JP6888043B2 - 改変型β−ガラクトシダーゼ - Google Patents
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Description
上記成果及び考察に基づき、以下の発明が提供される。
[1]配列番号1〜4のいずれかのアミノ酸配列、又は配列番号1〜4のいずれかに示されるアミノ酸配列と90%以上同一であるアミノ酸配列からなるβ−ガラクトシダーゼにおいて、182番目のプロリン(P182)、187番目のチロシン(Y187)、188番目のセリン(S188)、405番目のトリプトファン(W405)、406番目のアラニン(A406)、407番目のグルタミン(Q407)、449番目のチロシン(Y449)、483番目のトレオニン(T483)、512番目のセリン(S512)、531番目のセリン(S531)、533番目のセリン(S533)、534番目のセリン(S534)、550番目のアスパラギン(N550)、551番目のグルタミン(Q551)、593番目のトリプトファン(W593)、598番目のチロシン(Y598)、602番目のプロリン(P602)、604番目のプロリン(P604)、609番目のチロシン(Y609)、612番目のリジン(K612)及び615番目のチロシン(Y615)からなる群より選択される一又は二以上のアミノ酸、或いはそれに相当するアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなる改変型β−ガラクトシダーゼ。
[2]置換の対象となる一又は二以上のアミノ酸が、449番目のチロシン(Y449)、531番目のセリン(S531)、593番目のトリプトファン(W593)、602番目のプロリン(P602)、604番目のプロリン(P604)及び612番目のリジン(K612)からなる群より選択される、[1]に記載の改変型β−ガラクトシダーゼ。
[3]置換の対象となる一又は二以上のアミノ酸が、187番目のチロシン(Y187)、188番目のセリン(S188)、533番目のセリン(S533)、602番目のプロリン(P602)及び612番目のリジン(K612)からなる群より選択される、[1]に記載の改変型β−ガラクトシダーゼ。
[4]置換の対象となる一又は二以上のアミノ酸が、182番目のプロリン(P182)、187番目のチロシン(Y187)、188番目のセリン(S188)、405番目のトリプトファン(W405)、407番目のグルタミン(Q407)、449番目のチロシン(Y449)、483番目のトレオニン(T483)、512番目のセリン(S512)、531番目のセリン(S531)、550番目のアスパラギン(N550)、602番目のプロリン(P602)及び604番目のプロリン(P604)からなる群より選択される、[1]に記載の改変型β−ガラクトシダーゼ。
[5]置換の対象となる一又は二以上のアミノ酸が、483番目のトレオニン(T483)、512番目のセリン(S512)、551番目のグルタミン(Q551)、598番目のチロシン(Y598)及び615番目のチロシン(Y615)からなる群より選択される、[1]に記載の改変型β−ガラクトシダーゼ。
[6]置換の対象となる一又は二以上のアミノ酸が、405番目のトリプトファン(W405)、483番目のトレオニン(T483)、531番目のセリン(S531)、550番目のアスパラギン(N550)及び598番目のチロシン(Y598)からなる群より選択される、[1]に記載の改変型β−ガラクトシダーゼ。
[7]置換の対象となる一又は二以上のアミノ酸が、182番目のプロリン(P182)、187番目のチロシン(Y187)、188番目のセリン(S188)、405番目のトリプトファン(W405)、406番目のアラニン(A406)、407番目のグルタミン(Q407)、449番目のチロシン(Y449)、483番目のトレオニン(T483)、512番目のセリン(S512)、534番目のセリン(S534)、550番目のアスパラギン(N550)、551番目のグルタミン(Q551)、602番目のプロリン(P602)、609番目のチロシン(Y609)、612番目のリジン(K612)及び615番目のチロシン(Y615)からなる群より選択される、[1]に記載の改変型β−ガラクトシダーゼ。
[8]449番目のチロシン(Y449)の置換後のアミノ酸はアスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン又はトリプトファンであり、531番目のセリン(S531)の置換後のアミノ酸はアラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、イソロイシン、メチオニン、アスパラギン又はグルタミンであり、593番目のトリプトファン(W593)の置換後のアミノ酸はフェニルアラニンであり、602番目のプロリン(P602)の置換後のアミノ酸はグルタミン酸又はグリシンであり、604番目のプロリン(P604)の置換後のアミノ酸はアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、メチオニン、セリン、トレオニン、バリン、トリプトファン又はチロシンであり、612番目のリジン(K612)の置換後のアミノ酸はメチオニンである、[2]に記載の改変型β−ガラクトシダーゼ。
[9]187番目のチロシン(Y187)の置換後のアミノ酸はアスパラギン酸、グルタミン酸又はグリシンであり、188番目のセリン(S188)の置換後のアミノ酸はプロリン又はトレオニンであり、533番目のセリン(S533)の置換後のアミノ酸はメチオニン又はグルタミンであり、602番目のプロリン(P602)置換後のアミノ酸はシステイン、イソロイシン、アスパラギン、セリン、トレオニン又はバリンであり、612番目のリジン(K612)の置換後のアミノ酸はフェニルアラニンである、[3]に記載の改変型β−ガラクトシダーゼ。
[10]182番目のプロリン(P182)の置換後のアミノ酸はロイシンであり、187番目のチロシン(Y187)の置換後のアミノ酸はアスパラギン酸又はロイシンであり、188番目のセリン(S188)の置換後のアミノ酸はイソロイシンであり、405番目のトリプトファン(W405)の置換後のアミノ酸はアラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、ロイシン、アスパラギン、セリン又はトレオニンであり、407番目のグルタミン(Q407)の置換後のアミノ酸はグリシン又はアルギニンであり、449番目のチロシン(Y449)の置換後のアミノ酸はグルタミン酸、イソロイシン、グルタミン、アルギニン又はセリンであり、483番目のトレオニン(T483)の置換後のアミノ酸はグルタミンであり、512番目のセリン(S512)の置換後のアミノ酸はフェニルアラニン、トレオニン又はバリンであり、531番目のセリン(S531)の置換後のアミノ酸はプロリンであり、550番目のアスパラギン(N550)の置換後のアミノ酸はロイシン、アルギニン又はセリンであり、602番目のプロリン(P602)の置換後のアミノ酸はロイシン、アスパラギン又はグルタミンであり、604番目のプロリン(P604)の置換後のアミノ酸はイソロイシン又はメチオニンである、[4]に記載の改変型β−ガラクトシダーゼ。
[11]483番目のトレオニン(T483)の置換後のアミノ酸はリジン、メチオニン又はアルギニンであり、512番目のセリン(S512)の置換後のアミノ酸はグリシン又はリジンであり、551番目のグルタミン(Q551)の置換後のアミノ酸はアスパラギンであり、598番目のチロシン(Y598)の置換後のアミノ酸はアスパラギンであり、615番目のチロシン(Y615)の置換後のアミノ酸はトレオニンである、[5]に記載の改変型β−ガラクトシダーゼ。
[12]405番目のトリプトファン(W405)の置換後のアミノ酸はアラニン、アスパラギン酸、セリン又はトレオニンであり、483番目のトレオニン(T483)の置換後のアミノ酸はメチオニンであり、531番目のセリン(S531)の置換後のアミノ酸はアスパラギン酸、フェニルアラニン、グリシン、ロイシン、リジン又はメチオニンであり、550番目のアスパラギン(N550)の置換後のアミノ酸はフェニルアラニンであり、598番目のチロシン(Y598)の置換後のアミノ酸はフェニルアラニン又はヒスチジンである、[6]に記載の改変型β−ガラクトシダーゼ。
[13]182番目のプロリン(P182)の置換後のアミノ酸はロイシン又はセリンであり、187番目のチロシン(Y187)の置換後のアミノ酸はアスパラギン酸、グルタミン酸又はアスパラギンであり、188番目のセリン(S188)の置換後のアミノ酸はグルタミン酸、グリシン、イソロイシン又はアスパラギンであり、405番目のトリプトファン(W405)の置換後のアミノ酸はヒスチジンであり、406番目のアラニン(A406)の置換後のアミノ酸はプロリンであり、407番目のグルタミン(Q407)の置換後のアミノ酸はアラニン、フェニルアラニン、グリシン、リジン又はアルギニンであり、449番目のチロシン(Y449)の置換後のアミノ酸はグルタミン酸又はアルギニンであり、483番目のトレオニン(T483)の置換後のアミノ酸はセリン又はグルタミンであり、512番目のセリン(S512)の置換後のアミノ酸はグリシン、トレオニン又はバリンであり、534番目のセリン(S534)の置換後のアミノ酸はリジン又はグルタミンであり、550番目のアスパラギン(N550)の置換後のアミノ酸はアラニン、グリシン、リジン、ロイシン、メチオニン、アルギニン又はセリンであり、551番目のグルタミン(Q551)の置換後のアミノ酸はリジン又はヒスチジンであり、602番目のプロリン(P602)の置換後のアミノ酸はシステイン、アスパラギン酸又はアスパラギンであり、609番目のチロシン(Y609)の置換後のアミノ酸はアスパラギン酸、グルタミン又はトレオニンであり、612番目のリジン(K612)の置換後のアミノ酸はフェニルアラニン又はイソロイシンであり、615番目のチロシン(Y615)の置換後のアミノ酸はグルタミン酸、イソロイシン又はトレオニンである、[7]に記載の改変型β−ガラクトシダーゼ。
[14]前記β−ガラクトシダーゼが配列番号1のアミノ酸配列からなり、前記置換に加えて、1540番目のトリプトファン(W1540)が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなる[1]〜[13]のいずれか一項に記載の改変型β−ガラクトシダーゼ。
[15]配列番号1〜4のいずれかのアミノ酸配列、又は配列番号1〜4のいずれかに示されるアミノ酸配列と90%以上同一であるアミノ酸配列からなるβ−ガラクトシダーゼにおいて、85番目のトリプトファン(W85)、91番目のフェニルアラニン(F91)、103番目のチロシン(Y103)、134番目のチロシン(Y134)、153番目のチロシン(Y153)、182番目のプロリン(P182)、186番目のトリプトファン(W186)、192番目のチロシン(Y192)、295番目のチロシン(Y295)、345番目のヒスチジン(H345)、349番目のグリシン(G349)、402番目のフェニルアラニン(F402)、407番目のグルタミン(Q407)、479番目のグリシン(G479)、480番目のグルタミン酸(E480)、482番目のリジン(K482)、483番目のトレオニン(T483)、484番目のアルギニン(R484)、485番目のグリシン(G485)、486番目のアスパラギン酸(D486)、487番目のリジン(K487)、488番目のバリン(V488)、496番目のチロシン(Y496)、512番目のセリン(S512)、513番目のグルタミン酸(E513)、514番目のアスパラギン(N514)、515番目のアスパラギン(N515)、516番目のチロシン(Y516)、517番目のアスパラギン酸(D517)、519番目のチロシン(Y519)、533番目のトレオニン(T533)、547番目のチロシン(Y547)、549番目のチロシン(Y549)、555番目のチロシン(Y555)、572番目のアルギニン(R572)、573番目のトレオニン(T573)、598番目のチロシン(Y598)、605番目のチロシン(Y605)、606番目のチロシン(Y606)、609番目のチロシン(Y609)、616番目のフェニルアラニン(F616)、624番目のフェニルアラニン(F624)、648番目のトリプトファン(W648)及び650番目のトリプトファン(W650)からなる群より選択される一又は二以上のアミノ酸、或いはそれに相当するアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなる改変型β−ガラクトシダーゼ。
[16]85番目のトリプトファン(W85)の置換後のアミノ酸はグリシンであり、91番目のフェニルアラニン(F91)の置換後のアミノ酸はアラニン又はイソロイシンであり、103番目のチロシン(Y103)の置換後のアミノ酸はグリシンであり、134番目のチロシン(Y134)の置換後のアミノ酸はグリシンであり、153番目のチロシン(Y153)の置換後のアミノ酸はグリシンであり、182番目のプロリン(P182)の置換後のアミノ酸はトリプトファン又はチロシンであり、186番目のトリプトファン(W186)の置換後のアミノ酸はメチオニンであり、192番目のチロシン(Y192)の置換後のアミノ酸はグリシンであり、295番目のチロシン(Y295)の置換後のアミノ酸はグリシンであり、345番目のヒスチジン(H345)の置換後のアミノ酸はグリシンであり、349番目のグリシン(G349)の置換後のアミノ酸はトリプトファンであり、402番目のフェニルアラニン(F402)の置換後のアミノ酸はグリシンであり、407番目のグルタミン(Q407)の置換後のアミノ酸はイソロイシン、ロイシン、メチオニン、バリン又はチロシンであり、479番目のグリシン(G479)の置換後のアミノ酸はロイシン、プロリン又はグルタミンであり、480番目のグルタミン酸(E480)の置換後のアミノ酸はアスパラギンであり、482番目のリジン(K482)の置換後のアミノ酸はメチオニン又はバリンであり、483番目のトレオニン(T483)の置換後のアミノ酸はグリシン又はセリンであり、484番目のアルギニン(R484)の置換後のアミノ酸はフェニルアラニン、イソロイシン、メチオニン、アスパラギン又はグルタミンであり、485番目のグリシン(G485)の置換後のアミノ酸はアスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン又はトレオニンであり、486番目のアスパラギン酸(D486)の置換後のアミノ酸はアラニン、グルタミン酸、フェニルアラニン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、プロリン、グルタミン、アルギニン、トレオニン、トリプトファン又はチロシンであり、487番目のリジン(K487)の置換後のアミノ酸はシステイン、グルタミン酸、フェニルアラニン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、アスパラギン、グルタミン、アルギニン、トレオニン、バリン、トリプトファン又はチロシンであり、488番目のバリン(V488)の置換後のアミノ酸はグリシン、イソロイシン、ロイシン、アルギニン、セリン、トレオニン、トリプトファン又はチロシンであり、496番目のチロシン(Y496)の置換後のアミノ酸はグリシンであり、512番目のセリン(S512)の置換後のアミノ酸はシステイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、プロリン、グルタミン又はトリプトファンであり、513番目のグルタミン酸(E513)の置換後のアミノ酸はアラニン、システイン、アスパラギン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、リジン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、トレオニン又はバリンであり、514番目のアスパラギン(N514)の置換後のアミノ酸はグルタミン酸、ロイシン又はリジンであり、515番目のアスパラギン(N515)の置換後のアミノ酸はアラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、イソロイシン、ロイシン、プロリン又はバリンであり、516番目のチロシン(Y516)の置換後のアミノ酸はトリプトファンであり、517番目のアスパラギン酸(D517)の置換後のアミノ酸はリジン又はトリプトファンであり、519番目のチロシン(Y519)の置換後のアミノ酸はグリシンであり、533番目のトレオニン(T533)の置換後のアミノ酸はグルタミン酸であり、547番目のチロシン(Y547)の置換後のアミノ酸はグリシンであり、549番目のチロシン(Y549)の置換後のアミノ酸はグリシンであり、555番目のチロシン(Y555)の置換後のアミノ酸はグリシンであり、572番目のアルギニン(R572)の置換後のアミノ酸はシステイン、ロイシン、メチオニン、トレオニン、トリプトファン又はチロシンであり、573番目のトレオニン(T573)の置換後のアミノ酸はグルタミン酸であり、598番目のチロシン(Y598)の置換後のアミノ酸はヒスチジン又はアスパラギンであり、605番目のチロシン(Y605)の置換後のアミノ酸はシステイン、アスパラギン酸、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、プロリン、アルギニン又はトレオニンであり、606番目のチロシン(Y606)の置換後のアミノ酸はアラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン又はセリンであり、609番目のチロシン(Y609)の置換後のアミノ酸はグルタミン酸、アスパラギン又はセリンであり、616番目のフェニルアラニン(F616)の置換後のアミノ酸はグリシンであり、624番目のフェニルアラニン(F624)の置換後のアミノ酸はグリシンであり、648番目のトリプトファン(W648)の置換後のアミノ酸はグリシンであり、650番目のトリプトファン(W650)の置換後のアミノ酸はグリシンである、[15]に記載の改変型β−ガラクトシダーゼ。
