), 533번째 세린(S533), 534번째 세린(S534), 550번째 아스파라긴(N550), 551번째 글루타민(Q551), 593번째 트립토판(W593), 598번째 티로신(Y598), 602번째 프롤린(P602), 604번째 프롤린(P604), 609번째 티로신(Y609), 612번째 리신(K612) 및 615번째 티로신(Y615)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 또는 2 이상의 아미노산, 또는 그것에 상당하는 아미노산을 다른 아미노산으로 치환한다.
Description
본 발명은 β-갈락토시다아제에 관한 것이다. 상세하게는, 바실러스·서큐란스(Bacillus circulans) 유래의 β-갈락토시다아제의 변형된 효소의 용도 등에 관한 것이다. 본 출원은, 2013년 9월 30일자에 출원된 일본 특허 출원 제2013-205097호에 기초한 우선권을 주장하는 것이며, 상기 특허 출원의 전 내용은 참조에 의해 원용된다.
β-갈락토시다아제(EC3.2.1.23)는, β-D-갈락토시드 결합을 가수분해하여 D-갈락토스를 유리하는 효소이며, 일반적으로 미생물 및 동식물 중에 널리 존재하고 있다. β-갈락토시다아제는 별명으로 락타아제라고도 한다. 또한, β-갈락토시다아제는 갈락토시드 결합을 전이시키는 능력도 가지고 있으며, 이 능력을 이용하여 갈락토올리고당(갈락토오스 잔기를 가지는 올리고당)을 제조하는 방법이 알려져 있다.
갈락토올리고당이란, 갈락토스의 직선형의 중합체 또는 분지된 중합체이며, 말단이 글루코오스인 것을 제외하고, 갈락토오스로 구성되어 있다. 갈락토올리고당은 모유에 포함되어 있지만, 그 다양한 갈락토올리고당의 혼합물인 것으로 보고되어 있다(비특허 문헌 1).
우라시마 등 화학과 생물 50, 7, (2012)
Song등 Biosci. Biotechnol. Biochem. 77. 73-79. (2013)
누룩곰팡이 아스퍼질러스·오리자에(Aspergillus oryzae), 효모 클루이베로마이세스·락티스(Kluyveromyces lactis), 클루이베로마이세스·마르키나스(K. marxinus)나 세균 바실러스·서큐란스(Bacillus circulans) 등이 β-갈락토시다아제를 발생하는 것으로 알려져 있다. 이 중에서, 바실러스·서큐란스 유래의 β-갈락토시다아제는 락토오스로부터 갈락토올리고당을 생성 가능한 효소이며, 공업적인 갈락토올리고당 제조에 있어서 중요한 효소이다(예를 들면, 「비오락타(BIOLACTA)」의 상품명으로 β-갈락토시다아제 제제가 판매되고 있다). 상기 효소로 제조되는 갈락토올리고당은 균일성이 높고, 또한, 제조 조건 등을 조정하더라도, 제조되는 갈락토올리고당은 조성(프로파일)를 변화시키는 것은 곤란했다. 이에, 본 발명은, 바실러스·서큐란스 유래의 β-갈락토시다아제의 유용성을 더욱 높이고, 새로운 용도(예를 들면, 야생형 효소에서는 제조할 수 없거나 또는 제조 효율이 낮은 올리고당의 제조)로의 적용을 가능하게 하기 위하여, 효소의 특이성을 임의로 변형한 변형된 β-갈락토시다아제를 제공하는 것을 주된 과제로 한다.
지금까지의 연구에서는, 바실러스·서큐란스 유래의 β-갈락토시다아제의 입체 구조 정보를 취득하는 것이 곤란하였고, 그 기능과 관련된 아미노산의 특정은 용이하지 않았다. 이에, 컴퓨터 시뮬레이션을 활용하여 입체 구조를 예측하고, 또한 특유의 도메인 구조에 주목하여, 특성의 변화에 유용한 아미노산 잔기를 선발하기로 했다. 선발한 아미노산 잔기 위치에 변이를 가함으로써 각종 변이체를 디자인하고, 그 특성을 조사한 결과, β-1,6 결합에 대한 가수분해 활성이 저하되어 있는 것이나 또는 향상되어 있는 것 등, 효소의 특이성이 분명하게 변화되어 있는 것을 인정했다. 즉, 효소의 특이성의 변형에 유용하며 또한 중요한 아미노산 잔기를 특정할 수 있고, 효소의 특이성이 변화된 복수의 변이체(변형된 효소)의 취득에 성공했다. 한편, 과거의 보고(비특허 문헌 2)에 주목하여 변이체를 설계하고, 그 특성을 상세하게 검토한 결과, 효소의 특이성의 변화에 유용한 다른 아미노산 잔기도 발견되었다.
그런데, 효과적인 2개의 아미노산 치환을 조합함으로써 상가적(相加的) 또는 상승적(相乘的) 효과가 생길 가능성이 높은 것은 많이 경험하는 바이다. 따라서, 특정에 성공한 변이 위치는 단독으로 한정되지 않고, 그 조합에 대해서도 특성의 변화에 유효하다고 할 수 있다.
상기 성과 및 고찰에 기초하여, 이하의 발명이 제공된다.
[1] 서열번호 1∼4 중 어느 하나의 아미노산 서열, 또는 서열번호 1∼4 중 어느 하나로 나타내는 아미노산 서열과 90% 이상 동일한 아미노산 서열로 이루어지는 β-갈락토시다아제에 있어서,
182번째 프롤린(P182), 187번째 티로신(Y187), 188번째 세린(S188), 405번째 트립토판(W405), 406번째 알라닌(A406), 407번째 글루타민(Q407), 449번째 티로신(Y449), 483번째 트레오닌(T483), 512번째 세린(S512), 531번째 세린(S531), 533번째 세린(S533), 534번째 세린(S534), 550번째 아스파라긴(N550), 551번째 글루타민(Q551), 593번째 트립토판(W593), 598번째 티로신(Y598), 602번째 프롤린(P602), 604번째 프롤린(P604), 609번째 티로신(Y609), 612번째 리신(K612) 및 615번째 티로신(Y615)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 또는 2 이상의 아미노산, 또는 그것에 상당하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열로 이루어지는 변형된 β-갈락토시다아제.
[2] 치환의 대상이 되는 1 또는 2 이상의 아미노산이, 449번째 티로신(Y449), 531번째 세린(S531), 593번째 트립토판(W593), 602번째 프롤린(P602), 604번째 프롤린(P604) 및 612번째 리신(K612)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는, [1]에 기재된 변형된 β-갈락토시다아제.
[3] 치환의 대상이 되는 1 또는 2 이상의 아미노산이, 187번째 티로신(Y187), 188번째 세린(S188), 533번째 세린(S533), 602번째 프롤린(P602) 및 612번째 리신(K612)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는, [1]에 기재된 변형된 β-갈락토시다아제.
[4] 치환의 대상이 되는 1 또는 2 이상의 아미노산이, 182번째 프롤린(P182), 187번째 티로신(Y187), 188번째 세린(S188), 405번째 트립토판(W405), 407번째 글루타민(Q407), 449번째 티로신(Y449), 483번째 트레오닌(T483), 512번째 세린(S512), 531번째 세린(S531), 550번째 아스파라긴(N550), 602번째 프롤린(P602) 및 604번째 프롤린(P604)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는, [1]에 기재된 변형된 β-갈락토시다아제.
[5] 치환의 대상이 되는 1 또는 2 이상의 아미노산이, 483번째 트레오닌(T483), 512번째 세린(S512), 551번째 글루타민(Q551), 598번째 티로신(Y598) 및 615번째 티로신(Y615)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는, [1]에 기재된 변형된 β-갈락토시다아제.
[6] 치환의 대상이 되는 1 또는 2 이상의 아미노산이, 405번째 트립토판(W405), 483번째 트레오닌(T483), 531번째 세린(S531), 550번째 아스파라긴(N550) 및 598번째 티로신(Y598)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는, [1]에 기재된 변형된 β-갈락토시다아제.
[7] 치환의 대상이 되는 1 또는 2 이상의 아미노산이, 182번째 프롤린(P182), 187번째 티로신(Y187), 188번째 세린(S188), 405번째 트립토판(W405), 406번째 알라닌(A406), 407번째 글루타민(Q407), 449번째 티로신(Y449), 483번째 트레오닌(T483), 512번째 세린(S512), 534번째 세린(S534), 550번째 아스파라긴(N550), 551번째 글루타민(Q551), 602번째 프롤린(P602), 609번째 티로신(Y609), 612번째 리신(K612) 및 615번째 티로신(Y615)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는, [1]에 기재된 변형된 β-갈락토시다아제.
[8] 449번째 티로신(Y449)에 대한 치환 후 아미노산은 아스파라긴산, 글루타민산, 아스파라긴 또는 트립토판이며, 531번째 세린(S531)에 대한 치환 후 아미노산은 알라닌, 아스파라긴산, 글루타민산, 페닐알라닌, 글리신, 이소류신, 메티오닌, 아스파라긴 또는 글루타민이며, 593번째 트립토판(W593)에 대한 치환 후 아미노산은 페닐알라닌이며, 602번째 프롤린(P602)에 대한 치환 후 아미노산은 글루타민산 또는 글리신이며, 604번째 프롤린(P604)에 대한 치환 후 아미노산은 알라닌, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 메티오닌, 세린, 트레오닌, 발린, 트립토판 또는 티로신이며, 612번째 리신(K612)에 대한 치환 후 아미노산은 메티오닌인, [2]에 기재된 변형된 β-갈락토시다아제.
[9] 187번째 티로신(Y187)에 대한 치환 후 아미노산은 아스파라긴산, 글루타민산 또는 글리신이며, 188번째 세린(S188)에 대한 치환 후 아미노산은 프롤린 또는 트레오닌이며, 533번째 세린(S533)에 대한 치환 후 아미노산은 메티오닌 또는 글루타민이며, 602번째 프롤린(P602)에 대한 치환 후 아미노산은 시스테인, 이소류신, 아스파라긴, 세린, 트레오닌 또는 발린이며, 612번째 리신(K612)에 대한 치환 후 아미노산은 페닐알라닌인, [3]에 기재된 변형된 β-갈락토시다아제.
[10] 182번째 프롤린(P182)에 대한 치환 후 아미노산은 류신이며, 187번째 티로신(Y187)에 대한 치환 후 아미노산은 아스파라긴산 또는 류신이며, 188번째 세린(S188)에 대한 치환 후 아미노산은 이소류신이며, 405번째 트립토판(W405)에 대한 치환 후 아미노산은 알라닌, 아스파라긴산, 글루타민산, 글리신, 히스티딘, 류신, 아스파라긴, 세린 또는 트레오닌이며, 407번째 글루타민(Q407)에 대한 치환 후 아미노산은 글리신 또는 아르기닌이며, 449번째 티로신(Y449)에 대한 치환 후 아미노산은 글루타민산, 이소류신, 글루타민, 아르기닌 또는 세린이며, 483번째 트레오닌(T483)에 대한 치환 후 아미노산은 글루타민이며, 512번째 세린(S512)에 대한 치환 후 아미노산은 페닐알라닌, 트레오닌 또는 발린이며, 531번째 세린(S531)에 대한 치환 후 아미노산은프로인이며, 550번째 아스파라긴(N550)에 대한 치환 후 아미노산은 류신, 아르기닌 또는 세린이며, 602번째 프롤린(P602)에 대한 치환 후 아미노산은 류신, 아스파라긴 또는 글루타민이며, 604번째 프롤린(P604)에 대한 치환 후 아미노산은 이소류신 또는 메티오닌인, [4]에 기재된 변형된 β-갈락토시다아제.
[11] 483번째 트레오닌(T483)에 대한 치환 후 아미노산은 리신, 메티오닌 또는 아르기닌이며, 512번째 세린(S512)에 대한 치환 후 아미노산은 글리신 또는 리신이며, 551번째 글루타민(Q551)에 대한 치환 후 아미노산은 아스파라긴이며, 598번째 티로신(Y598)에 대한 치환 후 아미노산은 아스파라긴이며, 615번째 티로신(Y615)에 대한 치환 후 아미노산은 트레오닌인, [5]에 기재된 변형된 β-갈락토시다아제.
[12] 405번째 트립토판(W405)에 대한 치환 후 아미노산은 알라닌, 아스파라긴산, 세린 또는 트레오닌이며, 483번째 트레오닌(T483)에 대한 치환 후 아미노산은 메티오닌이며, 531번째 세린(S531)에 대한 치환 후 아미노산은 아스파라긴산, 페닐알라닌, 글리신, 류신, 리신 또는 메티오닌이며, 550번째 아스파라긴(N550)에 대한 치환 후 아미노산은 페닐알라닌이며, 598번째 티로신(Y598)에 대한 치환 후 아미노산은 페닐알라닌 또는 히스티딘인, [6]에 기재된 변형된 β-갈락토시다아제.
[13] 182번째 프롤린(P182)에 대한 치환 후 아미노산은 류신 또는 세린이며, 187번째 티로신(Y187)에 대한 치환 후 아미노산은 아스파라긴산, 글루타민산 또는 아스파라긴이며, 188번째 세린(S188)에 대한 치환 후 아미노산은 글루타민산, 글리신, 이소류신 또는 아스파라긴이며, 405번째 트립토판(W405)에 대한 치환 후 아미노산은 히스티딘이며, 406번째 알라닌(A406)에 대한 치환 후 아미노산은 프롤린이며, 407번째 글루타민(Q407)에 대한 치환 후 아미노산은 알라닌, 페닐알라닌, 글리신, 리신 또는 아르기닌이며, 449번째 티로신(Y449)에 대한 치환 후 아미노산은 글루타민산 또는 아르기닌이며, 483번째 트레오닌(T483)에 대한 치환 후 아미노산은 세린 또는 글루타민이며, 512번째 세린(S512)에 대한 치환 후 아미노산은 글리신, 트레오닌 또는 발린이며, 534번째 세린(S534)에 대한 치환 후 아미노산은 리신 또는 글루타민이며, 550번째 아스파라긴(N550)에 대한 치환 후 아미노산은 알라닌, 글리신, 리신, 류신, 메티오닌, 아르기닌 또는 세린이며, 551번째 글루타민(Q551)에 대한 치환 후 아미노산은 리신 또는 히스티딘이며, 602번째 프롤린(P602)에 대한 치환 후 아미노산은 시스테인, 아스파라긴산 또는 아스파라긴이며, 609번째 티로신(Y609)에 대한 치환 후 아미노산은 아스파라긴산, 글루타민 또는 트레오닌이며, 612번째 리신(K612)에 대한 치환 후 아미노산은 페닐알라닌 또는 이소류신이며, 615번째 티로신(Y615)에 대한 치환 후 아미노산은 글루타민산, 이소류신 또는 트레오닌인, [7]에 기재된 변형된 β-갈락토시다아제.
[14] 상기 β-갈락토시다아제가 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지고, 상기 치환에 더하여, 1540번째 트립토판(W1540)이 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열로 이루어지는 [1]∼[13] 중 어느 한 항에 기재된 변형된 β-갈락토시다아제.
[15] 서열번호 1∼4 중 어느 하나의 아미노산 서열, 또는 서열번호 1∼4 중 어느 하나로 나타내는 아미노산 서열과 90% 이상 동일한 아미노산 서열로 이루어지는 β-갈락토시다아제에 있어서,
85번째 트립토판(W85), 91번째 페닐알라닌(F91), 103번째 티로신(Y103), 134번째 티로신(Y134), 153번째 티로신(Y153), 182번째 프롤린(P182), 186번째 트립토판(W186), 192번째 티로신(Y192), 295번째 티로신(Y295), 345번째 히스티딘(H345), 349번째 글리신(G349), 402번째 페닐알라닌(F402), 407번째 글루타민(Q407), 479번째 글리신(G479), 480번째 글루타민산(E480), 482번째 리신(K482), 483번째 트레오닌(T483), 484번째 아르기닌(R484), 485번째 글리신(G485), 486번째 아스파라긴산(D486), 487번째 리신(K487), 488번째 발린(V488), 496번째 티로신(Y496), 512번째 세린(S512), 513번째 글루타민산(E513), 514번째 아스파라긴(N514), 515번째 아스파라긴(N515), 516번째 티로신(Y516), 517번째 아스파라긴산(D517), 519번째 티로신(Y519), 533번째 트레오닌(T533), 547번째 티로신(Y547), 549번째 티로신(Y549), 555번째 티로신(Y555), 572번째 아르기닌(R572), 573번째 트레오닌(T573), 598번째 티로신(Y598), 605번째 티로신(Y605), 606번째 티로신(Y606), 609번째 티로신(Y609), 616번째 페닐알라닌(F616), 624번째 페닐알라닌(F624), 648번째 트립토판(W648) 및 650번째 트립토판(W650)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 또는 2 이상의 아미노산, 또는 그것에 상당하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열로 이루어지는 변형된 β-갈락토시다아제.
[16] 85번째 트립토판(W85)에 대한 치환 후 아미노산은 글리신이며, 91번째 페닐알라닌(F91)에 대한 치환 후 아미노산은 알라닌 또는 이소류신이며, 103번째 티로신(Y103)에 대한 치환 후 아미노산은 글리신이며, 134번째 티로신(Y134)에 대한 치환 후 아미노산은 글리신이며, 153번째 티로신(Y153)에 대한 치환 후 아미노산은 글리신이며, 182번째 프롤린(P182)에 대한 치환 후 아미노산은 트립토판 또는 티로신이며, 186번째 트립토판(W186)에 대한 치환 후 아미노산은 메티오닌이며, 192번째 티로신(Y192)에 대한 치환 후 아미노산은 글리신이며, 295번째 티로신(Y295)에 대한 치환 후 아미노산은 글리신이며, 345번째 히스티딘(H345)에 대한 치환 후 아미노산은 글리신이며, 349번째 글리신(G349)에 대한 치환 후 아미노산은 트립토판이며, 402번째 페닐알라닌(F402)에 대한 치환 후 아미노산은 글리신이며, 407번째 글루타민(Q407)에 대한 치환 후 아미노산은 이소류신, 류신, 메티오닌, 발린 또는 티로신이며, 479번째 글리신(G479)에 대한 치환 후 아미노산은 류신, 프롤린 또는 글루타민이며, 480번째 글루타민산(E480)에 대한 치환 후 아미노산은 아스파라긴이며, 482번째 리신(K482)에 대한 치환 후 아미노산은 메티오닌 또는 발린이며, 483번째 트레오닌(T483)에 대한 치환 후 아미노산은 글리신 또는 세린이며, 484번째 아르기닌(R484)에 대한 치환 후 아미노산은 페닐알라닌, 이소류신, 메티오닌, 아스파라긴 또는 글루타민이며, 485번째 글리신(G485)에 대한 치환 후 아미노산은 아스파라긴산, 아스파라긴, 글루타민 또는 트레오닌이며, 486번째 아스파라긴산(D486)에 대한 치환 후 아미노산은 알라닌, 글루타민산, 페닐알라닌, 이소류신, 리신, 류신, 메티오닌, 프롤린, 글루타민, 아르기닌, 트레오닌, 트립토판 또는 티로신이며, 487번째 리신(K487)에 대한 치환 후 아미노산은 시스테인, 글루타민산, 페닐알라닌, 히스티딘, 이소류신, 류신, 아스파라긴, 글루타민, 아르기닌, 트레오닌, 발린, 트립토판 또는 티로신이며, 488번째 발린(V488)에 대한 치환 후 아미노산은 글리신, 이소류신, 류신, 아르기닌, 세린, 트레오닌, 트립토판 또는 티로신이며, 496번째 티로신(Y496)에 대한 치환 후 아미노산은 글리신이며, 512번째 세린(S512)에 대한 치환 후 아미노산은 시스테인, 아스파라긴산, 글루타민산, 아스파라긴, 프롤린, 글루타민 또는 트립토판이며, 513번째 글루타민산(E513)에 대한 치환 후 아미노산은 알라닌, 시스테인, 아스파라긴산, 페닐알라닌, 글리신, 히스티딘, 리신, 류신, 메티오닌, 아스파라긴, 프롤린, 글루타민, 아르기닌, 세린, 트레오닌 또는 발린이며, 514번째 아스파라긴(N514)에 대한 치환 후 아미노산은 글루타민산, 류신 또는 리신이며, 515번째 아스파라긴(N515)에 대한 치환 후 아미노산은 알라닌, 아스파라긴산, 글루타민산, 글리신, 이소류신, 류신, 프롤린 또는 발린이며, 516번째 티로신(Y516)에 대한 치환 후 아미노산은 트립토판이며, 517번째 아스파라긴산(D517)에 대한 치환 후 아미노산은 리신 또는 트립토판이며, 519번째 티로신(Y519)에 대한 치환 후 아미노산은 글리신이며, 533번째 트레오닌(T533)에 대한 치환 후 아미노산은 글루타민산이며, 547번째 티로신(Y547)에 대한 치환 후 아미노산은 글리신이며, 549번째 티로신(Y549)에 대한 치환 후 아미노산은 글리신이며, 555번째 티로신(Y555)에 대한 치환 후 아미노산은 글리신이며, 572번째 아르기닌(R572)에 대한 치환 후 아미노산은 시스테인, 류신, 메티오닌, 트레오닌, 트립토판 또는 티로신이며, 573번째 트레오닌(T573)에 대한 치환 후 아미노산은 글루타민산이며, 598번째 티로신(Y598)에 대한 치환 후 아미노산은 히스티딘 또는 아스파라긴이며, 605번째 티로신(Y605)에 대한 치환 후 아미노산은 시스테인, 아스파라긴산, 히스티딘, 이소류신, 리신, 프롤린, 아르기닌 또는 트레오닌이며, 606번째 티로신(Y606)에 대한 치환 후 아미노산은 알라닌, 시스테인, 아스파라긴산, 글루타민산, 페닐알라닌, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 리신, 류신, 메티오닌 또는 세린이며, 609번째 티로신(Y609)에 대한 치환 후 아미노산은 글루타민산, 아스파라긴 또는 세린이며, 616번째 페닐알라닌(F616)에 대한 치환 후 아미노산은 글리신이며, 624번째 페닐알라닌(F624)에 대한 치환 후 아미노산은 글리신이며, 648번째 트립토판(W648)에 대한 치환 후 아미노산은 글리신이며, 650번째 트립토판(W650)에 대한 치환 후 아미노산은 글리신인, [15]에 기재된 변형된 β-갈락토시다아제.
[17] 서열번호 1∼4 중 어느 하나의 아미노산 서열, 또는 서열번호 1∼4 중 어느 하나로 나타내는 아미노산 서열과 90% 이상 동일한 아미노산 서열로 이루어지는 β-갈락토시다아제에 있어서,
76번째 트립토판(W76), 480번째 글루타민산(E480), 483번째 트레오닌(T483), 485번째 글리신(G485), 484번째 아르기닌(R484), 487번째 리신(K487), 488번째 발린(V488), 512번째 세린(S512), 514번째 아스파라긴(N514), 515번째 아스파라긴(N515), 569번째 글리신(G569) 및 596번째 페닐알라닌(F596)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 또는 2 이상의 아미노산, 또는 그것에 상당하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열로 이루어지는 변형된 β-갈락토시다아제.
[18] 76번째 트립토판(W76)에 대한 치환 후 아미노산은 글리신이며, 480번째 글루타민산(E480)에 대한 치환 후 아미노산은 글루타민이며, 483번째 트레오닌(T483)에 대한 치환 후 아미노산은 트립토판이며, 485번째 글리신(G485)에 대한 치환 후 아미노산은 프롤린 또는 트레오닌이며, 484번째 아르기닌(R484)에 대한 치환 후 아미노산은 알라닌, 시스테인, 아스파라긴산, 글리신, 프롤린, 세린, 티로신 또는 리신이며, 487번째 리신(K487)에 대한 치환 후 아미노산은 글리신 또는 프롤린이며, 488번째 발린(V488)에 대한 치환 후 아미노산은 프롤린이며, 512번째 세린(S512)에 대한 치환 후 아미노산은 류신 또는 메티오닌이며, 514번째 아스파라긴(N514)에 대한 치환 후 아미노산은 아스파라긴산이며, 515번째 아스파라긴(N515)에 대한 치환 후 아미노산은 페닐알라닌, 아르기닌, 트립토판, 티로신 또는 리신이며, 569번째 글리신(G569)에 대한 치환 후 아미노산은 리신, 프롤린 또는 발린이며, 596번째 페닐알라닌(F596)에 대한 치환 후 아미노산은 글리신인, [17]에 기재된 변형된 β-갈락토시다아제.
