CN117716047A - 寡糖的连续发酵生产 - Google Patents
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Abstract
本申请公开了一种生产所需寡糖的方法，该方法包括提供具有用于摄取中间寡糖的糖内向转运子和能够通过将单糖部分从供体底物转移到所述中间寡糖中进行所述中间寡糖转化的酶的基因工程化微生物细胞；在中间寡糖存在下培养所述基因工程化微生物细胞而产生所需寡糖；和回收所述所需寡糖。
Description
技术领域
本发明涉及用于糖类生产的方法。更具体而言，本发明涉及所需的寡糖或所需的多糖的发酵生产，即，涉及在微生物细胞中生产所需的寡糖或所需的多糖。
背景技术
除淀粉、纤维素和蔗糖以外的糖类的使用最近引起了人们的广泛兴趣。例如，某些寡糖被用作功能性食品成分、营养添加剂或营养品。具体而言，益生元寡糖引起了人们的高度兴趣，因为它们代表了刺激人类胃肠道微生物群生长和发育的非致癌不可消化化合物。
人们早就知晓，人母乳除了乳糖外，还含有一种叫人乳寡糖(HMO)的复杂寡糖混合物。就其寡糖的组成和各个寡糖的数量而言，人乳是独一无二的。如今，已经表征出了150多种结构独特的人乳寡糖。绝大多数人乳寡糖的特征在于其还原端的乳糖部分。许多人乳寡糖在其非还原端含有岩藻糖部分和/或唾液酸部分。更笼统而言，HMO源自的单糖是D-葡萄糖、D-半乳糖、N-乙酰葡糖胺、L-岩藻糖和唾液酸。
最突出的人乳寡糖是2'-岩藻糖基乳糖(2'-FL)和3-岩藻糖基乳糖(3-FL)，它们加在一起能够贡献高达总HMO部分的1/3。人乳中存在的其他突出HMO是乳糖-N-四糖(LNT)、乳糖-N-新四糖(LNnT)和乳糖-N-岩藻五糖(LNFP)。除了这些能够是岩藻糖基化或非岩藻糖基化的中性寡糖外，在人乳中还能够发现包含至少一个唾液酸部分的酸性HMO，如，例如，3'-唾液酸基乳糖(3'-SL)、6'-唾液酸基乳糖(6'-SL)和3-岩藻糖-3-唾液酸基乳糖、二唾液基-乳糖-N-四糖等。这些酸性HMO的结构与上皮细胞表面糖缀合物的表位，即路易斯(Lewis)组织-血型抗原密切相关。HMO与上皮表位的结构相似性解释了HMO抗细菌病原体的保护特性。
除了上述HMO在肠道中的局部作用外，它们还被证明通过进入体循环而在婴儿中引发全身作用。此外，HMO对蛋白质-碳水化合物相互作用的影响，例如，对选择素-白细胞结合的影响，能够调节免疫反应并减少炎性反应。
由于HMO具有优异的健康益处，在过去几年中，人们对HMO作为营养品的兴趣迅速增加。已充分证实的是，HMO有助于人体对抗病原体的防御机制，有助于建立特定的肠道菌群(微生物组)，并有助于产后刺激免疫系统。尽管人乳寡糖是婴儿自然食用的，但人们普遍认为，如果在生命后期食用，即在青春期及其后食用，这些寡糖也会产生有益效果。
如今，许多寡糖是通过使用糖基转移酶的体外生物催化糖基化反应从头合成。可替代地，寡糖是通过多糖的化学、物理和/或生物降解而获得。例如，低聚果糖(FOS)和低聚半乳糖(GOS)是生产量最大的寡糖。它们由植物多糖合成或生产。
寡糖的常规化学合成包括几个反应步骤，包括延长现有糖链、纯化中间体化合物，和，如果适用，进一步的反应步骤如(但不限于)乙酰化反应和/或硫酸化反应。这种多步骤合成的概念在寡糖的微生物生产领域是未知的。
益生元寡糖，特别是HMO，由于其有益的特性，需求不断增加，非常需要低成本大规模生产这些糖类。
然而，目前许多益生元和/或人乳寡糖的广泛商业应用的主要缺点是缺乏有效的寡糖生产。如上所述，寡糖能够通过使用生物催化或化学工程的合成，也能够通过使用物理、化学或酶促方法的多糖解聚而生成。
寡糖的化学合成已被证明是具有挑战性的，因为在糖类分子中存在几个具有相似化学反应性的羟基。因此，在寡糖的化学合成中，必须首先选择性地保护构建基块，才能控制化学相似基团的反应性，然后偶联，并最后脱保护，以获得所需的寡糖。即使小规模合成所需的寡糖也是可能的，因此所开发的合成路线通常是耗时的、技术上具有挑战性的，而且往往昂贵得令人望而却步。因此，将化学寡糖合成放大到商业上可行的工业规模生产几乎是不可能的。
酶合成或化学与酶合成的组合比单纯的化学合成路径会提供显著的优势。通过酶促合成，已经获得了几种人乳寡糖，如2'-岩藻糖基乳糖、乳糖-N-四糖、乳糖-N-新四糖或3'-唾液酸基乳糖。然而，寡糖的这种化学或生物化学合成比肽或核酸等其他生物聚合物的合成更困难。这使得寡糖的生物催化或化学与酶促合成的组合几乎不可能以合理的成本实现工业规模化生产。
在寡糖大规模生产过程中的一个显著增加成本的主要问题是需要从反应混合物中去除非所需化合物，如非所需的寡糖、供体底物和受体底物。
除了生物催化外，生产寡糖的发酵方法也很成功，而几种寡糖(包括HMO)已经通过发酵方法能够大量获得。
国际公开WO 2014/048439 A1涉及一种使用遗传修饰的细胞生产糖缀合物的方法，该糖缀合物包含与选自由氨基酸、肽、蛋白质、脂质、较长烷基、聚乙二醇、α,β-不饱和酰胺基和聚乙烯醇组成的组的非糖部分共价连接的寡糖部分。
国际公开WO 2015/032413 A1公开了一种生产具有至少四个单糖单元的寡糖的方法，其中岩藻糖基化、唾液基化或N-乙酰氨基葡萄糖基化的乳糖三糖作为受体被外源性添加到培养基中。在培养基中培养具有编码能够修饰受体的酶的重组基因的基因修饰细胞。
欧洲专利申请EP 3 141 610 A1涉及在遗传修饰细菌细胞中生产寡糖的方法，所述遗传修饰细菌细胞包含至少一种重组糖基转移酶和至少一种编码能够转运出寡糖的蛋白质的核苷酸序列。
国际公开WO 2010/070104 A1公开了一种用于制备具有产生岩藻糖基化化合物的能力的遗传修饰细胞的方法，其中所述细胞被转化而表达岩藻糖激酶、岩藻糖-1-磷酸鸟苷酸基转移酶和岩藻糖基转移酶。
