JP2004254562A

JP2004254562A - ポリ−ｎ−アセチルラクトサミン誘導体の製造方法

Info

Publication number: JP2004254562A
Application number: JP2003047908A
Authority: JP
Inventors: Yasuichi Usui; 泰市碓氷; Takeomi Murata; 健臣村田; Takeshi Hattori; 武史服部; Kaori Nishinomiya; 可織西宮; Shiori Jinbo; 詩織神保
Original assignee: Yaizu Suisan Kagaku Kogyo Co Ltd
Current assignee: Yaizu Suisan Kagaku Kogyo Co Ltd
Priority date: 2003-02-25
Filing date: 2003-02-25
Publication date: 2004-09-16

Abstract

【課題】Ｎ−アセチルラクトサミンが繰り返し結合した構造を有するポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン誘導体を効率よくかつ安価に製造する方法を提供する。
【解決手段】下記式（１）に示されるトリサッカライド又はその誘導体を供与体基質兼受容体基質として用い、エンド−β−ガラクトシダーゼを作用させることにより、該酵素の転移反応によって下記式（２）に示されるポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン誘導体を得る。前記エンド−β−ガラクトシダーゼとして、エシェリシア属由来のエンド−β−ガラクトシダーゼを用いることが好ましい。また、ウシ血清アルブミン共存下で、前記トリサッカライド又はその誘導体に前記エンド−β−ガラクトシダーゼを作用させることが好ましく、その場合、ウシ血清アルブミンを３０〜５００μｇ／ｍＬ含有する緩衝液中で、前記トリサッカライド又はその誘導体に前記エンド−β−ガラクトシダーゼを作用させることが好ましい。
【化１】

【化２】

【選択図】なし

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、Ｎ−アセチルラクトサミンが繰り返し結合した構造を有するポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン誘導体の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミンは、Ｎ−アセチルラクトサミン（Ｄ−ガラクトースとＮ−アセチルグルコサミンがβ−１，４グリコシド結合している二糖）が繰り返し結合した構造を有する糖鎖であり、糖タンパクや糖脂質等の複合糖鎖中に存在している。
【０００３】
生体内において、ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミンは、それが長い側鎖を持つことにより、様々な修飾を受けやすく、細胞表面の特徴的な糖鎖構造をとることが多い。現在までに、ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミンは、分化抗原、血管新生、炎症反応等の様々な生理現象に関与していることが知られており、研究試薬としてだけでなく、医薬品や診断薬等への利用も期待されている。
【０００４】
一般に、オリゴ糖を合成する方法としては、化学合成法と酵素合成法が知られており、ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミンの製造方法として、例えば、下記非特許文献１には、Ｎ−アセチルラクトサミンの繰り返し構造を４つ有するオリゴ糖の化学合成法が開示されている。
【０００５】
また、下記非特許文献２には、β−１，４ガラクトシルトランスフェラーゼ、及びβ−１，３Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ等を用いたポリ−Ｎ−アセチルラクトサミンの酵素合成法が開示されている。
【０００６】
【非特許文献１】
ＪｏｃｅｌｙｎｅＡＬＡＩＳａｎｄＡｌａｉｎＶＥＹＲＩＥＲＥＳ，ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔｅｒｓ，Ｖｏｌ．２８，Ｎｏ．２９，１９８７，ｐｐ３３４５−３３４８
【非特許文献２】
ＳｅｒｇｉｏＤｉＶｉｒｇｉｌｉｏ，ＪｏｈｎＧｌｕｓｈｋａ，ＫｅｌｌｅｙＭｏｒｅｍｅｎａｎｄＭｉｃｈａｅｌＰｉｅｒｃｅ，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．９，ｎｏ．４，１９９９，ｐｐ．３５３−３６４
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上記非特許文献１に記載されたような化学合成法では、反応に関与しない官能基の保護・脱保護等の多段階の反応工程及び複数回の精製工程が必要であり、工業的生産に適した合成方法とは言えなかった。
【０００８】
一方、酵素合成法は、化学合成法に比べて簡便な方法であるが、使用する酵素が高価であったり、酵素を大量に入手することが困難であったり、収率が低いなどの問題があった。特に上記非特許文献２に記載された方法では、２種類の転移酵素を用いる必要があるため、工業的に利用するには問題があった。
【０００９】
したがって、本発明の目的は、Ｎ−アセチルラクトサミンが繰り返し結合した構造を有するポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン誘導体を効率よくかつ安価に製造する方法を提供することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するため、本発明は、下記式（１）に示されるトリサッカライド又はその誘導体に、エンド−β−ガラクトシダーゼを作用させることを特徴とする、下記式（２）に示されるポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン誘導体の製造方法を提供するものである。
【００１１】
【化３】