[19] 서열번호 1∼4 중 어느 하나의 아미노산 서열, 또는 서열번호 1∼4 중 어느 하나로 나타내는 아미노산 서열과 90% 이상 동일한 아미노산 서열로 이루어지는 β-갈락토시다아제에 있어서,
하기 중 어느 하나의 변형이 행해진 변형된 β-갈락토시다아제:
188번째 세린 또는 그것에 상당하는 아미노산이 이소류신으로 치환되고, 또한 550번째 아스파라긴 또는 그것에 상당하는 아미노산이 페닐알라닌으로 치환(S188I_N550F);
407번째 글루타민 또는 그것에 상당하는 아미노산이 아르기닌으로 치환되고, 또한 550번째 아스파라긴 또는 그것에 상당하는 아미노산이 페닐알라닌으로 치환(Q407R_N550F);
449번째 티로신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 글루타민으로 치환되고, 또한 598번째 티로신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 히스티딘으로 치환(Y449Q_Y598H);
550번째 아스파라긴 또는 그것에 상당하는 아미노산이 페닐알라닌으로 치환되고, 또한 602번째 프롤린 또는 그것에 상당하는 아미노산이 글루타민으로 치환(N550F_P602Q);
407번째 글루타민 또는 그것에 상당하는 아미노산이 아르기닌으로 치환되고, 또한 449번째 티로신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 글루타민산으로 치환(Q407R_Y449E);
550번째 아스파라긴 또는 그것에 상당하는 아미노산이 페닐알라닌으로 치환되고, 또한 598번째 티로신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 아스파라긴으로 치환(N550F_Y598N);
182번째 프롤린 또는 그것에 상당하는 아미노산이 류신으로 치환되고, 또한 449번째 티로신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 글루타민산으로 치환(P182L_Y449E);
182번째 프롤린 또는 그것에 상당하는 아미노산이 류신으로 치환되고, 또한 449번째 티로신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 글루타민으로 치환(P182L_Y449Q);
187번째 티로신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 류신으로 치환되고, 또한 407번째 글루타민 또는 그것에 상당하는 아미노산이 아르기닌으로 치환(Y187L_Q407R);
187번째 티로신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 류신으로 치환되고, 또한 449번째 티로신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 글루타민산으로 치환(Y187L_Y449E);
187번째 티로신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 류신으로 치환되고, 또한 449번째 티로신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 글루타민으로 치환(Y187L_Y449Q);
187번째 티로신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 류신으로 치환되고, 또한 512번째 세린 또는 그것에 상당하는 아미노산이 시스테인으로 치환(Y187L_S512C);
187번째 티로신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 류신으로 치환되고, 또한 512번째 세린 또는 그것에 상당하는 아미노산이 아스파라긴으로 치환(Y187L_S512N);
187번째 티로신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 류신으로 치환되고, 또한 512번째 세린 또는 그것에 상당하는 아미노산이 트레오닌으로 치환(Y187L_S512T);
188번째 세린 또는 그것에 상당하는 아미노산이 이소류신으로 치환되고, 또한 407번째 글루타민 또는 그것에 상당하는 아미노산이 아르기닌으로 치환(S188I_Q407R);
188번째 세린 또는 그것에 상당하는 아미노산이 이소류신으로 치환되고, 또한 449번째 티로신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 글루타민으로 치환(S188I_Y449Q);
188번째 세린 또는 그것에 상당하는 아미노산이 이소류신으로 치환되고, 또한 483번째 트레오닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 글루타민산으로 치환(S188I_T483E);
407번째 글루타민 또는 그것에 상당하는 아미노산이 류신으로 치환되고, 또한 512번째 세린 또는 그것에 상당하는 아미노산이 발린으로 치환(Q407L_S512V);
407번째 글루타민 또는 그것에 상당하는 아미노산이 아르기닌으로 치환되고, 또한 483번째 트레오닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 글리신으로 치환(Q407R_T483G);
407번째 글루타민 또는 그것에 상당하는 아미노산이 아르기닌으로 치환되고, 또한 449번째 티로신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 글루타민으로 치환(Q407R_Y449Q);
407번째 글루타민 또는 그것에 상당하는 아미노산이 아르기닌으로 치환되고, 또한 550번째 아스파라긴 또는 그것에 상당하는 아미노산이 세린으로 치환(Q407R_N550S);
449번째 티로신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 글루타민으로 치환되고, 또한 550번째 아스파라긴 또는 그것에 상당하는 아미노산이 세린으로 치환(Y449Q_N550S);
487번째 리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 트립토판으로 치환되고, 또한 512번째 세린 또는 그것에 상당하는 아미노산이 트레오닌으로 치환(K487W_S512T);
487번째 리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 트립토판으로 치환되고, 또한 517번째 아스파라긴산 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신으로 치환(K487W_D517K);
487번째 리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 트립토판으로 치환되고, 또한 515번째 아스파라긴 또는 그것에 상당하는 아미노산이 글리신으로 치환(K487W_N515G);
487번째 리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 트립토판으로 치환되고, 또한 517번째 아스파라긴산 또는 그것에 상당하는 아미노산이 트립토판으로 치환(K487W_D517W);
487번째 리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 프롤린으로 치환되고, 또한 515번째 아스파라긴 또는 그것에 상당하는 아미노산이 아르기닌으로 치환(K487P_N515R);
91번째 페닐알라닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 세린으로 치환되고, 또한 407번째 글루타민 또는 그것에 상당하는 아미노산이 메티오닌으로 치환(F91S_Q407M);
180번째 트레오닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 발린으로 치환되고, 또한 187번째 티로신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 류신으로 치환(T180V_Y187L);
180번째 트레오닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 발린으로 치환되고, 또한 188번째 세린 또는 그것에 상당하는 아미노산이 이소류신으로 치환(T180V_S188I);
180번째 트레오닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 발린으로 치환되고, 또한 407번째 글루타민 또는 그것에 상당하는 아미노산이 아르기닌으로 치환(T180V_Q407R);
180번째 트레오닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 발린으로 치환되고, 또한 449번째 티로신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 글루타민산으로 치환(T180V_Y449E);
180번째 트레오닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 발린으로 치환되고, 또한 483번째 트레오닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 글리신으로 치환(T180V_T483G);
180번째 트레오닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 발린으로 치환되고, 또한 512번째 세린 또는 그것에 상당하는 아미노산이 발린으로 치환(T180V_S512V);
180번째 트레오닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 발린으로 치환되고, 또한 550번째 아스파라긴 또는 그것에 상당하는 아미노산이 페닐알라닌으로 치환(T180V_N550F);
180번째 트레오닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 발린으로 치환되고, 또한 615번째 티로신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 프롤린으로 치환(T180V_Y615P);
182번째 프롤린 또는 그것에 상당하는 아미노산이 류신으로 치환되고, 또한 376번째 아르기닌의 또는 그것에 상당하는 아미노산이 프롤린으로 치환(P182L_R376P);
182번째 프롤린 또는 그것에 상당하는 아미노산이 트립토판으로 치환되고, 또한 449번째 티로신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 글루타민으로 치환(P182W_Y449Q);
187번째 티로신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 류신으로 치환되고, 또한 487번째 리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 알라닌으로 치환(Y187L_K487A);
187번째 티로신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 류신으로 치환되고, 또한 512번째 세린 또는 그것에 상당하는 아미노산이 알라닌으로 치환(Y187L_S512A);
187번째 티로신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 류신으로 치환되고, 또한 533번째 트레오닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 아스파라긴으로 치환(Y187L_T533N);
376번째 아르기닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 프롤린으로 치환되고, 또한 407번째 글루타민 또는 그것에 상당하는 아미노산이 류신으로 치환(R376P_Q407L);
376번째 아르기닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 프롤린으로 치환되고, 또한 449번째 티로신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 글루타민으로 치환(R376P_Y449Q);
376번째 아르기닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 프롤린으로 치환되고, 또한 512번째 세린 또는 그것에 상당하는 아미노산이 발린으로 치환(R376P_S512V);
376번째 아르기닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 프롤린으로 치환되고, 또한 550번째 아스파라긴 또는 그것에 상당하는 아미노산이 트립토판으로 치환(R376P_N550W);
376번째 아르기닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 프롤린으로 치환되고, 또한 550번째 아스파라긴 또는 그것에 상당하는 아미노산이 티로신으로 치환(R376P_N550Y);
407번째 글루타민 또는 그것에 상당하는 아미노산이 류신으로 치환되고, 또한 533번째 트레오닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 글루타민산으로 치환(Q407L_T533E);
407번째 글루타민 또는 그것에 상당하는 아미노산이 류신으로 치환되고, 또한 570번째 트립토판 또는 그것에 상당하는 아미노산이 티로신으로 치환(Q407L_W570Y);
407번째 글루타민 또는 그것에 상당하는 아미노산이 류신으로 치환되고, 또한 615번째 티로신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 류신으로 치환(Q407L_Y615L);
407번째 글루타민 또는 그것에 상당하는 아미노산이 아르기닌으로 치환되고, 또한 615번째 티로신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 류신으로 치환(Q407R_Y615L);
407번째 글루타민 또는 그것에 상당하는 아미노산이 아르기닌으로 치환되고, 또한 615번째 티로신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 프롤린으로 치환(Q407R_Y615P);
449번째 티로신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 아스파라긴산으로 치환되고, 또한 598번째 티로신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 페닐알라닌으로 치환(Y449D_Y598F);
449번째 티로신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 글루타민으로 치환되고, 또한 533번째 트레오닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 글루타민산으로 치환(Y449Q_T533E);
449번째 티로신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 글루타민으로 치환되고, 또한 615번째 티로신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 글리신으로 치환(Y449Q_Y615G);
449번째 티로신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 글루타민으로 치환되고, 또한 615번째 티로신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 프롤린으로 치환(Y449Q_Y615P);
483번째 트레오닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 글리신으로 치환되고, 또한 512번째 세린 또는 그것에 상당하는 아미노산이 발린으로 치환(T483G_S512V);
483번째 트레오닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 글리신으로 치환되고, 또한 550번째 아스파라긴 또는 그것에 상당하는 아미노산이 세린으로 치환(T483G_N550S);
483번째 트레오닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 글리신으로 치환되고, 또한 615번째 티로신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 류신으로 치환(T483G_Y615L);
483번째 트레오닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 글루타민으로 치환되고, 또한 602번째 프롤린 또는 그것에 상당하는 아미노산이 글루타민으로 치환(T483Q_P602Q);
484번째 아르기닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 히스티딘으로 치환되고, 또한 487번째 리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 히스티딘으로 치환(R484H_K487H);
484번째 아르기닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 트립토판으로 치환되고, 또한 487번째 리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 아스파라긴산으로 치환(R484W_K487D);
484번째 아르기닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 트립토판으로 치환되고, 또한 575번째 트레오닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 트립토판으로 치환(R484W_T575W);
485번째 글리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신으로 치환되고, 또한 488번째 발린 또는 그것에 상당하는 아미노산이 트립토판으로 치환(G485K_V488W);
485번째 글리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신으로 치환되고, 또한 516번째 티로신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 트립토판으로 치환(G485K_Y516W);
485번째 글리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신으로 치환되고, 또한 517번째 아스파라긴산 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신으로 치환(G485K_D517K);
485번째 글리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신으로 치환되고, 또한 517번째 아스파라긴산 또는 그것에 상당하는 아미노산이 트립토판으로 치환(G485K_D517W);
485번째 글리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신으로 치환되고, 또한 569번째 글리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 트립토판으로 치환(G485K_G569W);
485번째 글리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신으로 치환되고, 또한 571번째 글리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신으로 치환(G485K_G571K);
485번째 글리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신으로 치환되고, 또한 572번째 아르기닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 트립토판으로 치환(G485K_R572W);
485번째 글리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신으로 치환되고, 또한 573번째 트레오닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 트립토판으로 치환(G485K_T573W);
485번째 글리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 트립토판으로 치환되고, 또한 516번째 티로신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 트립토판으로 치환(G485W_Y516W);
485번째 글리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 트립토판으로 치환되고, 또한 517번째 아스파라긴산 또는 그것에 상당하는 아미노산이 트립토판으로 치환(G485W_D517W);
485번째 글리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 트립토판으로 치환되고, 또한 573번째 트레오닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신으로 치환(G485W_T573K);
485번째 글리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 트립토판으로 치환되고, 또한 573번째 트레오닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 트립토판으로 치환(G485W_T573W);
487번째 리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 알라닌으로 치환되고, 또한 512번째 세린 또는 그것에 상당하는 아미노산이 발린으로 치환(K487A_S512V);
487번째 리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 글리신으로 치환되고, 또한 515번째 아스파라긴 또는 그것에 상당하는 아미노산이 글루타민으로 치환(K487G_N515Q);
487번째 리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 트립토판으로 치환되고, 또한 573번째 트레오닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신으로 치환(K487W_T573K);
487번째 리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 트립토판으로 치환되고, 또한 593번째 트립토판 또는 그것에 상당하는 아미노산이 페닐알라닌으로 치환(K487W_W593F);
488번째 발린 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신으로 치환되고, 또한 514번째 아스파라긴 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신으로 치환(V488K_N514K);
488번째 발린 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신으로 치환되고, 또한 517번째 아스파라긴산 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신으로 치환(V488K_D517K);
488번째 발린 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신으로 치환되고, 또한 569번째 글리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신으로 치환(V488K_G569K);
488번째 발린 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신으로 치환되고, 또한 569번째 글리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 트립토판으로 치환(V488K_G569W);
488번째 발린 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신으로 치환되고, 또한 572번째 아르기닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신으로 치환(V488K_R572K);
488번째 발린 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신으로 치환되고, 또한 573번째 트레오닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신으로 치환(V488K_T573K);
488번째 발린 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신으로 치환되고, 또한 573번째 트레오닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 트립토판으로 치환(V488K_T573W);
488번째 발린 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신으로 치환되고, 또한 516번째 티로신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신으로 치환(V488K_Y516K);
488번째 발린 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신으로 치환되고, 또한 516번째 티로신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 트립토판으로 치환(V488K_Y516W);
488번째 발린 또는 그것에 상당하는 아미노산이 트립토판으로 치환되고, 또한 514번째 아스파라긴 또는 그것에 상당하는 아미노산이 트립토판으로 치환(V488W_N514W);
488번째 발린 또는 그것에 상당하는 아미노산이 트립토판으로 치환되고, 또한 573번째 트레오닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 트립토판으로 치환(V488W_T573W);
500번째 글루타민산 또는 그것에 상당하는 아미노산이 알라닌으로 치환되고, 또한 501번째 이소류신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 알라닌으로 치환(E500A_I501A);
512번째 세린 또는 그것에 상당하는 아미노산이 발린으로 치환되고, 또한 550번째 아스파라긴 또는 그것에 상당하는 아미노산이 세린으로 치환(S512V_N550S);
533번째 트레오닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 글루타민산으로 치환되고, 또한 550번째 아스파라긴 또는 그것에 상당하는 아미노산이 세린으로 치환(T533E_N550S);
533번째 트레오닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 글루타민산으로 치환되고, 또한 615번째 티로신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 글리신으로 치환(T533E_Y615G);
570번째 트립토판 또는 그것에 상당하는 아미노산이 티로신으로 치환되고, 또한 615번째 티로신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 류신으로 치환(W570Y_Y615L);
91번째 페닐알라닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 발린으로 치환되고, 또한 513번째 글루타민산 또는 그것에 상당하는 아미노산이 글리신으로 치환(F91V_E513G);
180번째 트레오닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 발린으로 치환되고, 또한 483번째 트레오닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신으로 치환(T180V_T483K);
180번째 트레오닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 발린으로 치환되고, 또한 598번째 티로신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 아스파라긴으로 치환(T180V_Y598N);
180번째 트레오닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 발린으로 치환되고, 또한 615번째 티로신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 글리신으로 치환(T180V_Y615G);
182번째 프롤린 또는 그것에 상당하는 아미노산이 류신으로 치환되고, 또한 615번째 티로신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 류신으로 치환(P182L_Y615L);
376번째 아르기닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 프롤린으로 치환되고, 또한 598번째 티로신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 아스파라긴으로 치환(R376P_Y598N);
407번째 글루타민 또는 그것에 상당하는 아미노산이 류신으로 치환되고, 또한 483번째 트레오닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신으로 치환(Q407L_T483K);
407번째 글루타민 또는 그것에 상당하는 아미노산이 류신으로 치환되고, 또한 487번째 리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 프롤린으로 치환(Q407L_K487P);
407번째 글루타민 또는 그것에 상당하는 아미노산이 류신으로 치환되고, 또한 615번째 티로신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 글리신으로 치환(Q407L_Y615G);
449번째 티로신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 글루타민산으로 치환되고, 또한 487번째 리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 알라닌으로 치환(Y449E_K487A);
449번째 티로신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 글루타민산으로 치환되고, 또한 487번째 리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 프롤린으로 치환(Y449E_K487P);
483번째 트레오닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 글리신으로 치환되고, 또한 487번째 리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 알라닌으로 치환(T483G_K487A);
483번째 트레오닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 글리신으로 치환되고, 또한 533번째 트레오닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 글루타민산으로 치환(T483G_T533E);
483번째 트레오닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 글리신으로 치환되고, 또한 615번째 티로신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 글리신으로 치환(T483G_Y615G);
483번째 트레오닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 메티오닌으로 치환되고, 또한 487번째 리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 알라닌으로 치환(T483M_K487A);
483번째 트레오닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 메티오닌으로 치환되고, 또한 487번째 리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 글리신으로 치환(T483M_K487G);
483번째 트레오닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 메티오닌으로 치환되고, 또한 487번째 리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 프롤린으로 치환(T483M_K487P);
484번째 아르기닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 히스티딘으로 치환되고, 또한 487번째 리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 아스파라긴산으로 치환(R484H_K487D);
484번째 아르기닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신으로 치환되고, 또한 513번째 글루타민산 또는 그것에 상당하는 아미노산이 트립토판으로 치환(R484K_E513W);
484번째 아르기닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신으로 치환되고, 또한 514번째 아스파라긴 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신으로 치환(R484K_N514K);
484번째 아르기닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신으로 치환되고, 또한 514번째 아스파라긴 또는 그것에 상당하는 아미노산이 트립토판으로 치환(R484K_N514W);
484번째 아르기닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신으로 치환되고, 또한 515번째 아스파라긴 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신으로 치환(R484K_N515K);
484번째 아르기닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신으로 치환되고, 또한 515번째 아스파라긴 또는 그것에 상당하는 아미노산이 트립토판으로 치환(R484K_N515W);
484번째 아르기닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신으로 치환되고, 또한 517번째 아스파라긴산 또는 그것에 상당하는 아미노산이 트립토판으로 치환(R484K_D517W);
484번째 아르기닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신으로 치환되고, 또한 569번째 글리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신으로 치환(R484K_G569K);
484번째 아르기닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신으로 치환되고, 또한 571번째 글리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신으로 치환(R484K_G571K);
484번째 아르기닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신으로 치환되고, 또한 572번째 아르기닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신으로 치환(R484K_R572K);
484번째 아르기닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신으로 치환되고, 또한 572번째 아르기닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 트립토판으로 치환(R484K_R572W);
484번째 아르기닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신으로 치환되고, 또한 573번째 트레오닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신으로 치환(R484K_T573K);
484번째 아르기닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신으로 치환되고, 또한 573번째 트레오닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 트립토판으로 치환(R484K_T573W);
484번째 아르기닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신으로 치환되고, 또한 516번째 티로신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신으로 치환(R484K_Y516K);
484번째 아르기닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 트립토판으로 치환되고, 또한 515번째 아스파라긴 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신으로 치환(R484W_N515K);
485번째 글리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 아스파라긴산으로 치환되고, 또한 487번째 리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 히스티딘으로 치환(G485D_K487H);
485번째 글리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신으로 치환되고, 또한 487번째 리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 히스티딘으로 치환(G485K_K487H);
485번째 글리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신으로 치환되고, 또한 569번째 글리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신으로 치환(G485K_G569K);
485번째 글리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신으로 치환되고, 또한 514번째 아스파라긴 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신으로 치환(G485K_N514K);
485번째 글리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신으로 치환되고, 또한 515번째 아스파라긴 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신으로 치환(G485K_N515K);
485번째 글리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신으로 치환되고, 또한 515번째 아스파라긴 또는 그것에 상당하는 아미노산이 트립토판으로 치환(G485K_N515W);
485번째 글리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 아르기닌으로 치환되고, 또한 487번째 리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 아스파라긴산으로 치환(G485R_K487D);
485번째 글리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 트립토판으로 치환되고, 또한 513번째 글루타민산 또는 그것에 상당하는 아미노산이 트립토판으로 치환(G485W_E513W);
485번째 글리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 트립토판으로 치환되고, 또한 515번째 아스파라긴 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신으로 치환(G485W_N515K);
485번째 글리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 트립토판으로 치환되고, 또한 515번째 아스파라긴 또는 그것에 상당하는 아미노산이 트립토판으로 치환(G485W_N515W);
487번째 리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 알라닌으로 치환되고, 또한 531번째 세린 또는 그것에 상당하는 아미노산이 알라닌으로 치환(K487A_S531A);
487번째 리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 알라닌으로 치환되고, 또한 593번째 트립토판 또는 그것에 상당하는 아미노산이 페닐알라닌으로 치환(K487A_W593F);
487번째 리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 알라닌으로 치환되고, 또한 615번째 티로신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 류신으로 치환(K487A_Y615L);
487번째 리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 트립토판으로 치환되고, 또한 514번째 아스파라긴 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신으로 치환(K487W_N514K);
487번째 리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 트립토판으로 치환되고, 또한 514번째 아스파라긴 또는 그것에 상당하는 아미노산이 트립토판으로 치환(K487W_N514W);
487번째 리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 트립토판으로 치환되고, 또한 516번째 티로신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 트립토판으로 치환(K487W_Y516W);
487번째 리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 트립토판으로 치환되고, 또한 569번째 글리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신으로 치환(K487W_G569K);
487번째 리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 티로신으로 치환되고, 또한 515번째 아스파라긴 또는 그것에 상당하는 아미노산이 페닐알라닌으로 치환(K487Y_N515F);
487번째 리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 티로신으로 치환되고, 또한 515번째 아스파라긴 또는 그것에 상당하는 아미노산이 트립토판으로 치환(K487Y_N515W);
488번째 발린 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신으로 치환되고, 또한 515번째 아스파라긴 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신으로 치환(V488K_N515K);
488번째 발린 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신으로 치환되고, 또한 515번째 아스파라긴 또는 그것에 상당하는 아미노산이 트립토판으로 치환(V488K_N515W);
488번째 발린 또는 그것에 상당하는 아미노산이 트립토판으로 치환되고, 또한 515번째 아스파라긴 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신으로 치환(V488W_N515K);
488번째 발린 또는 그것에 상당하는 아미노산이 트립토판으로 치환되고, 또한 515번째 아스파라긴 또는 그것에 상당하는 아미노산이 트립토판으로 치환(V488W_N515W);
488번째 발린 또는 그것에 상당하는 아미노산이 티로신으로 치환되고, 또한 515번째 아스파라긴 또는 그것에 상당하는 아미노산이 트립토판으로 치환(V488Y_N515W);
550번째 아스파라긴 또는 그것에 상당하는 아미노산이 세린으로 치환되고, 또한 598번째 티로신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 아스파라긴으로 치환(N550S_Y598N);
550번째 아스파라긴 또는 그것에 상당하는 아미노산이 세린으로 치환되고, 또한 615번째 티로신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 글리신으로 치환(N550S_Y615G);
550번째 아스파라긴 또는 그것에 상당하는 아미노산이 세린으로 치환되고, 또한 615번째 티로신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 류신으로 치환(N550S_Y615L);
550번째 아스파라긴 또는 그것에 상당하는 아미노산이 세린으로 치환되고, 또한 615번째 티로신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 프롤린으로 치환(N550S_Y615P);
484번째 아르기닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 알라닌으로 치환되고, 485번째 글리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 알라닌으로 치환되고, 또한 487번째 리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 아스파라긴산으로 치환(R484A_G485A_K487D);
484번째 아르기닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 아스파라긴산으로 치환되고, 485번째 글리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 아스파라긴산으로 치환되고, 또한 487번째 리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 아스파라긴산으로 치환(R484D_G485D_K487D);
485번째 글리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 아르기닌으로 치환되고, 486번째 아스파라긴산 또는 그것에 상당하는 아미노산이 아르기닌으로 치환되고, 또한 487번째 리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신아르기닌으로 치환(G485R_D486R_K487R);
484번째 아르기닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 알라닌으로 치환되고, 485번째 글리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 알라닌으로 치환되고, 486번째 아스파라긴산 또는 그것에 상당하는 아미노산이 알라닌으로 치환되고, 또한 487번째 리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 알라닌으로 치환(R484A_G485A_D486A_K487A);
484번째 아르기닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 알라닌으로 치환되고, 485번째 글리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 알라닌으로 치환되고, 486번째 아스파라긴산 또는 그것에 상당하는 아미노산이 프롤린으로 치환되고, 또한 487번째 리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 프롤린으로 치환(R484A_G485A_D486P_K487P);
484번째 아르기닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 알라닌으로 치환되고, 485번째 글리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 알라닌으로 치환되고, 또한 487번째 리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 아스파라긴산으로 치환(R484A_G485A_K487D);
되고 484번째 아르기닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 시스테인으로 치환되고, 486번째 아스파라긴산 또는 그것에 상당하는 아미노산이 히스티딘으로 치환되고, 또한 487번째 리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 아르기닌으로 치환(R484C_D486H_K487R);
485번째 글리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 아르기닌으로 치환되고, 486번째 아스파라긴산 또는 그것에 상당하는 아미노산이 트립토판으로 치환되고, 또한 487번째 리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 트립토판으로 치환(G485R_D486W_K487W);
485번째 글리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 아르기닌으로 치환되고, 486번째 아스파라긴산 또는 그것에 상당하는 아미노산이 알라닌으로 치환되고, 또한 487번째 리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 알라닌으로 치환(G485R_D486A_K487A);
485번째 글리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 아르기닌으로 치환되고, 486번째 아스파라긴산 또는 그것에 상당하는 아미노산이 프롤린으로 치환되고, 또한 487번째 리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 프롤린으로 치환(G485R_D486P_K487P);
484번째 아르기닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 알라닌으로 치환되고, 485번째 글리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 알라닌으로 치환되고, 486번째 아스파라긴산 또는 그것에 상당하는 아미노산이 알라닌으로 치환되고, 또한 487번째 리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 알라닌으로 치환(R484A_G485A_D486A_K487A);
484번째 아르기닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 알라닌으로 치환되고, 485번째 글리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 알라닌으로 치환되고, 486번째 아스파라긴산 또는 그것에 상당하는 아미노산이 아르기닌으로 치환되고, 또한 487번째 리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 아르기닌으로 치환(R484A_G485A_D486R_K487R);
484번째 아르기닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 아스파라긴산으로 치환되고, 485번째 글리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 아스파라긴산으로 치환되고, 486번째 아스파라긴산 또는 그것에 상당하는 아미노산이 아르기닌으로 치환되고, 또한 487번째 리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 아르기닌으로 치환(R484D_G485D_D486R_K487R);
484번째 아르기닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 아스파라긴산으로 치환되고, 485번째 글리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 아스파라긴산으로 치환되고, 486번째 아스파라긴산 또는 그것에 상당하는 아미노산이 프롤린으로 치환되고, 또한 487번째 리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 프롤린으로 치환(R484D_G485D_D486P_K487P);
484번째 아르기닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 아스파라긴산으로 치환되고, 485번째 글리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 아스파라긴산으로 치환되고, 486번째 아스파라긴산 또는 그것에 상당하는 아미노산이 알라닌으로 치환되고, 또한 487번째 리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 알라닌으로 치환(R484D_G485D_D486A_K487A);
484번째 아르기닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 아스파라긴산으로 치환되고, 485번째 글리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 아스파라긴산으로 치환되고, 486번째 아스파라긴산 또는 그것에 상당하는 아미노산이 트립토판으로 치환되고, 또한 487번째 리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 트립토판으로 치환(R484D_G485D_D486W_K487W);
484번째 아르기닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 프롤린으로 치환되고, 485번째 글리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 프롤린으로 치환되고, 486번째 아스파라긴산 또는 그것에 상당하는 아미노산이 아르기닌으로 치환되고, 또한 487번째 리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 아르기닌으로 치환(R484P_G485P_D486R_K487R).
[20] 서열번호 1∼4 중 어느 하나의 아미노산 서열, 또는 서열번호 1∼4 중 어느 하나로 나타내는 아미노산 서열과 90% 이상 동일한 아미노산 서열로 이루어지는 β-갈락토시다아제에 있어서,
하기 중 어느 하나의 변형이 행해진 변형된 β-갈락토시다아제:
(a) 484번째 아르기닌(R484)∼487번째 리신(K487), 또는 이것에 상당하는 영역의 결실;
(b) 514번째 아스파라긴(N514)과 515번째 아스파라긴(N515)의 사이, 또는 이것에 상당하는 위치에 아미노산의 삽입;
(c) 604번째 프롤린(P604)과 605번째 티로신(Y605)의 사이, 또는 이것에 상당하는 위치에 아미노산의 삽입;
(d) 485번째 글리신(G485) 또는 이것에 상당하는 아미노산의 결실에 더하여, 486번째 아스파라긴산(D486) 또는 이것에 상당하는 아미노산의 다른 아미노산으로의 치환;
(e) 485번째 글리신(G485)∼486번째 아스파라긴산(D486), 또는 이것에 상당하는 영역의 결실에 더하여, 487번째 리신(K487) 또는 이것에 상당하는 아미노산의 다른 아미노산으로의 치환;
(f) 485번째 글리신(G485)∼486번째 아스파라긴산(D486), 또는 이것에 상당하는 영역의 결실에 더하여, 484번째 아르기닌(R484) 또는 이것에 상당하는 아미노산의 다른 아미노산으로의 치환, 및 487번째 리신(K487) 또는 이것에 상당하는 아미노산의 다른 아미노산으로의 치환;
(g) 484번째 아르기닌(R484)과 485번째 글리신(G485)의 사이, 또는 이것에 상당하는 위치에 아미노산의 삽입;
(h) 485번째 글리신(G485)과 486번째 아스파라긴산(D486)의 사이, 또는 이것에 상당하는 위치에 아미노산의 삽입.
[21] (d)∼(f)에 관하여, 484번째 아르기닌(R484)에 대한 치환 후 아미노산은 트립토판 또는 프롤린이며, 486번째 아스파라긴산(D486)에 대한 치환 후 아미노산은 히스티딘이며, 487번째 리신(K487)에 대한 치환 후 아미노산은 아르기닌, 트립토판 또는 프롤린이며,
(b), (c), (g), (h)에 관하여, 삽입되는 아미노산의 수는 1∼10개인, [20]에 기재된 변형된 β-갈락토시다아제.
[22] 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 β-갈락토시다아제에 있어서,
하기 중 어느 하나의 변형이 행해진 변형된 β-갈락토시다아제:
(i) 487번째 리신(K487)이 글리신 또는 프롤린으로 치환;
(ii) 514번째 아스파라긴(N514)이 트립토판으로 치환;
(iii) 515번째 아스파라긴(N515)이 리신 또는 트립토판으로 치환.
[23] [1]∼[22] 중 어느 한 항에 기재된 변형된 β-갈락토시다아제를 코딩하는 유전자.
[24] [23]에 기재된 유전자를 포함하는 재조합 DNA.
[25] [24]에 기재된 재조합 DNA를 보유하는 미생물.
[26] [1]∼[22] 중 어느 한 항에 기재된 변형된 β-갈락토시다아제를 포함하는 효소제.
[27] β-1,3 결합, β-1,4 결합 및 β-1,6 결합 중 적어도 1개를 가지는, 이당, 올리고당 또는 다당에 대하여, [1]∼[22] 중 어느 한 항에 기재된 변형된 β-갈락토시다아제를 작용시키는 것을 특징으로 하는, 올리고당의 제조 방법.
도 1은 바실러스·서큐란스 유래 β-갈락토시다아제와 3GM8(beta-glycosidase from Bacteroides vulgatus)의 비교(Identities = 282/824(34%), Positives = 425/824 (52%))를 나타낸다.
도 2는 변이체(변형된 β-갈락토시다아제)의 재조합 발현계를 나타낸다.
도 3은 알로락토오스에 대한 가수분해 활성이 저하 또는 향상되는 변이체를 나타낸다. (A)는, 알로락토오스 분해 활성÷1% 락토스 분해 활성이 50% 이하의 조건을 만족시키는 변이체의 측정 결과를 나타내고, (B)는, 알로락토오스 분해 활성÷1% 락토스 분해 활성이 150% 이상의 조건을 만족시키는 변이체의 측정 결과를 나타낸다(WT: 야생형 효소).
도 4는, 생성되는 갈락토올리고당은 조성 중의 4당 함유율이 변화된 변이체인 것을 나타낸다(WT: 야생형 효소).
도 5는, 생성되는 갈락토올리고당은 조성 중의 알로락토오스 함유율이 변화된 변이체인 것을 나타낸다(WT: 야생형 효소).
도 6은, 생성되는 갈락토올리고당은 조성 중의 4당 함유율이 변화된 변이체인 것을 나타낸다(WT: 야생형 효소).
도 7은 조건 3을 만족시키는, 1개소의 아미노산 치환이 행해진 변이체를 나타낸다(WT: 야생형 효소).
도 8은 조건 4를 만족시키는, 1개소의 아미노산 치환이 행해진 변이체를 나타낸다(WT: 야생형 효소).
도 9는 4당의 함유율이 많아지는, 1개소의 아미노산 치환이 행해진 변이체를 나타낸다(WT-A: BgaD-A형의 야생형 효소).
도 10은, 조건 3을 만족시키는 치환과 조건 5를 만족시키는 치환을 조합한 변이체(예 1), 조건 3을 만족시키는 치환과 조건 6을 만족시키는 치환을 조합한 변이체(예 3), 조건 4를 만족시키는 치환과 조건 5를 만족시키는 치환을 조합한 변이체(예 4), 조건 3을 만족시키는 치환끼리를 조합한 변이체(예 5-1), 조건 4를 만족시키는 치환끼리를 조합한 변이체(예 5-2를 각각 나타낸다(WT: 야생형 효소).
도 11은, 조건 3을 만족시키는, 2개소의 아미노산 치환이 행해진 변이체(좌측)와, 조건 4를 만족시키는, 3개소 또는 4개소의 아미노산 치환이 행해진 변이체(우측)를 나타낸다(WT: 야생형 효소).
도 12는, 조건 3을 만족시키는, 3개소 또는 4개소의 아미노산 치환이 행해진 변이체(위)와, 조건 4를 만족시키는, 3개소 또는 4개소의 아미노산 치환이 행해진 변이체(아래)를 나타낸다(WT: 야생형 효소).
도 13은, 조건 3을 만족시키는, 삽입 또는 결실 변이체(위)와, 조건 4를 만족시키는, 삽입 또는 결실 변이체(아래)를 나타낸다(WT: 야생형 효소).
도 2는 변이체(변형된 β-갈락토시다아제)의 재조합 발현계를 나타낸다.
도 3은 알로락토오스에 대한 가수분해 활성이 저하 또는 향상되는 변이체를 나타낸다. (A)는, 알로락토오스 분해 활성÷1% 락토스 분해 활성이 50% 이하의 조건을 만족시키는 변이체의 측정 결과를 나타내고, (B)는, 알로락토오스 분해 활성÷1% 락토스 분해 활성이 150% 이상의 조건을 만족시키는 변이체의 측정 결과를 나타낸다(WT: 야생형 효소).
도 4는, 생성되는 갈락토올리고당은 조성 중의 4당 함유율이 변화된 변이체인 것을 나타낸다(WT: 야생형 효소).
도 5는, 생성되는 갈락토올리고당은 조성 중의 알로락토오스 함유율이 변화된 변이체인 것을 나타낸다(WT: 야생형 효소).
도 6은, 생성되는 갈락토올리고당은 조성 중의 4당 함유율이 변화된 변이체인 것을 나타낸다(WT: 야생형 효소).
도 7은 조건 3을 만족시키는, 1개소의 아미노산 치환이 행해진 변이체를 나타낸다(WT: 야생형 효소).
도 8은 조건 4를 만족시키는, 1개소의 아미노산 치환이 행해진 변이체를 나타낸다(WT: 야생형 효소).
도 9는 4당의 함유율이 많아지는, 1개소의 아미노산 치환이 행해진 변이체를 나타낸다(WT-A: BgaD-A형의 야생형 효소).
도 10은, 조건 3을 만족시키는 치환과 조건 5를 만족시키는 치환을 조합한 변이체(예 1), 조건 3을 만족시키는 치환과 조건 6을 만족시키는 치환을 조합한 변이체(예 3), 조건 4를 만족시키는 치환과 조건 5를 만족시키는 치환을 조합한 변이체(예 4), 조건 3을 만족시키는 치환끼리를 조합한 변이체(예 5-1), 조건 4를 만족시키는 치환끼리를 조합한 변이체(예 5-2를 각각 나타낸다(WT: 야생형 효소).
도 11은, 조건 3을 만족시키는, 2개소의 아미노산 치환이 행해진 변이체(좌측)와, 조건 4를 만족시키는, 3개소 또는 4개소의 아미노산 치환이 행해진 변이체(우측)를 나타낸다(WT: 야생형 효소).
도 12는, 조건 3을 만족시키는, 3개소 또는 4개소의 아미노산 치환이 행해진 변이체(위)와, 조건 4를 만족시키는, 3개소 또는 4개소의 아미노산 치환이 행해진 변이체(아래)를 나타낸다(WT: 야생형 효소).
도 13은, 조건 3을 만족시키는, 삽입 또는 결실 변이체(위)와, 조건 4를 만족시키는, 삽입 또는 결실 변이체(아래)를 나타낸다(WT: 야생형 효소).
설명의 편의 상, 본 발명에서 사용하는 용어의 일부에 대하여 하기와 같이 정의한다.
(용어)
용어 「변형된 β-갈락토시다아제」란, 특정한 β-갈락토시다아제(설명의 편의 상, 「기준 β-갈락토시다아제」라고 함)를 변형 내지 변이하여 얻어지는 효소이다. 기준 β-갈락토시다아제는, 바실러스·서큐란스가 생산하는 β-갈락토시다아제이다. 지금까지의 연구에 의하면, 바실러스·서큐란스의 β-갈락토시다아제는 분자량이 상이한 4종류의 효소로 구성되어 있는 것으로 알려져 있다. 본 발명에서는, 이들 4종류의 효소 중 어느 하나를 기준 β-갈락토시다아제로 한다. 전형적으로는, 서열번호 1∼4 중 어느 하나의 아미노산 서열을 가지는 효소가 기준 β-갈락토시다아제가 되지만, 서열번호 1∼4 중 어느 하나의 아미노산 서열과 90% 이상 동일한 아미노산 서열을 가지는 효소(β-갈락토시다아제 활성을 나타낸 것)를 기준 β-갈락토시다아제로서 사용하는 것도 가능하다. 바람직하게는 서열번호 1∼4 중 어느 하나의 아미노산 서열과 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 가지는 효소(β-갈락토시다아제 활성을 나타낸 것), 더욱 바람직하게는 서열번호 1∼4 중 어느 하나의 아미노산 서열과 98% 이상 동일한 아미노산 서열을 가지는 효소(β-갈락토시다아제 활성을 나타낸 것), 가장 바람직하게는 서열번호 1∼4 중 어느 하나의 아미노산 서열과 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 가지는 효소(β-갈락토시다아제 활성을 나타낸 것)를 기준 β-갈락토시다아제로서 사용할 수도 있다. 서열번호 1은 분자량 195 kD의 β-갈락토시다아제(이하, BgaD-A라고도 함)의 아미노산 서열이며, 서열번호 2는 분자량 160 kD의 β-갈락토시다아제(이하, BgaD-B라고도 함)의 아미노산 서열이며, 서열번호 3은 분자량 135 kD의 β-갈락토시다아제(이하, BgaD-C라고도 함)의 아미노산 서열이며, 서열번호 4는 분자량 86 kD의 β-갈락토시다아제(이하, BgaD-D라고도 함)이다. 또한, BgaD-A, BgaD-B, BgaD-C 및 BgaD-D를 코딩하는 염기 서열을 각각 서열번호 5, 6, 7 및 8에 나타낸다.