国际公开WO 2007/101 862A1公开了一种生产唾液酸化寡糖的方法，其中微生物包含编码CMP-Neu5Ac合成酶、唾液酸合成酶、GlcNAc-6-磷酸2差向异构酶和唾液酸基转移酶的异源基因，并且其中编码唾液酸醛缩酶和ManNac激酶的基因已被缺失或灭活，在能够包含外源前体如乳糖的培养基中进行培养。
欧洲专利申请EP 3 575 404 A1公开了使用基因工程化微生物细胞发酵生产唾液酸化糖的方法。该基因工程化微生物细胞包含(i)唾液酸生物合成途径，其包含葡糖胺-6-磷酸N-乙酰转移酶，(ii)5-胞苷5'-单磷酸-(CMP)-N-乙酰神经氨酸合成酶，和(iii)唾液酸基转移酶。
国际公开WO 2018/122225 A1描述了能够通过细胞内生物合成途径合成唾液酸化化合物的工程化微生物。这些微生物能够将N-乙酰葡糖胺-6-磷酸脱磷酸化成N-乙酰葡糖胺，并将所述N-乙酰葡萄糖胺转化为N-乙酰甘露糖胺。这些微生物还具有将N-乙酰甘露糖胺转化为N-乙酰神经酰胺的能力。还公开了一种唾液酸化化合物的体内合成方法，其中所述工程化微生物在培养基中进行培养，所述培养基可选地含有外源性前体，并且使N-乙酰葡糖胺-6-磷酸细胞内脱磷酸，并通过N-乙酰甘露糖胺将所得到的N-乙酰葡糖胺转化为N-乙酰神经酰胺。
具体而言，与化学或生物化学合成方法相比，用于生产HMO的发酵方法具有成本有效性。已经建立了使用代谢工程化微生物发酵生产三糖HMO，如2'-岩藻糖基乳糖和3-岩藻糖基乳糖，而大量提供这些寡糖。然而，即使在发酵工艺中，由于所需寡糖的微生物生产中使用的酶的混杂性、碳水化合物的化学修饰和/或构成最终寡糖产品中污染物的剩余起始材料，会合成副产物。这些污染物，也称为副产物，通常在结构上与所需的寡糖密切相关。因此，从所需的寡糖中分离所述副产物特别困难。
例如，乳糖-N-新四糖(LNnT)的发酵合成是一个具有挑战性的方法，因为所述分子的非还原端会模拟乳糖的非还原端，因为两个分子在其非还原端都具有β-1,4-连接的半乳糖残基。值得注意的是，乳糖是LNnT发酵生产的起始材料或中间体。在LNnT的发酵生产中由微生物细胞利用的糖基转移酶的非特异性反应会导致大量形成副产物，如五糖或六糖。
此外，乳糖-N-三糖II(LNT-II)是LNnT生物合成的中间体。LNT-II能够有效地从合成LNnT的微生物细胞中转运出。去除LNT-II和其他三糖副产物，以及在LNnT产物的链延伸时形成的副产物，具有挑战性并且成本高昂。
另一个相关问题是当在微生物细胞中生产五糖如HMO乳糖-N-岩藻五糖III(LNFP-III)时会形成副产物。在使用单细胞从乳糖合成LNT-II、从LNT-II合成LNnT和从LNnT合成LNFP-III的发酵生产方法中，在LNnT的合成中已经出现的所有副产物都能够充当LNnT转化为LNFP-III的最终岩藻糖基化反应的底物。这会导致岩藻糖基化和非岩藻糖基化三糖、四糖、除LNFP-III外的五糖、六糖和甚至更大的寡糖的胞内混合物。这些非所需的副产物必须从所需寡糖的制备中去除，而使所需的寡糖能够以基本纯的制剂提供，即如果所需的寡糖预想供人消耗，则其纯度要符合监管机构的要求。优选所需寡糖在所述所需寡糖的基本纯制剂中具有≥80％、≥85％、≥90％、≥93％、≥95％、≥98％或甚至≥99％的纯度。
寡糖如HMO能够通过使用基因工程化微生物细胞发酵并向发酵培养基中添加乳糖作为酶促合成所需寡糖的初始底物进行生产。在这样的发酵方法中，能够生产多达六个单糖部分的寡糖。然而，由于所用糖基转移酶的混杂性，或碳水化合物的化学修饰，或中间寡糖的不完全转化，最终发酵液大多都会含有一堆不同长度和组成的寡糖。为了获得关于碳水化合物的纯产物，添加特定水解酶能够解决一些问题，但它要受到特定酶可用性的限制。在某些情况下，因为结构相似性，甚至不可能找到特异性降解副产物而不降解所需寡糖的酶，例如，在乳糖和LNnT中，两种5种碳水化合物中的β-1,4-糖苷键都会被β-半乳糖苷酶水解。
因此，非常需要成本高效的工业规模方法生产所需的寡糖，优选益生元寡糖，特别是所需的HMO。
该问题通过提供寡糖的发酵生产方法进行解决，其中所需寡糖的合成不是由乳糖作为单一微生物细胞中的起始材料而进行，而是由由至少三个单糖部分组成的中间寡糖进行。这种发酵生产方法能够利用成中间寡糖和所需寡糖的不同微生物细胞将形成所需寡糖的各个生物合成步骤拆分为各个发酵步骤。单独的发酵步骤可以与回收和/或纯化中间寡糖的工艺步骤相结合，然后将所述中间寡糖提供给随后的发酵步骤。使用这种方法，就有可能避免或至少减少发酵工艺过程结束时由中间寡糖的有害糖基化引起的非所需糖副产物的存在。
发明内容
提供了一种生产包含多于三个单糖部分的所需寡糖的方法，其中所述方法包括：提供一种基因工程化微生物细胞，其具有(i)促进所述基因工程化微生物单元摄取由至少三个单糖组成的寡糖的糖内向转运子(importer)，和(ii)能够将单糖部分从供体底物转移到由至少三个单糖部分组成的寡糖内的酶；在含有所述基因工程化微生物细胞摄取由至少三个单糖部分的寡糖并将至少一个单糖部分转移到所述由至少三个单糖部分组成的寡糖中的所述由至少三个单糖部分组成的寡糖的培养基中培养所述基因工程化微生物细胞，从而合成包含多于三个单糖部分的所需寡糖；和从所述培养基和/或所述基因工程化微生物细胞中回收所述所需寡糖。
更具体而言，该方法可以包括使用在单独的隔室中培养的至少两种不同的基因工程化微生物细胞，以逐步或按序方式生产更大的寡糖，即由至少四个单糖部分组成的寡糖，其中由所述至少两种不同的基因工程化微生物细胞中的一个产生的寡糖充当由所述最少两种基因工程化微生物细胞中另一种产生另一寡糖，例如，所需的寡糖或另一种中间寡糖的离析物。
当该方法以按序方式进行时，发酵步骤建立在先前发酵步骤的产物上。在最初的发酵步骤中生产寡糖产物(可选地含有非所需的寡糖副产物)。在随后的发酵步骤中，对初始发酵步骤的寡糖产物进行进一步处理，其中使所述非所需的寡糖副产物降解和/或所述产物的寡糖用作离析物。在按序发酵结束时，与在具有不同微生物的单个隔室中进行生产的方法相比，或通过使用各微生物菌株进行获得所需寡糖所需的所有酶促反应相比，会以更高的纯度获得所需的寡糖，即伴随有更少的非所需副产物。