[17]配列番号1〜4のいずれかのアミノ酸配列、又は配列番号1〜4のいずれかに示されるアミノ酸配列と90%以上同一であるアミノ酸配列からなるβ−ガラクトシダーゼにおいて、76番目のトリプトファン(W76)、480番目のグルタミン酸(E480)、483番目のトレオニン(T483)、485番目のグリシン(G485)、484番目のアルギニン(R484)、487番目のリジン(K487)、488番目のバリン(V488)、512番目のセリン(S512)、514番目のアスパラギン(N514)、515番目のアスパラギン(N515)、569番目のグリシン(G569)及び596番目のフェニルアラニン(F596)からなる群より選択される一又は二以上のアミノ酸、或いはそれに相当するアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなる改変型β−ガラクトシダーゼ。
[18]76番目のトリプトファン(W76)の置換後のアミノ酸はグリシンであり、480番目のグルタミン酸(E480)の置換後のアミノ酸はグルタミンであり、483番目のトレオニン(T483)の置換後のアミノ酸はトリプトファンであり、485番目のグリシン(G485)の置換後のアミノ酸はプロリン又はトレオニンであり、484番目のアルギニン(R484)の置換後のアミノ酸はアラニン、システイン、アスパラギン酸、グリシン、プロリン、セリン、チロシン又はリジンであり、487番目のリジン(K487)の置換後のアミノ酸はグリシン又はプロリンであり、488番目のバリン(V488)の置換後のアミノ酸はプロリンであり、512番目のセリン(S512)の置換後のアミノ酸はロイシン又はメチオニンであり、514番目のアスパラギン(N514)の置換後のアミノ酸はアスパラギン酸であり、515番目のアスパラギン(N515)の置換後のアミノ酸はフェニルアラニン、アルギニン、トリプトファン、チロシン又はリジンであり、569番目のグリシン(G569)の置換後のアミノ酸はリジン、プロリン又はバリンであり、596番目のフェニルアラニン(F596)の置換後のアミノ酸はグリシンである、[17]に記載の改変型β−ガラクトシダーゼ。
[19]配列番号1〜4のいずれかのアミノ酸配列、又は配列番号1〜4のいずれかに示されるアミノ酸配列と90%以上同一であるアミノ酸配列からなるβ−ガラクトシダーゼにおいて、以下のいずれかの改変が施された改変型β−ガラクトシダーゼ:
188番目のセリン又はそれに相当するアミノ酸がイソロイシンに置換され、且つ550番目のアスパラギン又はそれに相当するアミノ酸がフェニルアラニンに置換(S188I_N550F);
407番目のグルタミン又はそれに相当するアミノ酸がアルギニンに置換、且つ550番目のアスパラギン又はそれに相当するアミノ酸がフェニルアラニンに置換(Q407R_N550F);
449番目のチロシン又はそれに相当するアミノ酸がグルタミンに置換、且つ598番目のチロシン又はそれに相当するアミノ酸がヒスチジンに置換(Y449Q_Y598H);
550番目のアスパラギン又はそれに相当するアミノ酸がフェニルアラニンに置換、且つ602番目のプロリン又はそれに相当するアミノ酸がグルタミンに置換(N550F_P602Q);
407番目のグルタミン又はそれに相当するアミノ酸がアルギニンに置換、且つ449番目のチロシン又はそれに相当するアミノ酸がグルタミン酸に置換(Q407R_Y449E);
550番目のアスパラギン又はそれに相当するアミノ酸がフェニルアラニンに置換、且つ598番目のチロシン又はそれに相当するアミノ酸がアスパラギンに置換(N550F_Y598N);
182番目のプロリン又はそれに相当するアミノ酸がロイシンに置換、且つ449番目のチロシン又はそれに相当するアミノ酸がグルタミン酸に置換(P182L_Y449E);
182番目のプロリン又はそれに相当するアミノ酸がロイシンに置換、且つ449番目のチロシン又はそれに相当するアミノ酸がグルタミンに置換(P182L_Y449Q);
187番目のチロシン又はそれに相当するアミノ酸がロイシンに置換、且つ407番目のグルタミン又はそれに相当するアミノ酸がアルギニンに置換(Y187L_Q407R);
187番目のチロシン又はそれに相当するアミノ酸がロイシンに置換、且つ449番目のチロシン又はそれに相当するアミノ酸がグルタミン酸に置換(Y187L_Y449E);
187番目のチロシン又はそれに相当するアミノ酸がロイシンに置換、且つ449番目のチロシン又はそれに相当するアミノ酸がグルタミンに置換(Y187L_Y449Q);
187番目のチロシン又はそれに相当するアミノ酸がロイシンに置換、且つ512番目のセリン又はそれに相当するアミノ酸がシステインに置換(Y187L_S512C);
187番目のチロシン又はそれに相当するアミノ酸がロイシンに置換、且つ512番目のセリン又はそれに相当するアミノ酸がアスパラギンに置換(Y187L_S512N);
187番目のチロシン又はそれに相当するアミノ酸がロイシンに置換、且つ512番目のセリン又はそれに相当するアミノ酸がトレオニンに置換(Y187L_S512T);
188番目のセリン又はそれに相当するアミノ酸がイソロイシンに置換、且つ407番目のグルタミン又はそれに相当するアミノ酸がアルギニンに置換(S188I_Q407R);
188番目のセリン又はそれに相当するアミノ酸がイソロイシンに置換、且つ449番目のチロシン又はそれに相当するアミノ酸がグルタミンに置換(S188I_Y449Q);
188番目のセリン又はそれに相当するアミノ酸がイソロイシンに置換、且つ483番目のトレオニン又はそれに相当するアミノ酸がグルタミン酸に置換(S188I_T483E);
407番目のグルタミン又はそれに相当するアミノ酸がロイシンに置換、且つ512番目のセリン又はそれに相当するアミノ酸がバリンに置換(Q407L_S512V);
407番目のグルタミン又はそれに相当するアミノ酸がアルギニンに置換、且つ483番目のトレオニン又はそれに相当するアミノ酸がグリシンに置換(Q407R_T483G);
407番目のグルタミン又はそれに相当するアミノ酸がアルギニンに置換、且つ449番目のチロシン又はそれに相当するアミノ酸がグルタミンに置換(Q407R_Y449Q);
407番目のグルタミン又はそれに相当するアミノ酸がアルギニンに置換、且つ550番目のアスパラギン又はそれに相当するアミノ酸がセリンに置換(Q407R_N550S);
449番目のチロシン又はそれに相当するアミノ酸がグルタミンに置換、且つ550番目のアスパラギン又はそれに相当するアミノ酸がセリンに置換(Y449Q_N550S);
487番目のリジン又はそれに相当するアミノ酸がトリプトファンに置換、且つ512番目のセリン又はそれに相当するアミノ酸がトレオニンに置換(K487W_S512T);
487番目のリジン又はそれに相当するアミノ酸がトリプトファンに置換、且つ517番目のアスパラギン酸又はそれに相当するアミノ酸がリジンに置換(K487W_D517K);
487番目のリジン又はそれに相当するアミノ酸がトリプトファンに置換、且つ515番目のアスパラギン又はそれに相当するアミノ酸がグリシンに置換(K487W_N515G);
487番目のリジン又はそれに相当するアミノ酸がトリプトファンに置換、且つ517番目のアスパラギン酸又はそれに相当するアミノ酸がトリプトファンに置換(K487W_D517W);
487番目のリジン又はそれに相当するアミノ酸がプロリンに置換、且つ515番目のアスパラギン又はそれに相当するアミノ酸がアルギニンに置換(K487P_N515R);
91番目のフェニルアラニン又はそれに相当するアミノ酸がセリンに置換、且つ407番目のグルタミン又はそれに相当するアミノ酸がメチオニンに置換(F91S_Q407M);
180番目のトレオニン又はそれに相当するアミノ酸がバリンに置換、且つ187番目のチロシン又はそれに相当するアミノ酸がロイシンに置換(T180V_Y187L);
180番目のトレオニン又はそれに相当するアミノ酸がバリンに置換、且つ188番目のセリン又はそれに相当するアミノ酸がイソロイシンに置換(T180V_S188I);
180番目のトレオニン又はそれに相当するアミノ酸がバリンに置換、且つ407番目のグルタミン又はそれに相当するアミノ酸がアルギニンに置換(T180V_Q407R);
180番目のトレオニン又はそれに相当するアミノ酸がバリンに置換、且つ449番目のチロシン又はそれに相当するアミノ酸がグルタミン酸に置換(T180V_Y449E);
180番目のトレオニン又はそれに相当するアミノ酸がバリンに置換、且つ483番目のトレオニン又はそれに相当するアミノ酸がグリシンに置換(T180V_T483G);
180番目のトレオニン又はそれに相当するアミノ酸がバリンに置換、且つ512番目のセリン又はそれに相当するアミノ酸がバリンに置換(T180V_S512V);
180番目のトレオニン又はそれに相当するアミノ酸がバリンに置換、且つ550番目のアスパラギン又はそれに相当するアミノ酸がフェニルアラニンに置換(T180V_N550F);
180番目のトレオニン又はそれに相当するアミノ酸がバリンに置換、且つ615番目のチロシン又はそれに相当するアミノ酸がプロリンに置換(T180V_Y615P);
182番目のプロリン又はそれに相当するアミノ酸がロイシンに置換、且つ376番目アルギニンの又はそれに相当するアミノ酸がプロリンに置換(P182L_R376P);
182番目のプロリン又はそれに相当するアミノ酸がトリプトファンに置換、且つ449番目チロシンの又はそれに相当するアミノ酸がグルタミンに置換(P182W_Y449Q);
187番目のチロシン又はそれに相当するアミノ酸がロイシンに置換、且つ487番目のリジン又はそれに相当するアミノ酸がアラニンに置換(Y187L_K487A);
187番目のチロシン又はそれに相当するアミノ酸がロイシンに置換、且つ512番目のセリン又はそれに相当するアミノ酸がアラニンに置換(Y187L_S512A);
187番目のチロシン又はそれに相当するアミノ酸がロイシンに置換、且つ533番目のトレオニン又はそれに相当するアミノ酸がアスパラギンに置換(Y187L_T533N);
376番目のアルギニン又はそれに相当するアミノ酸がプロリンに置換、且つ407番目のグルタミン又はそれに相当するアミノ酸がロイシンに置換(R376P_Q407L);
376番目のアルギニン又はそれに相当するアミノ酸がプロリンに置換、且つ449番目のチロシン又はそれに相当するアミノ酸がグルタミンに置換(R376P_Y449Q);
376番目のアルギニン又はそれに相当するアミノ酸がプロリンに置換、且つ512番目のセリン又はそれに相当するアミノ酸がバリンに置換(R376P_S512V);
376番目のアルギニン又はそれに相当するアミノ酸がプロリンに置換、且つ550番目のアスパラギン又はそれに相当するアミノ酸がトリプトファンに置換(R376P_N550W);
376番目のアルギニン又はそれに相当するアミノ酸がプロリンに置換、且つ550番目のアスパラギン又はそれに相当するアミノ酸がチロシンに置換(R376P_N550Y);
407番目のグルタミン又はそれに相当するアミノ酸がロイシンに置換、且つ533番目のトレオニン又はそれに相当するアミノ酸がグルタミン酸に置換(Q407L_T533E);
407番目のグルタミン又はそれに相当するアミノ酸がロイシンに置換、且つ570番目のトリプトファン又はそれに相当するアミノ酸がチロシンに置換(Q407L_W570Y);
407番目のグルタミン又はそれに相当するアミノ酸がロイシンに置換、且つ615番目のチロシン又はそれに相当するアミノ酸がロイシンに置換(Q407L_Y615L);
407番目のグルタミン又はそれに相当するアミノ酸がアルギニンに置換、且つ615番目のチロシン又はそれに相当するアミノ酸がロイシンに置換(Q407R_Y615L);
407番目のグルタミン又はそれに相当するアミノ酸がアルギニンに置換、且つ615番目のチロシン又はそれに相当するアミノ酸がプロリンに置換(Q407R_Y615P);
449番目のチロシン又はそれに相当するアミノ酸がアスパラギン酸に置換、且つ598番目のチロシン又はそれに相当するアミノ酸がフェニルアラニンに置換(Y449D_Y598F);
449番目のチロシン又はそれに相当するアミノ酸がグルタミンに置換、且つ533番目のトレオニン又はそれに相当するアミノ酸がグルタミン酸に置換(Y449Q_T533E);
449番目のチロシン又はそれに相当するアミノ酸がグルタミンに置換、且つ615番目のチロシン又はそれに相当するアミノ酸がグリシンに置換(Y449Q_Y615G);
449番目のチロシン又はそれに相当するアミノ酸がグルタミンに置換、且つ615番目のチロシン又はそれに相当するアミノ酸がプロリンに置換(Y449Q_Y615P);
483番目のトレオニン又はそれに相当するアミノ酸がグリシンに置換、且つ512番目のセリン又はそれに相当するアミノ酸がバリンに置換(T483G_S512V);
483番目のトレオニン又はそれに相当するアミノ酸がグリシンに置換、且つ550番目のアスパラギン又はそれに相当するアミノ酸がセリンに置換(T483G_N550S);
483番目のトレオニン又はそれに相当するアミノ酸がグリシンに置換、且つ615番目のチロシン又はそれに相当するアミノ酸がロイシンに置換(T483G_Y615L);
483番目のトレオニン又はそれに相当するアミノ酸がグルタミンに置換、且つ602番目のプロリン又はそれに相当するアミノ酸がグルタミンに置換(T483Q_P602Q);
484番目のアルギニン又はそれに相当するアミノ酸がヒスチジンに置換、且つ487番目のリジン又はそれに相当するアミノ酸がヒスチジンに置換(R484H_K487H);
484番目のアルギニン又はそれに相当するアミノ酸がトリプトファンに置換、且つ487番目のリジン又はそれに相当するアミノ酸がアスパラギン酸に置換(R484W_K487D);
484番目のアルギニン又はそれに相当するアミノ酸がトリプトファンに置換、且つ575番目のトレオニン又はそれに相当するアミノ酸がトリプトファンに置換(R484W_T575W);
485番目のグリシン又はそれに相当するアミノ酸がリジンに置換、且つ488番目のバリン又はそれに相当するアミノ酸がトリプトファンに置換(G485K_V488W);
485番目のグリシン又はそれに相当するアミノ酸がリジンに置換、且つ516番目のチロシン又はそれに相当するアミノ酸がトリプトファンに置換(G485K_Y516W);
485番目のグリシン又はそれに相当するアミノ酸がリジンに置換、且つ 517番目のアスパラギン酸又はそれに相当するアミノ酸がリジンに置換(G485K_D517K);
485番目のグリシン又はそれに相当するアミノ酸がリジンに置換、且つ 517番目のアスパラギン酸又はそれに相当するアミノ酸がトリプトファンに置換(G485K_D517W);
485番目のグリシン又はそれに相当するアミノ酸がリジンに置換、且つ569番目のグリシン又はそれに相当するアミノ酸がトリプトファンに置換(G485K_G569W);
485番目のグリシン又はそれに相当するアミノ酸がリジンに置換、且つ571番目のグリシン又はそれに相当するアミノ酸がリジンに置換(G485K_G571K);
485番目のグリシン又はそれに相当するアミノ酸がリジンに置換、且つ572番目のアルギニン又はそれに相当するアミノ酸がトリプトファンに置換(G485K_R572W);
485番目のグリシン又はそれに相当するアミノ酸がリジンに置換、且つ573番目のトレオニン又はそれに相当するアミノ酸がトリプトファンに置換(G485K_T573W);
485番目のグリシン又はそれに相当するアミノ酸がトリプトファンに置換、且つ516番目のチロシン又はそれに相当するアミノ酸がトリプトファンに置換(G485W_Y516W);