【００１２】
【化４】

【００１３】
本発明によれば、上記式（１）に示されるトリサッカライド又はその誘導体を供与体基質兼受容体基質として用い、エンド−β−ガラクトシダーゼを作用させることにより、該酵素の転移反応によって上記式（２）に示されるポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン誘導体を効率よくかつ安価に得ることができる。
【００１４】
本発明の製造方法においては、前記エンド−β−ガラクトシダーゼとして、エシェリシア（Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ）属由来のエンド−β−ガラクトシダーゼを用いることが好ましい。この態様によれば、転移反応が効率よく起こり、上記式（２）に示されるポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン誘導体を更に効率よく得ることができる。
【００１５】
また、ウシ血清アルブミン共存下で、前記トリサッカライド又はその誘導体に前記エンド−β−ガラクトシダーゼを作用させることが好ましく、その場合、ウシ血清アルブミンを３０〜５００μｇ／ｍＬ含有する緩衝液中で、前記トリサッカライド又はその誘導体に前記エンド−β−ガラクトシダーゼを作用させることが好ましい。この態様によれば、緩衝液中でのエンド−β−ガラクトシダ−ゼを安定化させることができるので、トリサッカライド又はその誘導体を更に効率よく転移させることができる。
【００１６】
【発明の実施の形態】
本明細書において、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミン、ＧａｌはＤ−ガラクトース、Ｌａｃはラクトース、ＬａｃＮＡｃはＮ−アセチルラクトサミン、ｐＮＰはｐ−ニトロフェノール又はｐ−ニトロフェニル基、ＧｌｃＮＡｃβ−ｐＮＰはｐ−ニトロフェニルβ−Ｎ−アセチルグルコサミニド、ＧｌｃＮＡｃβ−ＭＵはメチルウンベリフェリルβ−Ｎ−アセチルグルコサミニド、ＬａｃＮＡｃβ−ｐＮＰはｐ−ニトロフェニルβ−Ｎ−アセチルラクトサミニド、ＬａｃＮＡｃβ−ＭＵはメチルウンベリフェリルβ−Ｎ−アセチルラクトサミニドをそれぞれ表す。
【００１７】
本発明において、基質として用いられるトリサッカライド又はその誘導体とは、下記式（１）に示されるように、ＬａｃＮＡｃ、ＬａｃＮＡｃβ−ｐＮＰ又はＬａｃＮＡｃβ−ＭＵのＧａｌ残基にＧｌｃＮＡｃがβ−１，３結合した化合物を意味する。
【００１８】
【化５】

【００１９】
また、ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン誘導体とは、下記式（２）に示されるように、構造中にＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌの繰り返し構造を少なくとも２つ以上有し、その還元末端側にＧｌｃＮＡｃ、ＧｌｃＮＡｃβ−ｐＮＰ又はＧｌｃＮＡｃβ−ＭＵがβ−１，４結合した化合物を意味し、好ましくは、構造中にＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌの繰り返し構造を２〜６つ有する化合物を意味する。したがって下記式（２）において、２≦ｎ≦６であることが好ましい。
【００２０】
【化６】