该按序发酵方法通过使用具有合适的寡糖摄取和/或所需寡糖、中间寡糖、寡糖副产物和/或其他非所需的微生物产物或碳水化合物的外排性能的不同基因工程化微生物细胞(细菌和/或真核微生物(例如，酵母)而利用特异性生物合成隔室。
附图说明
图1显示了图示说明通过按序发酵生产所需寡糖的实施方式的示意图。
图2显示了图示说明通过按序发酵生产所需寡糖的实施方式的示意图。
图3显示了图示说明通过按序发酵生产所需寡糖的实施方式的示意图。
图4显示了图示说明通过按序发酵生产所需寡糖及其后续回收的实施方式的示意图。
图5图示说明了不同LNFP-III样品的MRM光谱的比较。
图6图示说明了不同LNnT样品的MRM光谱的比较。
图7图示说明了不同LNT-II样品的MRM光谱的比较。
图8图示说明了不同LNFP-II样品的MRM光谱的比较。
具体实施方式
本发明提供了一种生产所需寡糖的方法。正如本文所用，术语“寡糖”通常是指由至少三个，但不超过12个，优选不超过10个由糖苷键相互连接的单糖部分组成的聚合糖分子。聚合糖分子可以是单糖部分的线性链，或可以是支链分子，其中至少一个单糖部分具有通过糖苷键与其结合的至少三个单糖部分。该单糖部分能够选自醛糖(例如，阿拉伯糖、木糖、核糖、脱氧核糖、来苏糖、葡萄糖、艾杜糖、半乳糖、塔罗糖、阿洛糖、阿卓糖、甘露糖等)、酮糖(例如，核酮糖、木酮糖、果糖、山梨糖、塔格糖等)、脱氧糖(例如，N-乙酰葡糖胺、N-乙酰甘露糖氨基、N-乙酰半乳糖胺等)、糖醛酸(如半乳糖醛酸、葡糖醛酸等)和酮醛糖酸(例如，N-乙酰神经氨酸)的组中。
正如本文所用，术语“所需的寡糖”是指拟生产的寡糖。正如本文所用，术语“中间寡糖”是指在该方法中使用和/或合成的寡糖，但它不是构成该方法产生的最终产物的寡糖。应当理解的是，给定的寡糖可以是根据特定实施方式的方法中所需的寡糖，并且所述给定的寡糖也可以是根据另一特定实施方式的方法中的中间寡糖。
该方法包括：培养能够在含有由至少三个单糖部分组成但其由比所需寡糖更少的单糖部分组成的寡糖的培养基中合成所需寡糖的基因工程化微生物细胞。所述含有至少三个单糖部分的寡糖被称为“中间寡糖”。优选所述中间寡糖由一个或两个比所需寡糖少的单糖部分组成，因为在生产所需寡糖的方法中，一个、两个或更多个单糖部分与中间寡糖连接而变成所需的寡糖。
表1提供了能够通过本发明方法生产的所需寡糖和相应中间寡糖的非限制性列表。
表1：通过使用本发明的方法能够生产的所需寡糖以及要提供给所述培养基的中间寡糖的列表
该方法包括提供具有用于摄取由至少三个单糖部分组成的中间寡糖的糖内向转运子的基因工程化微生物细胞。所述的中间寡糖从外源性来源获得。因此，所述中间寡糖提供给培养基，并被所述基因工程化微生物细胞内化或吸收。该微生物细胞对中间寡糖的吸收可以通过跨细胞膜扩散而发生。
本文公开的方法的一个重要方面是将中间寡糖有效转运出入本方法中利用的微生物细胞，以及将所需的寡糖有效转运出用于被合成的微生物细胞。这种摄取(内向转运)和外排机制可以在微生物细胞中自然发生，或可以通过基因工程导致合适内向转运子和/或外向转运子的表达引入微生物细胞。
在具体实施方式中，通过在基因工程化的微生物细胞中实施中间寡糖内向转运系统的糖内向转运系统，会促进中间寡糖内化到所述基因工程化微生物细胞中而生产所需的寡糖。因此，该基因工程化微生物细胞具有用于摄取该中间寡糖的糖内向转运子。
为了使微生物细胞具有糖内向转运子而进行基因工程化，能够从细胞内降解此类寡糖的细菌基因组中获得编码复杂寡糖如HMO的糖内向转运子的基因。这种细菌能够，例如，作为共生体在哺乳动物的结肠或瘤胃中发现，也可以在昆虫肠道中发现。此外，在人乳喂养婴儿结肠中殖生的细菌中能够发现有效促进具有至少三个单糖部分的复杂寡糖如乳糖-N-三糖、乳糖-N-四糖或乳糖-N-新四糖摄取的转运蛋白。
在一个优选的实施方式中，胞外中间寡糖的内化由与微生物细胞异源的糖内向转运子促进。编码形成糖内向转运系统的蛋白质的基因或功能DNA序列在基因工程化微生物细胞中表达。为此，编码和表达所述糖内向转运子的核苷酸序列能够整合到微生物细胞的基因组中，或它们能够从染色体外和/或附加型载体进行转录。
已知几种肠道殖生细菌，如双歧杆菌和乳酸杆菌，能够在人乳寡糖上生长，作为唯一的碳源。复杂人乳寡糖的降解能够通过两种方式实现。细菌可以在培养基中分泌糖苷酶，以将人乳寡糖水解成单糖和双糖，然后通过众所周知的既知碳水化合物摄取系统将其转运入内。然而，已知几种双歧杆菌能够内化复杂寡糖(Garrido，D.et al.(2015).Comparativetranscriptomics reveals key differences in the response to milkoligosaccharides of infant gut-associated bifidobacteria.Scientific reports,5,13517)；(E.,&Sela,D.A.(2018).Inefficient metabolism of the human milkoligosaccharides lacto-N-tetraose and lacto-N-neotetraose shiftsBifidobacterium longum subsp.infantis physiology.Frontiers in Nutrition,5,46.)；(James,K.et al.15(2016).Bifidobacterium breve UCC2003 metabolises thehuman milk oligosaccharides lacto-N-tetraose and lacto-N-neotetraose throughoverlapping,yet distinct pathways.Scientific reports,6,38560)。这些细菌使用的转运系统包括具有2-3个辅助膜/ATP酶亚基的ATP依赖性渗透酶和相关的细胞质外溶质结合蛋白。该溶质结合蛋白在接受具有两到八个单糖单元的寡糖的结合碳水化合物链中表现出高度混杂性(Garrido,D.et al.(2011).Oligosaccharide binding proteins fromBifidobacterium longum subsp.infantis reveal a preference for hostglycans.PLoS One,6(3),e17315.)。