485番目のグリシン又はそれに相当するアミノ酸がトリプトファンに置換、且つ 517番目のアスパラギン酸又はそれに相当するアミノ酸がトリプトファンに置換(G485W_D517W);
485番目のグリシン又はそれに相当するアミノ酸がトリプトファンに置換、且つ573番目のトレオニン又はそれに相当するアミノ酸がリジンに置換(G485W_T573K);
485番目のグリシン又はそれに相当するアミノ酸がトリプトファンに置換、且つ573番目のトレオニン又はそれに相当するアミノ酸がトリプトファンに置換(G485W_T573W);
487番目のリジン又はそれに相当するアミノ酸がアラニンに置換、且つ512番目のセリン又はそれに相当するアミノ酸がバリンに置換(K487A_S512V);
487番目のリジン又はそれに相当するアミノ酸がグリシンに置換、且つ515番目のアスパラギン又はそれに相当するアミノ酸がグルタミンに置換(K487G_N515Q);
487番目のリジン又はそれに相当するアミノ酸がトリプトファンに置換、且つ573番目のトレオニン又はそれに相当するアミノ酸がリジンに置換(K487W_T573K);
487番目のリジン又はそれに相当するアミノ酸がトリプトファンに置換、且つ593番目のトリプトファン又はそれに相当するアミノ酸がフェニルアラニンに置換(K487W_W593F);
488番目のバリン又はそれに相当するアミノ酸がリジンに置換、且つ514番目のアスパラギン又はそれに相当するアミノ酸がリジンに置換(V488K_N514K);
488番目のバリン又はそれに相当するアミノ酸がリジンに置換、且つ 517番目のアスパラギン酸又はそれに相当するアミノ酸がリジンに置換(V488K_D517K);
488番目のバリン又はそれに相当するアミノ酸がリジンに置換、且つ569番目のグリシン又はそれに相当するアミノ酸がリジンに置換(V488K_G569K);
488番目のバリン又はそれに相当するアミノ酸がリジンに置換、且つ569番目のグリシン又はそれに相当するアミノ酸がトリプトファンに置換(V488K_G569W);
488番目のバリン又はそれに相当するアミノ酸がリジンに置換、且つ572番目のアルギニン又はそれに相当するアミノ酸がリジンに置換(V488K_R572K);
488番目のバリン又はそれに相当するアミノ酸がリジンに置換、且つ573番目のトレオニン又はそれに相当するアミノ酸がリジンに置換(V488K_T573K);
488番目のバリン又はそれに相当するアミノ酸がリジンに置換、且つ573番目のトレオニン又はそれに相当するアミノ酸がトリプトファンに置換(V488K_T573W);
488番目のバリン又はそれに相当するアミノ酸がリジンに置換、且つ516番目のチロシン又はそれに相当するアミノ酸がリジンに置換(V488K_Y516K);
488番目のバリン又はそれに相当するアミノ酸がリジンに置換、且つ516番目のチロシン又はそれに相当するアミノ酸がトリプトファンに置換(V488K_Y516W);
488番目のバリン又はそれに相当するアミノ酸がトリプトファンに置換、且つ514番目のアスパラギン又はそれに相当するアミノ酸がトリプトファンに置換(V488W_N514W);
488番目のバリン又はそれに相当するアミノ酸がトリプトファンに置換、且つ573番目のトレオニン又はそれに相当するアミノ酸がトリプトファンに置換(V488W_T573W);
500番目のグルタミン酸又はそれに相当するアミノ酸がアラニンに置換、且つ501番目のイソロイシン又はそれに相当するアミノ酸がアラニンに置換(E500A_I501A);
512番目のセリン又はそれに相当するアミノ酸がバリンに置換、且つ550番目のアスパラギン又はそれに相当するアミノ酸がセリンに置換(S512V_N550S);
533番目のトレオニン又はそれに相当するアミノ酸がグルタミン酸に置換、且つ550番目のアスパラギン又はそれに相当するアミノ酸がセリンに置換(T533E_N550S);
533番目のトレオニン又はそれに相当するアミノ酸がグルタミン酸に置換、且つ615番目のチロシン又はそれに相当するアミノ酸がグリシンに置換(T533E_Y615G);
570番目のトリプトファン又はそれに相当するアミノ酸がチロシンに置換、且つ615番目のチロシン又はそれに相当するアミノ酸がロイシンに置換(W570Y_Y615L);
91番目のフェニルアラニン又はそれに相当するアミノ酸がバリンに置換、且つ 513番目のグルタミン酸又はそれに相当するアミノ酸がグリシンに置換(F91V_E513G);
180番目のトレオニン又はそれに相当するアミノ酸がバリンに置換、且つ483番目のトレオニン又はそれに相当するアミノ酸がリジンに置換(T180V_T483K);
180番目のトレオニン又はそれに相当するアミノ酸がバリンに置換、且つ598番目のチロシン又はそれに相当するアミノ酸がアスパラギンに置換(T180V_Y598N);
180番目のトレオニン又はそれに相当するアミノ酸がバリンに置換、且つ615番目のチロシン又はそれに相当するアミノ酸がグリシンに置換(T180V_Y615G);
182番目のプロリン又はそれに相当するアミノ酸がロイシンに置換、且つ615番目のチロシン又はそれに相当するアミノ酸がロイシンに置換(P182L_Y615L);
376番目のアルギニン又はそれに相当するアミノ酸がプロリンに置換、且つ598番目のチロシン又はそれに相当するアミノ酸がアスパラギンに置換(R376P_Y598N);
407番目のグルタミン又はそれに相当するアミノ酸がロイシンに置換、且つ483番目のトレオニン又はそれに相当するアミノ酸がリジンに置換(Q407L_T483K);
407番目のグルタミン又はそれに相当するアミノ酸がロイシンに置換、且つ487番目のリジン又はそれに相当するアミノ酸がプロリンに置換(Q407L_K487P);
407番目のグルタミン又はそれに相当するアミノ酸がロイシンに置換、且つ615番目のチロシン又はそれに相当するアミノ酸がグリシンに置換(Q407L_Y615G);
449番目のチロシン又はそれに相当するアミノ酸がグルタミン酸に置換、且つ487番目のリジン又はそれに相当するアミノ酸がアラニンに置換(Y449E_K487A);
449番目のチロシン又はそれに相当するアミノ酸がグルタミン酸に置換、且つ487番目のリジン又はそれに相当するアミノ酸がプロリンに置換(Y449E_K487P);
483番目のトレオニン又はそれに相当するアミノ酸がグリシンに置換、且つ487番目のリジン又はそれに相当するアミノ酸がアラニンに置換(T483G_K487A);
483番目のトレオニン又はそれに相当するアミノ酸がグリシンに置換、且つ533番目のトレオニン又はそれに相当するアミノ酸がグルタミン酸に置換(T483G_T533E);
483番目のトレオニン又はそれに相当するアミノ酸がグリシンに置換、且つ615番目のチロシン又はそれに相当するアミノ酸がグリシンに置換(T483G_Y615G);
483番目のトレオニン又はそれに相当するアミノ酸がメチオニンに置換、且つ487番目のリジン又はそれに相当するアミノ酸がアラニンに置換(T483M_K487A);
483番目のトレオニン又はそれに相当するアミノ酸がメチオニンに置換、且つ487番目のリジン又はそれに相当するアミノ酸がグリシンに置換(T483M_K487G);
483番目のトレオニン又はそれに相当するアミノ酸がメチオニンに置換、且つ487番目のリジン又はそれに相当するアミノ酸がプロリンに置換(T483M_K487P);
484番目のアルギニン又はそれに相当するアミノ酸がヒスチジンに置換、且つ487番目のリジン又はそれに相当するアミノ酸がアスパラギン酸に置換(R484H_K487D);
484番目のアルギニン又はそれに相当するアミノ酸がリジンに置換、且つ513番目のグルタミン酸又はそれに相当するアミノ酸がトリプトファンに置換(R484K_E513W);
484番目のアルギニン又はそれに相当するアミノ酸がリジンに置換、且つ514番目のアスパラギン又はそれに相当するアミノ酸がリジンに置換(R484K_N514K);
484番目のアルギニン又はそれに相当するアミノ酸がリジンに置換、且つ514番目のアスパラギン又はそれに相当するアミノ酸がトリプトファンに置換(R484K_N514W);
484番目のアルギニン又はそれに相当するアミノ酸がリジンに置換、且つ515番目のアスパラギン又はそれに相当するアミノ酸がリジンに置換(R484K_N515K);
484番目のアルギニン又はそれに相当するアミノ酸がリジンに置換、且つ515番目のアスパラギン又はそれに相当するアミノ酸がトリプトファンに置換(R484K_N515W);
484番目のアルギニン又はそれに相当するアミノ酸がリジンに置換、且つ517番目のアスパラギン酸又はそれに相当するアミノ酸がトリプトファンに置換(R484K_D517W);
484番目のアルギニン又はそれに相当するアミノ酸がリジンに置換、且つ569番目のグリシン又はそれに相当するアミノ酸がリジンに置換(R484K_G569K);
484番目のアルギニン又はそれに相当するアミノ酸がリジンに置換、且つ571番目のグリシン又はそれに相当するアミノ酸がリジンに置換(R484K_G571K);
484番目のアルギニン又はそれに相当するアミノ酸がリジンに置換、且つ572番目のアルギニン又はそれに相当するアミノ酸がリジンに置換(R484K_R572K);
484番目のアルギニン又はそれに相当するアミノ酸がリジンに置換、且つ572番目のアルギニン又はそれに相当するアミノ酸がトリプトファンに置換(R484K_R572W);
484番目のアルギニン又はそれに相当するアミノ酸がリジンに置換、且つ573番目のトレオニン又はそれに相当するアミノ酸がリジンに置換(R484K_T573K);
484番目のアルギニン又はそれに相当するアミノ酸がリジンに置換、且つ573番目のトレオニン又はそれに相当するアミノ酸がトリプトファンに置換(R484K_T573W);
484番目のアルギニン又はそれに相当するアミノ酸がリジンに置換、且つ516番目のチロシン又はそれに相当するアミノ酸がリジンに置換(R484K_Y516K);
484番目のアルギニン又はそれに相当するアミノ酸がトリプトファンに置換、且つ515番目のアスパラギン又はそれに相当するアミノ酸がリジンに置換(R484W_N515K);
485番目のグリシン又はそれに相当するアミノ酸がアスパラギン酸に置換、且つ487番目のリジン又はそれに相当するアミノ酸がヒスチジンに置換(G485D_K487H);
485番目のグリシン又はそれに相当するアミノ酸がリジンに置換、且つ487番目のリジン又はそれに相当するアミノ酸がヒスチジンに置換(G485K_K487H);
485番目のグリシン又はそれに相当するアミノ酸がリジンに置換、且つ569番目のグリシン又はそれに相当するアミノ酸がリジンに置換(G485K_G569K);
485番目のグリシン又はそれに相当するアミノ酸がリジンに置換、且つ514番目のアスパラギン又はそれに相当するアミノ酸がリジンに置換(G485K_N514K);
485番目のグリシン又はそれに相当するアミノ酸がリジンに置換、且つ515番目のアスパラギン又はそれに相当するアミノ酸がリジンに置換(G485K_N515K);
485番目のグリシン又はそれに相当するアミノ酸がリジンに置換、且つ515番目のアスパラギン又はそれに相当するアミノ酸がトリプトファンに置換(G485K_N515W);
485番目のグリシン又はそれに相当するアミノ酸がアルギニンに置換、且つ487番目のリジン又はそれに相当するアミノ酸がアスパラギン酸に置換(G485R_K487D);
485番目のグリシン又はそれに相当するアミノ酸がトリプトファンに置換、且つ 513番目のグルタミン酸又はそれに相当するアミノ酸がトリプトファンに置換(G485W_E513W);
485番目のグリシン又はそれに相当するアミノ酸がトリプトファンに置換、且つ515番目のアスパラギン又はそれに相当するアミノ酸がリジンに置換(G485W_N515K);
485番目のグリシン又はそれに相当するアミノ酸がトリプトファンに置換、且つ515番目のアスパラギン又はそれに相当するアミノ酸がトリプトファンに置換(G485W_N515W);
487番目のリジン又はそれに相当するアミノ酸がアラニンに置換、且つ531番目のセリン又はそれに相当するアミノ酸がアラニンに置換(K487A_S531A);
487番目のリジン又はそれに相当するアミノ酸がアラニンに置換、且つ593番目のトリプトファン又はそれに相当するアミノ酸がフェニルアラニンに置換(K487A_W593F);
487番目のリジン又はそれに相当するアミノ酸がアラニンに置換、且つ615番目のチロシン又はそれに相当するアミノ酸がロイシンに置換(K487A_Y615L);
487番目のリジン又はそれに相当するアミノ酸がトリプトファンに置換、且つ514番目のアスパラギン又はそれに相当するアミノ酸がリジンに置換(K487W_N514K);
487番目のリジン又はそれに相当するアミノ酸がトリプトファンに置換、且つ514番目のアスパラギン又はそれに相当するアミノ酸がトリプトファンに置換(K487W_N514W);
487番目のリジン又はそれに相当するアミノ酸がトリプトファンに置換、且つ516番目のチロシン又はそれに相当するアミノ酸がトリプトファンに置換(K487W_Y516W);
487番目のリジン又はそれに相当するアミノ酸がトリプトファンに置換、且つ569番目のグリシン又はそれに相当するアミノ酸がリジンに置換(K487W_G569K);
487番目のリジン又はそれに相当するアミノ酸がチロシンに置換、且つ515番目のアスパラギン又はそれに相当するアミノ酸がフェニルアラニンに置換(K487Y_N515F);
487番目のリジン又はそれに相当するアミノ酸がチロシンに置換、且つ515番目のアスパラギン又はそれに相当するアミノ酸がトリプトファンに置換(K487Y_N515W);
488番目のバリン又はそれに相当するアミノ酸がリジンに置換、且つ515番目のアスパラギン又はそれに相当するアミノ酸がリジンに置換(V488K_N515K);
488番目のバリン又はそれに相当するアミノ酸がリジンに置換、且つ515番目のアスパラギン又はそれに相当するアミノ酸がトリプトファンに置換(V488K_N515W);
488番目のバリン又はそれに相当するアミノ酸がトリプトファンに置換、且つ515番目のアスパラギン又はそれに相当するアミノ酸がリジンに置換(V488W_N515K);
488番目のバリン又はそれに相当するアミノ酸がトリプトファンに置換、且つ515番目のアスパラギン又はそれに相当するアミノ酸がトリプトファンに置換(V488W_N515W);
488番目のバリン又はそれに相当するアミノ酸がチロシンに置換、且つ515番目のアスパラギン又はそれに相当するアミノ酸がトリプトファンに置換(V488Y_N515W);
550番目のアスパラギン又はそれに相当するアミノ酸がセリンに置換、且つ598番目のチロシン又はそれに相当するアミノ酸がアスパラギンに置換(N550S_Y598N);
550番目のアスパラギン又はそれに相当するアミノ酸がセリンに置換、且つ615番目のチロシン又はそれに相当するアミノ酸がグリシンに置換(N550S_Y615G);
550番目のアスパラギン又はそれに相当するアミノ酸がセリンに置換、且つ615番目のチロシン又はそれに相当するアミノ酸がロイシンに置換(N550S_Y615L);
550番目のアスパラギン又はそれに相当するアミノ酸がセリンに置換、且つ615番目のチロシン又はそれに相当するアミノ酸がプロリンに置換(N550S_Y615P);
484番目のアルギニン又はそれに相当するアミノ酸がアラニンに置換、485番目のグリシン又はそれに相当するアミノ酸がアラニンに置換、且つ487番目のリジン又はそれに相当するアミノ酸がアスパラギン酸に置換(R484A_G485A_K487D);
484番目のアルギニン又はそれに相当するアミノ酸がアスパラギン酸に置換、485番目のグリシン又はそれに相当するアミノ酸がアスパラギン酸に置換、且つ487番目のリジン又はそれに相当するアミノ酸がアスパラギン酸に置換(R484D_G485D_K487D);
485番目のグリシン又はそれに相当するアミノ酸がアルギニンに置換、486番目のアスパラギン酸又はそれに相当するアミノ酸がアルギニンに置換、且つ487番目のリジン又はそれに相当するアミノ酸がリジンアルギニンに置換(G485R_D486R_K487R);
484番目のアルギニン又はそれに相当するアミノ酸がアラニンに置換、485番目のグリシン又はそれに相当するアミノ酸がアラニンに置換、486番目のアスパラギン酸又はそれに相当するアミノ酸がアラニンに置換、且つ487番目のリジン又はそれに相当するアミノ酸がアラニンに置換(R484A_G485A_D486A_K487A);
484番目のアルギニン又はそれに相当するアミノ酸がアラニンに置換、485番目のグリシン又はそれに相当するアミノ酸がアラニンに置換、486番目のアスパラギン酸又はそれに相当するアミノ酸がプロリンに置換、且つ487番目のリジン又はそれに相当するアミノ酸がプロリンに置換(R484A_G485A_D486P_K487P);