본 발명에서는, 변형 내지 변이로서 「아미노산의 치환」이 행해진다. 따라서, 변형된 β-갈락토시다아제와 기준 β-갈락토시다아제를 비교하면, 일부 아미노산 잔기에 상이가 인정된다. 그리고, 본 명세서에서는, 변형된 β-갈락토시다아제를, 변형된 효소, 변이 β-갈락토시다아제, 변이체 등이라고도 한다.
본 명세서에서는 관례에 따라, 하기와 같디, 각 아미노산을 1 문자로 표기한다.
메티오닌: M, 세린: S, 알라닌: A, 트레오닌: T, 발린: V, 티로신: Y, 류신: L, 아스파라긴: N, 이소류신: I, 글루타민: Q, 프롤린: P, 아스파라긴산: D, 페닐알라닌: F, 글루타민산: E, 트립토판: W, 리신: K, 시스테인: C, 아르기닌: R, 글리신: G, 히스티딘: H
또한, 변이점의 아미노산 잔기(치환의 대상이 되는 아미노산 잔기)를, 아미노산의 종류를 나타낸 상기 1 문자와 아미노산의 위치를 나타낸 숫자와의 조합으로 표현한다. 예를 들면, 182번째 프롤린이 변이점은 「P182」로 표현된다.
(변형된 β-갈락토시다아제)
본 발명의 제1 태양은 변형된 β-갈락토시다아제(변형된 효소)에 관한 것이다. 본 발명의 변형된 효소는, 전형적으로는, 서열번호 1∼4 중 어느 하나의 아미노산 서열, 또는 서열번호 1∼4 중 어느 하나로 나타내는 아미노산 서열과 90% 이상 동일한 아미노산 서열로 이루어지는 β-갈락토시다아제에 있어서,
하기의 (1)∼(21)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 또는 2 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열을 가진다.
(1) 182번째 프롤린(P182)
(2) 187번째 티로신(Y187)
(3) 188번째 세린(S188)
(4) 405번째 트립토판(W405)
(5) 406번째 알라닌(A406)
(6) 407번째 글루타민(Q407)
(7) 449번째 티로신(Y449)
(8) 483번째 트레오닌(T483)
(9) 512번째 세린(S512)
(10) 531번째 세린(S531)
(11) 533번째 세린(S533)
(12) 534번째 세린(S534)
(13) 550번째 아스파라긴(N550)
(14) 551번째 글루타민(Q551)
(15) 593번째 트립토판(W593)
(16) 598번째 티로신(Y598)
(17) 602번째 프롤린(P602)
(18) 604번째 프롤린(P604)
(19) 609번째 티로신(Y609)
(20) 612번째 리신(K612)
(21) 615번째 티로신(Y615)
후술하는 실시예에 나타낸 바와 같이, 치환 대상이 되는 상기한 아미노산 잔기는, 입체 구조 예측 및 검증 실험에 의해 특정된 것이다. 본 발명의 일태양에서는, 이들 아미노산을 치환함으로써 효소의 구조를 변형하여, β-갈락토시다아제의 특성을 변화시킨다. 여기서 「특성」은 올리고당 합성 활성 및/또는 알로락토오스에 대한 가수분해 활성이다.
서열번호 1∼4 중 어느 하나의 아미노산 서열과 90% 이상(바람직하게는 95% 이상, 더욱 바람직하게는 98% 이상, 가장 바람직하게는 99% 이상) 동일한 아미노산 서열을 가지는 기준 β-갈락토시다아제에서는, 아미노산의 삽입이나 결실 등에 의하여, 배열 1∼4 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어지는 효소 와의 사이에서 아미노산 위치의 어긋남이 생기는 경우가 있다. 이에, 본 발명의 일태양에서는, 기준 β-갈락토시다아제에 있어서, 상기 (1)∼(21)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 또는 2 이상의 아미노산에 상당하는 아미노산이 치환의 대상이 된다. 여기서, 용어 「상당하는」이란, 비교되는 단백질(효소) 사이에 있어서 그 기능의 발휘에 동등한 공헌을 하고 있는 것을 의미한다. 예를 들면, 기준 아미노산 서열(예를 들면, 서열번호 1의 아미노산 서열)에 대하여 비교 대상의 아미노산 서열을, 1차 구조(아미노산 서열)의 부분적인 상동성(相同性)을 고려하면서, 최적의 비교가 가능하도록 배열했을 때(이 때 필요에 따라 갭을 도입하여, 얼라인먼트를 최적화할 수도 있다), 기준 아미노산 서열 중의 특정한 아미노산에 대응하는 위치의 아미노산을 「상당하는 아미노산」으로서 특정할 수 있다. 1차 구조끼리 비교하는 대신, 또는 여기에 더하여 입체 구조(3차원 구조)끼리를 비교하는 것에 의해 「상당하는 아미노산」을 특정할 수도 있다. 입체 구조 정보를 이용함으로써 신뢰성이 높은 비교 결과가 얻어진다. 이 경우에는, 복수의 효소의 입체 구조의 원자 좌표를 비교하면서 얼라인먼트를 행하여 가는 방법을 채용할 수 있다.
치환 후의 아미노산의 종류는 특별히 한정되지 않는다. 따라서, 보존적 아미노산 치환이라도 되고 비보존적 아미노산 치환이라도 된다. 여기서 「보존적 아미노산 치환」이란, 어느 아미노산 잔기를, 동일한 성질의 측쇄를 가지는 아미노산 잔기로 치환하는 것을 말한다. 아미노산 잔기는 그 측쇄에 따라 염기성 측쇄(예를 들면, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예를 들면, 아스파라긴산, 글루타민산), 비하전 극성 측쇄(예를 들면, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄(예를 들면, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), β분지 측쇄(예를 들면, 트레오닌, 발린, 이소류신), 방향족 측쇄(예를 들면, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)와 같이, 몇 가지 패밀리로 분류되어 있다. 보존적 아미노산 치환은 전형적으로는 동일한 패밀리 내의 아미노산 잔기 사이의 치환이다.
본 발명의 제1 태양에서는, 치환의 대상이 되는 1 또는 2 이상의 아미노산이, 449번째 티로신(Y449), 531번째 세린(S531), 593번째 트립토판(W593), 602번째 프롤린(P602), 604번째 프롤린(P604) 및 612번째 리신(K612)으로 이루어지는 군으로부터 선택되게 된다. 이들 아미노산은, 후술하는 실시예에 나타낸 실험에 있어서, 「알로락토오스 분해 활성이 50% 이하」의 조건(조건 1)을 만족시키는 것으로서 특정된 것이며, 알로락토오스에 대한 가수분해 활성의 기질 특이성과 관련이 있다. 따라서, 상기 태양의 변형된 효소는, 알로락토오스 가수분해 활성이 낮다는 점에서 유용성이 높다고 할 수 있다. 치환 후의 아미노산은, 바람직하게는, 하기와 같다. 그리고, 제1 태양에 있어서 치환 대상이 되는 아미노산을 「제1군의 아미노산」이라고 한다.
449번째 티로신(Y449)에 대한 치환 후 아미노산은 아스파라긴산, 글루타민산, 아스파라긴 또는 트립토판.
531번째 세린(S531)에 대한 치환 후 아미노산은 알라닌, 아스파라긴산, 글루타민산, 페닐알라닌, 글리신, 이소류신, 메티오닌, 아스파라긴 또는 글루타민.
593번째 트립토판(W593)에 대한 치환 후 아미노산은 페닐알라닌.
602번째 프롤린(P602)에 대한 치환 후 아미노산은 글루타민산 또는 글리신.
604번째 프롤린(P604)에 대한 치환 후 아미노산은 알라닌, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 메티오닌, 세린, 트레오닌, 발린, 트립토판 또는 티로신.
612번째 리신(K612)에 대한 치환 후 아미노산은 메티오닌.
본 발명의 제2 태양에서는, 치환의 대상이 되는 1 또는 2 이상의 아미노산이, 187번째 티로신(Y187), 188번째 세린(S188), 533번째 세린(S533), 602번째 프롤린(P602) 및 612번째 리신(K612)으로 이루어지는 군으로부터 선택되게 된다. 이들 아미노산은, 후술하는 실시예에 나타낸 실험에 있어서, 「알로락토오스 분해 활성이 150% 이상」의 조건(조건 2)을 만족시키는 것으로서 특정된 것이며, 알로락토오스에 대한 가수분해 활성의 기질 특이성과 관련이 있다. 따라서, 상기 태양의 변형된 효소는, 알로락토오스 가수분해 활성이 높다는 점에서 유용성이 높다고 할 수 있다. 치환 후의 아미노산은, 바람직하게는, 다음과 같다. 그리고, 제2 태양에 두어 치환 대상이 되는 아미노산을 「제2군의 아미노산」이라고한다.
187번째 티로신(Y187)에 대한 치환 후 아미노산은 아스파라긴산, 글루타민산 또는 글리신.
188번째 세린(S188)에 대한 치환 후 아미노산은 프롤린 또는 트레오닌.
533번째 세린(S533)에 대한 치환 후 아미노산은 메티오닌 또는 글루타민.
602번째 프롤린(P602)에 대한 치환 후 아미노산은 시스테인, 이소류신, 아스파라긴, 세린, 트레오닌 또는 발린.
612번째 리신(K612)에 대한 치환 후 아미노산은 페닐알라닌
본 발명의 제3 태양에서는, 치환의 대상이 되는 1 또는 2 이상의 아미노산이, 182번째 프롤린(P182), 187번째 티로신(Y187), 188번째 세린(S188), 405번째 트립토판(W405), 407번째 글루타민(Q407), 449번째 티로신(Y449), 483번째 트레오닌(T483), 512번째 세린(S512), 531번째 세린(S531), 550번째 아스파라긴(N550), 602번째 프롤린(P602) 및 604번째 프롤린(P604)으로 이루어지는 군으로부터 선택되게 된다. 이들 아미노산은, 후술하는 실시예에 나타낸 실험에 있어서, 「3당 이상의 함유율이 야생형 효소와 동일한 정도이며 4당의 함유율이 야생형 효소보다 적다」의 조건(조건 3)을 만족시키는로서 특정된 것이며, 4당의 생성량에 관련된다. 따라서, 상기 태양의 변형된 효소는, 이것을 사용하면 4당의 함유량이 내린다는 점에 있어서 유용성이 높다고 할 수 있다. 치환 후의 아미노산은, 바람직하게는, 하기와 같다. 그리고, 제3 태양에 있어서 치환 대상이 되는 아미노산을 「제3군의 아미노산」이라고 한다.
182번째 프롤린(P182)에 대한 치환 후 아미노산은 류신.
187번째 티로신(Y187)에 대한 치환 후 아미노산은 아스파라긴산 또는 류신.
188번째 세린(S188)에 대한 치환 후 아미노산은 이소류신.
405번째 트립토판(W405)에 대한 치환 후 아미노산은 알라닌, 아스파라긴산, 글루타민산, 글리신, 히스티딘, 류신, 아스파라긴, 세린 또는 트레오닌.
407번째 글루타민(Q407)에 대한 치환 후 아미노산은 글리신 또는 아르기닌.
449번째 티로신(Y449)에 대한 치환 후 아미노산은 글루타민산, 이소류신, 글루타민, 아르기닌 또는 세린.
483번째 트레오닌(T483)에 대한 치환 후 아미노산은 글루타민.
512번째 세린(S512)에 대한 치환 후 아미노산은 페닐알라닌, 트레오닌 또는 발린. 531번째 세린(S531)에 대한 치환 후 아미노산은 프롤린.
550번째 아스파라긴(N550)에 대한 치환 후 아미노산은 류신, 아르기닌 또는 세린.
602번째 프롤린(P602)에 대한 치환 후 아미노산은 류신, 아스파라긴 또는 글루타민.
604번째 프롤린(P604)에 대한 치환 후 아미노산은 이소류신 또는 메티오닌
검토를 진행한 결과, 「3당 이상의 함유율이 야생형 효소와 동일한 정도이며 4당의 함유율이 야생형 효소보다 적다」의 조건(조건 3)을 만족시키는, 치환 대상의 아미노산(즉, 제3군의 아미노산)으로서, 85번째 트립토판(W85), 91번째 페닐알라닌(F91), 103번째 티로신(Y103), 134번째 티로신(Y134), 153번째 티로신(Y153), 182번째 프롤린(P182), 186번째 트립토판(W186), 192번째 티로신(Y192), 295번째 티로신(Y295), 345번째 히스티딘(H345), 349번째 글리신(G349), 402번째 페닐알라닌(F402), 407번째 글루타민(Q407), 479번째 글리신(G479), 480번째 글루타민산(E480), 482번째 리신(K482), 483번째 트레오닌(T483), 484번째 아르기닌(R484), 485번째 글리신(G485), 486번째 아스파라긴산(D486), 487번째 리신(K487), 488번째 발린(V488), 496번째 티로신(Y496), 512번째 세린(S512), 513번째 글루타민산(E513), 514번째 아스파라긴(N514), 515번째 아스파라긴(N515), 516번째 티로신(Y516), 517번째 아스파라긴산(D517), 519번째 티로신(Y519), 533번째 트레오닌(T533), 547번째 티로신(Y547), 549번째 티로신(Y549), 555번째 티로신(Y555), 572번째 아르기닌(R572), 573번째 트레오닌(T573), 598번째 티로신(Y598), 605번째 티로신(Y605), 606번째 티로신(Y606), 609번째 티로신(Y609), 616번째 페닐알라닌(F616), 624번째 페닐알라닌(F624), 648번째 트립토판(W648), 650번째 트립토판(W650)이 특정되었다. 이에, 본 발명의 일태양에서는, 서열번호 1∼4 중 어느 하나의 아미노산 서열, 또는 서열번호 1∼4 중 어느 하나로 나타내는 아미노산 서열과 90% 이상 동일한 아미노산 서열로 이루어지는 β-갈락토시다아제에 있어서, 상기 아미노산군으로부터 선택되는 1 또는 2 이상의 아미노산, 또는 그것에 상당하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열로 이루어지는 변형된 효소가 제공된다. 치환 후의 아미노산은, 바람직하게는, 하기와 같다.
85번째 트립토판(W85)에 대한 치환 후 아미노산은 글리신.
91번째 페닐알라닌(F91)에 대한 치환 후 아미노산은 알라닌 또는 이소류신.
103번째 티로신(Y103)에 대한 치환 후 아미노산은 글리신.
134번째 티로신(Y134)에 대한 치환 후 아미노산은 글리신.
153번째 티로신(Y153)에 대한 치환 후 아미노산은 글리신.
182번째 프롤린(P182)에 대한 치환 후 아미노산은 트립토판 또는 티로신.
186번째 트립토판(W186)에 대한 치환 후 아미노산은 메티오닌.
192번째 티로신(Y192)에 대한 치환 후 아미노산은 글리신.
295번째 티로신(Y295)에 대한 치환 후 아미노산은 글리신.
345번째 히스티딘(H345)에 대한 치환 후 아미노산은 글리신.
349번째 글리신(G349)에 대한 치환 후 아미노산은 트립토판.
402번째 페닐알라닌(F402)에 대한 치환 후 아미노산은 글리신.
407번째 글루타민(Q407)에 대한 치환 후 아미노산은 이소류신, 류신, 메티오닌, 발린 또는 티로신.
479번째 글리신(G479)에 대한 치환 후 아미노산은 류신, 프롤린 또는 글루타민.
480번째 글루타민산(E480)에 대한 치환 후 아미노산은 아스파라긴.
482번째 리신(K482)에 대한 치환 후 아미노산은 메티오닌 또는 발린.
483번째 트레오닌(T483)에 대한 치환 후 아미노산은 글리신 또는 세린.
484번째 아르기닌(R484)에 대한 치환 후 아미노산은 페닐알라닌, 이소류신, 메티오닌, 아스파라긴 또는 글루타민.
485번째 글리신(G485)에 대한 치환 후 아미노산은 아스파라긴산, 아스파라긴, 글루타민 또는 트레오닌.
486번째 아스파라긴산(D486)에 대한 치환 후 아미노산은 알라닌, 글루타민산, 페닐알라닌, 이소류신, 리신, 류신, 메티오닌, 프롤린, 글루타민, 아르기닌, 트레오닌, 트립토판 또는 티로신.
487번째 리신(K487)에 대한 치환 후 아미노산은 시스테인, 글루타민산, 페닐알라닌, 히스티딘, 이소류신, 류신, 아스파라긴, 글루타민, 아르기닌, 트레오닌, 발린, 트립토판 또는 티로신.
488번째 발린(V488)에 대한 치환 후 아미노산은 글리신, 이소류신, 류신, 아르기닌, 세린, 트레오닌, 트립토판 또는 티로신.
496번째 티로신(Y496)에 대한 치환 후 아미노산은 글리신.
512번째 세린(S512)에 대한 치환 후 아미노산은 시스테인, 아스파라긴산, 글루타민산, 아스파라긴, 프롤린, 글루타민 또는 트립토판.
513번째 글루타민산(E513)에 대한 치환 후 아미노산은 알라닌, 시스테인, 아스파라긴산, 페닐알라닌, 글리신, 히스티딘, 리신, 류신, 메티오닌, 아스파라긴, 프롤린, 글루타민, 아르기닌, 세린, 트레오닌 또는 발린.
514번째 아스파라긴(N514)에 대한 치환 후 아미노산은 글루타민산, 류신 또는 리신.
515번째 아스파라긴(N515)에 대한 치환 후 아미노산은 알라닌, 아스파라긴산, 글루타민산, 글리신, 이소류신, 류신, 프롤린 또는 발린.
516번째 티로신(Y516)에 대한 치환 후 아미노산은 트립토판.
517번째 아스파라긴산(D517)에 대한 치환 후 아미노산은 리신 또는 트립토판.
519번째 티로신(Y519)에 대한 치환 후 아미노산은 글리신.
533번째 트레오닌(T533)에 대한 치환 후 아미노산은 글루타민산.
547번째 티로신(Y547)에 대한 치환 후 아미노산은 글리신.
549번째 티로신(Y549)에 대한 치환 후 아미노산은 글리신.
555번째 티로신(Y555)에 대한 치환 후 아미노산은 글리신.
572번째 아르기닌(R572)에 대한 치환 후 아미노산은 시스테인, 류신, 메티오닌, 트레오닌, 트립토판 또는 티로신.
573번째 트레오닌(T573)에 대한 치환 후 아미노산은 글루타민산.
598번째 티로신(Y598)에 대한 치환 후 아미노산은 히스티딘 또는 아스파라긴.
605번째 티로신(Y605)에 대한 치환 후 아미노산은 시스테인, 아스파라긴산, 히스티딘, 이소류신, 리신, 프롤린, 아르기닌 또는 트레오닌.
606번째 티로신(Y606)에 대한 치환 후 아미노산은 알라닌, 시스테인, 아스파라긴산, 글루타민산, 페닐알라닌, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 리신, 류신, 메티오닌 또는 세린.
609번째 티로신(Y609)에 대한 치환 후 아미노산은 글루타민산, 아스파라긴 또는 세린.
616번째 페닐알라닌(F616)에 대한 치환 후 아미노산은 글리신.
624번째 페닐알라닌(F624)에 대한 치환 후 아미노산은 글리신.
648번째 트립토판(W648)에 대한 치환 후 아미노산은 글리신.
650번째 트립토판(W650)에 대한 치환 후 아미노산은 글리신.
본 발명의 제4 태양에서는, 치환의 대상이 되는 1 또는 2 이상의 아미노산이, 483번째 트레오닌(T483), 512번째 세린(S512), 551번째 글루타민(Q551), 598번째 티로신(Y598) 및 615번째 티로신(Y615)으로 이루어지는 군으로부터 선택되게 된다. 이들 아미노산은, 후술하는 실시예에 나타낸 실험에 있어서, 「3당 이상의 함유율이 야생형 효소와 동일한 정도이며 4당의 함유율이 야생형 효소보다 많다」의 조건(조건 4)을 만족시키는 것으로서 특정된 것이며, 4당의 생성량과 관련이 있다. 따라서, 상기 태양의 변형된 효소는, 이것을 사용하면 4당의 함유량이 높아지는 점에서 유용성이 높다고 할 수 있다. 치환 후의 아미노산은, 바람직하게는, 하기와 같다. 그리고, 제4 태양에 있어서 치환 대상이 되는 아미노산을 「제4군의 아미노산」이라고 한다.
483번째 트레오닌(T483)에 대한 치환 후 아미노산은 리신, 메티오닌 또는 아르기닌.
512번째 세린(S512)에 대한 치환 후 아미노산은 글리신 또는 리신.
551번째 글루타민(Q551)에 대한 치환 후 아미노산은 아스파라긴.
598번째 티로신(Y598)에 대한 치환 후 아미노산은 아스파라긴.
615번째 티로신(Y615)에 대한 치환 후 아미노산은 트레오닌.
검토를 진행한 결과, 「3당 이상의 함유율이 야생형 효소와 동일한 정도이며 4당의 함유율이 야생형 효소보다 많다」의 조건(조건 4)을 만족시키는, 치환 대상의 아미노산(즉, 제4군의 아미노산)으로서, 76번째 트립토판(W76), 480번째 글루타민산(E480), 483번째 트레오닌(T483), 485번째 글리신(G485), 484번째 아르기닌(R484), 487번째 리신(K487), 488번째 발린(V488), 512번째 세린(S512), 514번째 아스파라긴(N514), 515번째 아스파라긴(N515), 569번째 글리신(G569), 596번째 페닐알라닌(F596)이 특정되었다. 이에, 본 발명의 일태양에서는, 서열번호 1∼4 중 어느 하나의 아미노산 서열, 또는 서열번호 1∼4 중 어느 하나로 나타내는 아미노산 서열과 90% 이상 동일한 아미노산 서열로 이루어지는 β-갈락토시다아제에 있어서, 상기 아미노산군으로부터 선택되는 1 또는 2 이상의 아미노산, 또는 그것에 상당하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열로 이루어지는 변형된 효소가 제공된다. 치환 후의 아미노산은, 바람직하게는, 하기와 같다.
76번째 트립토판(W76)에 대한 치환 후 아미노산은 글리신.
480번째 글루타민산(E480)에 대한 치환 후 아미노산은 글루타민.
483번째 트레오닌(T483)에 대한 치환 후 아미노산은 트립토판.
485번째 글리신(G485)에 대한 치환 후 아미노산은 프롤린 또는 트레오닌.
484번째 아르기닌(R484)에 대한 치환 후 아미노산은 알라닌, 시스테인, 아스파라긴산, 글리신, 프롤린, 세린, 티로신 또는 리신.
487번째 리신(K487)에 대한 치환 후 아미노산은 글리신 또는 프롤린.
488번째 발린(V488)에 대한 치환 후 아미노산은 프롤린.
512번째 세린(S512)에 대한 치환 후 아미노산은 류신 또는 메티오닌.
514번째 아스파라긴(N514)에 대한 치환 후 아미노산은 아스파라긴산.
515번째 아스파라긴(N515)에 대한 치환 후 아미노산은 페닐알라닌, 아르기닌, 트립토판, 티로신 또는 리신.
569번째 글리신(G569)에 대한 치환 후 아미노산은 리신, 프롤린 또는 발린.
596번째 페닐알라닌(F596)에 대한 치환 후 아미노산은 글리신.
본 발명의 제5 태양에서는, 치환의 대상이 되는 1 또는 2 이상의 아미노산이, 405번째 트립토판(W405), 483번째 트레오닌(T483), 531번째 세린(S531), 550번째 아스파라긴(N550) 및 598번째 티로신(Y598)으로 이루어지는 군으로부터 선택되게 된다. 이들 아미노산은, 후술하는 실시예에 나타낸 실험에 있어서, 「3당 이상의 함유율이 야생형 효소와 동일한 정도이며 알로락토오스 함유율이 야생형 효소보다 적다」의 조건(조건 5)을 만족시키는 것으로서 특정된 것이며, 알로락토오스 함유량과 관련이 있다. 따라서, 전술한 태양의 변형된 효소는, 이것을 사용하면 알로락토오스의 비율이 저하되는 점에서 유용성이 높다고 할 수 있다. 치환 후의 아미노산은, 바람직하게는, 하기와 같다. 그리고, 제5 태양에 있어서 치환 대상이 되는 아미노산을 「제5군의 아미노산」이라고 한다.
405번째 트립토판(W405)에 대한 치환 후 아미노산은 알라닌, 아스파라긴산, 세린 또는 트레오닌.
483번째 트레오닌(T483)에 대한 치환 후 아미노산은 메티오닌.
531번째 세린(S531)에 대한 치환 후 아미노산은 아스파라긴산, 페닐알라닌, 글리신, 류신, 리신 또는 메티오닌.
550번째 아스파라긴(N550)에 대한 치환 후 아미노산은 페닐알라닌.
598번째 티로신(Y598)에 대한 치환 후 아미노산은 페닐알라닌 또는 히스티딘
본 발명의 제6 태양에서는, 치환의 대상이 되는 1 또는 2 이상의 아미노산이, 182번째 프롤린(P182), 187번째 티로신(Y187), 188번째 세린(S188), 405번째 트립토판(W405), 406번째 알라닌(A406), 407번째 글루타민(Q407), 449번째 티로신(Y449), 483번째 트레오닌(T483), 512번째 세린(S512), 534번째 세린(S534), 550번째 아스파라긴(N550), 551번째 글루타민(Q551), 602번째 프롤린(P602), 609번째 티로신(Y609), 612번째 리신(K612) 및 615번째 티로신(Y615)으로 이루어지는 군으로부터 선택되게 된다. 이들 아미노산은, 후술하는 실시예에 나타낸 실험에 있어서, 「3당 이상의 함유율이 야생형 효소와 동일한 정도이며 알로락토오스 함유율이 야생형 효소보다 많다」의 조건(조건)을 만족시키는 것으로서 특정된 것이며, 알로락토오스 함유량과 관련이 있다. 따라서, 상기 태양의 변형된 효소는, 이것을 사용하면 알로락토오스의 비율이 높아지는 점에서 유용성이 높다고 할 수 있다. 치환 후의 아미노산은, 바람직하게는, 하기와 같다. 그리고, 제6 태양에 있어서 치환 대상이 되는 아미노산을 「제6군의 아미노산」이라고 한다.
182번째 프롤린(P182)에 대한 치환 후 아미노산은 류신 또는 세린.
187번째 티로신(Y187)에 대한 치환 후 아미노산은 아스파라긴산, 글루타민산 또는 아스파라긴.
188번째 세린(S188)에 대한 치환 후 아미노산은 글루타민산, 글리신, 이소류신 또는 아스파라긴.
405번째 트립토판(W405)에 대한 치환 후 아미노산은 히스티딘.
406번째 알라닌(A406)에 대한 치환 후 아미노산은 프롤린.
407번째 글루타민(Q407)에 대한 치환 후 아미노산은 알라닌, 페닐알라닌, 글리신, 리신 또는 아르기닌.
449번째 티로신(Y449)에 대한 치환 후 아미노산은 글루타민산 또는 아르기닌.
483번째 트레오닌(T483)에 대한 치환 후 아미노산은 세린 또는 글루타민.
512번째 세린(S512)에 대한 치환 후 아미노산은 글리신, 트레오닌 또는 발린.
534번째 세린(S534)에 대한 치환 후 아미노산은 리신 또는 글루타민.
550번째 아스파라긴(N550)에 대한 치환 후 아미노산은 알라닌, 글리신, 리신, 류신, 메티오닌, 아르기닌 또는 세린.
551번째 글루타민(Q551)에 대한 치환 후 아미노산은 리신 또는 히스티딘.
602번째 프롤린(P602)에 대한 치환 후 아미노산은 시스테인, 아스파라긴산 또는 아스파라긴.
609번째 티로신(Y609)에 대한 치환 후 아미노산은 아스파라긴산, 글루타민 또는 트레오닌.
612번째 리신(K612)에 대한 치환 후 아미노산은 페닐알라닌 또는 이소류신.
615번째 티로신(Y615)에 대한 치환 후 아미노산은 글루타민산, 이소류신 또는 트레오닌
본 발명에서는, 2개 이상의 아미노산이 치환되어 있어도 된다. 전술한 바와 같이, 치환되는 아미노산은 제1군∼제6군으로 분류된다. 치환되는 2개 이상의 아미노산은, 예를 들면, 동일 군 중에서 선택된다. 이 태양에서는, 1개의 군에 속하는 2 개 이상의 아미노산이 치환되고, 상기 군에 특징적인 특성(예를 들면, 제1군의 경우에는 알로락토오스 분해 활성이 낮은 것)이 증강된 변형된 효소가 될 것으로 기대된다. 한편, 치환되는 2개 이상의 아미노산을, 2 이상의 군으로부터 선택할 수도 있다. 이와 같이 하면, 선택한 아미노산이 속하는 각 군의 특성을 겸비한 변형된 효소가 될 것으로 기대된다. 이 태양의 바람직한 구체예를 이하에 나타낸다. 그리고, 치환되는 아미노산의 조합은 특별히 한정되지 않지만, 상반되는 특성을 나타내는 군(즉, 제1군과 제2군, 제3군과 제4군, 제5군과 제6군)의 아미노산이 병용되지 않는 것이 바람직하다.
(예 1)
제3군의 아미노산과, 제5군의 아미노산을 치환 대상으로 한다. 얻어지는 변형된 효소는, 4당의 비율도 알로락토오스의 비율도 적은 특징을 나타낼 것으로 기대된다.
(예 2)
제4군의 아미노산과, 제6군의 아미노산을 치환 대상으로 한다. 얻어지는 변형된 효소는, 4당의 비율, 도 알로락토오스의 비율도 많은 특징을 나타낼 것으로 기대된다.
(예 3)
제3군의 아미노산과, 제6군의 아미노산을 치환 대상으로 한다. 얻어지는 변형된 효소는, 4당의 비율이 적기는 하지만, 알로락토오스의 비율은 많은 특징을 나타낼 것으로 기대된다.
(예 4)
제4군의 아미노산과, 제5군의 아미노산을 치환 대상으로 한다. 얻어지는 변형된 효소는, 4당의 비율이 많고, 알로락토오스의 비율은 적은 특징을 나타낼 것으로 기대된다.
(예 5)
동일한 군의 아미노산을 복수 치환한다. 동일한 군의 아미노산을 복수 치환함으로써, 보다 큰 변화를 기대할 수 있다. 예를 들면, 제3군의 아미노산의 복수의 아미노산을 치환 대상으로 하면, 얻어지는 변형된 효소는 4당의 비율이 보다 적은 특징을 나타낼 것으로 기대된다.
상기한 예 1에 해당하는 구체예로서, 188번째 세린이 이소류신으로 치환되고, 또한 550번째 아스파라긴이 페닐알라닌으로 치환된, 변형된 효소(S188I_N550F), 407번째 글루타민이 아르기닌으로 치환되고, 또한 550번째 아스파라긴이 페닐알라닌으로 치환된, 변형된 효소(Q407R_N550F), 449번째 티로신이 글루타민으로 치환되고, 또한 598번째 티로신이 히스티딘으로 치환된, 변형된 효소(Y449Q_Y598H), 550번째 아스파라긴이 페닐알라닌으로 치환되고, 또한 602번째 프롤린이 글루타민으로 치환된, 변형된 효소(N550F_P602Q)를 들 수 있다.
상기 예 3에 해당하는 구체예로서, 407번째 글루타민이 아르기닌으로 치환되고, 또한 449번째 티로신이 글루타민산으로 치환된, 변형된 효소(Q407R_Y449E)를 들 수 있다.
상기 예 4에 해당하는 구체예로서, 550번째 아스파라긴이 페닐알라닌으로 치환되고, 또한 598번째 티로신이 아스파라긴으로 치환된, 변형된 효소(N550F_Y598N)를 들 수 있다.