一种体内内向转运系统构建于表达胞浆水解酶而在细胞内切割人乳寡糖的长双歧杆菌(B.longum)菌株中。编码寡糖转运蛋白的异源基因的表达使菌株能够在特定的人乳寡糖上生长(Sakanaka，M.et al.(2019).Evolutionary adaptation in fucosyllactoseuptake systems supports bifido-bacteria-infant symbiosis.Science advances,5(8),eaaw7696)。来自革兰氏阳性细菌长双歧杆菌的果糖ABC-内向转运子能够补充果糖摄取不足的大肠杆菌菌株(Wei,X.et al.(2012).Fructose uptake in Bifido-bacteriumlongum NCC2705 is mediated by an ATP-binding cassette transporter.Journal ofBiological Chemistry,287(1),357-367)。然而，迄今为止，双歧杆菌或其他已知代谢HMO的细菌的HMO内向转运系统尚未以功能性方式克隆到大肠杆菌中。编码类似HMO摄取转运系统的蛋白质的基因对于长双歧杆菌和短双歧杆菌的物种进行了描述。
当试图定义人肠道微生物群的组成时，必须指出的是，生活在人类肠道中的大量细菌物种是不可繁殖的，因此，包括HMO的内向转运系统的代谢特征的整个功能目前尚不明确(Almeida，A.et al.(2019).A new genomic blueprint of the 10human gutmicrobiota.Nature,568(7753),499)。通过搜索人乳喂养婴儿的粪便的宏基因组，找到HMO内向转运促进蛋白的可能性并非不重要。通过在细胞中鉴定和功能表达尚未描述的内向转运系统以产生所需的寡糖，就能够解决中间寡糖的内化问题。
编码具有至少三个单糖单元的寡糖的糖内向转运子的基因或核苷酸序列能够获自从适当环境中分离出的宏基因组或从已知携带这种寡糖摄取机制的细菌菌株或其组合。
革兰氏阴性菌，如大肠杆菌，具有双层细胞膜而ABC转运蛋白采用周质连接细胞质。孔蛋白会促进复杂寡糖通过外膜摄入周质。孔蛋白是形成通道的蛋白质，允许大分子或带电分子跨外膜扩散。这种寡糖孔蛋白的一个实例是大肠杆菌中的ChiP，它是(GlcNAc)3-6的壳寡糖特异性外膜孔蛋白。(Verma，S.C.&Mahadevan，S.(2012).The chbG gene of thechito-biose(chb)operon ofEscherichia coli encodes a chitooligosaccharidedeacetylase.Journal of Bacteriology,194(18),4959-4971)。孔蛋白的另一个实例是来自大肠杆菌的RafY，已证实其构成碳水化合物非特异性大孔，促进寡糖在大肠杆菌外膜上向上扩散至己糖(Andersen,C.et al.(1998).The porin RafY encoded by theraffinose plasmid pRSD2 of Escherichia coli forms a general diffusion poreand not a carbohydrate-specific porin.European Journal of Biochemistry,254(3),679-684)。
除了用于将中间寡糖通过内膜摄取到细胞质中的糖内向转运子外，还能够使用促进中间寡糖通过微生物细胞如大肠杆菌外膜转运的成孔蛋白而提高微生物细胞对中间寡糖的摄取。
在一个实施方式中，微生物细胞具有编码和表达或过表达成孔蛋白的功能基因或等效核苷酸序列。功能基因可以是微生物细胞内源性的，或所述基因的蛋白质编码区可以源自不同的物种。
该方法包括通过所提供的基因工程化微生物细胞合成所需的寡糖。所述基因工程化微生物细胞包含能够将单糖部分从供体底物转移到中间寡糖内的酶。在某些实施方式中，所述基因工程化微生物是经基因工程化而具有能够将单糖部分从供体底物转移到中间寡糖内的酶的细胞，其中所述基因工程化微生物细胞包含用于表达能够将单糖从供体底物转运到中间寡糖内的酶的功能基因。
用于表达能够将单糖部分从供体底物转移到中间寡糖内的酶的功能基因是编码所述酶的氨基酸序列的核酸序列。所述功能性核酸序列进一步包含表达控制序列。所述表达控制序列可操作地连接至编码所述酶的一个或多个氨基酸序列的所述核酸序列，并介导编码所述酶的一个(多个)氨基酸序列的核酸序列的表达。表达控制序列可以选自由启动子、增强子和终止子组成的组中。
赋予将单糖部分添加到遗传修饰细胞的内化中间寡糖的酶促能力的功能基因或等效DNA序列能够是源自植物、动物、细菌、古菌、真菌或病毒的同源核苷酸序列或异源核苷酸序列。
将单糖部分能够从供体底物转移到中间寡糖内的酶可以是糖基转移酶或转糖苷酶。糖基转移酶和转糖苷酶的实例描述于碳水化合物活性酶数据库(Carbohydrate ActiveEnzymes database)(CAZy)(http://www.cazy.org)中和文献中，但天然或工程化的糖基转移酶和转糖苷酶的序列并不限于这些实例。