484番目のアルギニン又はそれに相当するアミノ酸がアラニンに置換、485番目のグリシン又はそれに相当するアミノ酸がアラニンに置換、且つ487番目のリジン又はそれに相当するアミノ酸がアスパラギン酸に置換(R484A_G485A_K487D);
484番目のアルギニン又はそれに相当するアミノ酸がシステインに置換、486番目のアスパラギン酸又はそれに相当するアミノ酸がヒスチジンに置換、且つ487番目のリジン又はそれに相当するアミノ酸がアルギニンに置換(R484C_D486H_K487R);
485番目のグリシン又はそれに相当するアミノ酸がアルギニンに置換、486番目のアスパラギン酸又はそれに相当するアミノ酸がトリプトファンに置換、且つ487番目のリジン又はそれに相当するアミノ酸がトリプトファンに置換(G485R_D486W_K487W);
485番目のグリシン又はそれに相当するアミノ酸がアルギニンに置換、486番目のアスパラギン酸又はそれに相当するアミノ酸がアラニンに置換、且つ487番目のリジン又はそれに相当するアミノ酸がアラニンに置換(G485R_D486A_K487A);
485番目のグリシン又はそれに相当するアミノ酸がアルギニンに置換、486番目のアスパラギン酸又はそれに相当するアミノ酸がプロリンに置換、且つ487番目のリジン又はそれに相当するアミノ酸がプロリンに置換(G485R_D486P_K487P);
484番目のアルギニン又はそれに相当するアミノ酸がアラニンに置換、485番目のグリシン又はそれに相当するアミノ酸がアラニンに置換、486番目のアスパラギン酸又はそれに相当するアミノ酸がアラニンに置換、且つ487番目のリジン又はそれに相当するアミノ酸がアラニンに置換(R484A_G485A_D486A_K487A);
484番目のアルギニン又はそれに相当するアミノ酸がアラニンに置換、485番目のグリシン又はそれに相当するアミノ酸がアラニンに置換、486番目のアスパラギン酸又はそれに相当するアミノ酸がアルギニンに置換、且つ487番目のリジン又はそれに相当するアミノ酸がアルギニンに置換(R484A_G485A_D486R_K487R);
484番目のアルギニン又はそれに相当するアミノ酸がアスパラギン酸に置換、485番目のグリシン又はそれに相当するアミノ酸がアスパラギン酸に置換、486番目のアスパラギン酸又はそれに相当するアミノ酸がアルギニンに置換、且つ487番目のリジン又はそれに相当するアミノ酸がアルギニンに置換(R484D_G485D_D486R_K487R);
484番目のアルギニン又はそれに相当するアミノ酸がアスパラギン酸に置換、485番目のグリシン又はそれに相当するアミノ酸がアスパラギン酸に置換、486番目のアスパラギン酸又はそれに相当するアミノ酸がプロリンに置換、且つ487番目のリジン又はそれに相当するアミノ酸がプロリンに置換(R484D_G485D_D486P_K487P);
484番目のアルギニン又はそれに相当するアミノ酸がアスパラギン酸に置換、485番目のグリシン又はそれに相当するアミノ酸がアスパラギン酸に置換、486番目のアスパラギン酸又はそれに相当するアミノ酸がアラニンに置換、且つ487番目のリジン又はそれに相当するアミノ酸がアラニンに置換(R484D_G485D_D486A_K487A);
484番目のアルギニン又はそれに相当するアミノ酸がアスパラギン酸に置換、485番目のグリシン又はそれに相当するアミノ酸がアスパラギン酸に置換、486番目のアスパラギン酸又はそれに相当するアミノ酸がトリプトファンに置換、且つ487番目のリジン又はそれに相当するアミノ酸がトリプトファンに置換(R484D_G485D_D486W_K487W);
484番目のアルギニン又はそれに相当するアミノ酸がプロリンに置換、485番目のグリシン又はそれに相当するアミノ酸がプロリンに置換、486番目のアスパラギン酸又はそれに相当するアミノ酸がアルギニンに置換、且つ487番目のリジン又はそれに相当するアミノ酸がアルギニンに置換(R484P_G485P_D486R_K487R)。
[20]配列番号1〜4のいずれかのアミノ酸配列、又は配列番号1〜4のいずれかに示されるアミノ酸配列と90%以上同一であるアミノ酸配列からなるβ−ガラクトシダーゼにおいて、以下のいずれかの改変が施された改変型β−ガラクトシダーゼ:
(a)484番目のアルギニン(R484)〜487番目のリジン(K487)、又はこれに相当する領域の欠失;
(b)514番目のアスパラギン(N514)と515番目のアスパラギン(N515)の間、又はこれに相当する位置にアミノ酸の挿入;
(c)604番目のプロリン(P604)と605番目のチロシン(Y605)の間、又はこれに相当する位置にアミノ酸の挿入;
(d)485番目のグリシン(G485)又はこれに相当するアミノ酸の欠失に加え、486番目のアスパラギン酸(D486)又はこれに相当するアミノ酸の他のアミノ酸への置換;
(e)485番目のグリシン(G485)〜486番目のアスパラギン酸(D486)、又はこれに相当する領域の欠失に加え、487番目のリジン(K487)又はこれに相当するアミノ酸の他のアミノ酸への置換;
(f)485番目のグリシン(G485)〜486番目のアスパラギン酸(D486)、又はこれに相当する領域の欠失に加え、484番目のアルギニン(R484)又はこれに相当するアミノ酸の他のアミノ酸への置換、及び487番目のリジン(K487)又はこれに相当するアミノ酸の他のアミノ酸への置換;
(g)484番目のアルギニン(R484)と485番目のグリシン(G485)の間、又はこれに相当する位置にアミノ酸の挿入;
(h)485番目のグリシン(G485)と486番目のアスパラギン酸(D486)の間、又はこれに相当する位置にアミノ酸の挿入。
[21](d)〜(f)に関して、484番目のアルギニン(R484)の置換後のアミノ酸はトリプトファン又はプロリンであり、486番目のアスパラギン酸(D486)の置換後のアミノ酸はヒスチジンであり、487番目のリジン(K487)の置換後のアミノ酸はアルギニン、トリプトファン又はプロリンであり、
(b)、(c)、(g)、(h)に関して、挿入されるアミノ酸の数は1〜10個である、
[20]に記載の改変型β−ガラクトシダーゼ。
[22]配列番号1のアミノ酸配列からなるβ−ガラクトシダーゼにおいて、以下のいずれかの改変が施された改変型β−ガラクトシダーゼ:
(i)487番目のリジン(K487)がグリシン又はプロリンに置換;
(ii)514番目のアスパラギン(N514)がトリプトファンに置換;
(iii)515番目のアスパラギン(N515)がリジン又はトリプトファンに置換。
[23][1]〜[22]のいずれか一項に記載の改変型β−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子。
[24][23]に記載の遺伝子を含む組換えDNA。
[25][24]に記載の組換えDNAを保有する微生物。
[26][1]〜[22]のいずれか一項に記載の改変型β−ガラクトシダーゼを含む酵素剤。
[27]β-1,3結合、β-1,4結合及びβ-1,6結合の中の少なくとも一つを有する、二糖、オリゴ糖又は多糖に対して、[1]〜[22]のいずれか一項に記載の改変型β−ガラクトシダーゼを作用させることを特徴とする、オリゴ糖の製造方法。
(用語)
用語「改変型β−ガラクトシダーゼ」とは、特定のβ−ガラクトシダーゼ(説明の便宜上、「基準β−ガラクトシダーゼ」と呼ぶ)を改変ないし変異して得られる酵素である。基準β−ガラクトシダーゼは、バチルス・サーキュランスが生産するβ-ガラクトシダーゼである。これまでの研究から、バチルス・サーキュランスのβ-ガラクトシダーゼは分子量の異なる4種類の酵素で構成されていることが知られている。本発明では、これら4種類の酵素のいずれかを基準β−ガラクトシダーゼとする。典型的には、配列番号1〜4のいずれかのアミノ酸配列を有する酵素が基準β−ガラクトシダーゼとなるが、配列番号1〜4のいずれかのアミノ酸配列と90%以上同一であるアミノ酸配列を有する酵素(β−ガラクトシダーゼ活性を示すもの)を基準β−ガラクトシダーゼとして用いることも可能である。好ましくは配列番号1〜4のいずれかのアミノ酸配列と95%以上同一であるアミノ酸配列を有する酵素(β−ガラクトシダーゼ活性を示すもの)、より好ましくは配列番号1〜4のいずれかのアミノ酸配列と98%以上同一であるアミノ酸配列を有する酵素(β−ガラクトシダーゼ活性を示すもの)、最も好ましくは配列番号1〜4のいずれかのアミノ酸配列と99%以上同一であるアミノ酸配列を有する酵素(β−ガラクトシダーゼ活性を示すもの)を基準β−ガラクトシダーゼとして用いてもよい。配列番号1は分子量195kDのβ−ガラクトシダーゼ(以下、BgaD-Aとも呼ぶ)のアミノ酸配列であり、配列番号2は分子量160kDのβ−ガラクトシダーゼ(以下、BgaD-Bとも呼ぶ)のアミノ酸配列であり、配列番号3は分子量135kDのβ−ガラクトシダーゼ(以下、BgaD-Cとも呼ぶ)のアミノ酸配列であり、配列番号4は分子量86kDのβ−ガラクトシダーゼ(以下、BgaD-Dとも呼ぶ)である。また、BgaD-A、BgaD-B、BgaD-C及びBgaD-Dをコードする塩基配列をそれぞれ配列番号5、6、7及び8に示す。
メチオニン:M、セリン:S、アラニン:A、トレオニン:T、バリン:V、チロシン:Y、ロイシン:L、アスパラギン:N、イソロイシン:I、グルタミン:Q、プロリン:P、アスパラギン酸:D、フェニルアラニン:F、グルタミン酸:E、トリプトファン:W、リジン:K、システイン:C、アルギニン:R、グリシン:G、ヒスチジン:H
本発明の第1の局面は改変型β−ガラクトシダーゼ(改変型酵素)に関する。本発明の改変型酵素は、典型的には、配列番号1〜4のいずれかのアミノ酸配列、又は配列番号1〜4のいずれかに示されるアミノ酸配列と90%以上同一であるアミノ酸配列からなるβ−ガラクトシダーゼにおいて、以下の(1)〜(21)からなる群より選択される一又は二以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有する。
(1) 182番目のプロリン(P182)
(2) 187番目のチロシン(Y187)
(3) 188番目のセリン(S188)
(4) 405番目のトリプトファン(W405)
(5) 406番目のアラニン(A406)
(6) 407番目のグルタミン(Q407)
(7) 449番目のチロシン(Y449)
(8) 483番目のトレオニン(T483)
(9) 512番目のセリン(S512)
(10) 531番目のセリン(S531)
(11) 533番目のセリン(S533)
(12) 534番目のセリン(S534)
(13) 550番目のアスパラギン(N550)
(14) 551番目のグルタミン(Q551)
(15) 593番目のトリプトファン(W593)
(16) 598番目のチロシン(Y598)
(17) 602番目のプロリン(P602)
(18) 604番目のプロリン(P604)
(19) 609番目のチロシン(Y609)
(20) 612番目のリジン(K612)
(21) 615番目のチロシン(Y615)
449番目のチロシン(Y449)の置換後のアミノ酸はアスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン又はトリプトファン。
531番目のセリン(S531)の置換後のアミノ酸はアラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、イソロイシン、メチオニン、アスパラギン又はグルタミン。
593番目のトリプトファン(W593)の置換後のアミノ酸はフェニルアラニン。
602番目のプロリン(P602)の置換後のアミノ酸はグルタミン酸又はグリシン。
604番目のプロリン(P604)の置換後のアミノ酸はアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、メチオニン、セリン、トレオニン、バリン、トリプトファン又はチロシン。
612番目のリジン(K612)の置換後のアミノ酸はメチオニン。
187番目のチロシン(Y187)の置換後のアミノ酸はアスパラギン酸、グルタミン酸又はグリシン。
188番目のセリン(S188)の置換後のアミノ酸はプロリン又はトレオニン。
533番目のセリン(S533)の置換後のアミノ酸はメチオニン又はグルタミン。
602番目のプロリン(P602)置換後のアミノ酸はシステイン、イソロイシン、アスパラギン、セリン、トレオニン又はバリン。
612番目のリジン(K612)の置換後のアミノ酸はフェニルアラニン
182番目のプロリン(P182)の置換後のアミノ酸はロイシン。
187番目のチロシン(Y187)の置換後のアミノ酸はアスパラギン酸又はロイシン。
188番目のセリン(S188)の置換後のアミノ酸はイソロイシン。
405番目のトリプトファン(W405)の置換後のアミノ酸はアラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、ロイシン、アスパラギン、セリン又はトレオニン。
407番目のグルタミン(Q407)の置換後のアミノ酸はグリシン又はアルギニン。
449番目のチロシン(Y449)の置換後のアミノ酸はグルタミン酸、イソロイシン、グルタミン、アルギニン又はセリン。
483番目のトレオニン(T483)の置換後のアミノ酸はグルタミン。
512番目のセリン(S512)の置換後のアミノ酸はフェニルアラニン、トレオニン又はバリン。
531番目のセリン(S531)の置換後のアミノ酸はプロリン。
550番目のアスパラギン(N550)の置換後のアミノ酸はロイシン、アルギニン又はセリン。
602番目のプロリン(P602)の置換後のアミノ酸はロイシン、アスパラギン又はグルタミン。
604番目のプロリン(P604)の置換後のアミノ酸はイソロイシン又はメチオニン
85番目のトリプトファン(W85)の置換後のアミノ酸はグリシン。
91番目のフェニルアラニン(F91)の置換後のアミノ酸はアラニン又はイソロイシン。
103番目のチロシン(Y103)の置換後のアミノ酸はグリシン。
134番目のチロシン(Y134)の置換後のアミノ酸はグリシン。
153番目のチロシン(Y153)の置換後のアミノ酸はグリシン。
182番目のプロリン(P182)の置換後のアミノ酸はトリプトファン又はチロシン。
186番目のトリプトファン(W186)の置換後のアミノ酸はメチオニン。
192番目のチロシン(Y192)の置換後のアミノ酸はグリシン。
295番目のチロシン(Y295)の置換後のアミノ酸はグリシン。
345番目のヒスチジン(H345)の置換後のアミノ酸はグリシン。
349番目のグリシン(G349)の置換後のアミノ酸はトリプトファン。
402番目のフェニルアラニン(F402)の置換後のアミノ酸はグリシン。
407番目のグルタミン(Q407)の置換後のアミノ酸はイソロイシン、ロイシン、メチオニン、バリン又はチロシン。
479番目のグリシン(G479)の置換後のアミノ酸はロイシン、プロリン又はグルタミン。
480番目のグルタミン酸(E480)の置換後のアミノ酸はアスパラギン。
482番目のリジン(K482)の置換後のアミノ酸はメチオニン又はバリン。
483番目のトレオニン(T483)の置換後のアミノ酸はグリシン又はセリン。
484番目のアルギニン(R484)の置換後のアミノ酸はフェニルアラニン、イソロイシン、メチオニン、アスパラギン又はグルタミン。
485番目のグリシン(G485)の置換後のアミノ酸はアスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン又はトレオニン。
486番目のアスパラギン酸(D486)の置換後のアミノ酸はアラニン、グルタミン酸、フェニルアラニン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、プロリン、グルタミン、アルギニン、トレオニン、トリプトファン又はチロシン。
487番目のリジン(K487)の置換後のアミノ酸はシステイン、グルタミン酸、フェニルアラニン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、アスパラギン、グルタミン、アルギニン、トレオニン、バリン、トリプトファン又はチロシン。
488番目のバリン(V488)の置換後のアミノ酸はグリシン、イソロイシン、ロイシン、アルギニン、セリン、トレオニン、トリプトファン又はチロシン。
496番目のチロシン(Y496)の置換後のアミノ酸はグリシン。
512番目のセリン(S512)の置換後のアミノ酸はシステイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、プロリン、グルタミン又はトリプトファン。
513番目のグルタミン酸(E513)の置換後のアミノ酸はアラニン、システイン、アスパラギン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、リジン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、トレオニン又はバリン。