【００２１】
以下、本発明の製造方法について更に詳しく説明する。
本発明において、ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミン誘導体を製造する際に用いられる基質は、上記式（１）に示されるトリサッカライド又はその誘導体であるが、例えば、上記トリサッカライド誘導体は、その前駆物質となるＬａｃＮＡｃβ−ｐＮＰを合成し、次いで、受容体基質としてＬａｃＮＡｃβ−ｐＮＰ、供与体基質としてＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを用い、β−１，３−ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼを作用させることにより得ることができる。
【００２２】
すなわち、Ｌａｃ（供与体基質）と、ＧｌｃＮＡｃβ−ｐＮＰ（受容体基質）を、好ましくはモル比で０．５〜３：０．５〜３となるようにリン酸−リン酸ナトリウム緩衝液、酢酸緩衝液、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液等の緩衝液（ｐＨ５．０〜８．０）とアセトニトリルの混合溶媒に溶解し、予め緩衝液（ｐＨ５．０〜８．０）に溶解したβ−Ｄ−ガラクトシダーゼを添加し、３０〜５０℃で２〜４８時間反応を行う。β−Ｄ−ガラクトシダーゼの添加量は、基質（供与体基質＋受容体基質）１ｍｏｌに対して１００〜５，０００Ｕが好ましい。なお、本発明において、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ１Ｕとは、１分間に１μｍｏｌのｐ−ニトロフェニル−β−ガラクトピラノシドを加水分解する酵素量を意味する。
【００２３】
そして、反応中は、反応液を経時的にサンプリングして、高速液体クロマトグラフィー（以下、ＨＰＬＣと略記する）で生成物のピークを確認後、酵素を失活させて未反応のＧｌｃＮＡｃβ−ｐＮＰを除去する。そして、例えば、予め２５％（ｖ／ｖ）メタノールで平衡化した「トヨパールＨＷ−４０Ｓ」（商品名、東ソー株式会社製）等を用いたクロマトグラフィーにより、生成したＬａｃＮＡｃβ−ｐＮＰを単離する。なお、上記β−Ｄ−ガラクトシダーゼとしては、例えば、バチルス・サーキュランス（Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ、ＩＦＯ１３６２６）、ロドトルラ・ミヌタ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａｍｉｎｕｔａ）、ロドトルラ・ラクトサ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａｌａｃｔｏｓａ）、ストレプトコッカス・ニューモニア（Ｓｔｒｅｐｔｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ストレプトコッカス・ｓｐ．（Ｓｔｒｅｐｔｃｏｃｃｕｓｓｐ．）、ステリグマトマイセス・サーキュランス（Ｓｔｅｒｉｇｍａｔｏｍｙｃｅｓｃｉｒｃｕｌａｎｓ）由来のものが好ましく用いられ、β−１，４−グリコシド結合に対する特異性が高い点からバチルス・サーキュランス（Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）由来のものがより好ましく用いられる。バチルス・サーキュランス（Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）由来のβ−Ｄ−ガラクトシダーゼは市販されており、例えば、商品名「ビオラクタ」（大和化成株式会社製）等を必要に応じて精製して用いることができる。
【００２４】
次いで、受容体基質としてＬａｃＮＡｃβ−ｐＮＰとＮａＣｌを、カコジル酸バッファー（ｐＨ７．０）に溶かし、供与体基質としてＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ、ＡＴＰ、ＭｎＣｌ_２、ＧｌｃＮＡｃ、１０％（ｗ／ｖ）ＮａＮ_３溶液を加えて完全に溶解させ、β−１，３−ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼを添加して、３０〜５０℃で２〜７２時間反応を行う。β−１，３−ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼの添加量は、基質（受容体基質）１ｍｏｌに対して５００〜１０，０００Ｕが好ましい。なお、本発明において、β−１，３−ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ１Ｕとは、１時間に１ｍｍｏｌのＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ−ｐＮＰを生成する酵素量を意味する。