该糖基转移酶会催化单糖部分从作为供体底物的核苷酸活化糖转移到受体分子，例如，中间寡糖内。该葡糖基转移酶可以选自由半乳糖基转移酶类、葡糖氨基转移酶类、唾液酸基转移酶类、N-乙酰葡糖氨基移酶类、N-乙酰半乳糖氨基转移酶类、葡糖醛酸基转移酶类、甘露糖基转移酶类、木糖基转移酶类和岩藻糖基转移酶组成的葡糖基移酶组中。在具体实施方式中，该糖基转移酶是α-1,2-甘露糖基转移酶类、β-1,4-木糖基转移酶、β-1,3-N-乙酰基-葡糖胺基转移酶、β-1,6-N-乙酰基葡糖胺转移酶、β-1,3-N-乙酰基-半乳糖氨基转移酶、β-1,4-N-乙酰基-半乳糖氨基转移酶、α-1,3-N-乙酰基半乳糖氨基转移酶、β-1,3-半乳糖基转移酶、β-1,4-半乳糖基转移酶、β-1,6-半乳糖基转移酶、α-1,3-葡糖基转移酶、α-4-葡糖基-转移酶、α-2,3-唾液酸基转移酶、α-2,6-唾液酸基转移酶、α-2,8-唾液酸基转移酶、α-1,2-岩藻糖基转移酶、α-1,3-岩藻糖基转移酶或α-1,3/1,4-岩藻糖基转移酶。
用于转移单糖部分的供体底物可以是核苷酸活化糖，或糖，优选寡糖。核苷酸活化糖是糖基转移酶使用的单糖部分的供体底物。该核苷酸活化糖可以是GDP-岩藻糖、UDP-半乳糖、UDP-葡萄糖、CMP-N-乙酰神经氨酸、GDP-甘露糖、UDP-N-乙酰半乳糖氨或UDP-N-乙酰基葡糖胺。据了解，岩藻糖基转移酶利用GDP-岩藻糖作为供体底物，将岩藻糖部分从GDP-岩藻糖转移到受体分子，而半乳糖转移酶利用UDP-半乳糖作为供体底物，将半乳糖部分转移到受体底物，等等。
葡糖基转移酶用作供体底物的核苷酸活化糖由基因工程化微生物细胞在从头生物合成途径中和/或通过使用挽救途径进行合成。
当该基因工程化微生物细胞从头合成核苷酸活化糖时，微生物细胞具有构成代谢途径的酶，用于从简单的碳源如葡萄糖、蔗糖、果糖、甘油等从头合成所述核苷酸活化糖。
在某些实施方式中，从头合成核苷酸活化糖的基因工程化微生物细胞已经经过基因工程化而包含并表达编码用于核苷酸活化糖从头生物合成的所有酶的基因。所述基因可以是微生物细胞内源性的，或任何一个所述基因都能够源自其他生物体并被引入所述微生物细胞中而以功能性方式进行转录和翻译。
在挽救途径中用作形成核苷酸活化糖的底物的单糖能够被微生物细胞被动摄取，或该单糖的内化能够通过转运子促进，优选通过编码这种转运子的内源性基因的过表达和/或通过编码这种转运子的异源基因的表达促进。微生物细胞摄取单糖的单糖转运子的实例是来自大肠杆菌的岩藻糖渗透酶FucP或唾液酸转运子NanT。
当使用用于生物合成作为供体底物的核苷酸活化糖的补救途径时，该微生物细胞包含催化核苷酸转移到单糖的酶。这类酶的实例是催化激酶和焦磷酸酶反应而形成GDP岩藻糖的双功能岩藻激酶/L-岩藻糖-1-P-鸟苷基转移酶(EC 2.7.7.30)，例如，来自脆弱拟杆菌的FKP(WO 2010/070104A1)和形成CMP-神经氨酸的N-乙酰神经氨酸胞苷基转移酶(EC27.7.43)。
该基因工程化微生物细胞包含该转运子的功能性核酸序列，该转运子促进由至少三个单糖部分但比所需寡糖少的单糖部分组成的中间寡糖的摄取。
在另一个实施方式中，该基因工程化微生物细胞含有转糖苷酶。该转糖苷酶可以是异源转糖苷酶。因此，该基因工程化微生物细胞可以具有编码转糖苷酶的功能基因或与所述功能基因等效的核苷酸序列。该转糖苷酶是能够催化二糖或寡糖水解(糖苷酶活性)的酶，并且在逆反应中将糖苷残基从糖苷供体转移到受体底物。
具有转糖苷酶活性的糖苷酶能够外作用或内作用于碳水化合物底物。具有转葡糖苷酶活性的糖苷酶的实例是对于，例如，纤维二糖酶、岩藻糖苷酶、唾液酸苷酶、葡糖苷酶、半乳糖苷酶、乳糖-N-二糖苷酶和壳聚糖酶。
在一个具体实施方式中，用于生物合成人乳寡糖的转糖苷酶能够选自由β-1,3-半乳糖苷酶、β-1,4-半乳糖苷酶、β-1,6-半乳糖苷酶、α-1,2-岩藻糖苷酶、α-1,3-岩藻糖苷酶、α-2,3-唾液酸苷酶、α-2,6-唾液酸苷酶和β-N-乙酰己糖胺酶。
编码用于提供用于生产所需寡糖的基因工程化微生物细胞的转糖苷酶的核苷酸序列可以在自然界中找到，或可以使用遗传技术对其进行修饰以有利于对抗糖苷酶反应的转糖基化反应。本领域普通技术人员知晓如何修饰核苷酸序列而获得具有转糖苷酶增强活性的酶(Zeuner，B.et al.(2019).Synthesis of human milk oligosaccharides:Proteinengineering strategies for improved enzymatic transglycosylation.Molecules,24(11),2033)。
优选在微生物细胞中用于转糖基化的酶应该不表达或仅表达对受体底物非常低的水解酶活性。水解酶活性与其转糖苷酶活性相比应该小于10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％，优选小于0.01％。
在一些实施方式中，所用的转糖苷酶是α-1,3/4-岩藻糖苷酶，其催化L-岩藻糖部分从供体寡糖转移到含N-乙酰葡糖胺部分的寡糖受体，即中间寡糖。该中间寡糖加入培养基中，在该培养基中生长含有α-1,3/4-岩藻糖苷酶活性的微生物细胞。该供体寡糖由细胞合成，或也加入该培养基中并内化到细胞中。
在优选的实施方式中，该α-1,3/4-岩藻糖苷酶是来自双歧杆菌的AfcB，而供体底物是3-岩藻糖基乳糖。酶AfcB的水解酶活性通过蛋白质工程化而被消除(Zeuner，B.et al.(2018).Loop engineering of anα-1,3/4-l-fucosidase for improved synthesis ofhuman milk oligo-saccharides.Enzyme and microbial technology,115,37-44)。从对该内化中间寡糖的细胞内转糖基化反应中获得的产物是α-1,3-岩藻糖基化或α-1,4-岩藻糖基化寡糖。当使用工程化AfcB和3-FL作为供体底物时，岩藻糖基寡糖产物能够获自该内化受体底物：1)当中间寡糖为LNT时是LNFP-II，2)当中间寡糖为LNnT时是LNFP-Ⅲ，3)当中间寡糖为LNFP-Ⅰ时是LNDFH-1。