상기 예 5에 해당하는 구체예(제3군의 아미노산의 복수의 아미노산을 치환 대상으로 한 것)로서, 182번째 프롤린이 류신으로 치환되고, 또한 449번째 티로신이 글루타민산으로 치환된, 변형된 효소(P182L_Y449E), 182번째 프롤린이 류신으로 치환되고, 또한 449번째 티로신이 글루타민으로 치환된, 변형된 효소(P182L_Y449Q), 187번째 티로신이 류신으로 치환되고, 또한 407번째 글루타민이 아르기닌으로 치환된, 변형된 효소(Y187L_Q407R), 187번째 티로신이 류신으로 치환되고, 또한 449번째 티로신이 글루타민산으로 치환된, 변형된 효소(Y187L_Y449E), 187번째 티로신이 류신으로 치환되고, 또한 449번째 티로신이 글루타민으로 치환된, 변형된 효소(Y187L_Y449Q), 187번째 티로신이 류신으로 치환되고, 또한 512번째 세린이 시스테인으로 치환된, 변형된 효소(Y187L_S512C), 187번째 티로신이 류신으로 치환되고, 또한 512번째 세린이 아스파라긴으로 치환된, 변형된 효소(Y187L_S512N), 187번째 티로신이 류신으로 치환되고, 또한 512번째 세린이 트레오닌으로 치환된, 변형된 효소(Y187L_S512T), 188번째 세린이 이소류신으로 치환되고, 또한 407번째 글루타민이 아르기닌으로 치환된, 변형된 효소(S188I_Q407R), 188번째 세린이 이소류신으로 치환되고, 또한 449번째 티로신이 글루타민으로 치환된, 변형된 효소(S188I_Y449Q), 188번째 세린이 이소류신으로 치환되고, 또한 483번째 트레오닌이 글루타민산으로 치환된, 변형된 효소(S188I_T483E), 407번째 글루타민이 류신으로 치환되고, 또한 512번째 세린이 발린으로 치환된, 변형된 효소(Q407L_S512V), 407번째 글루타민이 아르기닌으로 치환되고, 또한 483번째 트레오닌이 글리신으로 치환된, 변형된 효소(Q407R_T483G), 407번째 글루타민이 아르기닌으로 치환되고, 또한 449번째 티로신이 글루타민으로 치환된, 변형된 효소(Q407R_Y449Q), 407번째 글루타민이 아르기닌으로 치환되고, 또한 550번째 아스파라긴이 세린으로 치환된, 변형된 효소(Q407R_N550S), 449번째 티로신이 글루타민으로 치환되고, 또한 550번째 아스파라긴이 세린으로 치환된, 변형된 효소(Y449Q_N550S), 487번째 리신이 트립토판으로 치환되고, 또한 512번째 세린이 트레오닌으로 치환된, 변형된 효소(K487W_S512T), 487번째 리신이 트립토판으로 치환되고, 또한 517번째 아스파라긴산이 리신으로 치환된, 변형된 효소(K487W_D517K), 487번째 리신이 트립토판으로 치환되고, 또한 515번째 아스파라긴이 글리신으로 치환된, 변형된 효소(K487W_N515G), 487번째 리신이 트립토판으로 치환되고, 또한 517번째 아스파라긴산이 트립토판으로 치환된, 변형된 효소(K487W_D517W)를 들 수 있다.
마찬가지로 상기 예 5에 해당하는 구체예(제4군의 아미노산의 복수의 아미노산을 치환 대상으로 한 것)로서, 487번째 리신이 프롤린으로 치환되고, 또한 515번째 아스파라긴이 아르기닌으로 치환된, 변형된 효소(K487P_N515R)를 들 수 있다.
2개 이상의 아미노산이 치환된, 변형된 효소의 보다 구체예로서, 91번째 페닐알라닌이 세린으로 치환되고, 또한 407번째 글루타민이 메티오닌으로 치환된, 변형된 효소(F91S_Q407M), 180번째 트레오닌이 발린으로 치환되고, 또한 187번째 티로신이 류신으로 치환된, 변형된 효소(T180V_Y187L), 180번째 트레오닌이 발린으로 치환되고, 또한 188번째 세린이 이소류신으로 치환된, 변형된 효소(T180V_S188I), 180번째 트레오닌이 발린으로 치환되고, 또한 407번째 글루타민이 아르기닌으로 치환된, 변형된 효소(T180V_Q407R), 180번째 트레오닌이 발린으로 치환되고, 또한 449번째 티로신이 글루타민산으로 치환된, 변형된 효소(T180V_Y449E), 180번째 트레오닌이 발린으로 치환되고, 또한 483번째 트레오닌이 글리신으로 치환된, 변형된 효소(T180V_T483G), 180번째 트레오닌이 발린으로 치환되고, 또한 512번째 세린이 발린으로 치환된, 변형된 효소(T180V_S512V), 180번째 트레오닌이 발린으로 치환되고, 또한 550번째 아스파라긴이 페닐알라닌으로 치환된, 변형된 효소(T180V_N550F), 180번째 트레오닌이 발린으로 치환되고, 또한 615번째 티로신이 프롤린으로 치환된, 변형된 효소(T180V_Y615P), 182번째 프롤린이 류신으로 치환되고, 또한 376번째 아르기닌이 프롤린으로 치환된, 변형된 효소(P182L_R376P), 182번째 프롤린이 트립토판으로 치환되고, 또한 449번째 티로신이 글루타민으로 치환된, 변형된 효소(P182W_Y449Q), 187번째 티로신이 류신으로 치환되고, 또한 487번째 리신이 알라닌으로 치환된, 변형된 효소(Y187L_K487A), 187번째 티로신이 류신으로 치환되고, 또한 512번째 세린이 알라닌으로 치환된, 변형된 효소(Y187L_S512A), 187번째 티로신이 류신으로 치환되고, 또한 533번째 트레오닌이 아스파라긴으로 치환된, 변형된 효소(Y187L_T533N), 376번째 아르기닌이 프롤린으로 치환되고, 또한 407번째 글루타민이 류신으로 치환된, 변형된 효소(R376P_Q407L), 376번째 아르기닌이 프롤린으로 치환되고, 또한 449번째 티로신이 글루타민으로 치환된, 변형된 효소(R376P_Y449Q), 376번째 아르기닌이 프롤린으로 치환되고, 또한 512번째 세린이 발린으로 치환된, 변형된 효소(R376P_S512V), 376번째 아르기닌이 프롤린으로 치환되고, 또한 550번째 아스파라긴이 트립토판으로 치환된, 변형된 효소(R376P_N550W), 376번째 아르기닌이 프롤린으로 치환되고, 또한 550번째 아스파라긴이 티로신으로 치환된, 변형된 효소(R376P_N550Y), 407번째 글루타민이 류신으로 치환되고, 또한 533번째 트레오닌이 글루타민산으로 치환된, 변형된 효소(Q407L_T533E), 407번째 글루타민이 류신으로 치환되고, 또한 570번째 트립토판이 티로신으로 치환된, 변형된 효소(Q407L_W570Y), 407번째 글루타민이 류신으로 치환되고, 또한 615번째 티로신이 류신으로 치환된, 변형된 효소(Q407L_Y615L), 407번째 글루타민이 아르기닌으로 치환되고, 또한 615번째 티로신이 류신으로 치환된, 변형된 효소(Q407R_Y615L), 407번째 글루타민이 아르기닌으로 치환되고, 또한 615번째 티로신이 프롤린으로 치환된, 변형된 효소(Q407R_Y615P), 449번째 티로신이 아스파라긴산으로 치환되고, 또한 598번째 티로신이 페닐알라닌으로 치환된, 변형된 효소(Y449D_Y598F), 449번째 티로신이 글루타민으로 치환되고, 또한 533번째 트레오닌이 글루타민산으로 치환된, 변형된 효소(Y449Q_T533E), 449번째 티로신이 글루타민으로 치환되고, 또한 615번째 티로신이 글리신으로 치환된, 변형된 효소(Y449Q_Y615G), 449번째 티로신이 글루타민으로 치환되고, 또한 615번째 티로신이 프롤린으로 치환된, 변형된 효소(Y449Q_Y615P), 483번째 트레오닌이 글리신으로 치환되고, 또한 512번째 세린이 발린으로 치환된, 변형된 효소(T483G_S512V), 483번째 트레오닌이 글리신으로 치환되고, 또한 550번째 아스파라긴이 세린으로 치환된, 변형된 효소(T483G_N550S), 483번째 트레오닌이 글리신으로 치환되고, 또한 615번째 티로신이 류신으로 치환된, 변형된 효소(T483G_Y615L), 483번째 트레오닌이 글루타민으로 치환되고, 또한 602번째 프롤린이 글루타민으로 치환된, 변형된 효소(T483Q_P602Q), 484번째 아르기닌이 히스티딘으로 치환되고, 또한 487번째 리신이 히스티딘으로 치환된, 변형된 효소(R484H_K487H), 484번째 아르기닌이 트립토판으로 치환되고, 또한 487번째 리신이 아스파라긴산으로 치환된, 변형된 효소(R484W_K487D), 484번째 아르기닌이 트립토판으로 치환되고, 또한 575번째 트레오닌이 트립토판으로 치환된, 변형된 효소(R484W_T575W), 485번째 글리신이 리신으로 치환되고, 또한 488번째 발린이 트립토판으로 치환된, 변형된 효소(G485K_V488W), 485번째 글리신이 리신으로 치환되고, 또한 516번째 티로신이 트립토판으로 치환된, 변형된 효소(G485K_Y516W), 485번째 글리신이 리신으로 치환되고, 또한 517번째 아스파라긴산이 리신으로 치환된, 변형된 효소(G485K_D517K), 485번째 글리신이 리신으로 치환되고, 또한 517번째 아스파라긴산이 트립토판으로 치환된, 변형된 효소(G485K_D517W), 485번째 글리신이 리신으로 치환되고, 또한 569번째 글리신이 트립토판으로 치환된, 변형된 효소(G485K_G569W), 485번째 글리신이 리신으로 치환되고, 또한 571번째 글리신이 리신으로 치환된, 변형된 효소(G485K_G571K), 485번째 글리신이 리신으로 치환되고, 또한 572번째 아르기닌이 트립토판으로 치환된, 변형된 효소(G485K_R572W), 485번째 글리신이 리신으로 치환되고, 또한 573번째 트레오닌이 트립토판으로 치환된, 변형된 효소(G485K_T573W), 485번째 글리신이 트립토판으로 치환되고, 또한 516번째 티로신이 트립토판으로 치환된, 변형된 효소(G485W_Y516W), 485번째 글리신이 트립토판으로 치환되고, 또한 517번째 아스파라긴산이 트립토판으로 치환된, 변형된 효소(G485W_D517W), 485번째 글리신이 트립토판으로 치환되고, 또한 573번째 트레오닌이 리신으로 치환된, 변형된 효소(G485W_T573K), 485번째 글리신이 트립토판으로 치환되고, 또한 573번째 트레오닌이 트립토판으로 치환된, 변형된 효소(G485W_T573W), 487번째 리신이 알라닌으로 치환되고, 또한 512번째 세린이 발린으로 치환된, 변형된 효소(K487A_S512V), 487번째 리신이 글리신으로 치환되고, 또한 515번째 아스파라긴이 글루타민으로 치환된, 변형된 효소(K487G_N515Q), 487번째 리신이 트립토판으로 치환되고, 또한 573번째 트레오닌이 리신으로 치환된, 변형된 효소(K487W_T573K), 487번째 리신이 트립토판으로 치환되고, 또한 593번째 트립토판이 페닐알라닌으로 치환된, 변형된 효소(K487W_W593F), 488번째 발린이 리신으로 치환되고, 또한 514번째 아스파라긴이 리신으로 치환된, 변형된 효소(V488K_N514K), 488번째 발린이 리신으로 치환되고, 또한 517번째 아스파라긴산이 리신으로 치환된, 변형된 효소(V488K_D517K), 488번째 발린이 리신으로 치환되고, 또한 569번째 글리신이 리신으로 치환된, 변형된 효소(V488K_G569K), 488번째 발린이 리신으로 치환되고, 또한 569번째 글리신이 트립토판으로 치환된, 변형된 효소(V488K_G569W), 488번째 발린이 리신으로 치환되고, 또한 572번째 아르기닌이 리신으로 치환된, 변형된 효소(V488K_R572K), 488번째 발린이 리신으로 치환되고, 또한 573번째 트레오닌이 리신으로 치환된, 변형된 효소(V488K_T573K), 488번째 발린이 리신으로 치환되고, 또한 573번째 트레오닌이 트립토판으로 치환된, 변형된 효소(V488K_T573W), 488번째 발린이 리신으로 치환되고, 또한 516번째 티로신이 리신으로 치환된, 변형된 효소(V488K_Y516K), 488번째 발린이 리신으로 치환되고, 또한 516번째 티로신이 트립토판으로 치환된, 변형된 효소(V488K_Y516W), 488번째 발린이 트립토판으로 치환되고, 또한 514번째 아스파라긴이 트립토판으로 치환된, 변형된 효소(V488W_N514W), 488번째 발린이 트립토판으로 치환되고, 또한 573번째 트레오닌이 트립토판으로 치환된, 변형된 효소(V488W_T573W), 500번째 글루타민산이 알라닌으로 치환되고, 또한 501번째 이소류신이 알라닌으로 치환된, 변형된 효소(E500A_I501A), 512번째 세린이 발린으로 치환되고, 또한 550번째 아스파라긴이 세린으로 치환된, 변형된 효소(S512V_N550S), 533번째 트레오닌이 글루타민산으로 치환되고, 또한 550번째 아스파라긴이 세린으로 치환된, 변형된 효소(T533E_N550S), 533번째 트레오닌이 글루타민산으로 치환되고, 또한 615번째 티로신이 글리신으로 치환된, 변형된 효소(T533E_Y615G), 570번째 트립토판이 티로신으로 치환되고, 또한 615번째 티로신이 류신으로 치환된, 변형된 효소(W570Y_Y615L)(이상의 변형된 효소는, 상기한 조건 3 「3당 이상의 함유율이 야생형 효소와 동일한 정도이며 4당의 함유율이 야생형 효소보다 적다」를 만족시킨다), 91번째 페닐알라닌이 발린으로 치환되고, 또한 513번째 글루타민산이 글리신으로 치환된, 변형된 효소(F91V_E513G), 180번째 트레오닌이 발린으로 치환되고, 또한 483번째 트레오닌이 리신으로 치환된, 변형된 효소(T180V_T483K), 180번째 트레오닌이 발린으로 치환되고, 또한 598번째 티로신이 아스파라긴으로 치환된, 변형된 효소(T180V_Y598N), 180번째 트레오닌이 발린으로 치환되고, 또한 615번째 티로신이 글리신으로 치환된, 변형된 효소(T180V_Y615G), 182번째 프롤린이 류신으로 치환되고, 또한 615번째 티로신이 류신으로 치환된, 변형된 효소(P182L_Y615L), 376번째 아르기닌이 프롤린으로 치환되고, 또한 598번째 티로신이 아스파라긴으로 치환된, 변형된 효소(R376P_Y598N), 407번째 글루타민이 류신으로 치환되고, 또한 483번째 트레오닌이 리신으로 치환된, 변형된 효소(Q407L_T483K), 407번째 글루타민이 류신으로 치환되고, 또한 487번째 리신이 프롤린으로 치환된, 변형된 효소(Q407L_K487P), 407번째 글루타민이 류신으로 치환되고, 또한 615번째 티로신이 글리신으로 치환된, 변형된 효소(Q407L_Y615G), 449번째 티로신이 글루타민산으로 치환되고, 또한 487번째 리신이 알라닌으로 치환된, 변형된 효소(Y449E_K487A), 449번째 티로신이 글루타민산으로 치환되고, 또한 487번째 리신이 프롤린으로 치환된, 변형된 효소(Y449E_K487P), 483번째 트레오닌이 글리신으로 치환되고, 또한 487번째 리신이 알라닌으로 치환된, 변형된 효소(T483G_K487A), 483번째 트레오닌이 글리신으로 치환되고, 또한 533번째 트레오닌이 글루타민산으로 치환된, 변형된 효소(T483G_T533E), 483번째 트레오닌이 글리신으로 치환되고, 또한 615번째 티로신이 글리신으로 치환된, 변형된 효소(T483G_Y615G), 483번째 트레오닌이 메티오닌으로 치환되고, 또한 487번째 리신이 알라닌으로 치환된, 변형된 효소(T483M_K487A), 483번째 트레오닌이 메티오닌으로 치환되고, 또한 487번째 리신이 글리신으로 치환된, 변형된 효소(T483M_K487G), 483번째 트레오닌이 메티오닌으로 치환되고, 또한 487번째 리신이 프롤린으로 치환된, 변형된 효소(T483M_K487P), 484번째 아르기닌이 히스티딘으로 치환되고, 또한 487번째 리신이 아스파라긴산으로 치환된, 변형된 효소(R484H_K487D), 484번째 아르기닌이 리신으로 치환되고, 또한 513번째 글루타민산이 트립토판으로 치환된, 변형된 효소(R484K_E513W), 484번째 아르기닌이 리신으로 치환되고, 또한 514번째 아스파라긴이 리신으로 치환된, 변형된 효소(R484K_N514K), 484번째 아르기닌이 리신으로 치환되고, 또한 514번째 아스파라긴이 트립토판으로 치환된, 변형된 효소(R484K_N514W), 484번째 아르기닌이 리신으로 치환되고, 또한 515번째 아스파라긴이 리신으로 치환된, 변형된 효소(R484K_N515K), 484번째 아르기닌이 리신으로 치환되고, 또한 515번째 아스파라긴이 트립토판으로 치환된, 변형된 효소(R484K_N515W), 484번째 아르기닌이 리신으로 치환되고, 또한 517번째 아스파라긴산이 트립토판으로 치환된, 변형된 효소(R484K_D517W), 484번째 아르기닌이 리신으로 치환되고, 또한 569번째 글리신이 리신으로 치환된, 변형된 효소(R484K_G569K), 484번째 아르기닌이 리신으로 치환되고, 또한 571번째 글리신이 리신으로 치환된, 변형된 효소(R484K_G571K), 484번째 아르기닌이 리신으로 치환되고, 또한 572번째 아르기닌이 리신으로 치환된, 변형된 효소(R484K_R572K), 484번째 아르기닌이 리신으로 치환되고, 또한 572번째 아르기닌이 트립토판으로 치환된, 변형된 효소(R484K_R572W), 484번째 아르기닌이 리신으로 치환되고, 또한 573번째 트레오닌이 리신으로 치환된, 변형된 효소(R484K_T573K), 484번째 아르기닌이 리신으로 치환되고, 또한 573번째 트레오닌이 트립토판으로 치환된, 변형된 효소(R484K_T573W), 484번째 아르기닌이 리신으로 치환되고, 또한 516번째 티로신이 리신으로 치환된, 변형된 효소(R484K_Y516K), 484번째 아르기닌이 트립토판으로 치환되고, 또한 515번째 아스파라긴이 리신으로 치환된, 변형된 효소(R484W_N515K), 485번째 글리신이 아스파라긴산으로 치환되고, 또한 487번째 리신이 히스티딘으로 치환된, 변형된 효소(G485D_K487H), 485번째 글리신이 리신으로 치환되고, 또한 487번째 리신이 히스티딘으로 치환된, 변형된 효소(G485K_K487H), 485번째 글리신이 리신으로 치환되고, 또한 569번째 글리신이 리신으로 치환된, 변형된 효소(G485K_G569K), 485번째 글리신이 리신으로 치환되고, 또한 514번째 아스파라긴이 리신으로 치환된, 변형된 효소(G485K_N514K), 485번째 글리신이 리신으로 치환되고, 또한 515번째 아스파라긴이 리신으로 치환된, 변형된 효소(G485K_N515K), 485번째 글리신이 리신으로 치환되고, 또한 515번째 아스파라긴이 트립토판으로 치환된, 변형된 효소(G485K_N515W), 485번째 글리신이 아르기닌으로 치환되고, 또한 487번째 리신이 아스파라긴산으로 치환된, 변형된 효소(G485R_K487D), 485번째 글리신이 트립토판으로 치환되고, 또한 513번째 글루타민산이 트립토판으로 치환된, 변형된 효소(G485W_E513W), 485번째 글리신이 트립토판으로 치환되고, 또한 515번째 아스파라긴이 리신으로 치환된, 변형된 효소(G485W_N515K), 485번째 글리신이 트립토판으로 치환되고, 또한 515번째 아스파라긴이 트립토판으로 치환된, 변형된 효소(G485W_N515W), 487번째 리신이 알라닌으로 치환되고, 또한 531번째 세린이 알라닌으로 치환된, 변형된 효소(K487A_S531A), 487번째 리신이 알라닌으로 치환되고, 또한 593번째 트립토판이 페닐알라닌으로 치환된, 변형된 효소(K487A_W593F), 487번째 리신이 알라닌으로 치환되고, 또한 615번째 티로신이 류신으로 치환된, 변형된 효소(K487A_Y615L), 487번째 리신이 트립토판으로 치환되고, 또한 514번째 아스파라긴이 리신으로 치환된, 변형된 효소(K487W_N514K), 487번째 리신이 트립토판으로 치환되고, 또한 514번째 아스파라긴이 트립토판으로 치환된, 변형된 효소(K487W_N514W), 487번째 리신이 트립토판으로 치환되고, 또한 516번째 티로신이 트립토판으로 치환된, 변형된 효소(K487W_Y516W), 487번째 리신이 트립토판으로 치환되고, 또한 569번째 글리신이 리신으로 치환된, 변형된 효소(K487W_G569K), 487번째 리신이 티로신으로 치환되고, 또한 515번째 아스파라긴이 페닐알라닌으로 치환된, 변형된 효소(K487Y_N515F), 487번째 리신이 티로신으로 치환되고, 또한 515번째 아스파라긴이 트립토판으로 치환된, 변형된 효소(K487Y_N515W), 488번째 발린이 리신으로 치환되고, 또한 515번째 아스파라긴이 리신으로 치환된, 변형된 효소(V488K_N515K), 488번째 발린이 리신으로 치환되고, 또한 515번째 아스파라긴이 트립토판으로 치환된, 변형된 효소(V488K_N515W), 488번째 발린이 트립토판으로 치환되고, 또한 515번째 아스파라긴이 리신으로 치환된, 변형된 효소(V488W_N515K), 488번째 발린이 트립토판으로 치환되고, 또한 515번째 아스파라긴이 트립토판으로 치환된, 변형된 효소(V488W_N515W), 488번째 발린이 티로신으로 치환되고, 또한 515번째 아스파라긴이 트립토판으로 치환된, 변형된 효소(V488Y_N515W), 550번째 아스파라긴이 세린으로 치환되고, 또한 598번째 티로신이 아스파라긴으로 치환된, 변형된 효소(N550S_Y598N), 550번째 아스파라긴이 세린으로 치환되고, 또한 615번째 티로신이 글리신으로 치환된, 변형된 효소(N550S_Y615G), 550번째 아스파라긴이 세린으로 치환되고, 또한 615번째 티로신이 류신으로 치환된, 변형된 효소(N550S_Y615L), 550번째 아스파라긴이 세린으로 치환되고, 또한 615번째 티로신이 프롤린으로 치환된, 변형된 효소(N550S_Y615P)(이상의 변형된 효소는, 상기한 조건 4 「3당 이상의 함유율이 야생형 효소와 동일한 정도이며 4당의 함유율이 야생형 효소보다 많다」를 만족시킨다)를 들 수 있다.
이상의 구체예는 2개의 아미노산이 치환된, 변형된 효소지만, 3개 또는 4개의 아미노산이 치환된, 변형된 효소의 예로서, 484번째 아르기닌이 알라닌으로 치환되고, 485번째 글리신이 알라닌으로 치환되고, 또한 487번째 리신이 아스파라긴산으로 치환된, 변형된 효소(R484A_G485A_K487D), 484번째 아르기닌이 아스파라긴산으로 치환되고, 485번째 글리신이 아스파라긴산으로 치환되고, 또한 487번째 리신이 아스파라긴산으로 치환된, 변형된 효소(R484D_G485D_K487D), 485번째 글리신이 아르기닌으로 치환되고, 486번째 아스파라긴산이 아르기닌으로 치환되고, 또한 487번째 리신이 리신아르기닌으로 치환된, 변형된 효소(G485R_D486R_K487R), 484번째 아르기닌이 알라닌으로 치환되고, 485번째 글리신이 알라닌으로 치환되고, 486번째 아스파라긴산이 알라닌으로 치환되고, 또한 487번째 리신이 알라닌으로 치환된, 변형된 효소(R484A_G485A_D486A_K487A), 484번째 아르기닌이 알라닌으로 치환되고, 485번째 글리신이 알라닌으로 치환되고, 486번째 아스파라긴산이 프롤린으로 치환되고, 또한 487번째 리신이 프롤린으로 치환된, 변형된 효소(R484A_G485A_D486P_K487P)(이상의 변형된 효소는, 상기한 조건 3 「3당 이상의 함유율이 야생형 효소와 동일한 정도이며 4당의 함유율이 야생형 효소보다 적다」를 만족시킨다), 484번째 아르기닌이 알라닌으로 치환되고, 485번째 글리신이 알라닌으로 치환되고, 또한 487번째 리신이 아스파라긴산으로 치환된, 변형된 효소(R484A_G485A_K487D), 484번째 아르기닌이 시스테인으로 치환되고, 486번째 아스파라긴산이 히스티딘으로 치환되고, 또한 487번째 리신이 아르기닌으로 치환된, 변형된 효소(R484C_D486H_K487R), 485번째 글리신이 아르기닌으로 치환되고, 486번째 아스파라긴산이 트립토판으로 치환되고, 또한 487번째 리신이 트립토판으로 치환된, 변형된 효소(G485R_D486W_K487W), 485번째 글리신이 아르기닌으로 치환되고, 486번째 아스파라긴산이 알라닌으로 치환되고, 또한 487번째 리신이 알라닌으로 치환된, 변형된 효소(G485R_D486A_K487A), 485번째 글리신이 아르기닌으로 치환되고, 486번째 아스파라긴산이 프롤린으로 치환되고, 또한 487번째 리신이 프롤린으로 치환된, 변형된 효소(G485R_D486P_K487P), 484번째 아르기닌이 알라닌으로 치환되고, 485번째 글리신이 알라닌으로 치환되고, 486번째 아스파라긴산이 알라닌으로 치환되고, 또한 487번째 리신이 알라닌으로 치환된, 변형된 효소(R484A_G485A_D486A_K487A), 484번째 아르기닌이 알라닌으로 치환되고, 485번째 글리신이 알라닌으로 치환되고, 486번째 아스파라긴산이 아르기닌으로 치환되고, 또한 487번째 리신이 아르기닌으로 치환된, 변형된 효소(R484A_G485A_D486R_K487R), 484번째 아르기닌이 아스파라긴산으로 치환되고, 485번째 글리신이 아스파라긴산으로 치환되고, 486번째 아스파라긴산이 아르기닌으로 치환되고, 또한 487번째 리신이 아르기닌으로 치환된, 변형된 효소(R484D_G485D_D486R_K487R), 484번째 아르기닌이 아스파라긴산으로 치환되고, 485번째 글리신이 아스파라긴산으로 치환되고, 486번째 아스파라긴산이 프롤린으로 치환되고, 또한 487번째 리신이 프롤린으로 치환된, 변형된 효소(R484D_G485D_D486P_K487P), 484번째 아르기닌이 아스파라긴산으로 치환되고, 485번째 글리신이 아스파라긴산으로 치환되고, 486번째 아스파라긴산이 알라닌으로 치환되고, 또한 487번째 리신이 알라닌으로 치환된, 변형된 효소(R484D_G485D_D486A_K487A), 484번째 아르기닌이 아스파라긴산으로 치환되고, 485번째 글리신이 아스파라긴산으로 치환되고, 486번째 아스파라긴산이 트립토판으로 치환되고, 또한 487번째 리신이 트립토판으로 치환된, 변형된 효소(R484D_G485D_D486W_K487W), 484번째 아르기닌이 프롤린으로 치환되고, 485번째 글리신이 프롤린으로 치환되고, 486번째 아스파라긴산이 아르기닌으로 치환되고, 또한 487번째 리신이 아르기닌으로 치환된, 변형된 효소(R484P_G485P_D486R_K487R)(이상의 변형된 효소는, 상기한 조건 4 「3당 이상의 함유율이 야생형 효소와 동일한 정도이며 4당의 함유율이 야생형 효소보다 많다」를 만족시킨다)를 들 수 있다.
이상의 변형된 효소는, 기준 β-갈락토시다아제의 특정한 아미노산을 다른 아미노산으로 치환하여 얻어진다. 본 발명자들의 검토에 의해, 이와 같은 아미노산 치환 변이체 이외에도, 유용한 변형된 효소로서, 아미노산 서열의 특정한 위치에 아미노산이 삽입된 것(삽입 변이체), 및 아미노산 서열의 특정한 아미노산이 결실한 것(결실 변이체), 또한 결실 변이체에 아미노산 치환을 가한 것이 발견되었다. 이에, 본 발명의 일태양에서는, 서열번호 1∼4 중 어느 하나의 아미노산 서열, 또는 서열번호 1∼4 중 어느 하나로 나타내는 아미노산 서열과 90% 이상 동일한 아미노산 서열로 이루어지는 β-갈락토시다아제에 대하여, 이하의 변형이 행해진 변형된 효소가 제공된다.
(a) 484번째 아르기닌(R484)∼487번째 리신(K487), 또는 이것에 상당하는 영역의 결실
(b) 514번째 아스파라긴(N514)과 515번째 아스파라긴(N515)의 사이, 또는 이것에 상당하는 위치에 아미노산의 삽입
(c) 604번째 프롤린(P604)과 605번째 티로신(Y605)의 사이, 또는 이것에 상당하는 위치에 아미노산의 삽입
(d) 485번째 글리신(G485) 또는 이것에 상당하는 아미노산의 결실에 더하여, 486번째 아스파라긴산(D486) 또는 이것에 상당하는 아미노산의 다른 아미노산으로의 치환
(e) 485번째 글리신(G485)∼486번째 아스파라긴산(D486), 또는 이것에 상당하는 영역의 결실에 더하여, 487번째 리신(K487) 또는 이것에 상당하는 아미노산의 다른 아미노산으로의 치환
(f) 485번째 글리신(G485)∼486번째 아스파라긴산(D486), 또는 이것에 상당하는 영역의 결실에 더하여, 484번째 아르기닌(R484) 또는 이것에 상당하는 아미노산의 다른 아미노산으로의 치환, 및 487번째 리신(K487) 또는 이것에 상당하는 아미노산의 다른 아미노산으로의 치환
(g) 484번째 아르기닌(R484)과 485번째 글리신(G485)의 사이, 또는 이것에 상당하는 위치에 아미노산의 삽입
(h) 485번째 글리신(G485)과 486번째 아스파라긴산(D486)의 사이, 또는 이것에 상당하는 위치에 아미노산의 삽입
(d)∼(f)에 관하여, 바람직하게는, 치환 후의 아미노산은, R484에 대하여는 트립토판 또는 프롤린이며, D486에 대하여는 히스티딘이며, K487에 대하여는 아르기닌, 트립토판 또는 프롤린이다. 한편, (b), (c), (g), (h)에 관하여, 삽입되는 아미노산의 수는, 예를 들면 1∼10 개이며, 바람직하게는 2∼8 개이다. 이하, 표기 방법과 함께, 상기 (a)∼(g)의 구체예를 나타낸다.
<표기 방법>
「N514-F-F-N515」는, N514와 N515의 사이에 F(페닐알라닌)를 2개 삽입한 변형된 효소인 것을 나타낸다.
「Δ484-487」은, 484번째 아미노산∼487번째 아미노산을 결실시킨 변형된 효소인 것을 나타낸다.
「Δ485-486_K487R」는, 485번째 아미노산∼486번째 아미노산을 결실시키고, 또한 487번째 아미노산을 R(아르기닌)으로 치환한 변형된 효소인 것을 나타낸다.