【００２５】
そして、反応中は、反応液を経時的にサンプリングして、ＨＰＬＣで生成物のピークを確認後、酵素を失活させて、沈殿物を除去する。そして、例えば、予め２５％（ｖ／ｖ）メタノールで平衡化した「トヨパールＨＷ−４０Ｓ」（商品名、東ソー株式会社製）等を用いたクロマトグラフィーにより、生成したＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ−ｐＮＰを単離する。なお、本発明においては、上記β−１，３−ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼは、ウシ血清、ヒト血清由来のものが好ましく用いられ、酵素活性の点から、特にウシ胎児血清由来のものが好ましく用いられる。上記血清からβ−１，３−ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼを精製する方法は、常法にしたがって行えばよく、例えば、硫安沈殿、アフィニティークロマトグラフィー、銅キレートクロマトグラフィー等を適宜組み合わせて行えばよい。また、市販されているウシ血清又はヒト血清由来のβ−１，３−ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼを用いてもよい。
【００２６】
本発明のポリ−Ｎ−アセチルラクトサミンの製造方法は、上記のようにして得られるトリサッカライド誘導体を供与体基質兼受容体基質として用い、エンド−β−ガラクトシダーゼを作用させることにより、該酵素の転移反応を利用して上記式（２）に示されるポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン誘導体を得る方法であり、例えば、以下のようにして実施することができる。
【００２７】
すなわち、ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ−ｐＮＰを、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液等の緩衝液（ｐＨ４．０〜７．０）に溶解して、これにエンド−β−ガラクトシダーゼを添加して３０〜５０℃で１〜１，０００時間反応を行う。反応中は、反応液を経時的にサンプリングして、ＨＰＬＣで生成物のピークを確認後、酵素を失活させ、ＨＰＬＣ等により、目的のポリ−Ｎ−アセチルラクトサミンを単離する。本発明においては、ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ−ｐＮＰ１ｍｏｌに対して、エンド−β−ガラクトシダーゼを０．３〜３０Ｕ添加することが好ましい。また、反応中に、エンド−β−ガラクトシダーゼを適宜追加添加してもよい。
【００２８】
上記エンド−β−ガラクトシダーゼとしては、エシェリシア（Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ）属由来のエンド−β−ガラクトシダーゼを用いることが好ましく、特にエシェリシア・フラウンディ（Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａｆｒｅｕｎｄｉｉ）由来のものが好ましく用いられる。なお、サイドモナスｓｐ．由来のエンド−β−ガラクトシダーゼ（ＳＩＧＭＡ社製）も用いることができる。
【００２９】
エシェリシア・フラウンディ（Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａｆｒｅｕｎｄｉｉ）由来のエンド−β−ガラクトシダーゼは、エシェリシア・フラウンディ（Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａｆｒｅｕｎｄｉｉ、ＩＦＯ２１５２４）の培養濾液から、常法に従って精製して用いてもよく、例えば、生化学工業株式会社等から販売されている市販のものを用いてもよい。
【００３０】
なお、本発明において、エンド−β−ガラクトシダーゼの活性は、図１に示す作用機序に基づいて、表１に示す試薬を用いて下記の方法により測定した際に、（ＬａｃＮＡｃ）_２β−ｐＮＰから１分間に１μｍｏｌのＧｌｃＮＡｃβ−ｐＮＰを遊離させる酵素量を１Ｕと定義する。
【００３１】
【表１】