当使用转糖苷酶延长寡糖时，供体底物是二糖或寡糖。供体底物能够通过基因修饰细胞进行合成，或能够内化于细胞外来源。该供体底物的摄取能够通过扩散而被动进行，或供体底物的摄入能够通过宿主细胞内源性的转运系统或重组到宿主细胞的转运系统而实现。这种糖转运系统能够发现于，但不限于，含有二级转运机制的主要促进者超家族，或ATP依赖性转运系统(ABC转运子)中。
该基因工程化微生物细胞可以是原核细胞或真核细胞。用于通过本文公开的方法生产所需寡糖的基因工程真核细胞的非限制性实例是酵母细胞。酵母细胞可以选自由酿酒酵母组成的属组，如酿酒酵母、裂殖酵母(Schizosaccharomyces)、毕赤酵母(Pichia)、汉逊酵母(Hanensula)和亚罗酵母(Yarrowia)。该基因工程原核细胞可以是选自埃希氏菌(Escherichia sp.)、棒状杆菌、芽孢杆菌(Bacillus sp.)、乳酸杆菌、乳球菌和假单胞菌的一组属的细胞。用于生产所需寡糖的特别合适的原核细胞是大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌和枯草芽孢杆菌。
基因工程化微生物细胞包括一个或多个外源功能基因。外源功能基因要么从染色体外载体转录，要么整合到基因工程化微生物细胞的基因组。这些功能基因的转录是组成型或诱导型的，例如，通过添加外部诱导剂或通过诱导细胞合成的代谢产物。本领域技术人员知晓如何构造设计构成功能基因的核苷酸序列，所述功能基因包括启动子、可选的操作子、核糖体结合位点、所关注的蛋白编码序列和转录终止子，以获得组成型或诱导型重组表达。
生物合成内源性基因编码的酶，可以通过基因修饰微生物细胞进行修饰，例如，导致表达增强或减弱。遗传修饰包括，但不限于，修饰转录启动子和操作子序列，修饰核糖体结合位点，修饰密码子用法，或修饰细胞中一个或多个所关注基因的拷贝数。功能性核苷酸序列的修饰能够导致一个或多个所关注基因的过表达，或导致不同基因的更平衡表达，以获得用于合成所需寡糖的最佳量的核苷酸活化糖供体底物。
获得所关注基因过表达的遗传修饰是指所关注基因的表达高于野生型细胞中的表达。该基因修饰使所关注基因的表达增加10％、20％、30％、40％或50％。优选与野生型中的表达相比，该表达增加2倍或高达10倍。该过表达能够是组成型，或通过添加外部诱导剂或通过诱导细胞合成的代谢产物的诱导型。
该基因工程化微生物细胞不含有任何酶促活性，这些酶活性可降解内化到细胞中的受体底物，或在使用转葡糖基化反应的情况下，供体底物被细胞吸收或被细胞合成。
在根据本文公开的方法生产人乳寡糖的方法中，要培养基因工程化微生物细胞，所述基因工程化微生物细胞可以具有：
-至少一种编码糖基转移酶的功能性基因，和
-使所述细胞能够合成一种或多种核苷酸活化糖作为供体底物的基因，或编码能够由单糖前体合成核苷酸活化糖的酶的基因；和/或
-至少一种编码具有转糖苷酶活性的酶的功能基因，和允许该微生物细胞摄取寡糖(二糖或三糖)而用作转糖苷酶反应中的供体底物的功能基因；和
-至少一种编码寡糖转运系统的功能性基因，以促进具有三个或更多单糖单元的寡糖的摄取，所述寡糖应该在糖基转移酶或转糖苷酶反应中用作中间寡糖，从而获得具有四个、五个或更多个单糖单元的所需寡糖。
该基因工程化微生物细胞不含任何易于降解内化到细胞中的受体底物的酶活性，或在使用转糖基化反应的情况下，该供体底物由细胞吸收或由细胞合成。
该方法包括在含有用于基因工程化微生物细胞摄取中间寡糖并将至少一个单糖部分从供体底物转移到所述中间寡糖的中间寡糖的培养基中培养生产所需寡糖的基因工程化微生物细胞，从而合成所需的寡糖。
培养所述基因工程化微生物细胞是指在含有碳源和中间寡糖的培养基中培养该微生物细胞。该培养基可以含有另外的化合物。如果单糖部分通过糖苷酶转移到该中间寡糖，则单糖部分的供体底物能够添加到培养基中，而由此也能够包含于培养基中。碳源可以选自由甘油、葡萄糖、果糖、蔗糖、纤维素、糖原、乳糖或更复杂的底物如莫拉糖(molasse)和/或玉米糖浆组成的组。优选该碳源选自甘油、葡萄糖、果糖、蔗糖中的至少一种。
培养所述微生物细胞能够作为间歇式发酵、补料间歇式发酵或以连续式发酵方式进行。优选该培养作为补料间歇式发酵进行，该补料间歇式培养包括具有过量碳源的微生物细胞的指数生长阶段和受碳源的可用性限制的后续细胞生长阶段。更优选的是涉及用于生产中间寡糖、生产所需寡糖和/或降解非所需的寡糖副产物的限定隔室的连续式按序发酵工艺过程。
在最后一个发酵步骤结束时，即在该微生物细胞合成所需寡糖的发酵步骤结束后，从所述培养基和/或所述微生物细胞中回收所需寡糖而生产所需的寡糖。
回收所需寡糖可以包括各种回收步骤，包括，但不限于，离心、微滤、超滤、纳滤、离子交换处理(阳离子交换处理和/或阴离子交换处理)、电渗析、反渗透、溶剂蒸发、结晶、喷雾干燥和/或活性炭处理。应该理解的是(在第一个回收步骤中)所述微生物细胞从培养基中分离出来。这种分离可以通过离心和/或微滤和超滤步骤而获得。
通过破坏产生所需寡糖的微生物细胞并从该微生物细胞的细胞质部分回收所需的寡糖，就能够从所述微生物细胞中获得所需的寡糖。
在一个优选的实施方式中，生产所需寡糖的微生物细胞将所述寡糖分泌到培养基中。然后在发酵步骤结束时通过离心和/或过滤将所述微生物细胞从该培养基中分离出来，并从所述无细胞培养基中回收所需的寡糖。