514番目のアスパラギン(N514)の置換後のアミノ酸はグルタミン酸、ロイシン又はリジン。
515番目のアスパラギン(N515)の置換後のアミノ酸はアラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、イソロイシン、ロイシン、プロリン又はバリン。
516番目のチロシン(Y516)の置換後のアミノ酸はトリプトファン。
517番目のアスパラギン酸(D517)の置換後のアミノ酸はリジン又はトリプトファン。
519番目のチロシン(Y519)の置換後のアミノ酸はグリシン。
533番目のトレオニン(T533)の置換後のアミノ酸はグルタミン酸。
547番目のチロシン(Y547)の置換後のアミノ酸はグリシン。
549番目のチロシン(Y549)の置換後のアミノ酸はグリシン。
555番目のチロシン(Y555)の置換後のアミノ酸はグリシン。
572番目のアルギニン(R572)の置換後のアミノ酸はシステイン、ロイシン、メチオニン、トレオニン、トリプトファン又はチロシン。
573番目のトレオニン(T573)の置換後のアミノ酸はグルタミン酸。
598番目のチロシン(Y598)の置換後のアミノ酸はヒスチジン又はアスパラギン。
605番目のチロシン(Y605)の置換後のアミノ酸はシステイン、アスパラギン酸、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、プロリン、アルギニン又はトレオニン。
606番目のチロシン(Y606)の置換後のアミノ酸はアラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン又はセリン。
609番目のチロシン(Y609)の置換後のアミノ酸はグルタミン酸、アスパラギン又はセリン。
616番目のフェニルアラニン(F616)の置換後のアミノ酸はグリシン。
624番目のフェニルアラニン(F624)の置換後のアミノ酸はグリシン。
648番目のトリプトファン(W648)の置換後のアミノ酸はグリシン。
650番目のトリプトファン(W650)の置換後のアミノ酸はグリシン。
483番目のトレオニン(T483)の置換後のアミノ酸はリジン、メチオニン又はアルギニン。
512番目のセリン(S512)の置換後のアミノ酸はグリシン又はリジン。
551番目のグルタミン(Q551)の置換後のアミノ酸はアスパラギン。
598番目のチロシン(Y598)の置換後のアミノ酸はアスパラギン。
615番目のチロシン(Y615)の置換後のアミノ酸はトレオニン。
76番目のトリプトファン(W76)の置換後のアミノ酸はグリシン。
480番目のグルタミン酸(E480)の置換後のアミノ酸はグルタミン。
483番目のトレオニン(T483)の置換後のアミノ酸はトリプトファン。
485番目のグリシン(G485)の置換後のアミノ酸はプロリン又はトレオニン。
484番目のアルギニン(R484)の置換後のアミノ酸はアラニン、システイン、アスパラギン酸、グリシン、プロリン、セリン、チロシン又はリジン。
487番目のリジン(K487)の置換後のアミノ酸はグリシン又はプロリン。
488番目のバリン(V488)の置換後のアミノ酸はプロリン。
512番目のセリン(S512)の置換後のアミノ酸はロイシン又はメチオニン。
514番目のアスパラギン(N514)の置換後のアミノ酸はアスパラギン酸。
515番目のアスパラギン(N515)の置換後のアミノ酸はフェニルアラニン、アルギニン、トリプトファン、チロシン又はリジン。
569番目のグリシン(G569)の置換後のアミノ酸はリジン、プロリン又はバリン。
596番目のフェニルアラニン(F596)の置換後のアミノ酸はグリシン。
405番目のトリプトファン(W405)の置換後のアミノ酸はアラニン、アスパラギン酸、セリン又はトレオニン。
483番目のトレオニン(T483)の置換後のアミノ酸はメチオニン。
531番目のセリン(S531)の置換後のアミノ酸はアスパラギン酸、フェニルアラニン、グリシン、ロイシン、リジン又はメチオニン。
550番目のアスパラギン(N550)の置換後のアミノ酸はフェニルアラニン。
598番目のチロシン(Y598)の置換後のアミノ酸はフェニルアラニン又はヒスチジン
182番目のプロリン(P182)の置換後のアミノ酸はロイシン又はセリン。
187番目のチロシン(Y187)の置換後のアミノ酸はアスパラギン酸、グルタミン酸又はアスパラギン。
188番目のセリン(S188)の置換後のアミノ酸はグルタミン酸、グリシン、イソロイシン又はアスパラギン。
405番目のトリプトファン(W405)の置換後のアミノ酸はヒスチジン。
406番目のアラニン(A406)の置換後のアミノ酸はプロリン。
407番目のグルタミン(Q407)の置換後のアミノ酸はアラニン、フェニルアラニン、グリシン、リジン又はアルギニン。
449番目のチロシン(Y449)の置換後のアミノ酸はグルタミン酸又はアルギニン。
483番目のトレオニン(T483)の置換後のアミノ酸はセリン又はグルタミン。
512番目のセリン(S512)の置換後のアミノ酸はグリシン、トレオニン又はバリン。
534番目のセリン(S534)の置換後のアミノ酸はリジン又はグルタミン。
550番目のアスパラギン(N550)の置換後のアミノ酸はアラニン、グリシン、リジン、ロイシン、メチオニン、アルギニン又はセリン。
551番目のグルタミン(Q551)の置換後のアミノ酸はリジン又はヒスチジン。
602番目のプロリン(P602)の置換後のアミノ酸はシステイン、アスパラギン酸又はアスパラギン。
609番目のチロシン(Y609)の置換後のアミノ酸はアスパラギン酸、グルタミン又はトレオニン。
612番目のリジン(K612)の置換後のアミノ酸はフェニルアラニン又はイソロイシン。
615番目のチロシン(Y615)の置換後のアミノ酸はグルタミン酸、イソロイシン又はトレオニン
(例1)
第3群のアミノ酸と、第5群のアミノ酸を置換対象にする。得られる改変型酵素は、4糖の割合もアロラクトースの割合も少ないという特徴を示すことが期待される。
(例2)
第4群のアミノ酸と、第6群のアミノ酸を置換対象にする。得られる改変型酵素は、4糖の割合もアロラクトースの割合も多いという特徴を示すことが期待される。
(例3)
第3群のアミノ酸と、第6群のアミノ酸を置換対象にする。得られる改変型酵素は、4糖の割合が少ないものの、アロラクトースの割合は多いという特徴を示すことが期待される。
(例4)
第4群のアミノ酸と、第5群のアミノ酸を置換対象にする。得られる改変型酵素は、4糖の割合が多く、アロラクトースの割合は少ないという特徴を示すことが期待される。
(例5)
同じ群のアミノ酸を複数置換する。同じ群のアミノ酸を複数置換することで、より大きな変化が期待できる。たとえば、第3群のアミノ酸の複数のアミノ酸を置換対象にすると、得られる改変型酵素は4糖の割合がより少ないという特徴を示すことが期待される。
型酵素(R484K_N515K)、484番目のアルギニンがリジンに置換され、且つ515番目のアスパラギンがトリプトファンに置換された改変型酵素(R484K_N515W)、484番目のアルギニンがリジンに置換され、且つ 517番目のアスパラギン酸がトリプトファンに置換された改変型酵素(R484K_D517W)、484番目のアルギニンがリジンに置換され、且つ569番目のグリシンがリジンに置換された改変型酵素(R484K_G569K)、484番目のアルギニンがリジンに置換され、且つ571番目のグリシンがリジンに置換された改変型酵素(R484K_G571K)、484番目のアルギニンがリジンに置換され、且つ572番目のアルギニンがリジンに置換された改変型酵素(R484K_R572K)、484番目のアルギニンがリジンに置換され、且つ572番目のアルギニンがトリプトファンに置換された改変型酵素(R484K_R572W)、484番目のアルギニンがリジンに置換され、且つ573番目のトレオニンがリジンに置換された改変型酵素(R484K_T573K)、484番目のアルギニンがリジンに置換され、且つ573番目のトレオニンがトリプトファンに置換された改変型酵素(R484K_T573W)、484番目のアルギニンがリジンに置換され、且つ516番目のチロシンがリジンに置換された改変型酵素(R484K_Y516K)、484番目のアルギニンがトリプトファンに置換され、且つ515番目のアスパラギンがリジンに置換された改変型酵素(R484W_N515K)、485番目のグリシンがアスパラギン酸に置換され、且つ487番目のリジンがヒスチジンに置換された改変型酵素(G485D_K487H)、485番目のグリシンがリジンに置換され、且つ487番目のリジンがヒスチジンに置換された改変型酵素(G485K_K487H)、485番目のグリシンがリジンに置換され、且つ569番目のグリシンがリジンに置換された改変型酵素(G485K_G569K)、485番目のグリシンがリジンに置換され、且つ514番目のアスパラギンがリジンに置換された改変型酵素(G485K_N514K)、485番目のグリシンがリジンに置換され、且つ515番目のアスパラギンがリジンに置換された改変型酵素(G485K_N515K)、485番目のグリシンがリジンに置換され、且つ515番目のアスパラギンがトリプトファンに置換された改変型酵素(G485K_N515W)、485番目のグリシンがアルギニンに置換され、且つ487番目のリジンがアスパラギン酸に置換された改変型酵素(G485R_K487D)、485番目のグリシンがトリプトファンに置換され、且つ 513番目のグルタミン酸がトリプトファンに置換された改変型酵素(G485W_E513W)、485番目のグリシンがトリプトファンに置換され、且つ515番目のアスパラギンがリジンに置換された改変型酵素(G485W_N515K)、485番目のグリシンがトリプトファンに置換され、且つ515番目のアスパラギンがトリプトファンに置換された改変型酵素(G485W_N515W)、487番目のリジンがアラニンに置換され、且つ531番目のセリンがアラニンに置換された改変型酵素(K487A_S531A)、487番目のリジンがアラニンに置換され、且つ593番目のトリプトファンがフェニルアラニンに置換された改変型酵素(K487A_W593F)、487番目のリジンがアラニンに置換され、且つ615番目のチロシンがロイシンに置換された改変型酵素(K487A_Y615L)、487番目のリジンがトリプトファンに置換され、且つ514番目のアスパラギンがリジンに置換された改変型酵素(K487W_N514K)、487番目のリジンがトリプトファンに置換され、且つ514番目のアスパラギンがトリプトファンに置換された改変型酵素(K487W_N514W)、487番目のリジンがトリプトファンに置換され、且つ516番目のチロシンがトリプトファンに置換された改変型酵素(K487W_Y516W)、487番目のリジンがトリプトファンに置換され、且つ569番目のグリシンがリジンに置換された改変型酵素(K487W_G569K)、487番目のリジンがチロシンに置換され、且つ515番目のアスパラギンがフェニルアラニンに置換された改変型酵素(K487Y_N515F)、487番目のリジンがチロシンに置換され、且つ515番目のアスパラギンがトリプトファンに置換された改変型酵素(K487Y_N515W)、488番目のバリンがリジンに置換され、且つ515番目のアスパラギンがリジンに置換された改変型酵素(V488K_N515K)、488番目のバリンがリジンに置換され、且つ515番目のアスパラギンがトリプトファンに置換された改変型酵素(V488K_N515W)、488番目のバリンがトリプトファンに置換され、且つ515番目のアスパラギンがリジンに置換された改変型酵素(V488W_N515K)、488番目のバリンがトリプトファンに置換され、且つ515番目のアスパラギンがトリプトファンに置換された改変型酵素(V488W_N515W)、488番目のバリンがチロシンに置換され、且つ515番目のアスパラギンがトリプトファンに置換された改変型酵素(V488Y_N515W)、550番目のアスパラギンがセリンに置換され、且つ598番目のチロシンがアスパラギンに置換された改変型酵素(N550S_Y598N)、550番目のアスパラギンがセリンに置換され、且つ615番目のチロシンがグリシンに置換された改変型酵素(N550S_Y615G)、550番目のアスパラギンがセリンに置換され、且つ615番目のチロシンがロイシンに置換された改変型酵素(N550S_Y615L)、550番目のアスパラギンがセリンに置換され、且つ615番目のチロシンがプロリンに置換された改変型酵素(N550S_Y615P)(以上の改変型酵素は、上記の条件4「3糖以上の含有率が野生型酵素と同程度で4糖の含有率が野生型酵素より多い」を満足する)を挙げることができる。
(a)484番目のアルギニン(R484)〜487番目のリジン(K487)、又はこれに相当する領域の欠失
(b)514番目のアスパラギン(N514)と515番目のアスパラギン(N515)の間、又はこれに相当する位置にアミノ酸の挿入
(c)604番目のプロリン(P604)と605番目のチロシン(Y605)の間、又はこれに相当する位置にアミノ酸の挿入
(d)485番目のグリシン(G485)又はこれに相当するアミノ酸の欠失に加え、486番目のアスパラギン酸(D486)又はこれに相当するアミノ酸の他のアミノ酸への置換
(e)485番目のグリシン(G485)〜486番目のアスパラギン酸(D486)、又はこれに相当する領域の欠失に加え、487番目のリジン(K487)又はこれに相当するアミノ酸の他のアミノ酸への置換
(f)485番目のグリシン(G485)〜486番目のアスパラギン酸(D486)、又はこれに相当する領域の欠失に加え、484番目のアルギニン(R484)又はこれに相当するアミノ酸の他のアミノ酸への置換、及び487番目のリジン(K487)又はこれに相当するアミノ酸の他のアミノ酸への置換
(g)484番目のアルギニン(R484)と485番目のグリシン(G485)の間、又はこれに相当する位置にアミノ酸の挿入
(h)485番目のグリシン(G485)と486番目のアスパラギン酸(D486)の間、又はこれに相当する位置にアミノ酸の挿入
<表記方法>
「N514-F-F-N515」は、N514とN515の間にF(フェニルアラニン)を2個挿入した改変型酵素であることを表す。
「Δ484-487」は、484番目アミノ酸〜487番目アミノ酸を欠失させた改変型酵素であることを表す。
「Δ485-486_K487R」は、485番目アミノ酸〜486番目アミノ酸を欠失させるとともに、487番目アミノ酸をR(アルギニン)に置換した改変型酵素であることを表す。
(A)上記の条件3「3糖以上の含有率が野生型酵素と同程度で4糖の含有率が野生型酵素より少ない」を満足する改変型酵素
Δ484-487
N514-F-F-N515
N514-W-W-N515
P604-W-W-Y605
P604-A-A-A-A-Y605
P604-F-F-F-F-Y605
(B)上記の条件4「3糖以上の含有率が野生型酵素と同程度で4糖の含有率が野生型酵素より多い」を満足する改変型酵素
Δ485_D486H
Δ485-486_K487R
Δ485-486_R484W_K487W
Δ485-486_R484P_K487P
R484-A-A-G485
R484-F-F-G485
R484-K-K-G485
R484-P-P-G485
R484-R-R-G485
R484-S-S-G485
R484-W-W-G485
G485-S-S-S-D486
R484-A-A-A-A-G485
R484-D-D-D-D-G485
R484-F-F-F-F-G485
R484-P-P-P-P-G485
R484-R-R-R-R-G485
R484-S-S-S-S-G485
R484-W-W-W-W-G485
R484-A-A-A-A-A-A-A-A-G485
R484-D-D-D-D-D-D-D-D-G485
R484-F-F-F-F-F-F-F-F-G485
R484-K-K-K-K-K-K-K-K-G485
R484-P-P-P-P-P-P-P-P-G485
487番目のリジン(K487)の置換後のアミノ酸はグリシン又はプロリン。
514番目のアスパラギン(N514)の置換後のアミノ酸はトリプトファン。
515番目のアスパラギン(N515)の置換後のアミノ酸はリジン又はトリプトファン。
本発明の第2の局面は本発明の改変型酵素に関連する核酸を提供する。即ち、改変型酵素をコードする遺伝子、改変型酵素をコードする核酸を同定するためのプローブとして用いることができる核酸、改変型酵素をコードする核酸を増幅又は突然変異等させるためのプライマーとして用いることができる核酸が提供される。