【００３２】
すなわち、５ｍＭ（ＬａｃＮＡｃ）_２β−ｐＮＰ溶液に、２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．８）及びβ−Ｎ−アセチルヘキソミニダーゼ２５ｍＵを加えて３７℃で５分間置いた後、エンド−β−ガラクトシダーゼを加えて反応させて経時的に反応液から５０μＬ採取し、等量の１ＭＮａ_２ＣＯ_３とよく混合して反応を停止させ、４０５ｎｍにおける吸光度を測定して、遊離したｐＮＰ量を測定し、下記式により酵素量を算出する。
【００３３】
【数１】

【００３４】
上記β−Ｎ−アセチルヘキソミニダーゼは、例えば、アミコラトプシス・オリエンタルス（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓｏｒｉｅｎｔａｉｌｓ、ＩＦＯ１２８０６）由来のものを用いることができる。アミコラトプシス・オリエンタルス（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓｏｒｉｅｎｔａｉｌｓ）由来のβ−Ｎ−アセチルヘキソミニダーゼは、該微生物の培養上清の７５％飽和硫酸アンモニウム沈殿画分を、例えば、ＧｌｃＮＡｃ−ｃｅｌｕｌｏｆｉｎｅ（商品名「セルロファイン」、生化学工業株式会社製）、商品名「セファデックスＧ−２００」（アマシャムファルマシアバイオテク株式会社製）、商品名「ＤＥＡＥ−セファデックス」（アマシャムファルマシアバイオテク株式会社製）等を用いて精製することにより得ることができるが、市販のβ−Ｎ−アセチルヘキソミニダーゼを用いてもよい。なお、β−Ｎ−アセチルヘキソミニダーゼ１Ｕとは、１分間に１μｍｏｌのｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミニドを加水分解する酵素量を意味する。
【００３５】
また、本発明においては、前記ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ−ｐＮＰにエンド−β−ガラクトシダーゼを作用させる際に、反応液中にウシ血清アルブミン（以下、ＢＳＡと略記する）を添加しておくことが好ましい。反応液中におけるＢＳＡの濃度は、３０〜５００μｇ／ｍＬが好ましく、１００〜３００μｇ／ｍＬがより好ましい。これによれば、後述する実施例に示されるように、基質（ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ−ｐＮＰ）の水解が効率よく起こるので、目的のポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンを効率よく得ることができる。この理由は、ＢＳＡを添加することによりエンド−β−ガラクトシダーゼの安定性が増したためであると考えられる。
【００３６】
【実施例】
以下、実施例を挙げて、本発明を更に具体的に説明する。まず、以下の例において用いたβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ及びβ−１，３−ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼの調製方法について説明する。
【００３７】
・β−Ｄ−ガラクトシダーゼ
バチルス・サーキュランス（Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）由来の粗酵素（商品名「ビオラクタ」、大和化成株式会社製）１００ｍｇを、６０ｍＭリン酸−リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）１００ｍＬに溶解し、予め同緩衝液で平衡化したＧｌｃＮＡｃ−ｃｅｌｌｕｒｏｆｉｎｅ（商品名「セルロファイン」、生化学工業株式会社製）アフィニティークロマトグラフィー（φ３．０×１０ｃｍ）に供した。すなわち、非吸着部を同緩衝液（９００ｍＬ）で洗浄してβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ活性画分を回収し、その後、吸着部を０．１Ｍ酢酸、１ＭＮａＣｌ、１％ＧｌｃＮＡｃを含む溶液（３００ｍｌ）で溶出させた。回収したβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ活性画分である非吸着部を「アミコンＰＭ１０ポリエーテルスルフォン」（商品名、Ａｍｉｃｏｎ社製）で限外濃縮し、凍結乾燥した。これを、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ（部分精製）として用いた。