所需寡糖的分泌可以通过细胞膜上的被动扩散或通过主动转运过程进行。编码促进所需寡糖或与功能基因等效的核苷酸序列的向外转运过程的蛋白质的功能基因可以是基因工程化微生物细胞内源性的，也可以是重组的。在功能基因或与其等价的核苷酸序列是重组的情况下，它们可以从基因组整合拷贝(通过将表达片段(操纵子)整合到基因组中)或从染色体外载体表达于所述微生物细胞中。
对于所需寡糖的回收或在回收期间，该培养基或细胞内部分能够经历一系列连续的过滤步骤，以i)从培养基中分离出生物质，例如，通过微滤和超滤；ii)例如通过纳滤去除小分子如水、单糖或盐；iii)例如通过反渗透或蒸发而浓缩含寡糖的溶液。该浓缩物能够进行进一步的纯化步骤，例如，通过在活性炭上对该浓缩物进行处理。如有必要，通过电渗析能够对所需寡糖进行去离子，和/或进行过滤以去除内毒素和微生物，这在回收过程中对所需寡糖进行加工期间而完成，从而获得微生物载量非常低的产品。
回收/纯化的所需寡糖能够以液体形式或作为干燥的物质进行储存和使用。为了获得固体形式的所需寡糖，能够将其冷冻干燥，喷雾干燥，造粒，结晶，在滚筒干燥器或带式干燥器上进行干燥。
如果回收/纯化的所需寡糖是人乳寡糖，能够将其用作婴儿配方奶粉、幼儿配方奶粉、婴儿谷物、用作饮料的功能性食品、酒吧、酸奶等、医疗营养品或普通食品中的补充剂。
所需的寡糖能够单独使用，或也能够与其他寡糖组合使用。这些其他寡糖也能够属于人乳寡糖组或其他寡糖，如低聚半乳糖、麦芽糊精或低聚果糖。
所需寡糖或所需寡糖与其他寡糖的组合能够与益生菌组合用于上述任何一种食品中。优选所述益生菌是双歧杆菌属和乳酸杆菌属中的一个或多个属的细菌菌株。
众所周知，人乳寡糖对新生儿的发育和成人的健康都有广泛的积极影响。人乳寡糖是益生元，因此有利于新生儿肠道中健康微生物组的发育(Chu,D.M.,&Aagaard,K.M.(2016).Microbiome:Eating for trillions.Nature,532(7599),316)。此外，这些寡糖已经证明能够降低由细菌或病毒病原体引起的传染病的风险(Craft,K.M.,&Townsend,S.D.(2017).The human milk glycome as a defense against infectious diseases:rationale,challenges,and opportunities.ACS infectious diseases,4(2),77-83)，并直接起抗菌作用(Craft,K.M.,&Townsend,S.D.(2019).Mother Knows Best:Decipheringthe Antibacterial Properties of Human Milk Oligosaccharides.Accounts ofchemical research,52(3),760-768)。唾液酸化寡糖据发现会为发育中的大脑提供唾液酸(Wang,B.(2009).Sialic acid is an essential nutrient for brain development andcognition.Annual review of nutrition,29,177-222；Mudd,A.et al.(2017).Dietarysialyllactose influences sialic acid concentrations in the prefrontal cortexand magnetic resonance imaging measures in corpus callosum of youngpigs.Nutrients,9(12),1297)。在成人中，人乳寡糖已经证明会改善IBS患者的肠道微生物群和代谢产物组成(Jackson,F.et al.(2018).Human Milk Oligosaccharides Are Ableto Impact the Gut Microbiota and Metabolites in Irritable Bowel SyndromePatients:2788.American Journal of Gastroenterology,113,S1548)。
所需寡糖或所需寡糖与其他寡糖和/或与益生菌的组合能够作为食品补充剂用于预防微生态失调、预防特定传染病或增强免疫系统。
通过化学合成或生物催化使用纯化或富集的酶制剂或合成合适酶的细胞的粗细胞提取物就能够获得该中间寡糖。在一个优选的实施方式中，该中间寡糖通过使用基因工程化微生物细胞由简单碳源、二糖或另一寡糖生产中间寡糖的微生物发酵而获得。
在使用按序发酵步骤的这些实施方式中，使用不同的基因工程化微生物细胞生产中间寡糖和所需寡糖。例如，该中间寡糖可以通过基因工程酵母细胞生产，而所需的寡糖通过该基因工程化细菌细胞由中间寡糖生产，反之亦然。
在一些实施方式中，该中间寡糖从培养基中进行至少部分纯化，因为在提供中间寡糖的发酵步骤结束时培养基会经历一个或多个纯化步骤。用于纯化中间寡糖的所述至少一个纯化步骤可以选自离心、微滤、超滤、纳滤、离子交换处理(阳离子交换处理和/或阴离子交换处理)、电渗析、反渗透、溶剂蒸发、结晶、喷雾干燥和/或活性炭处理。
应当理解的是，在使用由此获得的含中间寡糖的无细胞培养基作为培养基而培养用于生产所需寡糖的基因工程化微生物细胞之前，至少从含中间寡糖的培养基中去除用于生产中间寡糖的微生物细胞。
从一个发酵步骤获得的中间寡糖能够通过使用i)在发酵步骤结束时和在去除微生物细胞后的培养基；ii)作为工艺物流，其中所述中间寡糖相比于所述培养基而被富集，例如，因为含中间寡糖的无细胞培养基经历了至少一个脱盐步骤和/或至少一个脱色步骤；和/或iii)通过添加作为浓缩物或作为固体材料的纯化中间寡糖，转移到下一个发酵步骤。