<변형된 효소의 구체예>
(A) 상기한 조건 3 「3당 이상의 함유율이 야생형 효소와 동일한 정도이며 4당의 함유율이 야생형 효소보다 적다」를 만족시키는 변형된 효소
Δ484-487
N514-F-F-N515
N514-W-W-N515
P604-W-W-Y605
P604-A-A-A-A-Y605
P604-F-F-F-F-Y605
(B) 상기한 조건 4 「3당 이상의 함유율이 야생형 효소와 동일한 정도이며 4당의 함유율이 야생형 효소보다 많다」를 만족시키는 변형된 효소
Δ485_D486H
Δ485-486_K487R
Δ485-486_R484W_K487W
Δ485-486_R484P_K487P
R484-A-A-G485
R484-F-F-G485
R484-K-K-G485
R484-P-P-G485
R484-R-R-G485
R484-S-S-G485
R484-W-W-G485
G485-S-S-S-D486
R484-A-A-A-A-G485
R484-D-D-D-D-G485
R484-F-F-F-F-G485
R484-P-P-P-P-G485
R484-R-R-R-R-G485
R484-S-S-S-S-G485
R484-W-W-W-W-G485
R484-A-A-A-A-A-A-A-A-G485
R484-D-D-D-D-D-D-D-D-G485
R484-F-F-F-F-F-F-F-F-G485
R484-K-K-K-K-K-K-K-K-G485
R484-P-P-P-P-P-P-P-P-G485
여기서, 후술하는 실시예에 나타낸 바와 같이, 제1군의 아미노산∼제6군의 아미노산을 동정하는 경우와는 상이한 어프로치에 의해, 효소의 특이성의 변화에 유용한 다른 아미노산 잔기도 발견되었다. 전술한 성과에 기초하여 본 발명은, 또한 이하의 변형된 β-갈락토시다아제 효소를 제공한다. 즉, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 β-갈락토시다아제에 있어서, 상기한 치환에 더하여, 1540번째 트립토판(W1540)이 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열로 이루어지는 변형된 β-갈락토시다아제이다. 치환 후의 아미노산은, 바람직하게는, 알라닌, 시스테인, 아스파라긴산, 글루타민산, 페닐알라닌, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 리신, 류신, 메티오닌, 아스파라긴, 프롤린, 글루타민, 아르기닌, 세린, 트레오닌 또는 발린이다. 전술한 태양의 변형된 효소는, 조합하는 상기한 치환에 기인하는 특성에 더하여, 이것을 사용하면 4당의 함유량이 많아지는 점에 있어서 유용성이 높다.
검토를 진행한 결과, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 β-갈락토시다아제의 경우, 4당의 함유량이 많아지는 점에서 특히 유용성이 높은, 치환 대상의 아미노산으로서, 487번째 리신(K487), 514번째 아스파라긴(N514), 515번째 아스파라긴(N515)이 특정되었다. 치환 후의 아미노산은, 바람직하게는, 하기와 같다.
487번째 리신(K487)에 대한 치환 후 아미노산은 글리신 또는 프롤린.
514번째 아스파라긴(N514)에 대한 치환 후 아미노산은 트립토판.
515번째 아스파라긴(N515)에 대한 치환 후 아미노산은 리신 또는 트립토판.
그런데, 바실러스·서큐란스 유래 β-갈락토시다아제의 하나가 WO2010/098561에 나타나 있다. 상기 β-갈락토시다아제에 대하여, 본 명세서가 개시하는 아미노산 치환에 상당하는 변이를 행하여, 변형된 β-갈락토시다아제를 취득하는 것도 가능하다. 그리고, WO2010/098561이 개시하는 β-갈락토시다아제를 코딩하는 서열은, 본원에서의 기준 β-갈락토시다아제의 하나를 코딩하는 서열(서열번호 5)과 약70%의 동일성을 나타낸다.
(변형된 β-갈락토시다아제를 코딩하는 핵산 등)
본 발명의 제2 태양은 본 발명의 변형된 효소와 관련된 핵산을 제공한다. 즉, 변형된 효소를 코딩하는 유전자, 변형된 효소를 코딩하는 핵산을 동정하기 위한 프로브로서 사용할 수 있는 핵산, 변형된 효소를 코딩하는 핵산을 증폭 또는 돌연변이 등을 만들기 위한 프라이머로서 사용할 수 있는 핵산이 제공된다.
변형된 효소를 코딩하는 유전자는 전형적으로는 변형된 효소의 조제에 이용된다. 변형된 효소를 코딩하는 유전자를 사용한 유전자 공학적 조제법에 의하면, 보다 균질인 상태의 변형된 효소를 얻는 것이 가능하다. 또한, 전술한 방법은 대량의 변형된 효소를 조제하는 경우에도 바람직한 방법이라고 할 수 있다. 그리고, 변형된 효소를 코딩하는 유전자의 용도는 변형된 효소의 조제에 한정되지 않는다. 예를 들면, 변형된 효소의 작용 기구(機構)의 규명 등을 목적으로 한 실험용 툴로서, 또는 효소의 또한 변형체를 디자인 또는 제작하기 위한 툴로서, 상기 핵산을 이용할 수도 있다.
본 명세서에 있어서「변형된 효소를 코딩하는 유전자」란, 그것을 발현시켰을 경우에 상기 변형된 효소를 얻을 수 있는 핵산을 말하며, 상기 변형된 효소의 아미노산 서열에 대응하는 염기 서열을 가지는 핵산은 물론, 이와 같은 핵산에 아미노산 서열을 코딩하지 않는 서열이 부가되어 이루어지는 핵산도 포함한다. 또한, 코돈의 축중(縮重)도 고려된다.
본 발명의 핵산은, 본 명세서 또는 첨부한 서열목록이 개시하는 서열 정보를 참고로 하여, 표준적인 유전자 공학적 방법, 분자 생물학적 방법, 생화학적 방법 등을 사용함으로써, 단리된 상태로 조제할 수 있다.
본 발명의 다른 태양에서는, 본 발명의 변형된 효소를 코딩하는 유전자의 염기 서열과 비교한 경우에 그것이 코딩하는 단백질의 기능은 동등하지만 일부에 있어서 염기 서열이 상이한 핵산(이하, 「상동 핵산」이라고도 한다. 또한, 상동 핵산을 규정하는 염기 서열을 「상동 염기 서열」이라고 한다)이 제공된다. 상동 핵산의 예로서, 본 발명의 변형된 효소를 코딩하는 핵산의 염기 서열을 기준으로 하여 1 또는 복수의 염기의 치환, 결실, 삽입, 부가, 또는 역위를 포함하는 염기 서열로 이루어지고, 변형된 효소에 특징적인 효소 활성을 가지는 단백질을 코딩하는 DNA를 들 수 있다. 염기의 치환이나 결실 등은 복수의 부위에 발생할 수도 있다. 여기서의 「복수」란, 상기 핵산이 코딩하는 단백질의 입체 구조에서의 아미노산 잔기의 위치나 종류에 의해서도 상이하며, 예를 들면 2∼40 염기, 바람직하게는 2∼20 염기, 더욱 바람직하게는 2∼10 염기이다.
이상과 같은 상동 핵산은, 예를 들면, 제한 효소 처리, 엑소뉴클레아제나 DNA 리가아제 등에 의한 처리, 위치 지정 돌연변이 도입법(Molecular Cloning, Third Edition, Chapter 13, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York)이나 랜덤 돌연변이 도입법(Molecular Cloning, Third Edition, Chapter 13, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York)에 따른 변이의 도입 등에 의해 얻어진다. 또한, 자외선 조사(照射) 등 다른 방법에 의해서도 상동 핵산을 얻을 수 있다.
본 발명의 다른 태양은, 본 발명의 변형된 효소를 코딩하는 유전자의 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열을 가지는 핵산에 관한 것이다. 본 발명의 또 다른 태양은, 본 발명의 변형된 효소를 코딩하는 유전자의 염기 서열, 또는 거기에 상보적인 염기 서열에 대하여 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 99.9% 동일한 염기 서열을 가지는 핵산을 제공한다.
본 발명의 한 다른 태양은, 본 발명의 변형된 효소를 코딩하는 유전자의 염기 서열 또는 그의 상동 염기 서열에 상보적인 염기 서열에 대하여 엄중 조건(stringent condition) 하에서 하이브리다이즈하는 염기 서열을 가지는 핵산에 관한 것이다. 여기서의 「엄중 조건」이란, 이른바 특이적인 하이브리드가 형성되고, 비특이적인 하이브리드가 형성되지 않은 조건을 말한다. 이와 같은 엄중 조건은 당업자에게 공지되어 있으며, 예를 들면, Molecular Cloning(Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York)이나 Current protocols in molecular biology(edited by Frederick M. Ausubel et al., 1987)을 참조하여 설정할 수 있다. 엄중 조건으로서, 예를 들면, 하이브리다이제이션액(50% 포름아미드, 10×SSC(0.15M NaCl, 15mM sodium citrate, pH 7.0), 5×Denhardt 용액, 1% SDS, 10% 덱스트란 황산, 10μg/ml의 변성 연어 정자 DNA, 50mM 인산 버퍼(pH 7.5))을 사용하여 약 42℃∼약 50℃에서 인큐베이션하고, 그 후 0.1×SSC, 0.1% SDS를 사용하여 약 65℃∼약 70℃로 세정하는 조건을 들 수 있다. 더욱 바람직한 엄중 조건으로서, 예를 들면, 하이브리다이제이션액으로서 50% 포름아미드, 5×SSC(0.15M NaCl, 15mM sodium citrate, pH 7.0), 1×Denhardt 용액, 1% SDS, 10% 덱스트란 황산, 10μg/ml의 변성 연어 정자 DNA, 50mM 인산 버퍼(pH 7.5))를 사용하는 조건을 들 수 있다.
본 발명의 또 다른 태양은, 본 발명의 변형된 효소를 코딩하는 유전자의 염기 서열, 또는 거기에 상보적인 염기 서열의 일부를 가지는 핵산(핵산 단편)을 제공한다. 이와 같은 핵산 단편은, 본 발명의 변형된 효소를 코딩하는 유전자의 염기 서열을 가지는 핵산 등을 검출, 확인, 및/또는 증폭하는 것 등에 사용할 수 있다. 핵산 단편은, 예를 들면, 본 발명의 변형된 효소를 코딩하는 유전자의 염기 서열에 있어서 연속하는 뉴클레오티드 부분(예를 들면, 약 10∼약 100 염기 길이, 바람직하게는 약 20∼약 100 염기 길이, 더욱 바람직하게는 약30∼약 100 염기 길이)에 하이브리다이즈하는 부분을 적어도 포함하도록 설계된다. 프로브로서 이용되는 경우에는 핵산 단편을 표지화할 수 있다. 표지화에는, 예를 들면, 형광 물질, 효소, 방사성 동위 원소를 사용할 수 있다.
본 발명의 또 다른 태양은, 본 발명의 유전자(변형된 효소를 코딩하는 유전자)를 포함하는 재조합 DNA에 관한 것이다. 본 발명의 재조합 DNA는, 예를 들면, 벡터의 형태로 제공된다. 본 명세서에 있어서 용어 「벡터」는, 거기에 삽입된 핵산을 세포 등의 타겟 내로 수송할 수 있는 핵산성 분자를 말한다.
사용 목적(클로닝, 단백질의 발현)에 따라, 또한 숙주 세포의 종류를 고려하여 적절한 벡터가 선택된다. 대장균을 숙주로 하는 벡터로서는 M13 파지 또는 그의 변형체, λ 파지 또는 그의 변형체, pBR322 또는 그의 변형체(pB325, pAT153, pUC8 등) 등, 효모를 숙주로 하는 벡터로서는 pYepSec1, pMFa, pYES2 등, 곤충 세포를 숙주로 하는 벡터로서는 pAc, pVL 등, 포유류 세포를 숙주로 하는 벡터로서는 pCDM8, pMT2PC 등을 예시할 수 있다.
본 발명의 벡터는 바람직하게는 발현 벡터이다. 「발현 벡터」란, 거기에 삽입된 핵산을 목적으로 하는 세포(숙주 세포) 내에 도입할 수 있고, 또한 상기 세포 내에 있어서 발현시키는 것이 가능한 벡터를 말한다. 발현 벡터는 통상, 삽입된 핵산의 발현에 필요한 프로모터 서열이나, 발현을 촉진시키는 인핸서 서열 등을 포함한다. 선택 마커를 포함하는 발현 벡터를 사용할 수도 있다. 이러한 발현 벡터를 사용한 경우에는, 선택 마커를 이용하여 발현 벡터의 도입의 유무(및 그 정도)를 확인할 수 있다.
본 발명의 핵산의 벡터로의 삽입, 선택 마커 유전자의 삽입(필요한 경우), 프로모터의 삽입(필요한 경우) 등은 표준적인 재조합 DNA 기술(예를 들면, Molecular Cloning, Third Edition, 1.84, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York을 참조할 수 있는, 제한 효소 및 DNA 리가아제를 사용한 주지의 방법)을 사용하여 행할 수 있다.
숙주 세포로서는, 취급의 용이성을 고려하여, 대장균(에세리키아·코리(Esherichia coli)), 출아 효모(사카로마이세스·세레비시에(Saccharomyces cerevisiae)) 등의 미생물을 사용하는 것이 바람직하지만, 재조합 DNA가 복제 가능하고, 또한 변형된 효소의 유전자가 발현 가능한 숙주 세포이면 이용 가능하다. 대장균의 예로서 T7계 프로모터를 이용하는 경우에는 대장균 BL21(DE3) pLysS, 그렇지 않은 경우에는 대장균 JM109를 들 수 있다. 또한, 출아 효모의 예로서 출아 효모 SHY2, 출아 효모 AH22 또는 출아 효모 INVSc1(인비트로젠사)d을 들 수 있다.
본 발명의 다른 태양은, 본 발명의 재조합 DNA를 보유하는 미생물(즉 형질 전환체)에 관한 것이다. 본 발명의 미생물은, 상기 본 발명의 벡터를 사용한 트랜스펙션 내지는 변환에 의해 얻을 수 있다. 예를 들면, 염화 칼슘법(저널 오브 몰레큘러 바이올로지(J. Mol. Biol.), 제53권, 제159페이지 (1970)), 하나한(Hanahan)법(저널 오브 몰레큘러 바이올로지, 제166권, 제557페이지 (1983)), SEM법(진(Gene), 제96권, 제23 페이지(1990)), 장(Chung) 등의 방법(프로시딩즈 오브 더 내쇼날 아카데미 오브 사이언시즈 오브 더 USA, 제86권, 제2172페이지(1989)), 인산 칼슘 공침강법, 일렉트로포레이션(Potter, H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 7161-7165(1984)), 리포펙션(Felgner, P. L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84, 7413-7417(1984)) 등에 의해 실시할 수 있다. 그리고, 본 발명의 미생물은, 본 발명의 변형된 효소를 생산하는 것에 이용할 수 있다.
(변형된 β-갈락토시다아제를 포함하는 효소제)
본 발명의 변형된 효소는, 예를 들면, 효소제의 형태로 제공된다. 효소제는, 유효 성분(본 발명의 변형된 효소) 외에, 부형제(賦形劑), 완충제, 현탁 제, 안정제, 보존제, 방부제, 생리 식염수 등을 함유하고 있어도 된다. 부형제로서는 전분, 덱스트린, 말토오스, 트레할로오스, 유당, D-글루코오스, 소르비톨, D-만니톨, 백당(白糖), 글리세롤 등을 사용할 수 있다. 완충제로서는 인산염, 구연산염, 아세트산염 등을 사용할 수 있다. 안정제로서는 프로필렌글리콜, 아스코르브산 등을 사용할 수 있다. 보존제로서는 페놀, 염화 벤잘코늄, 벤질알코올, 클로로부탄올, 메틸파라벤 등을 사용할 수 있다. 방부제로서는 에탄올, 염화 벤잘코늄, 파라옥시벤조산, 클로로부탄올 등을 사용할 수 있다.
(변형된 β-갈락토시다아제의 용도)
본 발명의 더 한층의 국면은 변형된 효소 또는 효소제의 용도를 제공한다. 용도의 예는, 갈락토올리고당은 제조, 유당불내증 환자를 위한 의약이나 서플리먼트의 제조·가공, 유제품(저유당 우유 등의 가공유, 분유(탈지분유, 육아 분유 등), 요구르트 등)의 제조·가공, 의료용 식품(메디컬 푸드)의 제조·가공을 들 수 있다.
본 발명의 변형된 효소는 갈락토올리고당의 제조에 특히 유용하다. 갈락토올리고당의 제조에 있어서는, 예를 들면, 미리 가열 용해시킨 유당액(예를 들면 30%∼50%의 유당, pH 7.0)에 소정량(예를 들면, 50 U∼1000 U)의 변형된 효소를 가하고, 40℃ 전후에서 1∼10 시간 방치하여, 갈락토올리고당을 생성시킨다. 그리고, 갈락토올리고당은 Gal-(Gal)n-Glc(n은 0∼5 정도)로 표시된다(Gal: 갈락토스 잔기, Glc: 글루코오스 잔기). 결합 양식에는 β1-6, β1-3, β1-4, β1-2 외에, α1-3, α1-6 등이 있다.
특성이 상이한 복수의 변형된 효소를 이용하면, 다양한 갈락토올리고당을 은 분류하여 만들 수 있다. 이와 같은 이용 형태는, 예를 들면, 모유 중에 포함되는 갈락토올리고당의 프로파일(갈락토올리고당의 종류 및 비율)의 재현에 유효하다.
변형된 효소는 야생형 효소와 특성이 상이하다. 따라서, 변형된 효소와 야생형 효소의 병용에 의해, 야생형 효소 단독으로는 제조할 수 없었던(또는 그 제조에 적합하지 않았던) 갈락토올리고당을 제조하는 것이 가능하게 된다. 특성이 상이한 복수의 변형된 효소와 야생형 효소를 병용하게 되면, 제조되는 갈락토올리고당의 종류를 더욱 증가시킬 수 있다. 이와 같이 변형된 효소(1 종류 또는 2 종류 이상)와 야생형 효소의 병용도, 다양한 갈락토올리고당을 구별하여 만드는 것에 유효하다.
그리고, 복수의 효소(복수의 변형된 효소의 병용, 또는 야생형 효소와 1 종류 또는 2 종류 이상의 변형된 효소의 병용)를 사용하여 갈락토올리고당(복수 종류의 갈락토올리고당의 혼합물)을 얻는 방법은, 각 효소를 따로 따로 사용하여 제조한 갈락토올리고당을 혼합하는 방법, 원료(유당)에 대하여 동시에 복수의 효소를 작용시키는 방법, 및 원료에 대하여 복수의 효소를 단계적으로 작용하게 하는 방법으로 크게 나눌 수 있다.
[실시예]
<유효한 변이 위치의 특정 1>
1. 목적
바실러스·서큐란스 유래의 β-갈락토시다아제는 공업적인 갈락토올리고당 제조에 있어서 중요한 효소이지만, 이것을 사용하여 제조한 갈락토올리고당은 균일성이 높고, 제조 조건 등을 조정하더라도, 제조되는 갈락토올리고당의 조성(프로파일)을 변화시키는 것은 곤란하다. 종래에는, 상기 효소의 입체 구조 정보를 취득하는 것은 곤란하였고, 그 기능와 관련된 아미노산의 특정은 용이하지 않았다. 이에, 갈락토올리고당의 제조에 유용한 변형된 효소를 창출하는 것을 목표로 하여, 컴퓨터 시뮬레이션을 활용함으로써 유효한 변이 위치의 특정을 시도했다.
2. 방법·결과
(1) 입체 구조 예측과 변이체(변형된 β-갈락토시다아제)의 설계
(1-1) 1차 서열로부터의 입체 구조 예측과 변이점의 설계
바실러스·서큐란스 유래의 β-갈락토시다아제는 락토오스의 가수분해 및 갈락토실기 전이 반응(갈락토올리고당의 제조)을 행한다. 지금까지의 연구에 의하면, 바실러스·서큐란스가 생산하는 β-갈락토시다아제는 분자량이 상이한 4종류의 효소, 즉 분자량 195 kD의 β-갈락토시다아제(BgaD-A, 서열번호 1), 분자량 160 kD의 β-갈락토시다아제(BgaD-B, 서열번호 2), 분자량 135 kD의 β-갈락토시다아제(BgaD-C, 서열번호 3), 및 분자량 86 kD의 β-갈락토시다아제(BgaD-D, 서열번호 4)로 구성되어 있는 것으로 알려져 있다(특허 문헌 1, 비특허 문헌 1). 이 중에서, 분자량이 최소인 BgaD-D는, 효소 활성이 있는 최소 사이즈의 β-갈락토시다아제이며, 가장 당전이 활성이 높다.
전술한 바와 같이, 바실러스·서큐란스 유래의 β-갈락토시다아제의 입체 구조 정보를 취득하는 것은 곤란했다. 이에, 컴퓨터 시뮬레이션을 활용하여, 입체 구조의 예측을 행하였다. 데이터베이스(Protein Data Bank (http://www.pdb.org/))에 등록되어 있는 입체 구조 정보로부터, β-갈락토시다아제 활성을 가지는 효소의 입체 구조 정보를 추출하여, 바실러스·서큐란스 유래의 β-갈락토시다아제의 1차 서열에 상동성이 있는 것을 검색했다. 구체적으로는, 바실러스·서큐란스 유래의 β-갈락토시다아제의 1차 서열을 기준으로 하여, 상동성이 높은 것으로 예측되는 입체 구조를 탐색했다. 그 결과, 3GM8(beta-glycosidase from Bacteroides vulgatus)라는 구조를 찾아냈다(도 1). 다음으로, 3GM8을 템플레이트로 하여 모델링한 입체 구조를 바탕으로, 활성 중심의 주위에 있는 루프 서열을 확인했다. 이와 같이 하여 구축한 입체 구조 모델을 사용함으로써, 바실러스·서큐란스 유래의 β-갈락토시다아제의 기질 포켓을 구성하는 아미노산 중에서, 기질에 접촉하는 것으로 여겨지는 아미노산을 예측했다. 또한, 루프상의 아미노산에 주목하여, 변이 도입점을 디자인했다.
(1-2) 플라스미드 구축과 변이체의 생산
변이 도입점의 아미노산을 무작위로 치환하였다. 실제 변이 도입은, BgaD-D형의 DNA를 코딩하는 플라스미드를 템플레이트로 한 PCR로 행하였다. 1개소의 변이 도입점에 대하여 8∼19 종류의 치환 아미노산을 디자인하고, 실제로 변이 도입을 행하였다. 각 변이에 대응하는 프라이머를 설계하고, KOD plus Mutagenesis kit(Toyobo사)를 사용하여 inverse PCR법으로 변이 도입을 행하였다. 제품의 프로토콜에 따라, PCR 산물을 셀프라이게이션한 후에 대장균 DH5alpha로 형질 전환했다. 미니프렙으로 플라스미드를 얻은 후에 시퀀싱하고, 변이를 확인하였다. 또한, 대장균 BL21로 형질 전환하여, 이하의 프로토콜로 단백질(변이체)을 발현시켰다(도 2).
<프로토콜>
1. 1.5 mL LB+amp로 전배양(37℃, 하룻밤)
2. 0.06 mL 전 배양 후의 배양액을 3 mL LB+amp에 가한다
3. 37℃, 4시간 배양
4. 시험관을 얼음 위에 옮기로, 0.75μL 1 M IPTG를 가한다
5. 15℃, 24시간 배양
6. 집균하고 인산 버퍼(pH 7.4)로 세정
7. 0.25 mL 인산 버퍼(pH7.4)에 현탁
8. 소니케이터로 초음파 파쇄(30초×3회)
9. 원심분리로 상청액을 회수
이상의 방법으로 조제한 대장균 추출액을 변이체(변형된 β-갈락토시다아제)로서 사용하였다.
또한, 활성 확인을 위해 변이체를 정제하였다. 각 변이체는, N말단에 HIS 태그를 부탁한 융합 단백질로서 발현하고 있으므로, 니켈 컬럼 HISTrap HP1 ml(GE 헬스케어사)로 정제를 행하였다. 각 조작에 사용한 버퍼는 하기와 같다.
결합용 버퍼(20mM 인산 나트륨, 0.2M NaCl, 20mM 이미다졸, pH 7.4)
용출용 버퍼(10mM 인산 나트륨, 0.1M NaCl, 0.25M 이미다졸, pH 7.4)
결합용 버퍼로 컬럼에 결합시킨 후, 상기 버퍼로 세정하였다. 그 후, 결합 성분을 용출용 버퍼로 컬럼으로부터 용출했다. 용출 획분을 샘플로 하여 SDS-PAGE 및 가수분해 활성의 측정을 행하여, 효소의 정제도를 확인하였다.
(1-3) 가수분해 활성의 평가
가수분해 측정은 과거 문헌(특허 문헌 1)을 참고로 하여 행하였다. 기질로서 ο-Nitrophenyl-β-D-galactopyranoside(ONPG), 유당, 알로락토오스의 3 종류를 사용하여, 이하에 나타낸 방법으로 각각의 활성을 측정하였다.
(a) LSU 활성: ONPG법
락타아제가 ONPG(최종 농도 20 mM)에 pH 6.0, 40℃에서 작용할 때, 반응 초기의 1분간 1㎛ol의 ONP를 생성하는 효소량을 1 LSU로 한다.
(b) LU 활성: 유당 분해력법
락타아제가 유당(최종 농도 10%)에 pH 6.0, 40℃에서 작용할 때, 반응 초기의 1분간 1㎛ol의 글루코오스를 생성하는 효소량을 1 LU로 한다.
(c) 알로락토오스 분해 활성: 알로락토오스 분해력법
락타아제가 알로락토오스(최종 농도 1%)에 pH 6.0, 40℃에서 작용할 때, 반응 초기의 1분간 1㎛ol의 글루코오스를 생성하는 효소량을 1 U로 한다.
(d) 1% 락토스 분해 활성: 유당 분해력법
락타아제가 유당(최종 농도 1%)에 pH 6.0, 40℃에서 작용할 때, 반응 초기의 1분간 1㎛ol의 글루코오스를 생성하는 효소량을 1 U로 한다.
이상의 측정에 의해, 야생형와 비교하여 기질 선택성이 변화하는 변이점을 찾았다.
(1-4) 갈락토올리고당(GOS) 합성 활성의 평가
갈락토올리고당(GOS) 합성 활성의 평가는 고농도 유당액을 기질로 한 올리고당 합성 반응을 행하고, 반응성 생물을 HPLC에 의해 분석하였다. 지금까지의 연구에 의하면, 유당을 기질로 한 경우에는 최종 농도 50% 정도, pH 6 부근에서 효소 반응을 행함으로써, 고수율의 GOS 합성을 행할 수 있는 것으로 보고되어 있다(일본공개특허 평11-18763호 공보). 이 보고에 기재된 방법(실시예 2의 방법)에 준하여 GOS 합성을 행하였다. 생성된 GOS의 조성을 이하의 컬럼을 사용하여 분석하였다.
겔 여과 컬럼: MCIGEL CK04S(미쓰비시화성)
아미드 컬럼: NH2P-40 3E(쇼와전공)
해석의 결과에 기초하여, 전체 당량(糖量) 중의 4당의 올리고당의 함유율, 3당 이상의 올리고당의 함유율, 알로락토오스의 함유율을 측정하여 표를 작성하였다.
(2) 알로락토오스에 대한 가수분해 활성의 저하 또는 향상을 가져오는 변이점
전체 변이체와 야생형의 재조합 발현 효소에 대하여, LSU 활성, LU 활성, 알로락토오스 분해 활성 및 1% 락토스 분해 활성을 측정하였다. 처음에, LSU 활성과 LU 활성으로부터, 효소 활성이 소실된 변이체를 제외하였다. 한편, 락토스의 분해 활성에 따라 알로락토오스의 분해 활성도 변화하므로, 「알로락토오스 분해 활성÷1% 락토스 분해 활성」의 값을 사용하여 알로락토오스에 대한 상대적 기질 특이성을 평가하여, 야생형과 비교했다.
실제로 측정한 결과, 야생형 효소에서는, 「알로락토오스 분해 활성÷1% 락토스 분해 활성」이 0.02%가 되었다. 이에, 이하의 조건을 만족시키는 변이체를 알로락토오스에 대한 기질 특이성이 변화된 것으로서 선택하였다(도 3).
조건 1: 알로락토오스 분해 활성이 50% 이하, 즉 「알로락토오스 분해 활성÷1% 락토스 분해 활성」이 야생형 효소의 1/2 이하.
조건 2: 알로락토오스 분해 활성이 150% 이상, 즉 「알로락토오스 분해 활성÷1% 락토스 분해 활성」이 야생형 효소의 3/2 이상.
조건 1을 만족시키는 변이체는 하기의 28개였다(도 3의 (A)).
449번째 티로신(Y449): 변이 후의 아미노산(D, E, N, W)
531번째 세린(S531): 변이 후의 아미노산(A, D, E, F, G, I, M, N, Q)
593번째 트립토판(W593): 변이 후의 아미노산(F)
602번째 프롤린(P602): 변이 후의 아미노산(E, G)
604번째 프롤린(P604): 변이 후의 아미노산(A, G, H, I, M, S, T, V, W, Y)
612번째 리신(K612): 변이 후의 아미노산(M)
조건 2를 만족시키는 변이체는 하기의 14개였다(도 3의 (B)).
187번째 티로신(Y187): 변이 후의 아미노산(D, E, G)
188번째 세린(S188): 변이 후의 아미노산(P, T)
533번째 세린(S533): 변이 후의 아미노산(M, Q)
602번째 프롤린(P602): 변이 후의 아미노산(C, I, N, S, T, V)
612번째 리신(K612): 변이 후의 아미노산(F)
이상의 결과로부터, 합계 9개의 아미노산이 알로락토오스에 대한 가수분해 활성의 기질 특이성과 관련이 있는 것으로 판명되었다.
(3) 갈락토올리고당(GOS)의 조성이 변화하는 변이점
전체 변이체와 야생형의 재조합 발현 효소에 관하여 변이점의 평가를 행하였다. 하기의 조건을 만족시키는 변이체를 GOS 조성이 변화된 것으로서 선택하였다. 먼저, 생성된 GOS의 조성을 분석하여, 그 성분의 4당 올리고당의 함유율, 3당 이상의 올리고당의 함유율에 주목했다. 실제로 측정한 결과, 야생형 효소에서는 4당의 함유율이 10.8%, 3당 이상의 올리고당의 함유율이 40.0%가 되었다. 이에, 3당의 함유율이 야생형에 가까운 값이지만(즉, 올리고당의 합성량이 야생형과 동등), 4당의 함유율에 변화가 있는 변이점을 선발했다. 즉, 하기의 조건을 만족시키는 변이점을 선택하였다.
조건 3: 3당 이상의 함유율이 야생형 효소와 동일한 정도이며 4당의 함유율이 야생형 효소보다 적다.
조건 4: 3당 이상의 함유율이 야생형 효소와 동일한 정도이며 4당의 함유율이 야생형 효소보다 많다.
조건 3을 만족시키는 변이체는 하기의 33개였다(도 4의 (A)).
182번째 프롤린(P182): 변이 후의 아미노산(L)
187번째 티로신(Y187): 변이 후의 아미노산(D, L)
188번째 세린(S188): 변이 후의 아미노산(I)
405번째 트립토판(W405): 변이 후의 아미노산(A, D, E, G, H, L, N, S, T)
407번째 글루타민(Q407): 변이 후의 아미노산(G, R)
449번째 티로신(Y449): 변이 후의 아미노산(E, I, Q, R, S)
483번째 트레오닌(T483): 변이 후의 아미노산(Q)
512번째 세린(S512): 변이 후의 아미노산(F, T, V)
531번째 세린(S531): 변이 후의 아미노산(P)
550번째 아스파라긴(N550): 변이 후의 아미노산(L, R, S)
602번째 프롤린(P602): 변이 후의 아미노산(L, N, Q)
604번째 프롤린(P604): 변이 후의 아미노산(I, M)
조건 4를 만족시키는 변이체는 하기의 8개였다(도 4의 (B)).
483번째 트레오닌(T483): 변이 후의 아미노산(K, M, R)
512번째 세린(S512): 변이 후의 아미노산(G, K)
551번째 글루타민(Q551): 변이 후의 아미노산(N)
598번째 티로신(Y598): 변이 후의 아미노산(N)
615번째 티로신(Y615): 변이 후의 아미노산(T)
이상의 결과로부터, 합계 9개의 아미노산이 4당의 생성량와 관련이 있는 것으로 판명되었다.