本発明の改変型酵素は例えば酵素剤の形態で提供される。酵素剤は、有効成分(本発明の改変型酵素)の他、賦形剤、緩衝剤、懸濁剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩水などを含有していてもよい。賦形剤としてはデンプン、デキストリン、マルトース、トレハロース、乳糖、D-グルコース、ソルビトール、D-マンニトール、白糖、グリセロール等を用いることができる。緩衝剤としてはリン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩等を用いることができる。安定剤としてはプロピレングリコール、アスコルビン酸等を用いることができる。保存剤としてはフェノール、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルパラベン等を用いることができる。防腐剤としてはエタノール、塩化ベンザルコニウム、パラオキシ安息香酸、クロロブタノール等と用いることができる。
本発明の更なる局面は改変型酵素又は酵素剤の用途を提供する。用途の例は、ガラクトオリゴ糖の製造、乳糖不耐症患者のための医薬やサプリメントの製造・加工、乳製品(低乳糖牛乳等の加工乳、粉乳(脱脂粉乳、育児粉乳など)、ヨーグルトなど)の製造・加工、医療用食品(メディカルフード)の製造・加工である。
1.目的
バチルス・サーキュランス由来のβ−ガラクトシダーゼは工業的なガラクトオリゴ糖製造において重要な酵素であるが、それを使用して製造したガラクトオリゴ糖は均一性が高く、製造条件等を調整したとしても、製造されるガラクトオリゴ糖の組成(プロファイル)を変化させることは困難である。従来、当該酵素の立体構造情報を取得することは困難であり、その機能に関わるアミノ酸の特定は容易ではなかった。そこで、ガラクトオリゴ糖の製造に有用な改変型酵素を創出することを目指し、コンピュータシミュレーションを活用することで有効な変異位置の特定を試みた。
(1)立体構造予測と変異体(改変型β−ガラクトシダーゼ)の設計
(1−1)1次配列からの立体構造予測と変異点の設計
バチルス・サーキュランス由来のβ−ガラクトシダーゼはラクトースの加水分解及びにガラクトシル基転移反応(ガラクトオリゴ糖の製造)を行う。これまでの研究から、バチルス・サーキュランスが生産するβ−ガラクトシダーゼは分子量の異なる4種類の酵素、即ち、分子量195kDのβ−ガラクトシダーゼ(BgaD-A、配列番号1)、分子量160kDのβ−ガラクトシダーゼ(BgaD-B、配列番号2)、分子量135kDのβ−ガラクトシダーゼ(BgaD-C、配列番号3)、及び分子量86kDのβ−ガラクトシダーゼ(BgaD-D、配列番号4)で構成されていることが知られている(特許文献1、非特許文献1)。この中で、分子量が最小のBgaD-Dは、酵素活性がある最小サイズのβ−ガラクトシダーゼであり、最も糖転移活性が高い。
変異導入点のアミノ酸をランダムに置換することにした。実際の変異導入は、BgaD-D型のDNAをコードするプラスミドをテンプレートにしたPCRで行った。1ヶ所の変異導入点に対して8〜19種類の置換アミノ酸をデザインし、実際に変異導入を行った。各変異に対応するプライマーを設計し、KOD plus Mutagenesis kit (Toyobo社)を用いてinverse PCR法で変異導入を行った。製品のプロトコールに従って、PCR産物をセルフライゲーション後に大腸菌DH5alphaに形質転換した。ミニプレップでプラスミドを得た後にシークエンスし、変異を確認した。さらに、大腸菌BL21に形質転換して、以下のプロトコールでタンパク質(変異体)を発現させた(図2)。
<プロトコール>
1. 1.5 mL LB+ampで前培養(37℃、一晩)
2. 0.06 mL 前培養後の培養液を3 mL LB+ampに加える
3. 37℃、4時間培養
4. 試験管を氷上に移して、0.75μL 1M IPTGを加える
5. 15℃、24時間培養
6. 集菌してリン酸バッファー(pH7.4)で洗浄
7. 0.25 mL リン酸バッファー(pH7.4)に懸濁
8. ソニケーターで超音波破砕(30秒×3回)
9. 遠心で上清を回収
結合用バッファー(20 mM リン酸ナトリウム, 0.2 M NaCl, 20 mM イミダゾール, pH 7.4)
溶出用バッファー(10 mM リン酸ナトリウム, 0.1 M NaCl, 0.25 M イミダゾール, pH 7.4)
加水分解測定法は過去の文献(特許文献1)を参考にして行った。基質としてο-Nitrophenyl-β-D- galactopyranoside(ONPG)、乳糖、アロラクトースの3種類を使い、以下に示す方法でそれぞれの活性を測定した。
(a)LSU活性:ONPG法
ラクターゼがONPG(終濃度20 mM)にpH 6.0、40℃で作用するとき、反応初期の1分間に1μmolのONPを生成する酵素量を1 LSUとする。
(b)LU活性:乳糖分解力法
ラクターゼが乳糖(終濃度10%)にpH 6.0、40℃で作用するとき、反応初期の1分間に1μmolのグルコースを生成する酵素量を1 LUとする。
(c)アロラクトース分解活性:アロラクトース分解力法
ラクターゼがアロラクトース(終濃度1%)にpH 6.0、40℃で作用するとき、反応初期の1分間に1μmolのグルコースを生成する酵素量を1 Uとする。
(d)1%ラクトース分解活性:乳糖分解力法
ラクターゼが乳糖(終濃度1%)にpH 6.0、40℃で作用するとき、反応初期の1分間に1μmolのグルコースを生成する酵素量を1 Uとする。
ガラクトオリゴ糖(GOS)合成活性の評価は高濃度乳糖液を基質にしたオリゴ糖合成反応を行い、反応性生物をHPLCにより分析した。これまでの研究から、乳糖を基質にした場合は最終濃度50%程度、pH6付近で酵素反応を行うことで、高収率なGOS合成が行えると報告されている(特開平11−18763号公報)。この報告に記載の方法(実施例2の方法)に準じてGOS合成を行った。生成したGOSの組成を以下のカラムを用いて分析した。
ゲルろ過カラム:MCIGEL CK04S(三菱化成)
アミドカラム:NH2P-40 3E(昭和電工)
全変異体と野生型の組み換え発現酵素に関して、LSU活性、LU活性、アロラクトース分解活性及び1%ラクトース分解活性を測定した。最初に、LSU活性とLU活性から、酵素活性が消失した変異体を除外した。一方、ラクトースの分解活性に応じてアロラクトースの分解活性も変化することから、「アロラクトース分解活性÷1%ラクトース分解活性」の値を用いてアロラクトースに対する相対的基質特異性を評価し、野生型と比較した。
条件1:アロラクトース分解活性が50%以下、即ち「アロラクトース分解活性÷1%ラクトース分解活性」が野生型酵素の1/2以下。
条件2:アロラクトース分解活性が150%以上、即ち「アロラクトース分解活性÷1%ラクトース分解活性」が野生型酵素の3/2以上。
449番目のチロシン(Y449):変異後のアミノ酸(D, E, N, W)
531番目のセリン(S531):変異後のアミノ酸(A, D, E, F, G, I, M, N, Q)
593番目のトリプトファン(W593):変異後のアミノ酸(F)
602番目のプロリン(P602):変異後のアミノ酸(E, G)
604番目のプロリン(P604):変異後のアミノ酸(A, G, H, I, M, S, T, V, W, Y)
612番目のリジン(K612):変異後のアミノ酸(M)
187番目のチロシン(Y187):変異後のアミノ酸(D, E, G)
188番目のセリン(S188):変異後のアミノ酸(P, T)
533番目のセリン(S533):変異後のアミノ酸(M, Q)
602番目のプロリン(P602):変異後のアミノ酸(C, I, N, S, T, V)
612番目のリジン(K612):変異後のアミノ酸(F)
全変異体と野生型の組み換え発現酵素に関して変異点の評価を行った。以下の条件を満足する変異体をGOS組成が変化したものとして選択した。まず、生成したGOSの組成を分析して、その成分の4糖オリゴ糖の含有率、3糖以上のオリゴ糖の含有率に注目した。実際に測定した結果、野生型酵素では4糖の含有率が10.8%、3糖以上のオリゴ糖の含有率が40.0%となった。そこで、3糖の含有率が野生型に近い値であるが(即ち、オリゴ糖の合成量が野生型と同等)、4糖の含有率に変化がある変異点を選抜した。即ち、以下の条件を満足する変異点を選択した。
条件3:3糖以上の含有率が野生型酵素と同程度で4糖の含有率が野生型酵素より少ない。
条件4:3糖以上の含有率が野生型酵素と同程度で4糖の含有率が野生型酵素より多い。
182番目のプロリン(P182):変異後のアミノ酸(L)
187番目のチロシン(Y187):変異後のアミノ酸(D, L)
188番目のセリン(S188):変異後のアミノ酸(I)
405番目のトリプトファン(W405):変異後のアミノ酸(A, D, E, G, H, L, N, S, T)
407番目のグルタミン(Q407):変異後のアミノ酸(G, R)
449番目のチロシン(Y449):変異後のアミノ酸(E, I, Q, R, S)
483番目のトレオニン(T483):変異後のアミノ酸(Q)
512番目のセリン(S512):変異後のアミノ酸(F, T, V)
531番目のセリン(S531):変異後のアミノ酸(P)
550番目のアスパラギン(N550):変異後のアミノ酸(L, R, S)
602番目のプロリン(P602):変異後のアミノ酸(L, N, Q)
604番目のプロリン(P604):変異後のアミノ酸(I, M)
483番目のトレオニン(T483):変異後のアミノ酸(K, M, R)
512番目のセリン(S512):変異後のアミノ酸(G, K)
551番目のグルタミン(Q551):変異後のアミノ酸(N)
598番目のチロシン(Y598):変異後のアミノ酸(N)
615番目のチロシン(Y615):変異後のアミノ酸(T)
条件5:3糖以上の含有率が野生型酵素と同程度でアロラクトース含有率が野生型酵素より少ない。
条件6:3糖以上の含有率が野生型酵素と同程度でアロラクトース含有率が野生型酵素より多い。
405番目のトリプトファン(W405):変異後のアミノ酸(A, D, S, T)
483番目のトレオニン(T483):変異後のアミノ酸(M)
531番目のセリン(S531):変異後のアミノ酸(D, F, G, L, K, M)
550番目のアスパラギン(N550):変異後のアミノ酸(F)
598番目のチロシン(Y598):変異後のアミノ酸(F, H)
182番目のプロリン(P182):変異後のアミノ酸(L, S)
187番目のチロシン(Y187):変異後のアミノ酸(D, E, N)
188番目のセリン(S188):変異後のアミノ酸(E, G, I, N)
405番目のトリプトファン(W405):変異後のアミノ酸(H)
406番目のアラニン(A406):変異後のアミノ酸(P)
407番目のグルタミン(Q407):変異後のアミノ酸(A, F, G, K, R)
449番目のチロシン(Y449):変異後のアミノ酸(E, R)
483番目のトレオニン(T483):変異後のアミノ酸(S, Q)
512番目のセリン(S512):変異後のアミノ酸(G, T, V)
534番目のセリン(S534):変異後のアミノ酸(K, Q)
550番目のアスパラギン(N550):変異後のアミノ酸(A, G, K, L, M, R, S)
551番目のグルタミン(Q551):変異後のアミノ酸(K, H)
602番目のプロリン(P602):変異後のアミノ酸(C, D, N)
609番目のチロシン(Y609):変異後のアミノ酸(D, Q, T)
612番目のリジン(K612):変異後のアミノ酸(F, I)
615番目のチロシン(Y615):変異後のアミノ酸(E, I, T)
(1−1)で示した方法では、活性中心のループ構造に変異を加えるというデザインを行った。ところで、BgaD-A型については、GOS合成に関わるアミノ酸が過去に報告されている。特に、1540番目のトリプトファン(W1540)は、アラニンまたはフェニルアラニンに置換することでオリゴ糖合成の最大収量が多くなると報告されている(非特許文献1)。この報告に注目し、これまでに検討した活性中心付近のアミノ酸だけでなく、BgaD-A型にのみ存在するアミノ酸に変異を加えることによっても、生成するGOSの組成を変化できるのではないかと考えた。そこで、実際に、1540番目のトリプトファン(W1540)を19種類のアミノ酸に置換する飽和変異導入を実施することにした。具体的には、BgaD-A型のDNA(配列番号5)をコードするプラスミドをテンプレートにして、(1−2)と同様な手法で、W1540をすべてのアミノ酸に置換した。また、プラスミドを大腸菌に導入し変異酵素を発現させた。さらに、(1−4)と同様な方法でGOS合成反応を行い、生成したGOSの組成中の4糖オリゴ糖の含有率、3糖以上のオリゴ糖の含有率を解析した。
1540番目のトリプトファン(W1540):変異後のアミノ酸(A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V)
(1)変異体では、β-1,6結合を有する糖類に対する加水分解活性の低下又は向上が見られた(9ヶ所のアミノ酸;42変異体)
(2)変異体で生産したガラクトオリゴ糖は、生成物の重合度や分岐鎖の割合が変化していた(4糖が変化した変異点:15ヶ所のアミノ酸;41変異体。分岐鎖が変化した変異点:19ヶ所のアミノ酸;49変異体)。
(3)野生型では組成が一様なオリゴ糖の製造しかできなかったが、変異体を利用すれば様々な種類のガラクトオリゴ糖を作り分けられるようになる。変異体は、例えば、母乳成分の再現などに利用可能である。
(4)上記検討によって有効性を認めた変異点を組み合わせることで、有用性の一層高い変異体の構築が可能であると考えられる。
検討を進めた結果、有効な変異位置が更に特定され、有用な変異体が取得された。以下、取得に成功した変異体(改変型酵素)とその特徴を示す。尚、(A)、(B)、(D)〜(N)はBgaD-D型のβ−ガラクトシダーゼ(配列番号4)の変異体であり、(C)はBgaD-A型のβ−ガラクトシダーゼ(配列番号1)の変異体である。
85番目のトリプトファン(W85)がグリシンに置換
91番目のフェニルアラニン(F91)がアラニン又はイソロイシンに置換
103番目のチロシン(Y103)がグリシンに置換
134番目のチロシン(Y134)がグリシンに置換
153番目のチロシン(Y153)がグリシンに置換
182番目のプロリン(P182)がトリプトファン又はチロシンに置換
186番目のトリプトファン(W186)がメチオニンに置換
192番目のチロシン(Y192)がグリシンに置換
295番目のチロシン(Y295)がグリシンに置換
345番目のヒスチジン(H345)がグリシンに置換
349番目のグリシン(G349)がトリプトファンに置換
402番目のフェニルアラニン(F402)がグリシンに置換
407番目のグルタミン(Q407)がイソロイシン、ロイシン、メチオニン、バリン又はチロシンに置換
479番目のグリシン(G479)がロイシン、プロリン又はグルタミンに置換
480番目のグルタミン酸(E480)がアスパラギンに置換
482番目のリジン(K482)がメチオニン又はバリンに置換
483番目のトレオニン(T483)がグリシン又はセリンに置換
484番目のアルギニン(R484)がフェニルアラニン、イソロイシン、メチオニン、アスパラギン又はグルタミンに置換
485番目のグリシン(G485)がアスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン又はトレオニンに置換
486番目のアスパラギン酸(D486)がアラニン、グルタミン酸、フェニルアラニン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、プロリン、グルタミン、アルギニン、トレオニン、トリプトファン又はチロシンに置換
487番目のリジン(K487)がシステイン、グルタミン酸、フェニルアラニン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、アスパラギン、グルタミン、アルギニン、トレオニン、バリン、トリプトファン又はチロシンに置換
488番目のバリン(V488)がグリシン、イソロイシン、ロイシン、アルギニン、セリン、トレオニン、トリプトファン又はチロシンに置換
496番目のチロシン(Y496)がグリシンに置換
512番目のセリン(S512)がシステイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、プロリン、グルタミン又はトリプトファンに置換
513番目のグルタミン酸(E513)がアラニン、システイン、アスパラギン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、リジン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、トレオニン又はバリンに置換
514番目のアスパラギン(N514)がグルタミン酸、ロイシン又はリジンに置換
515番目のアスパラギン(N515)がアラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、イソロイシン、ロイシン、プロリン又はバリンに置換