【００３８】
・β−１，３−ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ
冷凍されたウシ胎児血清（ＳＩＧＭＡ社より購入）５００ｍＬを冷蔵庫の中で３日間かけてゆっくりと解凍した後、氷冷しながら８０％飽和となるように硫酸アンモニウム（２７５ｇ）を加え、１時間撹拌した後、４℃で１日静置した。上清をデカンテーションにより捨て、生じた沈殿を遠心分離（５，０００×ｇ、３０分、４℃）で回収し、少量の５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解し、蒸留水中、４℃で一昼夜透析した後、凍結乾燥した。これをβ−１，３−ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ（粗酵素）として用いた。
【００３９】
実施例１
（１）ＬａｃＮＡｃβ−ｐＮＰの酵素合成
供与体基質としてＬａｃ（９．２ｇ）、受容体基質としてＧｌｃＮＡｃβ−ｐＮＰ（５．８４ｇ）をモル比で３：２で、０．１Ｍリン酸−リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０、９９ｍＬ）とアセトニトリル（１００ｍＬ）の混合溶媒に溶解した。そこに、予め０．１Ｍリン酸−リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０、１ｍＬ）に溶解させたバチルス・サーキュランス（Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）由来のβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ（１２０Ｕ）を添加し、４０℃で５時間反応を行った。反応液は、下記条件でＨＰＬＣを用いて経時的に分析を行った。
【００４０】
・ＨＰＬＣ分析条件
送液装置：「ＨｉｔａｃｈｉＰｕｍｐＬ−６０００」（商品名、株式会社日立製作所製）
検出器：「ＨｉｔａｃｈｉＬ−４０００ＨＵＶＤｅｔｅｃｔｏｒ」（商品名、株式会社日立製作所製）
カラム：「ＴＳＫ−Ｇ−Ｏｌｉｇｏ−ＰＷ（φ７．８×３００ｍｍ）」（商品名、東ソー株式会社製）
オートサンプラー：「ＨｉｔａｃｈｉＡＳ−２０００Ａｕｔｏｓａｍｐｌｅｒ」（商品名、株式会社日立製作所製）
データ処理：「ＨｉｔａｃｈｉＤ−２５００ＣｈｒｏｍａｔｏＩｎｔｅｇｒａｔｏｒ」（商品名、株式会社日立製作所製）
検出波長：３００ｎｍ
溶媒：Ｈ_２Ｏ
流速：０．８ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度：５０℃
反応終了後、反応液を１０分間煮沸して反応を停止させ、煮沸により生じた沈殿物をセライトで濾過した後、濾液をアセトニトリルが無くなるまで濃縮した。この濃縮した濾液をガラスフィルターに通して未反応のＧｌｃＮＡｃβ−ｐＮＰの結晶を除去した後、予め２５％（ｖ／ｖ）メタノールで平衡化した「トヨパールＨＷ−４０Ｓ」（商品名、東ソー株式会社製）を用いたクロマトグラフィー（φ６×９７ｃｍ、流速２．５ｍＬ／ｍｉｎ）に供し、生成したＬａｃＮＡｃβ−ｐＮＰを単離回収した。
【００４１】
（２）ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ−ｐＮＰの酵素合成
受容体基質としてＬａｃＮＡｃβ−ｐＮＰ（２００ｍｇ）とＮａＣｌ（４１ｍｇ）を、１５０ｍＭカコジル酸バッファー（ｐＨ７．０、１７ｍＬ）に溶かし、供与体基質としてＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ（２３１．５ｍｇ）、ＡＴＰ（１５．５ｍｇ）、ＭｎＣｌ_２（５６．５ｍｇ）、ＧｌｃＮＡｃ（３７．５ｍｇ）、１０％（ｗ／ｖ）ＮａＮ_３溶液（７００μＬ）を加えて完全に溶解させた。そこに、ウシ胎児血清由来β−１，３−ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ（１２０ｍＵ）を添加して、４０℃で３６時間反応を行った。反応液は、下記条件でＨＰＬＣを用いて経時的に分析を行った。
【００４２】
・ＨＰＬＣ分析条件
送液装置：「ＨｉｔａｃｈｉＰｕｍｐＬ−６０００」（商品名、株式会社日立製作所製）