다음으로, 생성된 GOS 조성 중의 알로락토오스의 함유율과 3당 이상의 올리고당의 함유율에 주목했다. 야생형 효소에서는 알로락토오스 함유율이 3.58%, 3당 이상의 올리고당의 함유율이 40.2%가 되었다. 이에, 3당의 함유율이 야생형에 가까운 값이지만, 알로락토오스 함유율에 변화가 있던 것을 찾았다. 즉, 하기의 조건을 만족시키는 변이점을 선택하였다.
조건 5: 3당 이상의 함유율이 야생형 효소와 동일한 정도이며 알로락토오스 함유율이 야생형 효소보다 적다.
조건 6: 3당 이상의 함유율이 야생형 효소와 동일한 정도이며 알로락토오스 함유율이 야생형 효소보다 많다.
조건 5를 만족시키는 변이체는 하기의 14개였다(도 5의 (A)).
405번째 트립토판(W405): 변이 후의 아미노산(A, D, S, T)
483번째 트레오닌(T483): 변이 후의 아미노산(M)
531번째 세린(S531): 변이 후의 아미노산(D, F, G, L, K, M)
550번째 아스파라긴(N550): 변이 후의 아미노산(F)
598번째 티로신(Y598): 변이 후의 아미노산(F, H)
조건 6을 만족시키는 변이체는 하기의 45개였다(도 5의 (B)).
182번째 프롤린(P182): 변이 후의 아미노산(L, S)
187번째 티로신(Y187): 변이 후의 아미노산(D, E, N)
188번째 세린(S188): 변이 후의 아미노산(E, G, I, N)
405번째 트립토판(W405): 변이 후의 아미노산(H)
406번째 알라닌(A406): 변이 후의 아미노산(P)
407번째 글루타민(Q407): 변이 후의 아미노산(A, F, G, K, R)
449번째 티로신(Y449): 변이 후의 아미노산(E, R)
483번째 트레오닌(T483): 변이 후의 아미노산(S, Q)
512번째 세린(S512): 변이 후의 아미노산(G, T, V)
534번째 세린(S534): 변이 후의 아미노산(K, Q)
550번째 아스파라긴(N550): 변이 후의 아미노산(A, G, K, L, M, R, S)
551번째 글루타민(Q551): 변이 후의 아미노산(K, H)
602번째 프롤린(P602): 변이 후의 아미노산(C, D, N)
609번째 티로신(Y609): 변이 후의 아미노산(D, Q, T)
612번째 리신(K612): 변이 후의 아미노산(F, I)
615번째 티로신(Y615): 변이 후의 아미노산(E, I, T)
이상의 결과로부터, 합계 19개의 아미노산이 알로락토오스 함유량와 관련이 있는 것으로 판명되었다.
(4) BgaD-A형에서의 변이점
(1-1)에서 나타낸 방법에서는, 활성 중심의 루프 구조에 변이를 가하는 디자인을 행하였다. 그런데, BgaD-A형에 대해서는, GOS 합성과 관련이 있는 아미노산이 과거에 보고되어 있다. 특히, 1540번째 트립토판(W1540)은, 알라닌 또는 페닐알라닌으로 치환함으로써 올리고당 합성의 최대 수량(收量)이 많아지는 것으로 보고되어 있다(비특허 문헌 1). 이 보고에 주목하여, 지금까지 검토한 활성 중심 부근의 아미노산뿐만 아니라, BgaD-A형에만 존재하는 아미노산에 변이를 가하는 것에 의해서도, 생성되는 GOS의 조성을 변화시킬 수 있지 않을까 생각했다. 이에, 실제로, 1540번째 트립토판(W1540)을 19종류의 아미노산으로 치환하는 포화 변이 도입을 실시하기로 했다. 구체적으로는, BgaD-A형의 DNA(서열번호 5)를 코딩하는 플라스미드를 템플레이트로 하고, (1-2)와 동일한 방법으로, W1540을 모든 아미노산으로 치환하였다. 또한, 플라스미드를 대장균에 도입하고 변이 효소를 발현시켰다. 또한, (1-4)와 동일한 방법으로 GOS 합성 반응을 행하고, 생성된 GOS의 조성 중의 4당 올리고당의 함유율, 3당 이상의 올리고당의 함유율을 해석했다.
측정한 결과, 야생형에서는 4당의 함유율이 10.4%, 3당 이상의 올리고당의 함유율이 38.5%가 되었다. 이에, 모든 변이체에서 4당의 함유율에 변화가 있는지를 조사하였다. 그 결과, 18개의 변이체에 있어서, 야생형 효소보다 4당의 함유율이 많아지는 것을 알았다(도 6). 구체적으로는, 이하에 나타내는 변이체에 있어서 4당의 생성량이 증가하는 것이 판명되었다.
1540번째 트립토판(W1540): 변이 후의 아미노산(A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V)
이상의 결과로부터, 활성 중심의 루프 구조에 변이를 가하는 것뿐만 아니라, 1540번째 아미노산에 변이를 도입하는 것에 의해서도, 4당의 생성량을 증가시키는 효과가 있는 것이 판명되었다.
3. 정리
(1) 변이체에서는, β-1,6 결합을 가지는 당류에 대한 가수분해 활성의 저하 또는 향상을 관찰할 수 있었다(9개소의 아미노산; 42변이체)
(2) 변이체에서 생산한 갈락토올리고당은, 생성물의 중합도나 분지쇄의 비율이 변화되어 있었다(4당이 변화된 변이점: 15개소의 아미노산; 41변이체. 분지쇄가 변화된 변이점: 19개소의 아미노산; 49변이체).
(3) 야생형에서는 조성이 일정한 올리고당의 제조 밖에 행할 수 없었지만, 변이체를 이용하면 다양한 종류의 갈락토올리고당을 분류하여 만들 수 있게 된다. 변이체는, 예를 들면, 모유 성분의 재현 등에 이용 가능하다.
(4) 상기 검토에 의해 유효성을 인정한 변이점을 조합함으로써, 유용성이 한층 높은 변이체의 구축이 가능할 것으로 여겨진다.
<유효한 변이 위치의 특정 2>
검토를 진행한 결과, 유효한 변이 위치가 더욱 특정되고, 유용한 변이체가 취득되었다. 이하, 취득에 성공한 변이체(변형된 효소)와 그 특징을 나타낸다. 그리고, (A), (B), (D)∼(N)은 BgaD-D형의 β-갈락토시다아제(서열번호 4)의 변이체이며, (C)는 BgaD-A형의 β-갈락토시다아제(서열번호 1)의 변이체이다.
(A) 조건 3을 만족시키는, 1개소의 아미노산 치환이 행해진 변이체(도 7)
85번째 트립토판(W85)이 글리신으로 치환
91번째 페닐알라닌(F91)이 알라닌 또는 이소류신으로 치환
103번째 티로신(Y103)이 글리신으로 치환
134번째 티로신(Y134)이 글리신으로 치환
153번째 티로신(Y153)이 글리신으로 치환
182번째 프롤린(P182)이 트립토판 또는 티로신으로 치환
186번째 트립토판(W186)이 메티오닌으로 치환
192번째 티로신(Y192)이 글리신으로 치환
295번째 티로신(Y295)이 글리신으로 치환
345번째 히스티딘(H345)이 글리신으로 치환
349번째 글리신(G349)이 트립토판으로 치환
402번째 페닐알라닌(F402)이 글리신으로 치환
407번째 글루타민(Q407)이 이소류신, 류신, 메티오닌, 발린 또는 티로신으로 치환
479번째 글리신(G479)이 류신, 프롤린 또는 글루타민으로 치환
480번째 글루타민산(E480)이 아스파라긴으로 치환
482번째 리신(K482)이 메티오닌 또는 발린으로 치환
483번째 트레오닌(T483)이 글리신 또는 세린으로 치환
484번째 아르기닌(R484)이 페닐알라닌, 이소류신, 메티오닌, 아스파라긴 또는 글루타민으로 치환
485번째 글리신(G485)이 아스파라긴산, 아스파라긴, 글루타민 또는 트레오닌으로 치환
486번째 아스파라긴산(D486)이 알라닌, 글루타민산, 페닐알라닌, 이소류신, 리신, 류신, 메티오닌, 프롤린, 글루타민, 아르기닌, 트레오닌, 트립토판 또는 티로신으로 치환
487번째 리신(K487)이 시스테인, 글루타민산, 페닐알라닌, 히스티딘, 이소류신, 류신, 아스파라긴, 글루타민, 아르기닌, 트레오닌, 발린, 트립토판 또는 티로신으로 치환
488번째 발린(V488)이 글리신, 이소류신, 류신, 아르기닌, 세린, 트레오닌, 트립토판 또는 티로신으로 치환
496번째 티로신(Y496)이 글리신으로 치환
512번째 세린(S512)이 시스테인, 아스파라긴산, 글루타민산, 아스파라긴, 프롤린, 글루타민 또는 트립토판으로 치환
513번째 글루타민산(E513)이 알라닌, 시스테인, 아스파라긴산, 페닐알라닌, 글리신, 히스티딘, 리신, 류신, 메티오닌, 아스파라긴, 프롤린, 글루타민, 아르기닌, 세린, 트레오닌 또는 발린으로 치환
514번째 아스파라긴(N514)이 글루타민산, 류신 또는 리신으로 치환
515번째 아스파라긴(N515)이 알라닌, 아스파라긴산, 글루타민산, 글리신, 이소류신, 류신, 프롤린 또는 발린으로 치환
516번째 티로신(Y516)이 트립토판으로 치환
517번째 아스파라긴산(D517)이 리신 또는 트립토판으로 치환
519번째 티로신(Y519)이 글리신으로 치환
533번째 트레오닌(T533)이 글루타민산으로 치환
547번째 티로신(Y547)이 글리신으로 치환
549번째 티로신(Y549)이 글리신으로 치환
555번째 티로신(Y555)이 글리신으로 치환
572번째 아르기닌(R572)이 시스테인, 류신, 메티오닌, 트레오닌, 트립토판 또는 티로신으로 치환
573번째 트레오닌(T573)이 글루타민산으로 치환
598번째 티로신(Y598)이 히스티딘 또는 아스파라긴으로 치환
605번째 티로신(Y605)이 시스테인, 아스파라긴산, 히스티딘, 이소류신, 리신, 프롤린, 아르기닌 또는 트레오닌으로 치환
606번째 티로신(Y606)이 알라닌, 시스테인, 아스파라긴산, 글루타민산, 페닐알라닌, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 리신, 류신, 메티오닌 또는 세린으로 치환
609번째 티로신(Y609)이 글루타민산, 아스파라긴 또는 세린으로 치환
616번째 페닐알라닌(F616)이 글리신으로 치환
624번째 페닐알라닌(F624)이 글리신으로 치환
648번째 트립토판(W648)이 글리신으로 치환
650번째 트립토판(W650)이 글리신으로 치환
(B) 조건 4를 만족시키는, 1개소의 아미노산 치환이 행해진 변이체(도 8)
76번째 트립토판(W76)이 글리신으로 치환
480번째 글루타민산(E480)이 글루타민으로 치환
483번째 트레오닌(T483)이 트립토판으로 치환
485번째 글리신(G485)이 프롤린 또는 트레오닌으로 치환
484번째 아르기닌(R484)이 알라닌, 시스테인, 아스파라긴산, 글리신, 프롤린, 세린, 티로신 또는 리신으로 치환
487번째 리신(K487)이 글리신 또는 프롤린으로 치환
488번째 발린(V488)이 프롤린으로 치환
512번째 세린(S512)이 류신 또는 메티오닌으로 치환
514번째 아스파라긴(N514)이 아스파라긴산으로 치환
515번째 아스파라긴(N515)이 페닐알라닌, 아르기닌, 트립토판, 티로신 또는 리신으로 치환
569번째 글리신(G569)이 리신, 프롤린 또는 발린으로 치환
596번째 페닐알라닌(F596)이 글리신으로 치환
(C) 4당의 함유율이 많아지는, 1개소의 아미노산 치환이 행해진 변이체(BgaD-A형의 β-갈락토시다아제의 변이체)(도 9)
487번째 리신(K487)이 글리신 또는 프롤린으로 치환
514번째 아스파라긴(N514)이 트립토판으로 치환
515번째 아스파라긴(N515)이 리신 또는 트립토판으로 치환
(D) 조건 3을 만족시키는 치환과 조건 5를 만족시키는 치환을 조합한 변이체(도 10)
188번째 세린이 이소류신으로 치환되고, 또한 550번째 아스파라긴이 페닐알라닌으로 치환(S188I_N550F),
407번째 글루타민이 아르기닌으로 치환되고, 또한 550번째 아스파라긴이 페닐알라닌으로 치환(Q407R_N550F),
449번째 티로신이 글루타민으로 치환되고, 또한 598번째 티로신이 히스티딘으로 치환(Y449Q_Y598H),
550번째 아스파라긴이 페닐알라닌으로 치환되고, 또한 602번째 프롤린이 글루타민으로 치환(N550F_P602Q)
(E) 조건 3을 만족시키는 치환과 조건 6을 만족시키는 치환을 조합한 변이체(도 10)
407번째 글루타민이 아르기닌으로 치환되고, 또한 449번째 티로신이 글루타민산으로 치환(Q407R_Y449E)
(F) 조건 4를 만족시키는 치환과 조건 5를 만족시키는 치환을 조합한 변이체(도 10)
550번째 아스파라긴이 페닐알라닌으로 치환되고, 또한 598번째 티로신이 아스파라긴으로 치환(N550F_Y598N)
(G) 조건 3을 만족시키는 치환끼리를 조합한 변이체(도 10)
182번째 프롤린이 류신으로 치환되고, 또한 449번째 티로신이 글루타민산으로 치환(P182L_Y449E)
182번째 프롤린이 류신으로 치환되고, 또한 449번째 티로신이 글루타민으로 치환(P182L_Y449Q)
187번째 티로신이 류신으로 치환되고, 또한 407번째 글루타민이 아르기닌으로 치환(Y187L_Q407R)
187번째 티로신이 류신으로 치환되고, 또한 449번째 티로신이 글루타민산으로 치환(Y187L_Y449E)
187번째 티로신이 류신으로 치환되고, 또한 449번째 티로신이 글루타민으로 치환(Y187L_Y449Q)
187번째 티로신이 류신으로 치환되고, 또한 512번째 세린이 시스테인으로 치환(Y187L_S512C)
187번째 티로신이 류신으로 치환되고, 또한 512번째 세린이 아스파라긴으로 치환(Y187L_S512N)
187번째 티로신이 류신으로 치환되고, 또한 512번째 세린이 트레오닌으로 치환(Y187L_S512T)
188번째 세린이 이소류신으로 치환되고, 또한 407번째 글루타민이아르기닌으로 치환(S188I_Q407R)
188번째 세린이 이소류신으로 치환되고, 또한 449번째 티로신이 글루타민으로 치환(S188I_Y449Q)
188번째 세린이 이소류신으로 치환되고, 또한 483번째 트레오닌이글루타민산으로 치환(S188I_T483E)
407번째 글루타민이 류신으로 치환되고, 또한 512번째 세린이 발린으로 치환(Q407L_S512V)
407번째 글루타민이 아르기닌으로 치환되고, 또한 483번째 트레오닌이글리신으로 치환(Q407R_T483G)
407번째 글루타민이 아르기닌으로 치환되고, 또한 449번째 티로신이 글루타민으로 치환(Q407R_Y449Q)
407번째 글루타민이 아르기닌으로 치환되고, 또한 550번째 아스파라긴이 세린으로 치환(Q407R_N550S)
449번째 티로신이 글루타민으로 치환되고, 또한 550번째 아스파라긴이 세린으로 치환(Y449Q_N550S)
487번째 리신이 트립토판으로 치환되고, 또한 512번째 세린이 트레오닌으로 치환(K487W_S512T)
487번째 리신이 트립토판으로 치환되고, 또한 517번째 아스파라긴산이 리신으로 치환(K487W_D517K)
487번째 리신이 트립토판으로 치환되고, 또한 515번째 아스파라긴이 글리신으로 치환(K487W_N515G)
487번째 리신이 트립토판으로 치환되고, 또한 517번째 아스파라긴산이 트립토판으로 치환(K487W_D517W)
(H) 조건 4를 만족시키는 치환끼리를 조합한 변이체(도 10)
487번째 리신이 프롤린으로 치환되고, 또한 515번째 아스파라긴이 아르기닌으로 치환(K487P_N515R)
(I) 조건 3을 만족시키는, 2개소의 아미노산 치환이 행해진 변이체(도 11)
91번째 페닐알라닌이 세린으로 치환되고, 또한 407번째 글루타민이 메티오닌으로 치환(F91S_Q407M)
180번째 트레오닌이 발린으로 치환되고, 또한 187번째 티로신이 류신으로 치환(T180V_Y187L)
180번째 트레오닌이 발린으로 치환되고, 또한 188번째 세린이 이소류신으로 치환(T180V_S188I)
180번째 트레오닌이 발린으로 치환되고, 또한 407번째 글루타민이아르기닌으로 치환(T180V_Q407R)
180번째 트레오닌이 발린으로 치환되고, 또한 449번째 티로신이 글루타민산으로 치환(T180V_Y449E)
180번째 트레오닌이 발린으로 치환되고, 또한 483번째 트레오닌이글리신으로 치환(T180V_T483G)
180번째 트레오닌이 발린으로 치환되고, 또한 512번째 세린이 발린으로 치환(T180V_S512V)
180번째 트레오닌이 발린으로 치환되고, 또한 550번째 아스파라긴이 페닐알라닌으로 치환(T180V_N550F)
180번째 트레오닌이 발린으로 치환되고, 또한 615번째 티로신이 프롤린으로 치환(T180V_Y615P)
182번째 프롤린이 류신으로 치환되고, 또한 376번째 아르기닌이 프롤린으로 치환(P182L_R376P)
182번째 프롤린이 트립토판으로 치환되고, 또한 449번째 티로신이 글루타민으로 치환(P182W_Y449Q)
187번째 티로신이 류신으로 치환되고, 또한 487번째 리신이 알라닌으로 치환(Y187L_K487A)
187번째 티로신이 류신으로 치환되고, 또한 512번째 세린이 알라닌으로 치환(Y187L_S512A)
187번째 티로신이 류신으로 치환되고, 또한 533번째 트레오닌이 아스파라긴으로 치환(Y187L_T533N)
376번째 아르기닌이 프롤린으로 치환되고, 또한 407번째 글루타민이 류신으로 치환(R376P_Q407L)
376번째 아르기닌이 프롤린으로 치환되고, 또한 449번째 티로신이 글루타민으로 치환(R376P_Y449Q)
376번째 아르기닌이 프롤린으로 치환되고, 또한 512번째 세린이 발린으로 치환(R376P_S512V)
376번째 아르기닌이 프롤린으로 치환되고, 또한 550번째 아스파라긴이 트립토판으로 치환(R376P_N550W)
376번째 아르기닌이 프롤린으로 치환되고, 또한 550번째 아스파라긴이 티로신으로 치환(R376P_N550Y)
407번째 글루타민이 류신으로 치환되고, 또한 533번째 트레오닌이 글루타민산으로 치환(Q407L_T533E)
407번째 글루타민이 류신으로 치환되고, 또한 570번째 트립토판이 티로신으로 치환(Q407L_W570Y)
407번째 글루타민이 류신으로 치환되고, 또한 615번째 티로신이 류신으로 치환(Q407L_Y615L)
407번째 글루타민이 아르기닌으로 치환되고, 또한 615번째 티로신이 류신으로 치환(Q407R_Y615L)
407번째 글루타민이 아르기닌으로 치환되고, 또한 615번째 티로신이 프롤린으로 치환(Q407R_Y615P)
449번째 티로신이 아스파라긴산으로 치환되고, 또한 598번째 티로신이 페닐알라닌으로 치환(Y449D_Y598F)
449번째 티로신이 글루타민으로 치환되고, 또한 533번째 트레오닌이 글루타민산으로 치환(Y449Q_T533E)
449번째 티로신이 글루타민으로 치환되고, 또한 615번째 티로신이 글리신으로 치환(Y449Q_Y615G)
449번째 티로신이 글루타민으로 치환되고, 또한 615번째 티로신이 프롤린으로 치환(Y449Q_Y615P)
483번째 트레오닌이 글리신으로 치환되고, 또한 512번째 세린이 발린으로 치환(T483G_S512V)
483번째 트레오닌이 글리신으로 치환되고, 또한 550번째 아스파라긴이 세린으로 치환(T483G_N550S)
483번째 트레오닌이 글리신으로 치환되고, 또한 615번째 티로신이 류신으로 치환(T483G_Y615L)
483번째 트레오닌이 글루타민으로 치환되고, 또한 602번째 프롤린이 글루타민에치환(T483Q_P602Q)
484번째 아르기닌이 히스티딘으로 치환되고, 또한 487번째 리신이 히스티딘으로 치환(R484H_K487H)
484번째 아르기닌이 트립토판으로 치환되고, 또한 487번째 리신이 아스파라긴산으로 치환(R484W_K487D)
484번째 아르기닌이 트립토판으로 치환되고, 또한 575번째 트레오닌이 트립토판으로 치환(R484W_T575W)
485번째 글리신이 리신으로 치환되고, 또한 488번째 발린이 트립토판으로 치환(G485K_V488W)
485번째 글리신이 리신으로 치환되고, 또한 516번째 티로신이 트립토판으로 치환(G485K_Y516W)
485번째 글리신이 리신으로 치환되고, 또한 517번째 아스파라긴산이 리신으로 치환(G485K_D517K)
485번째 글리신이 리신으로 치환되고, 또한 517번째 아스파라긴산이 트립토판으로 치환(G485K_D517W)
485번째 글리신이 리신으로 치환되고, 또한 569번째 글리신이 트립토판으로 치환(G485K_G569W)
485번째 글리신이 리신으로 치환되고, 또한 571번째 글리신이 리신으로 치환(G485K_G571K)
485번째 글리신이 리신으로 치환되고, 또한 572번째 아르기닌이 트립토판으로 치환(G485K_R572W)
485번째 글리신이 리신으로 치환되고, 또한 573번째 트레오닌이 트립토판으로 치환(G485K_T573W)
485번째 글리신이 트립토판으로 치환되고, 또한 516번째 티로신이 트립토판으로 치환(G485W_Y516W)
485번째 글리신이 트립토판으로 치환되고, 또한 517번째 아스파라긴산이 트립토판으로 치환(G485W_D517W)
485번째 글리신이 트립토판으로 치환되고, 또한 573번째 트레오닌이 리신으로 치환(G485W_T573K)
485번째 글리신이 트립토판으로 치환되고, 또한 573번째 트레오닌이 트립토판으로 치환(G485W_T573W)
487번째 리신이 알라닌으로 치환되고, 또한 512번째 세린이 발린으로 치환(K487A_S512V)
487번째 리신이 글리신으로 치환되고, 또한 515번째 아스파라긴이 글루타민으로 치환(K487G_N515Q)
487번째 리신이 트립토판으로 치환되고, 또한 573번째 트레오닌이 리신으로 치환(K487W_T573K)
487번째 리신이 트립토판으로 치환되고, 또한 593번째 트립토판이 페닐알라닌으로 치환(K487W_W593F)
488번째 발린이 리신으로 치환되고, 또한 514번째 아스파라긴이 리신으로 치환(V488K_N514K)
488번째 발린이 리신으로 치환되고, 또한 517번째 아스파라긴산이 리신으로 치환(V488K_D517K)
488번째 발린이 리신으로 치환되고, 또한 569번째 글리신이 리신으로 치환(V488K_G569K)
488번째 발린이 리신으로 치환되고, 또한 569번째 글리신이 트립토판으로 치환(V488K_G569W)
488번째 발린이 리신으로 치환되고, 또한 572번째 아르기닌이 리신으로 치환(V488K_R572K)
488번째 발린이 리신으로 치환되고, 또한 573번째 트레오닌이 리신으로 치환(V488K_T573K)
488번째 발린이 리신으로 치환되고, 또한 573번째 트레오닌이 트립토판으로 치환(V488K_T573W)
488번째 발린이 리신으로 치환되고, 또한 516번째 티로신이 리신으로 치환(V488K_Y516K)
488번째 발린이 리신으로 치환되고, 또한 516번째 티로신이 트립토판으로 치환(V488K_Y516W)
488번째 발린이 트립토판으로 치환되고, 또한 514번째 아스파라긴이 트립토판으로 치환(V488W_N514W)
488번째 발린이 트립토판으로 치환되고, 또한 573번째 트레오닌이 트립토판으로 치환(V488W_T573W)
500번째 글루타민산이 알라닌으로 치환되고, 또한 501번째 이소류신이 알라닌으로 치환(E500A_I501A)
512번째 세린이 발린으로 치환되고, 또한 550번째 아스파라긴이 세린으로 치환(S512V_N550S)
533번째 트레오닌이 글루타민산으로 치환되고, 또한 550번째 아스파라긴이 세린으로 치환(T533E_N550S)
533번째 트레오닌이 글루타민산으로 치환되고, 또한 615번째 티로신이 글리신으로 치환(T533E_Y615G)
570번째 트립토판이 티로신으로 치환되고, 또한 615번째 티로신이 류신으로 치환(W570Y_Y615L)
(J) 조건 4를 만족시키는, 2개소의 아미노산 치환이 행해진 변이체(도 11)
91번째 페닐알라닌이 발린으로 치환되고, 또한 513번째 글루타민산이 글리신으로 치환(F91V_E513G)
180번째 트레오닌이 발린으로 치환되고, 또한 483번째 트레오닌이 리신으로 치환(T180V_T483K)
180번째 트레오닌이 발린으로 치환되고, 또한 598번째 티로신이 아스파라긴으로 치환(T180V_Y598N)
180번째 트레오닌이 발린으로 치환되고, 또한 615번째 티로신이 글리신으로 치환(T180V_Y615G)
182번째 프롤린이 류신으로 치환되고, 또한 615번째 티로신이 류신으로 치환(P182L_Y615L)
376번째 아르기닌이 프롤린으로 치환되고, 또한 598번째 티로신이 아스파라긴으로 치환(R376P_Y598N)
407번째 글루타민이 류신으로 치환되고, 또한 483번째 트레오닌이 리신으로 치환(Q407L_T483K)
407번째 글루타민이 류신으로 치환되고, 또한 487번째 리신이 프롤린으로 치환(Q407L_K487P)
407번째 글루타민이 류신으로 치환되고, 또한 615번째 티로신이 글리신으로 치환(Q407L_Y615G)
449번째 티로신이 글루타민산으로 치환되고, 또한 487번째 리신이 알라닌으로 치환(Y449E_K487A)
449번째 티로신이 글루타민산으로 치환되고, 또한 487번째 리신이 프롤린으로 치환(Y449E_K487P)
483번째 트레오닌이 글리신으로 치환되고, 또한 487번째 리신이 알라닌으로 치환(T483G_K487A)
483번째 트레오닌이 글리신으로 치환되고, 또한 533번째 트레오닌이 글루타민산으로 치환(T483G_T533E)
483번째 트레오닌이 글리신으로 치환되고, 또한 615번째 티로신이 글리신으로 치환(T483G_Y615G)
483번째 트레오닌이 메티오닌으로 치환되고, 또한 487번째 리신이 알라닌으로 치환(T483M_K487A)
483번째 트레오닌이 메티오닌으로 치환되고, 또한 487번째 리신이 글리신으로 치환(T483M_K487G)
483번째 트레오닌이 메티오닌으로 치환되고, 또한 487번째 리신이 프롤린으로 치환(T483M_K487P)
484번째 아르기닌이 히스티딘으로 치환되고, 또한 487번째 리신이 아스파라긴산으로 치환(R484H_K487D)
484번째 아르기닌이 리신으로 치환되고, 또한 513번째 글루타민산이 트립토판으로 치환(R484K_E513W)
484번째 아르기닌이 리신으로 치환되고, 또한 514번째 아스파라긴이 리신으로 치환(R484K_N514K)
484번째 아르기닌이 리신으로 치환되고, 또한 514번째 아스파라긴이 트립토판으로 치환(R484K_N514W)
484번째 아르기닌이 리신으로 치환되고, 또한 515번째 아스파라긴이 리신으로 치환(R484K_N515K)
484번째 아르기닌이 리신으로 치환되고, 또한 515번째 아스파라긴이 트립토판으로 치환(R484K_N515W)
484번째 아르기닌이 리신으로 치환되고, 또한 517번째 아스파라긴산이 트립토판으로 치환(R484K_D517W)
484번째 아르기닌이 리신으로 치환되고, 또한 569번째 글리신이 리신으로 치환(R484K_G569K)
484번째 아르기닌이 리신으로 치환되고, 또한 571번째 글리신이 리신으로 치환(R484K_G571K)
484번째 아르기닌이 리신으로 치환되고, 또한 572번째 아르기닌이 리신으로 치환(R484K_R572K)
484번째 아르기닌이 리신으로 치환되고, 또한 572번째 아르기닌이 트립토판으로 치환(R484K_R572W)
484번째 아르기닌이 리신으로 치환되고, 또한 573번째 트레오닌이 리신으로 치환(R484K_T573K)
484번째 아르기닌이 리신으로 치환되고, 또한 573번째 트레오닌이 트립토판으로 치환(R484K_T573W)
484번째 아르기닌이 리신으로 치환되고, 또한 516번째 티로신이 리신으로 치환(R484K_Y516K)
484번째 아르기닌이 트립토판으로 치환되고, 또한 515번째 아스파라긴이 리신으로 치환(R484W_N515K)
485번째 글리신이 아스파라긴산으로 치환되고, 또한 487번째 리신이 히스티딘으로 치환(G485D_K487H)
485번째 글리신이 리신으로 치환되고, 또한 487번째 리신이 히스티딘으로 치환(G485K_K487H)
485번째 글리신이 리신으로 치환되고, 또한 569번째 글리신이 리신으로 치환(G485K_G569K)
485번째 글리신이 리신으로 치환되고, 또한 514번째 아스파라긴이 리신으로 치환(G485K_N514K)
485번째 글리신이 리신으로 치환되고, 또한 515번째 아스파라긴이 리신으로 치환(G485K_N515K)
485번째 글리신이 리신으로 치환되고, 또한 515번째 아스파라긴이 트립토판으로 치환(G485K_N515W)
485번째 글리신이 아르기닌으로 치환되고, 또한 487번째 리신이 아스파라긴산으로 치환(G485R_K487D)
485번째 글리신이 트립토판으로 치환되고, 또한 513번째 글루타민산이 트립토판으로 치환(G485W_E513W)
485번째 글리신이 트립토판으로 치환되고, 또한 515번째 아스파라긴이 리신으로 치환(G485W_N515K)
485번째 글리신이 트립토판으로 치환되고, 또한 515번째 아스파라긴이 트립토판으로 치환(G485W_N515W)
487번째 리신이 알라닌으로 치환되고, 또한 531번째 세린이 알라닌으로 치환(K487A_S531A)
487번째 리신이 알라닌으로 치환되고, 또한 593번째 트립토판이 페닐알라닌으로 치환(K487A_W593F)
487번째 리신이 알라닌으로 치환되고, 또한 615번째 티로신이 류신으로 치환(K487A_Y615L)
487번째 리신이 트립토판으로 치환되고, 또한 514번째 아스파라긴이 리신으로 치환(K487W_N514K)
487번째 리신이 트립토판으로 치환되고, 또한 514번째 아스파라긴이 트립토판으로 치환(K487W_N514W)
487번째 리신이 트립토판으로 치환되고, 또한 516번째 티로신이 트립토판으로 치환(K487W_Y516W)
487번째 리신이 트립토판으로 치환되고, 또한 569번째 글리신이 리신으로 치환(K487W_G569K)
487번째 리신이 티로신으로 치환되고, 또한 515번째 아스파라긴이 페닐알라닌으로 치환(K487Y_N515F)
487번째 리신이 티로신으로 치환되고, 또한 515번째 아스파라긴이 트립토판으로 치환(K487Y_N515W)
488번째 발린이 리신으로 치환되고, 또한 515번째 아스파라긴이 리신으로 치환(V488K_N515K)
488번째 발린이 리신으로 치환되고, 또한 515번째 아스파라긴이 트립토판으로 치환(V488K_N515W)
488번째 발린이 트립토판으로 치환되고, 또한 515번째 아스파라긴이 리신으로 치환(V488W_N515K)
488번째 발린이 트립토판으로 치환되고, 또한 515번째 아스파라긴이 트립토판으로 치환(V488W_N515W)
488번째 발린이 티로신으로 치환되고, 또한 515번째 아스파라긴이 트립토판으로 치환(V488Y_N515W)
550번째 아스파라긴이 세린으로 치환되고, 또한 598번째 티로신이 아스파라긴으로 치환(N550S_Y598N)
550번째 아스파라긴이 세린으로 치환되고, 또한 615번째 티로신이 글리신으로 치환(N550S_Y615G)
550번째 아스파라긴이 세린으로 치환되고, 또한 615번째 티로신이 류신으로 치환(N550S_Y615L)
550번째 아스파라긴이 세린으로 치환되고, 또한 615번째 티로신이 프롤린으로 치환(N550S_Y615P)
(K) 조건 3을 만족시키는, 3개소 또는 4개소의 아미노산 치환이 행해진 변이체(도 12)
484번째 아르기닌이 알라닌으로 치환되고, 485번째 글리신이 알라닌으로 치환되고, 또한 487번째 리신이 아스파라긴산으로 치환(R484A_G485A_K487D)
484번째 아르기닌이 아스파라긴산으로 치환되고, 485번째 글리신이 아스파라긴산으로 치환되고, 또한 487번째 리신이 아스파라긴산으로 치환(R484D_G485D_K487D)
485번째 글리신이 아르기닌으로 치환되고, 486번째 아스파라긴산이 아르기닌으로 치환되고, 또한 487번째 리신이 리신아르기닌으로 치환(G485R_D486R_K487R)
484번째 아르기닌이 알라닌으로 치환되고, 485번째 글리신이 알라닌으로 치환되고, 486번째 아스파라긴산이 알라닌으로 치환되고, 또한 487번째 리신이 알라닌으로 치환(R484A_G485A_D486A_K487A)
484번째 아르기닌이 알라닌으로 치환되고, 485번째 글리신이 알라닌으로 치환되고, 486번째 아스파라긴산이 프롤린으로 치환되고, 또한 487번째 리신이 프롤린으로 치환(R484A_G485A_D486P_K487P)
(L) 조건 4를 만족시키는, 3개소 또는 4개소의 아미노산 치환이 행해진 변이체(도 12)
484번째 아르기닌이 알라닌으로 치환되고, 485번째 글리신이 알라닌으로 치환되고, 또한 487번째 리신이 아스파라긴산으로 치환(R484A_G485A_K487D)
484번째 아르기닌이 시스테인으로 치환되고, 486번째 아스파라긴산이 히스티딘으로 치환되고, 또한 487번째 리신이 아르기닌으로 치환(R484C_D486H_K487R)
485번째 글리신이 아르기닌으로 치환되고, 486번째 아스파라긴산이 트립토판으로 치환되고, 또한 487번째 리신이 트립토판으로 치환(G485R_D486W_K487W)
485번째 글리신이 아르기닌으로 치환되고, 486번째 아스파라긴산이 알라닌으로 치환되고, 또한 487번째 리신이 알라닌으로 치환(G485R_D486A_K487A)
485번째 글리신이 아르기닌으로 치환되고, 486번째 아스파라긴산이 프롤린으로 치환되고, 또한 487번째 리신이 프롤린으로 치환(G485R_D486P_K487P)
484번째 아르기닌이 알라닌으로 치환되고, 485번째 글리신이 알라닌으로 치환되고, 486번째 아스파라긴산이 알라닌으로 치환되고, 또한 487번째 리신이 알라닌으로 치환(R484A_G485A_D486A_K487A)
484번째 아르기닌이 알라닌으로 치환되고, 485번째 글리신이 알라닌으로 치환되고, 486번째 아스파라긴산이 아르기닌으로 치환되고, 또한 487번째 리신이 아르기닌으로 치환(R484A_G485A_D486R_K487R)
484번째 아르기닌이 아스파라긴산으로 치환되고, 485번째 글리신이 아스파라긴산으로 치환되고, 486번째 아스파라긴산이 아르기닌으로 치환되고, 또한 487번째 리신이 아르기닌으로 치환(R484D_G485D_D486R_K487R)
484번째 아르기닌이 아스파라긴산으로 치환되고, 485번째 글리신이 아스파라긴산으로 치환되고, 486번째 아스파라긴산이 프롤린으로 치환되고, 또한 487번째 리신이 프롤린으로 치환(R484D_G485D_D486P_K487P)
484번째 아르기닌이 아스파라긴산으로 치환되고, 485번째 글리신이 아스파라긴산으로 치환되고, 486번째 아스파라긴산이 알라닌으로 치환되고, 또한 487번째 리신이 알라닌으로 치환(R484D_G485D_D486A_K487A)
484번째 아르기닌이 아스파라긴산으로 치환되고, 485번째 글리신이 아스파라긴산으로 치환되고, 486번째 아스파라긴산이 트립토판으로 치환되고, 또한 487번째 리신이 트립토판으로 치환(R484D_G485D_D486W_K487W)
484번째 아르기닌이 프롤린으로 치환되고, 485번째 글리신이 프롤린으로 치환되고, 486번째 아스파라긴산이 아르기닌으로 치환되고, 또한 487번째 리신이 아르기닌으로 치환(R484P_G485P_D486R_K487R)
(M) 조건 3을 만족시키는, 삽입 또는 결실 변이체(도 13)
Δ484-487
N514-F-F-N515
N514-W-W-N515
P604-W-W-Y605
P604-A-A-A-A-Y605
P604-F-F-F-F-Y605
(N) 조건 4를 만족시키는, 삽입 또는 결실 변이체(도 13)
Δ485_D486H
Δ485-486_K487R
Δ485-486_R484W_K487W
Δ485-486_R484P_K487P
R484-A-A-G485
R484-F-F-G485
R484-K-K-G485
R484-P-P-G485
R484-R-R-G485
R484-S-S-G485
R484-W-W-G485
G485-S-S-S-D486
R484-A-A-A-A-G485
R484-D-D-D-D-G485
R484-F-F-F-F-G485
R484-P-P-P-P-G485
R484-R-R-R-R-G485
R484-S-S-S-S-G485
R484-W-W-W-W-G485
R484-A-A-A-A-A-A-A-A-G485
R484-D-D-D-D-D-D-D-D-G485
R484-F-F-F-F-F-F-F-F-G485
R484-K-K-K-K-K-K-K-K-G485
R484-P-P-P-P-P-P-P-P-G485
[산업상 이용가능성]
본 발명의 변형된 효소는 야생형 효소와 상이한 효소학적 성질을 나타낸다. 이 특성을 살려서, 다양한 갈락토올리고당을 분류하여 만드는 것으로의 이용이 상정(想定)된다. 특히, 야생형 효소 단독으로는 실현할 수 없었던, 모유 중의 올리고당 프로파일을 재현하는 것에 본 발명을 이용하는 것을 기대할 수 있다. 또한, 올리고당의 제조(합성)로의 이용이 기대된다. 또한, 유당불내증 환자를 위한 의약이나 서플리먼트의 제조·가공, 유제품(저유당 우유 등의 가공유, 분유(탈지분유, 육아 분유 등), 요구르트 등)의 제조·가공, 의료용 식품(메디컬 푸드)의 제조·가공 등에도 본 발명을 이용 가능하다.