516番目のチロシン(Y516)がトリプトファンに置換
517番目のアスパラギン酸(D517)がリジン又はトリプトファンに置換
519番目のチロシン(Y519)がグリシンに置換
533番目のトレオニン(T533)がグルタミン酸に置換
547番目のチロシン(Y547)がグリシンに置換
549番目のチロシン(Y549)がグリシンに置換
555番目のチロシン(Y555)がグリシンに置換
572番目のアルギニン(R572)がシステイン、ロイシン、メチオニン、トレオニン、トリプトファン又はチロシンに置換
573番目のトレオニン(T573)がグルタミン酸に置換
598番目のチロシン(Y598)がヒスチジン又はアスパラギンに置換
605番目のチロシン(Y605)がシステイン、アスパラギン酸、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、プロリン、アルギニン又はトレオニンに置換
606番目のチロシン(Y606)がアラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン又はセリンに置換
609番目のチロシン(Y609)がグルタミン酸、アスパラギン又はセリンに置換
616番目のフェニルアラニン(F616)がグリシンに置換
624番目のフェニルアラニン(F624)がグリシンに置換
648番目のトリプトファン(W648)がグリシンに置換
650番目のトリプトファン(W650)がグリシンに置換
76番目のトリプトファン(W76)がグリシンに置換
480番目のグルタミン酸(E480)がグルタミンに置換
483番目のトレオニン(T483)がトリプトファンに置換
485番目のグリシン(G485)がプロリン又はトレオニンに置換
484番目のアルギニン(R484)がアラニン、システイン、アスパラギン酸、グリシン、プロリン、セリン、チロシン又はリジンに置換
487番目のリジン(K487)がグリシン又はプロリンに置換
488番目のバリン(V488)がプロリンに置換
512番目のセリン(S512)がロイシン又はメチオニンに置換
514番目のアスパラギン(N514)がアスパラギン酸に置換
515番目のアスパラギン(N515)がフェニルアラニン、アルギニン、トリプトファン、チロシン又はリジンに置換
569番目のグリシン(G569)がリジン、プロリン又はバリンに置換
596番目のフェニルアラニン(F596)がグリシンに置換
487番目のリジン(K487)がグリシン又はプロリンに置換
514番目のアスパラギン(N514)がトリプトファンに置換
515番目のアスパラギン(N515)がリジン又はトリプトファンに置換
188番目のセリンがイソロイシンに置換され、且つ550番目のアスパラギンがフェニルアラニンに置換(S188I_N550F)、
407番目のグルタミンがアルギニンに置換され、且つ550番目のアスパラギンがフェニルアラニンに置換(Q407R_N550F)、
449番目のチロシンがグルタミンに置換され、且つ598番目のチロシンがヒスチジンに置換(Y449Q_Y598H)、
550番目のアスパラギンがフェニルアラニンに置換され、且つ602番目のプロリンがグルタミンに置換(N550F_P602Q)
407番目のグルタミンがアルギニンに置換され、且つ449番目のチロシンがグルタミン酸に置換(Q407R_Y449E)
550番目のアスパラギンがフェニルアラニンに置換され、且つ598番目のチロシンがアスパラギンに置換(N550F_Y598N)
182番目のプロリンがロイシンに置換され、且つ449番目のチロシンがグルタミン酸に置換(P182L_Y449E)
182番目のプロリンがロイシンに置換され、且つ449番目のチロシンがグルタミンに置換(P182L_Y449Q)
187番目のチロシンがロイシンに置換され、且つ407番目のグルタミンがアルギニンに置換(Y187L_Q407R)
187番目のチロシンがロイシンに置換され、且つ449番目のチロシンがグルタミン酸に置換(Y187L_Y449E)
187番目のチロシンがロイシンに置換され、且つ449番目のチロシンがグルタミンに置換(Y187L_Y449Q)
187番目のチロシンがロイシンに置換され、且つ512番目のセリンがシステインに置換(Y187L_S512C)
187番目のチロシンがロイシンに置換され、且つ512番目のセリンがアスパラギンに置換(Y187L_S512N)
187番目のチロシンがロイシンに置換され、且つ512番目のセリンがトレオニンに置換(Y187L_S512T)
188番目のセリンがイソロイシンに置換され、且つ407番目のグルタミンがアルギニンに置換(S188I_Q407R)
188番目のセリンがイソロイシンに置換され、且つ449番目のチロシンがグルタミンに置換(S188I_Y449Q)
188番目のセリンがイソロイシンに置換され、且つ483番目のトレオニンがグルタミン酸に置換(S188I_T483E)
407番目のグルタミンがロイシンに置換され、且つ512番目のセリンがバリンに置換(Q407L_S512V)
407番目のグルタミンがアルギニンに置換され、且つ483番目のトレオニンがグリシンに置換(Q407R_T483G)
407番目のグルタミンがアルギニンに置換され、且つ449番目のチロシンがグルタミンに置換(Q407R_Y449Q)
407番目のグルタミンがアルギニンに置換され、且つ550番目のアスパラギンがセリンに置換(Q407R_N550S)
449番目のチロシンがグルタミンに置換され、且つ550番目のアスパラギンがセリンに置換(Y449Q_N550S)
487番目のリジンがトリプトファンに置換され、且つ512番目のセリンがトレオニンに置換(K487W_S512T)
487番目のリジンがトリプトファンに置換され、且つ517番目のアスパラギン酸がリジンに置換(K487W_D517K)
487番目のリジンがトリプトファンに置換され、且つ515番目のアスパラギンがグリシンに置換(K487W_N515G)
487番目のリジンがトリプトファンに置換され、且つ517番目のアスパラギン酸がトリプトファンに置換(K487W_D517W)
487番目のリジンがプロリンに置換され、且つ515番目のアスパラギンがアルギニンに置換(K487P_N515R)
91番目のフェニルアラニンがセリンに置換され、且つ407番目のグルタミンがメチオニンに置換(F91S_Q407M)
180番目のトレオニンがバリンに置換され、且つ187番目のチロシンがロイシンに置換(T180V_Y187L)
180番目のトレオニンがバリンに置換され、且つ188番目のセリンがイソロイシンに置換(T180V_S188I)
180番目のトレオニンがバリンに置換され、且つ407番目のグルタミンがアルギニンに置換(T180V_Q407R)
180番目のトレオニンがバリンに置換され、且つ449番目のチロシンがグルタミン酸に置換(T180V_Y449E)
180番目のトレオニンがバリンに置換され、且つ483番目のトレオニンがグリシンに置換(T180V_T483G)
180番目のトレオニンがバリンに置換され、且つ512番目のセリンがバリンに置換(T180V_S512V)
180番目のトレオニンがバリンに置換され、且つ550番目のアスパラギンがフェニルアラニンに置換(T180V_N550F)
180番目のトレオニンがバリンに置換され、且つ615番目のチロシンがプロリンに置換(T180V_Y615P)
182番目のプロリンがロイシンに置換され、且つ376番目のアルギニンがプロリンに置換(P182L_R376P)
182番目のプロリンがトリプトファンに置換され、且つ449番目のチロシンがグルタミンに置換(P182W_Y449Q)
187番目のチロシンがロイシンに置換され、且つ487番目のリジンがアラニンに置換(Y187L_K487A)
187番目のチロシンがロイシンに置換され、且つ512番目のセリンがアラニンに置換(Y187L_S512A)
187番目のチロシンがロイシンに置換され、且つ533番目のトレオニンがアスパラギンに置換(Y187L_T533N)
376番目のアルギニンがプロリンに置換され、且つ407番目のグルタミンがロイシンに置換(R376P_Q407L)
376番目のアルギニンがプロリンに置換され、且つ449番目のチロシンがグルタミンに置換(R376P_Y449Q)
376番目のアルギニンがプロリンに置換され、且つ512番目のセリンがバリンに置換(R376P_S512V)
376番目のアルギニンがプロリンに置換され、且つ550番目のアスパラギンがトリプトファンに置換(R376P_N550W)
376番目のアルギニンがプロリンに置換され、且つ550番目のアスパラギンがチロシンに置換(R376P_N550Y)
407番目のグルタミンがロイシンに置換され、且つ533番目のトレオニンがグルタミン酸に置換(Q407L_T533E)
407番目のグルタミンがロイシンに置換され、且つ570番目のトリプトファンがチロシンに置換(Q407L_W570Y)
407番目のグルタミンがロイシンに置換され、且つ615番目のチロシンがロイシンに置換(Q407L_Y615L)
407番目のグルタミンがアルギニンに置換され、且つ615番目のチロシンがロイシンに置換(Q407R_Y615L)
407番目のグルタミンがアルギニンに置換され、且つ615番目のチロシンがプロリンに置換(Q407R_Y615P)
449番目のチロシンがアスパラギン酸に置換され、且つ598番目のチロシンがフェニルアラニンに置換(Y449D_Y598F)
449番目のチロシンがグルタミンに置換され、且つ533番目のトレオニンがグルタミン酸に置換(Y449Q_T533E)
449番目のチロシンがグルタミンに置換され、且つ615番目のチロシンがグリシンに置換(Y449Q_Y615G)
449番目のチロシンがグルタミンに置換され、且つ615番目のチロシンがプロリンに置換(Y449Q_Y615P)
483番目のトレオニンがグリシンに置換され、且つ512番目のセリンがバリンに置換(T483G_S512V)
483番目のトレオニンがグリシンに置換され、且つ550番目のアスパラギンがセリンに置換(T483G_N550S)
483番目のトレオニンがグリシンに置換され、且つ615番目のチロシンがロイシンに置換(T483G_Y615L)
483番目のトレオニンがグルタミンに置換され、且つ602番目のプロリンがグルタミンに置換(T483Q_P602Q)
484番目のアルギニンがヒスチジンに置換され、且つ487番目のリジンがヒスチジンに置換(R484H_K487H)
484番目のアルギニンがトリプトファンに置換され、且つ487番目のリジンがアスパラギン酸に置換(R484W_K487D)
484番目のアルギニンがトリプトファンに置換され、且つ575番目のトレオニンがトリプトファンに置換(R484W_T575W)
485番目のグリシンがリジンに置換され、且つ488番目のバリンがトリプトファンに置換(G485K_V488W)
485番目のグリシンがリジンに置換され、且つ516番目のチロシンがトリプトファンに置換(G485K_Y516W)
485番目のグリシンがリジンに置換され、且つ 517番目のアスパラギン酸がリジンに置換(G485K_D517K)
485番目のグリシンがリジンに置換され、且つ 517番目のアスパラギン酸がトリプトファンに置換(G485K_D517W)
485番目のグリシンがリジンに置換され、且つ569番目のグリシンがトリプトファンに置換(G485K_G569W)
485番目のグリシンがリジンに置換され、且つ571番目のグリシンがリジンに置換(G485K_G571K)
485番目のグリシンがリジンに置換され、且つ572番目のアルギニンがトリプトファンに置換(G485K_R572W)
485番目のグリシンがリジンに置換され、且つ573番目のトレオニンがトリプトファンに置換(G485K_T573W)
485番目のグリシンがトリプトファンに置換され、且つ516番目のチロシンがトリプトファンに置換(G485W_Y516W)
485番目のグリシンがトリプトファンに置換され、且つ 517番目のアスパラギン酸がトリプトファンに置換(G485W_D517W)
485番目のグリシンがトリプトファンに置換され、且つ573番目のトレオニンがリジンに置換(G485W_T573K)
485番目のグリシンがトリプトファンに置換され、且つ573番目のトレオニンがトリプトファンに置換(G485W_T573W)
487番目のリジンがアラニンに置換され、且つ512番目のセリンがバリンに置換(K487A_S512V)
487番目のリジンがグリシンに置換され、且つ515番目のアスパラギンがグルタミンに置換(K487G_N515Q)
487番目のリジンがトリプトファンに置換され、且つ573番目のトレオニンがリジンに置換(K487W_T573K)
487番目のリジンがトリプトファンに置換され、且つ593番目のトリプトファンがフェニルアラニンに置換(K487W_W593F)
488番目のバリンがリジンに置換され、且つ514番目のアスパラギンがリジンに置換(V488K_N514K)
488番目のバリンがリジンに置換され、且つ 517番目のアスパラギン酸がリジンに置換(V488K_D517K)
488番目のバリンがリジンに置換され、且つ569番目のグリシンがリジンに置換(V488K_G569K)
488番目のバリンがリジンに置換され、且つ569番目のグリシンがトリプトファンに置換(V488K_G569W)
488番目のバリンがリジンに置換され、且つ572番目のアルギニンがリジンに置換(V488K_R572K)
488番目のバリンがリジンに置換され、且つ573番目のトレオニンがリジンに置換(V488K_T573K)
488番目のバリンがリジンに置換され、且つ573番目のトレオニンがトリプトファンに置換(V488K_T573W)
488番目のバリンがリジンに置換され、且つ516番目のチロシンがリジンに置換(V488K_Y516K)
488番目のバリンがリジンに置換され、且つ516番目のチロシンがトリプトファンに置換(V488K_Y516W)
488番目のバリンがトリプトファンに置換され、且つ514番目のアスパラギンがトリプトファンに置換(V488W_N514W)
488番目のバリンがトリプトファンに置換され、且つ573番目のトレオニンがトリプトファンに置換(V488W_T573W)
500番目のグルタミン酸がアラニンに置換され、且つ501番目のイソロイシンがアラニンに置換(E500A_I501A)
512番目のセリンがバリンに置換され、且つ550番目のアスパラギンがセリンに置換(S512V_N550S)
533番目のトレオニンがグルタミン酸に置換され、且つ550番目のアスパラギンがセリンに置換(T533E_N550S)
533番目のトレオニンがグルタミン酸に置換され、且つ615番目のチロシンがグリシンに置換(T533E_Y615G)
570番目のトリプトファンがチロシンに置換され、且つ615番目のチロシンがロイシンに置換(W570Y_Y615L)
91番目のフェニルアラニンがバリンに置換され、且つ 513番目のグルタミン酸がグリシンに置換(F91V_E513G)
180番目のトレオニンがバリンに置換され、且つ483番目のトレオニンがリジンに置換(T180V_T483K)
180番目のトレオニンがバリンに置換され、且つ598番目のチロシンがアスパラギンに置換(T180V_Y598N)
180番目のトレオニンがバリンに置換され、且つ615番目のチロシンがグリシンに置換(T180V_Y615G)
182番目のプロリンがロイシンに置換され、且つ615番目のチロシンがロイシンに置換(P182L_Y615L)
376番目のアルギニンがプロリンに置換され、且つ598番目のチロシンがアスパラギンに置換(R376P_Y598N)
407番目のグルタミンがロイシンに置換され、且つ483番目のトレオニンがリジンに置換(Q407L_T483K)
407番目のグルタミンがロイシンに置換され、且つ487番目のリジンがプロリンに置換(Q407L_K487P)
407番目のグルタミンがロイシンに置換され、且つ615番目のチロシンがグリシンに置換(Q407L_Y615G)
449番目のチロシンがグルタミン酸に置換され、且つ487番目のリジンがアラニンに置換(Y449E_K487A)
449番目のチロシンがグルタミン酸に置換され、且つ487番目のリジンがプロリンに置換(Y449E_K487P)
483番目のトレオニンがグリシンに置換され、且つ487番目のリジンがアラニンに置換(T483G_K487A)
483番目のトレオニンがグリシンに置換され、且つ533番目のトレオニンがグルタミン酸に置換(T483G_T533E)
483番目のトレオニンがグリシンに置換され、且つ615番目のチロシンがグリシンに置換(T483G_Y615G)
483番目のトレオニンがメチオニンに置換され、且つ487番目のリジンがアラニンに置換(T483M_K487A)
483番目のトレオニンがメチオニンに置換され、且つ487番目のリジンがグリシンに置換(T483M_K487G)