検出器：「ＨｉｔａｃｈｉＬ−４０００ＨＵＶＤｅｔｅｃｔｏｒ」（商品名、株式会社日立製作所製）
カラム：「ＭｉｇｈｔｙｓｉｌＲＰ−１８ＧＰ（φ４．６×１５０ｍｍ）」（商品名、関東化学株式会社製）
オートサンプラー：「ＨｉｔａｃｈｉＡＳ−２０００Ａｕｔｏｓａｍｐｌｅｒ」（商品名、株式会社日立製作所製）
データ処理：「ＨｉｔａｃｈｉＤ−２５００ＣｈｒｏｍａｔｏＩｎｔｅｇｒａｔｏｒ」（商品名、株式会社日立製作所製）
検出波長：３００ｎｍ
溶媒：１０％（ｖ／ｖ）メタノール
流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度：４０℃
反応終了後、反応液を３倍希釈し、５分間煮沸して反応を停止させ、煮沸により生じた沈殿物を遠心分離により除去した後、上清を、予め２５％（ｖ／ｖ）メタノールで平衡化した「トヨパールＨＷ−４０Ｓ」（商品名、東ソー株式会社製）を用いたクロマトグラフィー（φ４．４×８０ｃｍ、流速１．５ｍＬ／ｍｉｎ）に供し、生成したＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ−ｐＮＰを単離回収した。
【００４３】
（３）ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ−ｐＮＰの酵素合成
ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ−ｐＮＰを酢酸緩衝液（ｐＨ５．８）に溶解して１４ｍＭに調製した基質溶液１，６１０μＬ（最終基質濃度１１．９ｍＭ）に、▲１▼ＢＳＡ溶液（１．３７ｍｇ／ｍＬ）２７６μＬ、又は▲２▼酢酸緩衝液（ｐＨ５．８）２７６μＬを加え、最後にエシェリシア・フラウンディ（Ｅ．ｆｒｅｕｎｄｉｉ）由来エンド−β−ガラクトシダーゼ（生化学工業株式会社製）を含む酵素溶液（３５．１ｍＵ／ｍＬ）を２μＬ（０．０７０２ｍＵ）加え、３７℃で７５２時間反応させた。反応中、２６５時間目に前記酵素溶液２μＬ（０．０７０２ｍＵ）、４３４時間目に前記酵素溶液４μＬ（０．１４０ｍＵ）をそれぞれ追加添加した。なお、反応中は、経時変化を観察するために反応液を２μＬずつ採取し、１９８μＬの脱塩水を加えた後、１００℃で５分間加熱して反応を停止させ、下記条件でＨＰＬＣを用いて経時的に分析を行った。
【００４４】
・ＨＰＬＣ分析条件
送液装置：「ＳＨＩＭＡＤＺＵＬＣ−１０ＡＤ」（商品名、株式会社島津製作所製）
検出器：「ＳＨＩＭＡＤＺＵＳＰＤ−１０ＡＶＰ」（商品名、株式会社島津製作所製）
カラム：「ＡｓａｈｉｐａｋＧＳ−２２０ＨＱ（φ７．６×２５０ｍｍ）」（商品名、昭和電工株式会社製）
オートサンプラー：「ＳＨＩＭＡＤＺＵＳＩＬ１０Ａ」（商品名、株式会社島津製作所）
データ処理：「ＳＨＩＭＡＤＺＵＣＨＲＯＭＡＴＯＰＡＣＣ−Ｒ７Ａ」（商品名、株式会社島津製作所）
検出波長：３００ｎｍ
溶媒：超純水
流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度：４０℃
ＨＰＬＣ分析による反応液中の基質（ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ−ｐＮＰ）の量の経時的な変化を図２に示す。図２から、ＢＳＡを添加しなかった系では、９６時間後でも基質の約９５％が水解を受けずに残存しているのに対して、ＢＳＡを添加した系では、４時間後には転移生成物と思われる３つピーク（Ｐｅａｋ１、Ｐｅａｋ２、Ｐｅａｋ３）が現れ、その後消失し、９６時間後には全ての基質が水解を受け、ＧｌｃＮＡｃβ−ｐＮＰのみになっていることが分かる。
【００４５】
また、生成した各ピークの転移生成物の生成量の経時的な変化を図３に示す。図３から、ＢＳＡを添加した系では、ＢＳＡを添加しなかった系に比べて、反応開始後早い時期に各ピークの転移生成物が現れており、また、その生成量も多いことが分かる。
【００４６】
そして、上記３つのピークの転移生成物についてＮＭＲで分析したところ、Ｐｅａｋ１、２の転移生成物については構造決定には至らなかったが、Ｐｅａｋ３は、ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ−ｐＮＰであることが分かった。図４〜６にＰｅａｋ３の^１Ｈ、^１３Ｃ、ＨＭＢＣスペクトル、表２にＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ−ｐＮＰの^１３Ｃケミカルシフトを示す。
【００４７】
【表２】