본 발명은, 상기 발명의 실시형태 및 실시예의 설명에 의해 한정되는 것은 아니다. 특허 청구의 범위의 기재를 일탈하지 않고, 당업자가 용이하게 상도(想到)할 수 있는 범위에서 각종 변형 태양도 본 발명에 포함된다. 본 명세서 중 명시한 논문, 공개 특허 공보, 및 특허 공보 등의 내용은, 그 모든 내용을 원용에 의해 인용하는 것으로 한다.
SEQUENCE LISTING
<110> AMANO ENZYME INC.
<120> MODIFIED BETA-GALACTOSIDASE
<130> AE13001P
<150> JP P2013-205097
<151> 2013-09-30
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<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1737
<212> PRT
<213> Bacillus circulans
<400> 1
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Phe Phe Asn Ala Trp Ala Glu His Asp Ile Lys Glu Met Val Asp Arg
420 425 430
Gly Lys Asn Glu Pro Ala Ile Ile Met Trp Ser Ile Gly Asn Glu Ile
435 440 445
Tyr Asp Thr Thr Asn Ala Ala Gly Val Glu Thr Ala Arg Asn Leu Val
450 455 460
Gly Trp Val Lys Glu Ile Asp Thr Thr Arg Pro Thr Thr Ile Gly Glu
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Asp Lys Thr Arg Gly Asp Lys Val Asn Val Thr Pro Ile Asn Ser Tyr
485 490 495
Ile Lys Glu Ile Phe Asn Ile Val Asp Val Val Gly Leu Asn Tyr Ser
500 505 510
Glu Asn Asn Tyr Asp Gly Tyr His Lys Gln Asn Pro Ser Trp Lys Leu
515 520 525
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530 535 540
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Val Asp Val Asn Glu Ala Pro Lys Leu Pro Ser Glu Ile Lys Val Tyr
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580 585 590
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595 600 605
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Pro Lys Asp Ile Phe Tyr Tyr Tyr Gln Ser Gln Trp Lys Lys Glu Pro
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tacagtgatg agagtgcagc tgcgaagaat gtgacttggg atgaggtgga tccaaagcag 2700
tacagcactg ttggtgaatt cacagtggaa ggcagtgtcg agggaacttc gctgaaggca 2760
aaggcatttg ttattgtcaa aggaattgtc gccgtcaagc cttattcaac ggcaacaaag 2820
gttggtgtac agccggtgct gcctgaaaaa gcaacccttc tttacagtga tggaacaacc 2880
aagggagcaa ctgtcacgtg ggatgagatc cctgaggaca agctggcaaa agagggccgg 2940
tttaccgtcg agggcagtgt ggagggaaca gacctcaagg ctaatgtcta tgtcagggtg 3000
acaaatgaag taaaatcagt gaatattatg cttcaggagc agggttcagc ttatccaaag 3060
ctcgaagcta cttttaccaa tccagctgac aatcttcagc atttgaacga tggcatcaag 3120
agctatacca ataacccggt caaccgctgg acgaactgga caagaacacc gcgtgatgct 3180
ggtgactcga ttacagttaa ttttggcaag aagcatgtga ttaataatct agatttattt 3240
gtttttaccg acagcggcac ggtggttcca gaaaaggcag aggtccaata ttgggatgga 3300
acggcgtgga aggatgtcga aaatctaaca cagccatcgc catatgtggt agagaaaaat 3360
gaacttacat ttgatgcggt cgcgacagaa aagctgaaat tccatttgac accatctgtg 3420
aaagggaaat tcctagctct aacggaagca gaggtgtacg ccgatcagat tgtgatgggt 3480
gaaacagcaa aacttcaaag tattacggtg aatgggaaag cattagaagg ctttgatcac 3540
gctaaaaaga attatgaact tgtacttcca tatggaagcg agcttcctaa gattgaggcg 3600
gctgctgccg acaatgcaac tgtcaccatt ttaccggcat tctcctatcc gggaacagca 3660
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acggttgtgg cccattataa ccgaggaatc ccgcgggatg ttaaggtgaa gtgggaaaga 4140
atcaatccgt ctaagtacca gcagctaggc gagtttaccg tatctggcat ggtggaaggg 4200
accgatataa aagcccaagc aaaagtgatt gtaaaagggg ctgttgcggt cgaggatatt 4260
agaatg 4266
<210> 7
<211> 3747
<212> DNA
<213> Bacillus circulans
<400> 7
gtgaaaaaag cgattagctg cgttttttta atttcagcac tgattctatc aagctttcaa 60
gtccctgtac agggacaagc catgtcaaaa acgacatcgg cagcaggaaa cagtgtgagc 120
tatgatggag agagacgagt gaattttaac gagaattggc gatttcaacg agaaaccaat 180
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ctgccgcatg actggagtat tgaattagat tttaataaaa attctcttgc cacacatgaa 300
ggcggttatt tggacggcgg aatcggctgg taccgaaaaa cctttacaat cccggaatcg 360
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tccgacaaac tttataaaga tggcagggcg aatgtccttg ttgtcaaagt caataacacc 540
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accgatccca tccatgtggc tcgctacgga acatttgtga caacacccaa tttagagaaa 660
tcgataaaag aagacagggc tgatgtgaac atcaagacga aaatcagtaa cgatgctgct 720
gaggcgaaac aggtaaagat taaatcaacc atctacgatg gggctgggaa caccgtacag 780
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acagaagtca tcgttggcgg gcaaacggtg gatacgtatg aaacaaaatt tggtgtcagg 960
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ccggcatcac cggaactgct ggaggcagct aataaattag ggctattcat catcgaggag 1200
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cgaaatttag tgggttgggt aaaagaaatt gacaccacaa ggccgacaac gatcggcgag 1440
gataaaaccc gcggagacaa agtaaatgtt acacctatca acagctacat caaggagatt 1500
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ggtgtctaca cgcatccgta ccagtataac caaagcacaa agtatgctga tttacagcaa 1680
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gtttttaccg acagcggcac ggtggttcca gaaaaggcag aggtccaata ttgggatgga 3300
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Claims (27)
- 서열번호 1∼4 중 어느 하나의 아미노산 서열, 또는 서열번호 1∼4 중 어느 하나로 나타내는 아미노산 서열과 90% 이상 동일한 아미노산 서열로 이루어지는 β-갈락토시다아제로서,
182번째 프롤린(P182), 187번째 티로신(Y187), 188번째 세린(S188), 405번째 트립토판(W405), 406번째 알라닌(A406), 407번째 글루타민(Q407), 449번째 티로신(Y449), 483번째 트레오닌(T483), 512번째 세린(S512), 531번째 세린(S531), 533번째 세린(S533), 534번째 세린(S534), 550번째 아스파라긴(N550), 551번째 글루타민(Q551), 593번째 트립토판(W593), 598번째 티로신(Y598), 602번째 프롤린(P602), 604번째 프롤린(P604), 609번째 티로신(Y609), 612번째 리신(K612) 및 615번째 티로신(Y615)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 또는 2 이상의 아미노산, 또는 그것에 상당하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열로 이루어지는, 변형된 β-갈락토시다아제. - 제1항에 있어서,
치환의 대상이 되는 1 또는 2 이상의 아미노산이, 449번째 티로신(Y449), 531번째 세린(S531), 593번째 트립토판(W593), 602번째 프롤린(P602), 604번째 프롤린(P604) 및 612번째 리신(K612)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 변형된 β-갈락토시다아제. - 제1항에 있어서,
치환의 대상이 되는 1 또는 2 이상의 아미노산이, 187번째 티로신(Y187), 188번째 세린(S188), 533번째 세린(S533), 602번째 프롤린(P602) 및 612번째 리신(K612)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 변형된 β-갈락토시다아제. - 제1항에 있어서,
치환의 대상이 되는 1 또는 2 이상의 아미노산이, 182번째 프롤린(P182), 187번째 티로신(Y187), 188번째 세린(S188), 405번째 트립토판(W405), 407번째 글루타민(Q407), 449번째 티로신(Y449), 483번째 트레오닌(T483), 512번째 세린(S512), 531번째 세린(S531), 550번째 아스파라긴(N550), 602번째 프롤린(P602) 및 604번째 프롤린(P604)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 변형된 β-갈락토시다아제. - 제1항에 있어서,
치환의 대상이 되는 1 또는 2 이상의 아미노산이, 483번째 트레오닌(T483), 512번째 세린(S512), 551번째 글루타민(Q551), 598번째 티로신(Y598) 및 615번째 티로신(Y615)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 변형된 β-갈락토시다아제. - 제1항에 있어서,
치환의 대상이 되는 1 또는 2 이상의 아미노산이, 405번째 트립토판(W405), 483번째 트레오닌(T483), 531번째 세린(S531), 550번째 아스파라긴(N550) 및 598번째 티로신(Y598)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 변형된 β-갈락토시다아제. - 제1항에 있어서,
치환의 대상이 되는 1 또는 2 이상의 아미노산이, 182번째 프롤린(P182), 187번째 티로신(Y187), 188번째 세린(S188), 405번째 트립토판(W405), 406번째 알라닌(A406), 407번째 글루타민(Q407), 449번째 티로신(Y449), 483번째 트레오닌(T483), 512번째 세린(S512), 534번째 세린(S534), 550번째 아스파라긴(N550), 551번째 글루타민(Q551), 602번째 프롤린(P602), 609번째 티로신(Y609), 612번째 리신(K612) 및 615번째 티로신(Y615)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 변형된 β-갈락토시다아제. - 제2항에 있어서,
449번째 티로신(Y449)에 대한 치환 후 아미노산은 아스파라긴산, 글루타민산, 아스파라긴 또는 트립토판이며, 531번째 세린(S531)에 대한 치환 후 아미노산은 알라닌, 아스파라긴산, 글루타민산, 페닐알라닌, 글리신, 이소류신, 메티오닌, 아스파라긴 또는 글루타민이며, 593번째 트립토판(W593)에 대한 치환 후 아미노산은 페닐알라닌이며, 602번째 프롤린(P602)에 대한 치환 후 아미노산은 글루타민산 또는 글리신이며, 604번째 프롤린(P604)에 대한 치환 후 아미노산은 알라닌, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 메티오닌, 세린, 트레오닌, 발린, 트립토판 또는 티로신이며, 612번째 리신(K612)에 대한 치환 후 아미노산은 메티오닌인, 변형된 β-갈락토시다아제. - 제3항에 있어서,
187번째 티로신(Y187)에 대한 치환 후 아미노산은 아스파라긴산, 글루타민산 또는 글리신이며, 188번째 세린(S188)에 대한 치환 후 아미노산은 프롤린 또는 트레오닌이며, 533번째 세린(S533)에 대한 치환 후 아미노산은 메티오닌 또는 글루타민이며, 602번째 프롤린(P602)에 대한 치환 후의 아미노산은 시스테인, 이소류신, 아스파라긴, 세린, 트레오닌 또는 발린이며, 612번째 리신(K612)에 대한 치환 후 아미노산은 페닐알라닌인, 변형된 β-갈락토시다아제. - 제4항에 있어서,
182번째 프롤린(P182)에 대한 치환 후 아미노산은 류신이며, 187번째 티로신(Y187)에 대한 치환 후 아미노산은 아스파라긴산 또는 류신이며, 188번째 세린(S188)에 대한 치환 후 아미노산은 이소류신이며, 405번째 트립토판(W405)에 대한 치환 후 아미노산은 알라닌, 아스파라긴산, 글루타민산, 글리신, 히스티딘, 류신, 아스파라긴, 세린 또는 트레오닌이며, 407번째 글루타민(Q407)에 대한 치환 후 아미노산은 글리신 또는 아르기닌이며, 449번째 티로신(Y449)에 대한 치환 후 아미노산은 글루타민산, 이소류신, 글루타민, 아르기닌 또는 세린이며, 483번째 트레오닌(T483)에 대한 치환 후 아미노산은 글루타민이며, 512번째 세린(S512)에 대한 치환 후 아미노산은 페닐알라닌, 트레오닌 또는 발린이며, 531번째 세린(S531)에 대한 치환 후 아미노산은 프롤린이며, 550번째 아스파라긴(N550)에 대한 치환 후 아미노산은 류신, 아르기닌 또는 세린이며, 602번째 프롤린(P602)에 대한 치환 후 아미노산은 류신, 아스파라긴 또는 글루타민이며, 604번째 프롤린(P604)에 대한 치환 후 아미노산은 이소류신 또는 메티오닌인, 변형된 β-갈락토시다아제. - 제5항에 있어서,
483번째 트레오닌(T483)에 대한 치환 후 아미노산은 리신, 메티오닌 또는 아르기닌이며, 512번째 세린(S512)에 대한 치환 후 아미노산은 글리신 또는 리신이며, 551번째 글루타민(Q551)에 대한 치환 후 아미노산은 아스파라긴이며, 598번째 티로신(Y598)에 대한 치환 후 아미노산은 아스파라긴이며, 615번째 티로신(Y615)에 대한 치환 후 아미노산은 트레오닌인, 변형된 β-갈락토시다아제. - 제6항에 있어서,
405번째 트립토판(W405)에 대한 치환 후 아미노산은 알라닌, 아스파라긴산, 세린 또는 트레오닌이며, 483번째 트레오닌(T483)에 대한 치환 후 아미노산은 메티오닌이며, 531번째 세린(S531)에 대한 치환 후 아미노산은 아스파라긴산, 페닐알라닌, 글리신, 류신, 리신 또는 메티오닌이며, 550번째 아스파라긴(N550)에 대한 치환 후 아미노산은 페닐알라닌이며, 598번째 티로신(Y598)에 대한 치환 후 아미노산은 페닐알라닌 또는 히스티딘인, 변형된 β-갈락토시다아제. - 제7항에 있어서,
182번째 프롤린(P182)에 대한 치환 후 아미노산은 류신 또는 세린이며, 187번째 티로신(Y187)에 대한 치환 후 아미노산은 아스파라긴산, 글루타민산 또는 아스파라긴이며, 188번째 세린(S188)에 대한 치환 후 아미노산은 글루타민산, 글리신, 이소류신 또는 아스파라긴이며, 405번째 트립토판(W405)에 대한 치환 후 아미노산은 히스티딘이며, 406번째 알라닌(A406)에 대한 치환 후 아미노산은 프롤린이며, 407번째 글루타민(Q407)에 대한 치환 후 아미노산은 알라닌, 페닐알라닌, 글리신, 리신 또는 아르기닌이며, 449번째 티로신(Y449)에 대한 치환 후 아미노산은 글루타민산 또는 아르기닌이며, 483번째 트레오닌(T483)에 대한 치환 후 아미노산은 세린 또는 글루타민이며, 512번째 세린(S512)에 대한 치환 후 아미노산은 글리신, 트레오닌 또는 발린이며, 534번째 세린(S534)에 대한 치환 후 아미노산은 리신 또는 글루타민이며, 550번째 아스파라긴(N550)에 대한 치환 후 아미노산은 알라닌, 글리신, 리신, 류신, 메티오닌, 아르기닌 또는 세린이며, 551번째 글루타민(Q551)에 대한 치환 후 아미노산은 리신 또는 히스티딘이며, 602번째 프롤린(P602)에 대한 치환 후 아미노산은 시스테인, 아스파라긴산 또는 아스파라긴이며, 609번째 티로신(Y609)에 대한 치환 후 아미노산은 아스파라긴산, 글루타민 또는 트레오닌이며, 612번째 리신(K612)에 대한 치환 후 아미노산은 페닐알라닌 또는 이소류신이며, 615번째 티로신(Y615)에 대한 치환 후 아미노산은 글루타민산, 이소류신 또는 트레오닌인, 변형된 β-갈락토시다아제. - 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 β-갈락토시다아제가 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지고, 상기 치환에 더하여, 1540번째 트립토판(W1540)이 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열로 이루어지는, 변형된 β-갈락토시다아제. - 서열번호 1∼4 중 어느 하나의 아미노산 서열, 또는 서열번호 1∼4 중 어느 하나로 나타내는 아미노산 서열과 90% 이상 동일한 아미노산 서열로 이루어지는 β-갈락토시다아제로서,
85번째 트립토판(W85), 91번째 페닐알라닌(F91), 103번째 티로신(Y103), 134번째 티로신(Y134), 153번째 티로신(Y153), 182번째 프롤린(P182), 186번째 트립토판(W186), 192번째 티로신(Y192), 295번째 티로신(Y295), 345번째 히스티딘(H345), 349번째 글리신(G349), 402번째 페닐알라닌(F402), 407번째 글루타민(Q407), 479번째 글리신(G479), 480번째 글루타민산(E480), 482번째 리신(K482), 483번째 트레오닌(T483), 484번째 아르기닌(R484), 485번째 글리신(G485), 486번째 아스파라긴산(D486), 487번째 리신(K487), 488번째 발린(V488), 496번째 티로신(Y496), 512번째 세린(S512), 513번째 글루타민산(E513), 514번째 아스파라긴(N514), 515번째 아스파라긴(N515), 516번째 티로신(Y516), 517번째 아스파라긴산(D517), 519번째 티로신(Y519), 533번째 트레오닌(T533), 547번째 티로신(Y547), 549번째 티로신(Y549), 555번째 티로신(Y555), 572번째 아르기닌(R572), 573번째 트레오닌(T573), 598번째 티로신(Y598), 605번째 티로신(Y605), 606번째 티로신(Y606), 609번째 티로신(Y609), 616번째 페닐알라닌(F616), 624번째 페닐알라닌(F624), 648번째 트립토판(W648) 및 650번째 트립토판(W650)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 또는 2 이상의 아미노산, 또는 그것에 상당하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열로 이루어지는, 변형된 β-갈락토시다아제. - 제15항에 있어서,
85번째 트립토판(W85)에 대한 치환 후 아미노산은 글리신이며, 91번째 페닐알라닌(F91)에 대한 치환 후 아미노산은 알라닌 또는 이소류신이며, 103번째 티로신(Y103)에 대한 치환 후 아미노산은 글리신이며, 134번째 티로신(Y134)에 대한 치환 후 아미노산은 글리신이며, 153번째 티로신(Y153)에 대한 치환 후 아미노산은 글리신이며, 182번째 프롤린(P182)에 대한 치환 후 아미노산은 트립토판 또는 티로신이며, 186번째 트립토판(W186)에 대한 치환 후 아미노산은 메티오닌이며, 192번째 티로신(Y192)에 대한 치환 후 아미노산은 글리신이며, 295번째 티로신(Y295)에 대한 치환 후 아미노산은 글리신이며, 345번째 히스티딘(H345)에 대한 치환 후 아미노산은 글리신이며, 349번째 글리신(G349)에 대한 치환 후 아미노산은 트립토판이며, 402번째 페닐알라닌(F402)에 대한 치환 후 아미노산은 글리신이며, 407번째 글루타민(Q407)에 대한 치환 후 아미노산은 이소류신, 류신, 메티오닌, 발린 또는 티로신이며, 479번째 글리신(G479)에 대한 치환 후 아미노산은 류신, 프롤린 또는 글루타민이며, 480번째 글루타민산(E480)에 대한 치환 후 아미노산은 아스파라긴이며, 482번째 리신(K482)에 대한 치환 후 아미노산은 메티오닌 또는 발린이며, 483번째 트레오닌(T483)에 대한 치환 후 아미노산은 글리신 또는 세린이며, 484번째 아르기닌(R484)에 대한 치환 후 아미노산은 페닐알라닌, 이소류신, 메티오닌, 아스파라긴 또는 글루타민이며, 485번째 글리신(G485)에 대한 치환 후 아미노산은 아스파라긴산, 아스파라긴, 글루타민 또는 트레오닌이며, 486번째 아스파라긴산(D486)에 대한 치환 후 아미노산은 알라닌, 글루타민산, 페닐알라닌, 이소류신, 리신, 류신, 메티오닌, 프롤린, 글루타민, 아르기닌, 트레오닌, 트립토판 또는 티로신이며, 487번째 리신(K487)에 대한 치환 후 아미노산은 시스테인, 글루타민산, 페닐알라닌, 히스티딘, 이소류신, 류신, 아스파라긴, 글루타민, 아르기닌, 트레오닌, 발린, 트립토판 또는 티로신이며, 488번째 발린(V488)에 대한 치환 후 아미노산은 글리신, 이소류신, 류신, 아르기닌, 세린, 트레오닌, 트립토판 또는 티로신이며, 496번째 티로신(Y496)에 대한 치환 후 아미노산은 글리신이며, 512번째 세린(S512)에 대한 치환 후 아미노산은 시스테인, 아스파라긴산, 글루타민산, 아스파라긴, 프롤린, 글루타민 또는 트립토판이며, 513번째 글루타민산(E513)에 대한 치환 후 아미노산은 알라닌, 시스테인, 아스파라긴산, 페닐알라닌, 글리신, 히스티딘, 리신, 류신, 메티오닌, 아스파라긴, 프롤린, 글루타민, 아르기닌, 세린, 트레오닌 또는 발린이며, 514번째 아스파라긴(N514)에 대한 치환 후 아미노산은 글루타민산, 류신 또는 리신이며, 515번째 아스파라긴(N515)에 대한 치환 후 아미노산은 알라닌, 아스파라긴산, 글루타민산, 글리신, 이소류신, 류신, 프롤린 또는 발린이며, 516번째 티로신(Y516)에 대한 치환 후 아미노산은 트립토판이며, 517번째 아스파라긴산(D517)에 대한 치환 후 아미노산은 리신 또는 트립토판이며, 519번째 티로신(Y519)에 대한 치환 후 아미노산은 글리신이며, 533번째 트레오닌(T533)에 대한 치환 후 아미노산은 글루타민산이며, 547번째 티로신(Y547)에 대한 치환 후 아미노산은 글리신이며, 549번째 티로신(Y549)에 대한 치환 후 아미노산은 글리신이며, 555번째 티로신(Y555)에 대한 치환 후 아미노산은 글리신이며, 572번째 아르기닌(R572)에 대한 치환 후 아미노산은 시스테인, 류신, 메티오닌, 트레오닌, 트립토판 또는 티로신이며, 573번째 트레오닌(T573)에 대한 치환 후 아미노산은 글루타민산이며, 598번째 티로신(Y598)에 대한 치환 후 아미노산은 히스티딘 또는 아스파라긴이며, 605번째 티로신(Y605)에 대한 치환 후 아미노산은 시스테인, 아스파라긴산, 히스티딘, 이소류신, 리신, 프롤린, 아르기닌 또는 트레오닌이며, 606번째 티로신(Y606)에 대한 치환 후 아미노산은 알라닌, 시스테인, 아스파라긴산, 글루타민산, 페닐알라닌, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 리신, 류신, 메티오닌 또는 세린이며, 609번째 티로신(Y609)에 대한 치환 후 아미노산은 글루타민산, 아스파라긴 또는 세린이며, 616번째 페닐알라닌(F616)에 대한 치환 후 아미노산은 글리신이며, 624번째 페닐알라닌(F624)에 대한 치환 후 아미노산은 글리신이며, 648번째 트립토판(W648)에 대한 치환 후 아미노산은 글리신이며, 650번째 트립토판(W650)에 대한 치환 후 아미노산은 글리신인, 변형된 β-갈락토시다아제. - 서열번호 1∼4 중 어느 하나의 아미노산 서열, 또는 서열번호 1∼4 중 어느 하나로 나타내는 아미노산 서열과 90% 이상 동일한 아미노산 서열로 이루어지는 β-갈락토시다아제로서,
76번째 트립토판(W76), 480번째 글루타민산(E480), 483번째 트레오닌(T483), 485번째 글리신(G485), 484번째 아르기닌(R484), 487번째 리신(K487), 488번째 발린(V488), 512번째 세린(S512), 514번째 아스파라긴(N514), 515번째 아스파라긴(N515), 569번째 글리신(G569) 및 596번째 페닐알라닌(F596)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 또는 2 이상의 아미노산, 또는 그것에 상당하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열로 이루어지는, 변형된 β-갈락토시다아제. - 제17항에 있어서,
76번째 트립토판(W76)에 대한 치환 후 아미노산은 글리신이며, 480번째 글루타민산(E480)에 대한 치환 후 아미노산은 글루타민이며, 483번째 트레오닌(T483)에 대한 치환 후 아미노산은 트립토판이며, 485번째 글리신(G485)에 대한 치환 후 아미노산은 프롤린 또는 트레오닌이며, 484번째 아르기닌(R484)에 대한 치환 후 아미노산은 알라닌, 시스테인, 아스파라긴산, 글리신, 프롤린, 세린, 티로신 또는 리신이며, 487번째 리신(K487)에 대한 치환 후 아미노산은 글리신 또는 프롤린이며, 488번째 발린(V488)에 대한 치환 후 아미노산은 프롤린이며, 512번째 세린(S512)에 대한 치환 후 아미노산은 류신 또는 메티오닌이며, 514번째 아스파라긴(N514)에 대한 치환 후 아미노산은 아스파라긴산이며, 515번째 아스파라긴(N515)에 대한 치환 후 아미노산은 페닐알라닌, 아르기닌, 트립토판, 티로신 또는 리신이며, 569번째 글리신(G569)에 대한 치환 후 아미노산은 리신, 프롤린 또는 발린이며, 596번째 페닐알라닌(F596)에 대한 치환 후 아미노산은 글리신인, 변형된 β-갈락토시다아제. - 서열번호 1∼4 중 어느 하나의 아미노산 서열, 또는 서열번호 1∼4 중 어느 하나로 나타내는 아미노산 서열과 90% 이상 동일한 아미노산 서열로 이루어지는 β-갈락토시다아제에 있어서, 하기 중 어느 하나의 변형이 행해진 변형된 β-갈락토시다아제:
188번째 세린 또는 그것에 상당하는 아미노산이 이소류신으로 치환되고, 또한 550번째 아스파라긴 또는 그것에 상당하는 아미노산이 페닐알라닌으로 치환(S188I_N550F);
407번째 글루타민 또는 그것에 상당하는 아미노산이 아르기닌으로 치환되고, 또한 550번째 아스파라긴 또는 그것에 상당하는 아미노산이 페닐알라닌으로 치환(Q407R_N550F);
449번째 티로신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 글루타민으로 치환되고, 또한 598번째 티로신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 히스티딘으로 치환(Y449Q_Y598H);
550번째 아스파라긴 또는 그것에 상당하는 아미노산이 페닐알라닌으로 치환되고, 또한 602번째 프롤린 또는 그것에 상당하는 아미노산이 글루타민으로 치환(N550F_P602Q);
407번째 글루타민 또는 그것에 상당하는 아미노산이 아르기닌으로 치환되고, 또한 449번째 티로신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 글루타민산으로 치환(Q407R_Y449E);
550번째 아스파라긴 또는 그것에 상당하는 아미노산이 페닐알라닌으로 치환되고, 또한 598번째 티로신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 아스파라긴으로 치환(N550F_Y598N);
182번째 프롤린 또는 그것에 상당하는 아미노산이 류신으로 치환되고, 또한 449번째 티로신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 글루타민산으로 치환(P182L_Y449E);
182번째 프롤린 또는 그것에 상당하는 아미노산이 류신으로 치환되고, 또한 449번째 티로신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 글루타민으로 치환(P182L_Y449Q);
187번째 티로신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 류신으로 치환되고, 또한 407번째 글루타민 또는 그것에 상당하는 아미노산이 아르기닌으로 치환(Y187L_Q407R);
187번째 티로신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 류신으로 치환되고, 또한 449번째 티로신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 글루타민산으로 치환(Y187L_Y449E);
187번째 티로신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 류신으로 치환되고, 또한 449번째 티로신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 글루타민으로 치환(Y187L_Y449Q);
187번째 티로신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 류신으로 치환되고, 또한 512번째 세린 또는 그것에 상당하는 아미노산이 시스테인으로 치환(Y187L_S512C);
187번째 티로신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 류신으로 치환되고, 또한 512번째 세린 또는 그것에 상당하는 아미노산이 아스파라긴으로 치환(Y187L_S512N);
187번째 티로신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 류신으로 치환되고, 또한 512번째 세린 또는 그것에 상당하는 아미노산이 트레오닌으로 치환(Y187L_S512T);
188번째 세린 또는 그것에 상당하는 아미노산이 이소류신으로 치환되고, 또한 407번째 글루타민 또는 그것에 상당하는 아미노산이 아르기닌으로 치환(S188I_Q407R);
188번째 세린 또는 그것에 상당하는 아미노산이 이소류신으로 치환되고, 또한 449번째 티로신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 글루타민으로 치환(S188I_Y449Q);
188번째 세린 또는 그것에 상당하는 아미노산이 이소류신으로 치환되고, 또한 483번째 트레오닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 글루타민산으로 치환(S188I_T483E);
407번째 글루타민 또는 그것에 상당하는 아미노산이 류신으로 치환되고, 또한 512번째 세린 또는 그것에 상당하는 아미노산이 발린으로 치환(Q407L_S512V);
407번째 글루타민 또는 그것에 상당하는 아미노산이 아르기닌으로 치환되고, 또한 483번째 트레오닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 글리신으로 치환(Q407R_T483G);
407번째 글루타민 또는 그것에 상당하는 아미노산이 아르기닌으로 치환되고, 또한 449번째 티로신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 글루타민으로 치환(Q407R_Y449Q);
407번째 글루타민 또는 그것에 상당하는 아미노산이 아르기닌으로 치환되고, 또한 550번째 아스파라긴 또는 그것에 상당하는 아미노산이 세린으로 치환(Q407R_N550S);
449번째 티로신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 글루타민으로 치환되고, 또한 550번째 아스파라긴 또는 그것에 상당하는 아미노산이 세린으로 치환(Y449Q_N550S);
487번째 리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 트립토판으로 치환되고, 또한 512번째 세린 또는 그것에 상당하는 아미노산이 트레오닌으로 치환(K487W_S512T);
487번째 리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 트립토판으로 치환되고, 또한 517번째 아스파라긴산 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신으로 치환(K487W_D517K);
487번째 리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 트립토판으로 치환되고, 또한 515번째 아스파라긴 또는 그것에 상당하는 아미노산이 글리신으로 치환(K487W_N515G);
487번째 리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 트립토판으로 치환되고, 또한 517번째 아스파라긴산 또는 그것에 상당하는 아미노산이 트립토판으로 치환(K487W_D517W);
487번째 리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 프롤린으로 치환되고, 또한 515번째 아스파라긴 또는 그것에 상당하는 아미노산이 아르기닌으로 치환(K487P_N515R);
91번째 페닐알라닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 세린으로 치환되고, 또한 407번째 글루타민 또는 그것에 상당하는 아미노산이 메티오닌으로 치환(F91S_Q407M);
180번째 트레오닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 발린으로 치환되고, 또한 187번째 티로신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 류신으로 치환(T180V_Y187L);
180번째 트레오닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 발린으로 치환되고, 또한 188번째 세린 또는 그것에 상당하는 아미노산이 이소류신으로 치환(T180V_S188I);
180번째 트레오닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 발린으로 치환되고, 또한 407번째 글루타민 또는 그것에 상당하는 아미노산이 아르기닌으로 치환(T180V_Q407R);
180번째 트레오닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 발린으로 치환되고, 또한 449번째 티로신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 글루타민산으로 치환(T180V_Y449E);
180번째 트레오닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 발린으로 치환되고, 또한 483번째 트레오닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 글리신으로 치환(T180V_T483G);
180번째 트레오닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 발린으로 치환되고, 또한 512번째 세린 또는 그것에 상당하는 아미노산이 발린으로 치환(T180V_S512V);
180번째 트레오닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 발린으로 치환되고, 또한 550번째 아스파라긴 또는 그것에 상당하는 아미노산이 페닐알라닌으로 치환(T180V_N550F);
180번째 트레오닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 발린으로 치환되고, 또한 615번째 티로신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 프롤린으로 치환(T180V_Y615P);
182번째 프롤린 또는 그것에 상당하는 아미노산이 류신으로 치환되고, 또한 376번째 아르기닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 프롤린으로 치환(P182L_R376P);
182번째 프롤린 또는 그것에 상당하는 아미노산이 트립토판으로 치환되고, 또한 449번째 티로신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 글루타민으로 치환(P182W_Y449Q);
187번째 티로신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 류신으로 치환되고, 또한 487번째 리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 알라닌으로 치환(Y187L_K487A);
187번째 티로신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 류신으로 치환되고, 또한 512번째 세린 또는 그것에 상당하는 아미노산이 알라닌으로 치환(Y187L_S512A);
187번째 티로신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 류신으로 치환되고, 또한 533번째 트레오닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 아스파라긴으로 치환(Y187L_T533N);
376번째 아르기닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 프롤린으로 치환되고, 또한 407번째 글루타민 또는 그것에 상당하는 아미노산이 류신으로 치환(R376P_Q407L);
376번째 아르기닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 프롤린으로 치환되고, 또한 449번째 티로신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 글루타민으로 치환(R376P_Y449Q);
376번째 아르기닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 프롤린으로 치환되고, 또한 512번째 세린 또는 그것에 상당하는 아미노산이 발린으로 치환(R376P_S512V);
376번째 아르기닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 프롤린으로 치환되고, 또한 550번째 아스파라긴 또는 그것에 상당하는 아미노산이 트립토판으로 치환(R376P_N550W);
376번째 아르기닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 프롤린으로 치환되고, 또한 550번째 아스파라긴 또는 그것에 상당하는 아미노산이 티로신으로 치환(R376P_N550Y);
407번째 글루타민 또는 그것에 상당하는 아미노산이 류신으로 치환되고, 또한 533번째 트레오닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 글루타민산으로 치환(Q407L_T533E);
407번째 글루타민 또는 그것에 상당하는 아미노산이 류신으로 치환되고, 또한 570번째 트립토판 또는 그것에 상당하는 아미노산이 티로신으로 치환(Q407L_W570Y);
407번째 글루타민 또는 그것에 상당하는 아미노산이 류신으로 치환되고, 또한 615번째 티로신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 류신으로 치환(Q407L_Y615L);
407번째 글루타민 또는 그것에 상당하는 아미노산이 아르기닌으로 치환되고, 또한 615번째 티로신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 류신으로 치환(Q407R_Y615L);
407번째 글루타민 또는 그것에 상당하는 아미노산이 아르기닌으로 치환되고, 또한 615번째 티로신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 프롤린으로 치환(Q407R_Y615P);
449번째 티로신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 아스파라긴산으로 치환되고, 또한 598번째 티로신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 페닐알라닌으로 치환(Y449D_Y598F);