483番目のトレオニンがメチオニンに置換され、且つ487番目のリジンがプロリンに置換(T483M_K487P)
484番目のアルギニンがヒスチジンに置換され、且つ487番目のリジンがアスパラギン酸に置換(R484H_K487D)
484番目のアルギニンがリジンに置換され、且つ 513番目のグルタミン酸がトリプトファンに置換(R484K_E513W)
484番目のアルギニンがリジンに置換され、且つ514番目のアスパラギンがリジンに置換(R484K_N514K)
484番目のアルギニンがリジンに置換され、且つ514番目のアスパラギンがトリプトファンに置換(R484K_N514W)
484番目のアルギニンがリジンに置換され、且つ515番目のアスパラギンがリジンに置換(R484K_N515K)
484番目のアルギニンがリジンに置換され、且つ515番目のアスパラギンがトリプトファンに置換(R484K_N515W)
484番目のアルギニンがリジンに置換され、且つ 517番目のアスパラギン酸がトリプトファンに置換(R484K_D517W)
484番目のアルギニンがリジンに置換され、且つ569番目のグリシンがリジンに置換(R484K_G569K)
484番目のアルギニンがリジンに置換され、且つ571番目のグリシンがリジンに置換(R484K_G571K)
484番目のアルギニンがリジンに置換され、且つ572番目のアルギニンがリジンに置換(R484K_R572K)
484番目のアルギニンがリジンに置換され、且つ572番目のアルギニンがトリプトファンに置換(R484K_R572W)
484番目のアルギニンがリジンに置換され、且つ573番目のトレオニンがリジンに置換(R484K_T573K)
484番目のアルギニンがリジンに置換され、且つ573番目のトレオニンがトリプトファンに置換(R484K_T573W)
484番目のアルギニンがリジンに置換され、且つ516番目のチロシンがリジンに置換(R484K_Y516K)
484番目のアルギニンがトリプトファンに置換され、且つ515番目のアスパラギンがリジンに置換(R484W_N515K)
485番目のグリシンがアスパラギン酸に置換され、且つ487番目のリジンがヒスチジンに置換(G485D_K487H)
485番目のグリシンがリジンに置換され、且つ487番目のリジンがヒスチジンに置換(G485K_K487H)
485番目のグリシンがリジンに置換され、且つ569番目のグリシンがリジンに置換(G485K_G569K)
485番目のグリシンがリジンに置換され、且つ514番目のアスパラギンがリジンに置換(G485K_N514K)
485番目のグリシンがリジンに置換され、且つ515番目のアスパラギンがリジンに置換(G485K_N515K)
485番目のグリシンがリジンに置換され、且つ515番目のアスパラギンがトリプトファンに置換(G485K_N515W)
485番目のグリシンがアルギニンに置換され、且つ487番目のリジンがアスパラギン酸に置換(G485R_K487D)
485番目のグリシンがトリプトファンに置換され、且つ 513番目のグルタミン酸がトリプトファンに置換(G485W_E513W)
485番目のグリシンがトリプトファンに置換され、且つ515番目のアスパラギンがリジンに置換(G485W_N515K)
485番目のグリシンがトリプトファンに置換され、且つ515番目のアスパラギンがトリプトファンに置換(G485W_N515W)
487番目のリジンがアラニンに置換され、且つ531番目のセリンがアラニンに置換(K487A_S531A)
487番目のリジンがアラニンに置換され、且つ593番目のトリプトファンがフェニルアラニンに置換(K487A_W593F)
487番目のリジンがアラニンに置換され、且つ615番目のチロシンがロイシンに置換(K487A_Y615L)
487番目のリジンがトリプトファンに置換され、且つ514番目のアスパラギンがリジンに置換(K487W_N514K)
487番目のリジンがトリプトファンに置換され、且つ514番目のアスパラギンがトリプトファンに置換(K487W_N514W)
487番目のリジンがトリプトファンに置換され、且つ516番目のチロシンがトリプトファンに置換(K487W_Y516W)
487番目のリジンがトリプトファンに置換され、且つ569番目のグリシンがリジンに置換(K487W_G569K)
487番目のリジンがチロシンに置換され、且つ515番目のアスパラギンがフェニルアラニンに置換(K487Y_N515F)
487番目のリジンがチロシンに置換され、且つ515番目のアスパラギンがトリプトファンに置換(K487Y_N515W)
488番目のバリンがリジンに置換され、且つ515番目のアスパラギンがリジンに置換(V488K_N515K)
488番目のバリンがリジンに置換され、且つ515番目のアスパラギンがトリプトファンに置換(V488K_N515W)
488番目のバリンがトリプトファンに置換され、且つ515番目のアスパラギンがリジンに置換(V488W_N515K)
488番目のバリンがトリプトファンに置換され、且つ515番目のアスパラギンがトリプトファンに置換(V488W_N515W)
488番目のバリンがチロシンに置換され、且つ515番目のアスパラギンがトリプトファンに置換(V488Y_N515W)
550番目のアスパラギンがセリンに置換され、且つ598番目のチロシンがアスパラギンに置換(N550S_Y598N)
550番目のアスパラギンがセリンに置換され、且つ615番目のチロシンがグリシンに置換(N550S_Y615G)
550番目のアスパラギンがセリンに置換され、且つ615番目のチロシンがロイシンに置換(N550S_Y615L)
550番目のアスパラギンがセリンに置換され、且つ615番目のチロシンがプロリンに置換(N550S_Y615P)
484番目のアルギニンがアラニンに置換され、485番目のグリシンがアラニンに置換され、且つ487番目のリジンがアスパラギン酸に置換(R484A_G485A_K487D)
484番目のアルギニンがアスパラギン酸に置換され、485番目のグリシンがアスパラギン酸に置換され、且つ487番目のリジンがアスパラギン酸に置換(R484D_G485D_K487D)
485番目のグリシンがアルギニンに置換され、486番目のアスパラギン酸がアルギニンに置換され、且つ487番目のリジンがリジンアルギニンに置換(G485R_D486R_K487R)
484番目のアルギニンがアラニンに置換され、485番目のグリシンがアラニンに置換され、486番目のアスパラギン酸がアラニンに置換され、且つ487番目のリジンがアラニンに置換(R484A_G485A_D486A_K487A)
484番目のアルギニンがアラニンに置換され、485番目のグリシンがアラニンに置換され、486番目のアスパラギン酸がプロリンに置換され、且つ487番目のリジンがプロリンに置換(R484A_G485A_D486P_K487P)
484番目のアルギニンがアラニンに置換され、485番目のグリシンがアラニンに置換され、且つ487番目のリジンがアスパラギン酸に置換(R484A_G485A_K487D)
484番目のアルギニンがシステインに置換され、486番目のアスパラギン酸がヒスチジンに置換され、且つ487番目のリジンがアルギニンに置換(R484C_D486H_K487R)
485番目のグリシンがアルギニンに置換され、486番目のアスパラギン酸がトリプトファンに置換され、且つ487番目のリジンがトリプトファンに置換(G485R_D486W_K487W)
485番目のグリシンがアルギニンに置換され、486番目のアスパラギン酸がアラニンに置換され、且つ487番目のリジンがアラニンに置換(G485R_D486A_K487A)
485番目のグリシンがアルギニンに置換され、486番目のアスパラギン酸がプロリンに置換され、且つ487番目のリジンがプロリンに置換(G485R_D486P_K487P)
484番目のアルギニンがアラニンに置換され、485番目のグリシンがアラニンに置換され、486番目のアスパラギン酸がアラニンに置換され、且つ487番目のリジンがアラニンに置換(R484A_G485A_D486A_K487A)
484番目のアルギニンがアラニンに置換され、485番目のグリシンがアラニンに置換され、486番目のアスパラギン酸がアルギニンに置換され、且つ487番目のリジンがアルギニンに置換(R484A_G485A_D486R_K487R)
484番目のアルギニンがアスパラギン酸に置換され、485番目のグリシンがアスパラギン酸に置換され、486番目のアスパラギン酸がアルギニンに置換され、且つ487番目のリジンがアルギニンに置換(R484D_G485D_D486R_K487R)
484番目のアルギニンがアスパラギン酸に置換され、485番目のグリシンがアスパラギン酸に置換され、486番目のアスパラギン酸がプロリンに置換され、且つ487番目のリジンがプロリンに置換(R484D_G485D_D486P_K487P)
484番目のアルギニンがアスパラギン酸に置換され、485番目のグリシンがアスパラギン酸に置換され、486番目のアスパラギン酸がアラニンに置換され、且つ487番目のリジンがアラニンに置換(R484D_G485D_D486A_K487A)
484番目のアルギニンがアスパラギン酸に置換され、485番目のグリシンがアスパラギン酸に置換され、486番目のアスパラギン酸がトリプトファンに置換され、且つ487番目のリジンがトリプトファンに置換(R484D_G485D_D486W_K487W)
484番目のアルギニンがプロリンに置換され、485番目のグリシンがプロリンに置換され、486番目のアスパラギン酸がアルギニンに置換され、且つ487番目のリジンがアルギニンに置換(R484P_G485P_D486R_K487R)
Δ484-487
N514-F-F-N515
N514-W-W-N515
P604-W-W-Y605
P604-A-A-A-A-Y605
P604-F-F-F-F-Y605
Δ485_D486H
Δ485-486_K487R
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R484-K-K-K-K-K-K-K-K-G485
R484-P-P-P-P-P-P-P-P-G485
Claims (6)
- 配列番号1〜4のいずれかのアミノ酸配列、又は配列番号1〜4のいずれかに示される
アミノ酸配列と90%以上同一であるアミノ酸配列からなるβ−ガラクトシダーゼにおいて、85番目のトリプトファン(W85)がグリシンに置換されるアミノ酸置換、91番目のフェニルアラニン(F91)がアラニン若しくはイソロイシンに置換されるアミノ酸置換、103番目のチロシン(Y103)がグリシンに置換されるアミノ酸置換、134番目のチロシン(Y134)がグリシンに置換されるアミノ酸置換、153番目のチロシン(Y153)がグリシンに置換されるアミノ酸置換、182番目のプロリン(P182)がトリプトファン若しくはチロシンに置換されるアミノ酸置換、186番目のトリプトファン(W186)がメチオニンに置換されるアミノ酸置換、192番目のチロシン(Y192)がグリシンに置換されるアミノ酸置換、295番目のチロシン(Y295)がグリシンに置換されるアミノ酸置換、345番目のヒスチジン(H345)がグリシンに置換されるアミノ酸置換、349番目のグリシン(G349)がトリプトファンに置換されるアミノ酸置換、402番目のフェニルアラニン(F402)がグリシンに置換されるアミノ酸置換、407番目のグルタミン(Q407)がイソロイシン、ロイシン、メチオニン、バリン若しくはチロシンに置換されるアミノ酸置換、479番目のグリシン(G479)がロイシン、プロリン若しくはグルタミンに置換されるアミノ酸置換、480番目のグルタミン酸(E480)がアスパラギンに置換されるアミノ酸置換、482番目のリジン(K482)がメチオニン若しくはバリンに置換されるアミノ酸置換、483番目のトレオニン(T483)がグリシン若しくはセリンに置換されるアミノ酸置換、484番目のアルギニン(R484)がフェニルアラニン、イソロイシン、メチオニン、アスパラギン若しくはグルタミンに置換されるアミノ酸置換、485番目のグリシン(G485)がアスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン若しくはトレオニンに置換されるアミノ酸置換、486番目のアスパラギン酸(D486)がアラニン、グルタミン酸、フェニルアラニン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、プロリン、グルタミン、アルギニン、トレオニン、トリプトファン若しくはチロシンに置換されるアミノ酸置換、487番目のリジン(K487)がシステイン、グルタミン酸、フェニルアラニン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、アスパラギン、グルタミン、アルギニン、トレオニン、バリン、トリプトファン若しくはチロシンに置換されるアミノ酸置換、488番目のバリン(V488)がグリシン、イソロイシン、ロイシン、アルギニン、セリン、トレオニン、トリプトファン若しくはチロシンに置換されるアミノ酸置換、496番目のチロシン(Y496)がグリシンに置換されるアミノ酸置換、512番目のセリン(S512)がシステイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、プロリン、グルタミン若しくはトリプトファンに置換されるアミノ酸置換、513番目のグルタミン酸(E513)がアラニン、システイン、アスパラギン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、リジン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、トレオニン若しくはバリンに置換されるアミノ酸置換、514番目のアスパラギン(N514)がグルタミン酸、ロイシン若しくはリジンに置換されるアミノ酸置換、515番目のアスパラギン(N515)がアラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、イソロイシン、ロイシン、プロリン若しくはバリンに置換されるアミノ酸置換、516番目のチロシン(Y516)がトリプトファンに置換されるアミノ酸置換、517番目のアスパラギン酸(D517)がリジン若しくはトリプトファンに置換されるアミノ酸置換、519番目のチロシン(Y519)がグリシンに置換されるアミノ酸置換、533番目のトレオニン(T533)がグルタミン酸に置換されるアミノ酸置換、547番目のチロシン(Y547)がグリシンに置換されるアミノ酸置換、549番目のチロシン(Y549)がグリシンに置換されるアミノ酸置換、555番目のチロシン(Y555)がグリシンに置換されるアミノ酸置換、572番目のアルギニン(R572)がシステイン、ロイシン、メチオニン、トレオニン、トリプトファン若しくはチロシンに置換されるアミノ酸置換、573番目のトレオニン(T573)がグルタミン酸に置換されるアミノ酸置換、598番目のチロシン(Y598)がヒスチジン若しくはアスパラギンに置換されるアミノ酸置換、605番目のチロシン(Y605)がシステイン、アスパラギン酸、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、プロリン、アルギニン若しくはトレオニンに置換されるアミノ酸置換、606番目のチロシン(Y606)がアラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン若しくはセリンに置換されるアミノ酸置換、609番目のチロシン(Y609)がグルタミン酸、アスパラギン若しくはセリンに置換されるアミノ酸置換、616番目のフェニルアラニン(F616)がグリシンに置換されるアミノ酸置換、624番目のフェニルアラニン(F624)がグリシンに置換されるアミノ酸置換、648番目のトリプトファン(W648)がグリシンに置換されるアミノ酸置換、又は650番目のトリプトファン(W650)がグリシンに置換されるアミノ酸置換を含むアミノ酸配列からなり、
オリゴ糖合成活性に関して、3糖以上の含有率が、野生型酵素の含有率を1とした場合に、0.8825〜1.0657であり、4糖の含有率が野生型酵素より少ない、との条件を満たす、改変型β−ガラクトシダーゼ。 - 請求項1に記載の改変型β−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子。
- 請求項2に記載の遺伝子を含む組換えDNA。
- 請求項3に記載の組換えDNAを保有する微生物。
- 請求項1に記載の改変型β−ガラクトシダーゼを含む酵素剤。
- β-1,3結合、β-1,4結合及びβ-1,6結合の中の少なくとも一つを有する、二糖、オリゴ糖又は多糖に対して、請求項1に記載の改変型β−ガラクトシダーゼを作用させることを特徴とする、オリゴ糖の製造方法。
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