【００４８】
上記の結果と、エンド−β−ガラクトシダーゼの水解様式を考慮すると、ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ−ｐＮＰは、図７に示すような機構で生成したものと考えられる。また、Ｐｅａｋ１、２については、ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ−ｐＮＰに、更にＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌがβ１−４結合で転移して伸長したものであるか、又は基質であるＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ−ｐＮＰの糖鎖末端側ＧｌｃＮＡｃ残基の３位又は６位のＯＨ基にＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌが転移して生成した異性体であると考えられる。
【００４９】
実施例２
ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ−ｐＮＰ（１６．０ｍｇ）、ＢＳＡ（０．３７８ｍｇ）、エシェリシア・フラウンディ（Ｅ．ｆｒｅｕｎｄｉｉ）由来エンド−β−ガラクトシダーゼ（１４０μＵ）を、２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．８）１．９ｍＬに溶解して、３７℃で７２０時間反応させた。反応中、エンド−β−ガラクトシダーゼを２８０時間目に７０μＵ、４５０時間目に１４０μＵそれぞれ追加添加した。なお、反応中は、実施例１と同様の条件でＨＰＬＣによる分析を行い、各ピークの転移生成物の生成量の経時的な変化を測定した。その結果を図８に示す。
【００５０】
反応終了後、酵素を失活させ、上記と同様の条件でＨＰＬＣを行い、Ｐｅａｋ３の転移生成物０．８ｍｇを単離した（収率３．３１％）。これをＮＭＲで分析したところ、ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ−ｐＮＰであった。
【００５１】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明によれば、上記式（１）に示されるトリサッカライド又はその誘導体を供与体基質兼受容体基質とし、エンド−β−ガラクトシダーゼを作用させることにより、該酵素の転移反応によって上記式（２）に示されるポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン誘導体を効率よくかつ安価に得ることができる。
【００５２】
本発明の製造方法によって得られるポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン誘導体は、例えば、分化抗原、血管新生、炎症反応等の研究における試薬や、医薬品、診断薬、食品、化粧品、農薬等へ利用が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】エンド−β−ガラクトシダーゼの活性測定の原理を示す図である。
【図２】反応液中の基質（ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ−ｐＮＰ）の量の経時的な変化を示す図である。
【図３】生成した各ピークの転移生成物の生成量の経時的な変化を示す図である。
【図４】Ｐｅａｋ３の^１Ｈスペクトルを示す図である。
【図５】Ｐｅａｋ３の^１３Ｃスペクトルを示す図である。
【図６】Ｐｅａｋ３のＨＭＢＣスペクトルを示す図である。
【図７】エンド−β−ガラクトシダーゼによるポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン誘導体の合成の作用機構を示す図である。
【図８】実施例２において、各ピークの転移生成物の生成量の経時的な変化を示す図である。

Claims

下記式（１）に示されるトリサッカライド又はその誘導体に、エンド−β−ガラクトシダーゼを作用させることを特徴とする、下記式（２）に示されるポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン誘導体の製造方法。
前記エンド−β−ガラクトシダーゼとして、エシェリシア（Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ）属由来のエンド−β−ガラクトシダーゼを用いる、請求項１に記載のポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン誘導体の製造方法。
ウシ血清アルブミン共存下で、前記トリサッカライド又はその誘導体に前記エンド−β−ガラクトシダーゼを作用させる、請求項１又は２に記載のポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン誘導体の製造方法。
ウシ血清アルブミンを３０〜５００μｇ／ｍＬ含有する緩衝液中で、前記トリサッカライド又はその誘導体に前記エンド−β−ガラクトシダーゼを作用させる、請求項３に記載のポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン誘導体の製造方法。