449번째 티로신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 글루타민으로 치환되고, 또한 533번째 트레오닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 글루타민산으로 치환(Y449Q_T533E);
449번째 티로신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 글루타민으로 치환되고, 또한 615번째 티로신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 글리신으로 치환(Y449Q_Y615G);
449번째 티로신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 글루타민으로 치환되고, 또한 615번째 티로신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 프롤린으로 치환(Y449Q_Y615P);
483번째 트레오닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 글리신으로 치환되고, 또한 512번째 세린 또는 그것에 상당하는 아미노산이 발린으로 치환(T483G_S512V);
483번째 트레오닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 글리신으로 치환되고, 또한 550번째 아스파라긴 또는 그것에 상당하는 아미노산이 세린으로 치환(T483G_N550S);
483번째 트레오닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 글리신으로 치환되고, 또한 615번째 티로신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 류신으로 치환(T483G_Y615L);
483번째 트레오닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 글루타민으로 치환되고, 또한 602번째 프롤린 또는 그것에 상당하는 아미노산이 글루타민으로 치환(T483Q_P602Q);
484번째 아르기닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 히스티딘으로 치환되고, 또한 487번째 리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 히스티딘으로 치환(R484H_K487H);
484번째 아르기닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 트립토판으로 치환되고, 또한 487번째 리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 아스파라긴산으로 치환(R484W_K487D);
484번째 아르기닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 트립토판으로 치환되고, 또한 575번째 트레오닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 트립토판으로 치환(R484W_T575W);
485번째 글리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신으로 치환되고, 또한 488번째 발린 또는 그것에 상당하는 아미노산이 트립토판으로 치환(G485K_V488W);
485번째 글리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신으로 치환되고, 또한 516번째 티로신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 트립토판으로 치환(G485K_Y516W);
485번째 글리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신으로 치환되고, 또한 517번째 아스파라긴산 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신으로 치환(G485K_D517K);
485번째 글리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신으로 치환되고, 또한 517번째 아스파라긴산 또는 그것에 상당하는 아미노산이 트립토판으로 치환(G485K_D517W);
485번째 글리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신으로 치환되고, 또한 569번째 글리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 트립토판으로 치환(G485K_G569W);
485번째 글리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신으로 치환되고, 또한 571번째 글리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신으로 치환(G485K_G571K);
485번째 글리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신으로 치환되고, 또한 572번째 아르기닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 트립토판으로 치환(G485K_R572W);
485번째 글리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신으로 치환되고, 또한 573번째 트레오닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 트립토판으로 치환(G485K_T573W);
485번째 글리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 트립토판으로 치환되고, 또한 516번째 티로신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 트립토판으로 치환(G485W_Y516W);
485번째 글리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 트립토판으로 치환되고, 또한 517번째 아스파라긴산 또는 그것에 상당하는 아미노산이 트립토판으로 치환(G485W_D517W);
485번째 글리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 트립토판으로 치환되고, 또한 573번째 트레오닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신으로 치환(G485W_T573K);
485번째 글리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 트립토판으로 치환되고, 또한 573번째 트레오닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 트립토판으로 치환(G485W_T573W);
487번째 리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 알라닌으로 치환되고, 또한 512번째 세린 또는 그것에 상당하는 아미노산이 발린으로 치환(K487A_S512V);
487번째 리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 글리신으로 치환되고, 또한 515번째 아스파라긴 또는 그것에 상당하는 아미노산이 글루타민으로 치환(K487G_N515Q);
487번째 리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 트립토판으로 치환되고, 또한 573번째 트레오닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신으로 치환(K487W_T573K);
487번째 리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 트립토판으로 치환되고, 또한 593번째 트립토판 또는 그것에 상당하는 아미노산이 페닐알라닌으로 치환(K487W_W593F);
488번째 발린 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신으로 치환되고, 또한 514번째 아스파라긴 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신으로 치환(V488K_N514K);
488번째 발린 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신으로 치환되고, 또한 517번째 아스파라긴산 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신으로 치환(V488K_D517K);
488번째 발린 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신으로 치환되고, 또한 569번째 글리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신으로 치환(V488K_G569K);
488번째 발린 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신으로 치환되고, 또한 569번째 글리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 트립토판으로 치환(V488K_G569W);
488번째 발린 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신으로 치환되고, 또한 572번째 아르기닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신으로 치환(V488K_R572K);
488번째 발린 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신으로 치환되고, 또한 573번째 트레오닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신으로 치환(V488K_T573K);
488번째 발린 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신으로 치환되고, 또한 573번째 트레오닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 트립토판으로 치환(V488K_T573W);
488번째 발린 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신으로 치환되고, 또한 516번째 티로신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신으로 치환(V488K_Y516K);
488번째 발린 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신으로 치환되고, 또한 516번째 티로신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 트립토판으로 치환(V488K_Y516W);
488번째 발린 또는 그것에 상당하는 아미노산이 트립토판으로 치환되고, 또한 514번째 아스파라긴 또는 그것에 상당하는 아미노산이 트립토판으로 치환(V488W_N514W);
488번째 발린 또는 그것에 상당하는 아미노산이 트립토판으로 치환되고, 또한 573번째 트레오닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 트립토판으로 치환(V488W_T573W);
500번째 글루타민산 또는 그것에 상당하는 아미노산이 알라닌으로 치환되고, 또한 501번째 이소류신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 알라닌으로 치환(E500A_I501A);
512번째 세린 또는 그것에 상당하는 아미노산이 발린으로 치환되고, 또한 550번째 아스파라긴 또는 그것에 상당하는 아미노산이 세린으로 치환(S512V_N550S);
533번째 트레오닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 글루타민산으로 치환되고, 또한 550번째 아스파라긴 또는 그것에 상당하는 아미노산이 세린으로 치환(T533E_N550S);
533번째 트레오닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 글루타민산으로 치환되고, 또한 615번째 티로신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 글리신으로 치환(T533E_Y615G);
570번째 트립토판 또는 그것에 상당하는 아미노산이 티로신으로 치환되고, 또한 615번째 티로신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 류신으로 치환(W570Y_Y615L);
91번째 페닐알라닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 발린으로 치환되고, 또한 513번째 글루타민산 또는 그것에 상당하는 아미노산이 글리신으로 치환(F91V_E513G);
180번째 트레오닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 발린으로 치환되고, 또한 483번째 트레오닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신으로 치환(T180V_T483K);
180번째 트레오닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 발린으로 치환되고, 또한 598번째 티로신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 아스파라긴으로 치환(T180V_Y598N);
180번째 트레오닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 발린으로 치환되고, 또한 615번째 티로신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 글리신으로 치환(T180V_Y615G);
182번째 프롤린 또는 그것에 상당하는 아미노산이 류신으로 치환되고, 또한 615번째 티로신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 류신으로 치환(P182L_Y615L);
376번째 아르기닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 프롤린으로 치환되고, 또한 598번째 티로신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 아스파라긴으로 치환(R376P_Y598N);
407번째 글루타민 또는 그것에 상당하는 아미노산이 류신으로 치환되고, 또한 483번째 트레오닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신으로 치환(Q407L_T483K);
407번째 글루타민 또는 그것에 상당하는 아미노산이 류신으로 치환되고, 또한 487번째 리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 프롤린으로 치환(Q407L_K487P);
407번째 글루타민 또는 그것에 상당하는 아미노산이 류신으로 치환되고, 또한 615번째 티로신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 글리신으로 치환(Q407L_Y615G);
449번째 티로신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 글루타민산으로 치환되고, 또한 487번째 리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 알라닌으로 치환(Y449E_K487A);
449번째 티로신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 글루타민산으로 치환되고, 또한 487번째 리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 프롤린으로 치환(Y449E_K487P);
483번째 트레오닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 글리신으로 치환되고, 또한 487번째 리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 알라닌으로 치환(T483G_K487A);
483번째 트레오닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 글리신으로 치환되고, 또한 533번째 트레오닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 글루타민산으로 치환(T483G_T533E);
483번째 트레오닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 글리신으로 치환되고, 또한 615번째 티로신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 글리신으로 치환(T483G_Y615G);
483번째 트레오닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 메티오닌으로 치환되고, 또한 487번째 리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 알라닌으로 치환(T483M_K487A);
483번째 트레오닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 메티오닌으로 치환되고, 또한 487번째 리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 글리신으로 치환(T483M_K487G);
483번째 트레오닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 메티오닌으로 치환되고, 또한 487번째 리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 프롤린으로 치환(T483M_K487P);
484번째 아르기닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 히스티딘으로 치환되고, 또한 487번째 리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 아스파라긴산으로 치환(R484H_K487D);
484번째 아르기닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신으로 치환되고, 또한 513번째 글루타민산 또는 그것에 상당하는 아미노산이 트립토판으로 치환(R484K_E513W);
484번째 아르기닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신으로 치환되고, 또한 514번째 아스파라긴 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신으로 치환(R484K_N514K);
484번째 아르기닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신으로 치환되고, 또한 514번째 아스파라긴 또는 그것에 상당하는 아미노산이 트립토판으로 치환(R484K_N514W);
484번째 아르기닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신으로 치환되고, 또한 515번째 아스파라긴 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신으로 치환(R484K_N515K);
484번째 아르기닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신으로 치환되고, 또한 515번째 아스파라긴 또는 그것에 상당하는 아미노산이 트립토판으로 치환(R484K_N515W);
484번째 아르기닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신으로 치환되고, 또한 517번째 아스파라긴산 또는 그것에 상당하는 아미노산이 트립토판으로 치환(R484K_D517W);
484번째 아르기닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신으로 치환되고, 또한 569번째 글리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신으로 치환(R484K_G569K);
484번째 아르기닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신으로 치환되고, 또한 571번째 글리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신으로 치환(R484K_G571K);
484번째 아르기닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신으로 치환되고, 또한 572번째 아르기닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신으로 치환(R484K_R572K);
484번째 아르기닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신으로 치환되고, 또한 572번째 아르기닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 트립토판으로 치환(R484K_R572W);
484번째 아르기닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신으로 치환되고, 또한 573번째 트레오닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신으로 치환(R484K_T573K);
484번째 아르기닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신으로 치환되고, 또한 573번째 트레오닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 트립토판으로 치환(R484K_T573W);
484번째 아르기닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신으로 치환되고, 또한 516번째 티로신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신으로 치환(R484K_Y516K);
484번째 아르기닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 트립토판으로 치환되고, 또한 515번째 아스파라긴 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신으로 치환(R484W_N515K);
485번째 글리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 아스파라긴산으로 치환되고, 또한 487번째 리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 히스티딘으로 치환(G485D_K487H);
485번째 글리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신으로 치환되고, 또한 487번째 리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 히스티딘으로 치환(G485K_K487H);
485번째 글리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신으로 치환되고, 또한 569번째 글리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신으로 치환(G485K_G569K);
485번째 글리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신으로 치환되고, 또한 514번째 아스파라긴 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신으로 치환(G485K_N514K);
485번째 글리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신으로 치환되고, 또한 515번째 아스파라긴 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신으로 치환(G485K_N515K);
485번째 글리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신으로 치환되고, 또한 515번째 아스파라긴 또는 그것에 상당하는 아미노산이 트립토판으로 치환(G485K_N515W);
485번째 글리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 아르기닌으로 치환되고, 또한 487번째 리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 아스파라긴산으로 치환(G485R_K487D);
485번째 글리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 트립토판으로 치환되고, 또한 513번째 글루타민산 또는 그것에 상당하는 아미노산이 트립토판으로 치환(G485W_E513W);
485번째 글리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 트립토판으로 치환되고, 또한 515번째 아스파라긴 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신으로 치환(G485W_N515K);
485번째 글리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 트립토판으로 치환되고, 또한 515번째 아스파라긴 또는 그것에 상당하는 아미노산이 트립토판으로 치환(G485W_N515W);
487번째 리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 알라닌으로 치환되고, 또한 531번째 세린 또는 그것에 상당하는 아미노산이 알라닌으로 치환(K487A_S531A);
487번째 리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 알라닌으로 치환되고, 또한 593번째 트립토판 또는 그것에 상당하는 아미노산이 페닐알라닌으로 치환(K487A_W593F);
487번째 리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 알라닌으로 치환되고, 또한 615번째 티로신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 류신으로 치환(K487A_Y615L);
487번째 리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 트립토판으로 치환되고, 또한 514번째 아스파라긴 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신으로 치환(K487W_N514K);
487번째 리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 트립토판으로 치환되고, 또한 514번째 아스파라긴 또는 그것에 상당하는 아미노산이 트립토판으로 치환(K487W_N514W);
487번째 리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 트립토판으로 치환되고, 또한 516번째 티로신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 트립토판으로 치환(K487W_Y516W);
487번째 리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 트립토판으로 치환되고, 또한 569번째 글리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신으로 치환(K487W_G569K);
487번째 리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 티로신으로 치환되고, 또한 515번째 아스파라긴 또는 그것에 상당하는 아미노산이 페닐알라닌으로 치환(K487Y_N515F);
487번째 리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 티로신으로 치환되고, 또한 515번째 아스파라긴 또는 그것에 상당하는 아미노산이 트립토판으로 치환(K487Y_N515W);
488번째 발린 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신으로 치환되고, 또한 515번째 아스파라긴 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신으로 치환(V488K_N515K);
488번째 발린 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신으로 치환되고, 또한 515번째 아스파라긴 또는 그것에 상당하는 아미노산이 트립토판으로 치환(V488K_N515W);
488번째 발린 또는 그것에 상당하는 아미노산이 트립토판으로 치환되고, 또한 515번째 아스파라긴 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신으로 치환(V488W_N515K);
488번째 발린 또는 그것에 상당하는 아미노산이 트립토판으로 치환되고, 또한 515번째 아스파라긴 또는 그것에 상당하는 아미노산이 트립토판으로 치환(V488W_N515W);
488번째 발린 또는 그것에 상당하는 아미노산이 티로신으로 치환되고, 또한 515번째 아스파라긴 또는 그것에 상당하는 아미노산이 트립토판으로 치환(V488Y_N515W);
550번째 아스파라긴 또는 그것에 상당하는 아미노산이 세린으로 치환되고, 또한 598번째 티로신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 아스파라긴으로 치환(N550S_Y598N);
550번째 아스파라긴 또는 그것에 상당하는 아미노산이 세린으로 치환되고, 또한 615번째 티로신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 글리신으로 치환(N550S_Y615G);
550번째 아스파라긴 또는 그것에 상당하는 아미노산이 세린으로 치환되고, 또한 615번째 티로신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 류신으로 치환(N550S_Y615L);
550번째 아스파라긴 또는 그것에 상당하는 아미노산이 세린으로 치환되고, 또한 615번째 티로신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 프롤린으로 치환(N550S_Y615P);
484번째 아르기닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 알라닌으로 치환되고, 485번째 글리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 알라닌으로 치환되고, 또한 487번째 리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 아스파라긴산으로 치환(R484A_G485A_K487D);
484번째 아르기닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 아스파라긴산으로 치환되고, 485번째 글리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 아스파라긴산으로 치환되고, 또한 487번째 리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 아스파라긴산으로 치환(R484D_G485D_K487D);
485번째 글리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 아르기닌으로 치환되고, 486번째 아스파라긴산 또는 그것에 상당하는 아미노산이 아르기닌으로 치환되고, 또한 487번째 리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 리신아르기닌으로 치환(G485R_D486R_K487R);
484번째 아르기닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 알라닌으로 치환되고, 485번째 글리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 알라닌으로 치환되고, 486번째 아스파라긴산 또는 그것에 상당하는 아미노산이 알라닌으로 치환되고, 또한 487번째 리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 알라닌으로 치환(R484A_G485A_D486A_K487A);
484번째 아르기닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 알라닌으로 치환되고, 485번째 글리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 알라닌으로 치환되고, 486번째 아스파라긴산 또는 그것에 상당하는 아미노산이 프롤린으로 치환되고, 또한 487번째 리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 프롤린으로 치환(R484A_G485A_D486P_K487P);
484번째 아르기닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 알라닌으로 치환되고, 485번째 글리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 알라닌으로 치환되고, 또한 487번째 리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 아스파라긴산으로 치환(R484A_G485A_K487D);
484번째 아르기닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 시스테인으로 치환되고, 486번째 아스파라긴산 또는 그것에 상당하는 아미노산이 히스티딘으로 치환되고, 또한 487번째 리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 아르기닌으로 치환(R484C_D486H_K487R);
485번째 글리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 아르기닌으로 치환되고, 486번째 아스파라긴산 또는 그것에 상당하는 아미노산이 트립토판으로 치환되고, 또한 487번째 리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 트립토판으로 치환(G485R_D486W_K487W);
485번째 글리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 아르기닌으로 치환되고, 486번째 아스파라긴산 또는 그것에 상당하는 아미노산이 알라닌으로 치환되고, 또한 487번째 리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 알라닌으로 치환(G485R_D486A_K487A);
485번째 글리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 아르기닌으로 치환되고, 486번째 아스파라긴산 또는 그것에 상당하는 아미노산이 프롤린으로 치환되고, 또한 487번째 리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 프롤린으로 치환(G485R_D486P_K487P);
484번째 아르기닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 알라닌으로 치환되고, 485번째 글리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 알라닌으로 치환되고, 486번째 아스파라긴산 또는 그것에 상당하는 아미노산이 알라닌으로 치환되고, 또한 487번째 리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 알라닌으로 치환(R484A_G485A_D486A_K487A);
484번째 아르기닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 알라닌으로 치환되고, 485번째 글리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 알라닌으로 치환되고, 486번째 아스파라긴산 또는 그것에 상당하는 아미노산이 아르기닌으로 치환되고, 또한 487번째 리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 아르기닌으로 치환(R484A_G485A_D486R_K487R);
484번째 아르기닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 아스파라긴산으로 치환되고, 485번째 글리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 아스파라긴산으로 치환되고, 486번째 아스파라긴산 또는 그것에 상당하는 아미노산이 아르기닌으로 치환되고, 또한 487번째 리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 아르기닌으로 치환(R484D_G485D_D486R_K487R);
484번째 아르기닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 아스파라긴산으로 치환되고, 485번째 글리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 아스파라긴산으로 치환되고, 486번째 아스파라긴산 또는 그것에 상당하는 아미노산이 프롤린으로 치환되고, 또한 487번째 리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 프롤린으로 치환(R484D_G485D_D486P_K487P);
484번째 아르기닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 아스파라긴산으로 치환되고, 485번째 글리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 아스파라긴산으로 치환되고, 486번째 아스파라긴산 또는 그것에 상당하는 아미노산이 알라닌으로 치환되고, 또한 487번째 리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 알라닌으로 치환(R484D_G485D_D486A_K487A);
484번째 아르기닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 아스파라긴산으로 치환되고, 485번째 글리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 아스파라긴산으로 치환되고, 486번째 아스파라긴산 또는 그것에 상당하는 아미노산이 트립토판으로 치환되고, 또한 487번째 리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 트립토판으로 치환(R484D_G485D_D486W_K487W);
484번째 아르기닌 또는 그것에 상당하는 아미노산이 프롤린으로 치환되고, 485번째 글리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 프롤린으로 치환되고, 486번째 아스파라긴산 또는 그것에 상당하는 아미노산이 아르기닌으로 치환되고, 또한 487번째 리신 또는 그것에 상당하는 아미노산이 아르기닌으로 치환(R484P_G485P_D486R_K487R). - 서열번호 1∼4 중 어느 하나의 아미노산 서열, 또는 서열번호 1∼4 중 어느 하나로 나타내는 아미노산 서열과 90% 이상 동일한 아미노산 서열로 이루어지는 β-갈락토시다아제에 있어서, 하기 중 어느 하나의 변형이 행해진 변형된 β-갈락토시다아제:
(a) 484번째 아르기닌(R484)∼487번째 리신(K487), 또는 이에 상당하는 영역의 결실;
(b) 514번째 아스파라긴(N514)과 515번째 아스파라긴(N515)의 사이, 또는 이에 상당하는 위치에 아미노산의 삽입;
(c) 604번째 프롤린(P604)과 605번째 티로신(Y605)의 사이, 또는 이에 상당하는 위치에 아미노산의 삽입;
(d) 485번째 글리신(G485) 또는 이에 상당하는 아미노산의 결실에 더하여, 486번째 아스파라긴산(D486) 또는 이것에 상당하는 아미노산의 다른 아미노산으로의 치환;
(e) 485번째 글리신(G485)∼486번째 아스파라긴산(D486), 또는 이에 상당하는 영역의 결실에 더하여, 487번째 리신(K487) 또는 이것에 상당하는 아미노산의 다른 아미노산으로의 치환;
(f) 485번째 글리신(G485)∼486번째 아스파라긴산(D486), 또는 이에 상당하는 영역의 결실에 더하여, 484번째 아르기닌(R484) 또는 이것에 상당하는 아미노산의 다른 아미노산으로의 치환, 및 487번째 리신(K487) 또는 이것에 상당하는 아미노산의 다른 아미노산으로의 치환;
(g) 484번째 아르기닌(R484)과 485번째 글리신(G485)의 사이, 또는 이에 상당하는 위치에 아미노산의 삽입;
(h) 485번째 글리신(G485)과 486번째 아스파라긴산(D486)의 사이, 또는 이에 상당하는 위치에 아미노산의 삽입. - 제20항에 있어서,
상기 (d)∼(f)에 관하여, 484번째 아르기닌(R484)에 대한 치환 후 아미노산은 트립토판 또는 프롤린이며, 486번째 아스파라긴산(D486)에 대한 치환 후 아미노산은 히스티딘이며, 487번째 리신(K487)에 대한 치환 후 아미노산은 아르기닌, 트립토판 또는 프롤린이며,
상기 (b), (c), (g), (h)에 관하여, 삽입되는 아미노산의 수는 1∼10개인, 변형된 β-갈락토시다아제. - 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 β-갈락토시다아제에 있어서, 하기 중 어느 하나의 변형이 행해진 변형된 β-갈락토시다아제:
(i) 487번째 리신(K487)이 글리신 또는 프롤린으로 치환;
(ii) 514번째 아스파라긴(N514)이 트립토판으로 치환;
(iii) 515번째 아스파라긴(N515)이 리신 또는 트립토판으로 치환. - 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 기재된 변형된 β-갈락토시다아제를 코딩하는, 유전자.
- 제23항에 기재된 유전자를 포함하는, 재조합 DNA.
- 제24항에 기재된 재조합 DNA를 보유하는, 미생물.
- 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 기재된 변형된 β-갈락토시다아제를 포함하는, 효소제.
- β-1,3 결합, β-1,4 결합 및 β-1,6 결합 중 적어도 1개를 가지는, 이당, 올리고당 또는 다당에 대하여, 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 기재된 변형된 β-갈락토시다아제를 작용시키는, 올리고당의 제조 방법.
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