在该方法的最后一个发酵步骤期间未转化为所需寡糖的中间寡糖能够通过添加对剩余中间寡糖和/或对中间寡糖的降解产物表现出而对所需寡糖却不表现出特异性水解活性的酶进行降解。这些表现出所述特异性水解活性的酶能够作为纯酶、表达所述酶的细胞的粗提取物或通过添加合成所述酶并且优选将这些表现出特定水解活活性的酶分泌到培养基中的第二组微生物细胞而进行添加。剩余中间寡糖的水解降解有助于从培养基中回收和纯化所需的寡糖，因为所需的寡糖和中间寡糖彼此仅在一个或两个单糖部分上不同，而因此很难以合理的成本通过工业规模的技术手段而相互分离。
在优选实施方式中，根据本发明的方法包括用于生产中间寡糖的第一发酵步骤。用于生产这种中间寡糖的基因工程化微生物细胞包含糖基转移酶，以将单糖部分从供体底物转移到受体底物。该供体底物可以是如前所述的核苷酸活化糖。受体底物是乳糖。乳糖被添加到培养基中，并被相应的微生物细胞摄取，以将乳糖转化为由至少三个单糖单元组成的中间寡糖。
在另一个实施方式中，该受体亚态乳糖通过在第一发酵步骤中使用的基因工程化微生物细胞合成。该微生物细胞包含将半乳糖分子特异性转移到葡萄糖分子上的β-1,4-半乳糖基转移酶。该微生物细胞还含有第二糖基转移酶，利用细胞内产生的乳糖作为受体底物合成三个单糖单元的中间寡糖。用于培养该微生物细胞的培养基可以含有蔗糖、葡萄糖或甘油和葡萄糖的组合作为碳源。该微生物细胞可能已经经过工程化而使将葡萄糖转化为葡萄糖-6-磷酸的酶已经从该微生物细胞的基因组中灭活或缺失。
该中间寡糖能够i)在发酵步骤中一次，ii)在发酵步骤期间以间歇多次，或iii)在整个发酵步骤中以连续的方式添加到用于培养微生物细胞而生产所需寡糖的培养基中。
该方法可以包括将所需寡糖的合成分成至少两个单独的发酵步骤，每个步骤利用不同的基因工程化微生物细胞，该细胞具有合成在该特定发酵步骤中获得的寡糖所需的酶活性。
与使用单个基因修饰细胞直接生产所需寡糖相反，将含有比所需寡糖少的至少一个单糖部分的中间寡糖作为前体添加到培养基中，被基因工程化微生物细胞摄取，并通过被一个或多个单糖单元延长而转化为所需的寡糖。
具有四个、五个或更多个单糖单元的所需寡糖的按序发酵方法包括两个或更多个发酵步骤。在第一发酵步骤中，使用外源受体底物如乳糖培养所述基因工程化微生物细胞而生产包含三个或更多个单糖单元的中间寡糖。该微生物细胞优选将所述中间寡糖分泌到培养基中。该中间寡糖能够从培养基中(至少部分)进行纯化，能够通过去除污染物质，特别是其他碳水化合物而进行富集，或含有所述中间寡糖的培养基能够直接用于第二个培养步骤。在第二发酵步骤中，在含有所述中间寡糖的培养基中培养第二基因工程化微生物细胞，以由所述微生物细胞延伸一个或多个单糖单元。在可选的第三发酵步骤中，从第二发酵获得的寡糖能够作为前体应用于能够摄取该寡糖并通过添加一个或多个单糖单元而修饰该寡糖的还有的另一基因工程化微生物细胞。
在本发明的一个具体实施方式中，所需的寡糖是三糖，而所述中间寡糖是乳糖，其由能够使用将半乳糖单元连接到添加到发酵过程中的葡萄糖的特定半乳糖基转移酶合成乳糖的生物体生产。所添加的葡萄糖能够也用作半乳糖基转移酶反应的C-源和底物，或除了另一个C-源之外还能够将葡萄糖添加到发酵培养基中，或通过在将蔗糖作为碳源进料时转化另一个酶促反应如蔗糖水解酶能够获得用作酶促半乳糖基转移酶反应的底物的葡萄糖。
在其他实施方式中，通过在单独的发酵步骤中使用不同的基因工程化微生物细胞而生产两种不同的中间寡糖。这两种中间寡糖中的任何一种从其培养基中纯化或从其培养基中富集，或将该培养基直接用于第三发酵步骤，其中第三基因工程化微生物细胞使用所述两种中间寡糖而生产所需的寡糖。
在本发明的另一个实施方式中，寡糖生产的单独步骤并未在空间分离的发酵容器中进行，而是在由半透膜分隔成两个隔室的单个容器中进行。所述半透膜的特性允许由两个隔室中的一个隔室的第一基因工程化微生物细胞生产的中间寡糖流入另一个隔室内，但不允许由第二基因工程化微生物单元产生的更复杂寡糖流入。因此，例如，在一个隔室中生长的微生物细胞能够将添加到发酵容器中的外源受体乳糖转化为包含三个单糖单元的中间寡糖。该三糖通过半透膜，被生长于第二隔室中的第二微生物细胞摄取，并转化为包含至少四个单糖的更复杂寡糖。
在一个实施方式中，包含四个或多个单糖单元的所需寡糖是四糖。所述基因工程化微生物细胞包含β-1,3-半乳糖基转移酶或β-1,4-半乳糖基转移酶。此外，该基因工程化微生物细胞将会生产UDP-半乳糖。该中间寡糖是一种被所述基因工程化微生物细胞内化并半乳糖基化而获得四糖的三糖。在一个优选的实施方式中，当该微生物细胞分别具有β-1,3-半乳糖基转移酶或β-1,4-半乳糖基转移酶时，该中间寡糖是LNT II，而所需寡糖是乳糖-N-四糖(LNT)或乳糖-N-新四糖(LNnT)。
在另一个实施方式中，所需的寡糖是由至少五个单糖部分组成的岩藻糖基寡糖。该基因工程化微生物细胞具有α-1,2-岩藻糖基转移酶、α-1,3-岩藻糖基转移酶或α-1,3/4岩藻糖转移酶。此外，该基因工程化微生物细胞能够合成GDP-岩藻糖。该基因工程化微生物细胞摄取的中间寡糖是四糖。当提供LNT作为中间寡糖并且该基因工程化微生物细胞具有α-1,2-岩藻糖基转移酶时，所生产的所需寡糖是LNFP-I。如果该基因工程化微生物细胞具有α-1,3/4-岩藻糖基转移酶，则所生产的寡糖为LNFP-II或LNFP-V。如果该基因工程化微生物细胞具有α-1,3-岩藻糖基转移酶，则所需的寡糖为LNFP-V。
当提供LNnT作为中间寡糖时，所获得的所需寡糖是LNnFP-I或LNFP-III，前提是该基因工程化微生物细胞分别具有α-1,2-岩藻糖基转移酶或α-1,3/4岩藻糖基转移酶。
在另一个实施方式中，所需的寡糖是六糖。生产六糖的基因工程化微生物细胞具有两个糖基转移酶基因，一个是α-1,2-果糖基转移酶，而另一个是α-1,3-N-乙酰基-半乳糖氨基转移酶。该基因工程化微生物细胞能够合成GDP-岩藻糖和UDP-N-乙酰半乳糖胺。当LNT作为中间寡糖提供时，所需的寡糖是人血型抗原(HBGA)A 1型，或当LNnT作为中间寡糖提供时是HBGA A 2型。
在生产HBGA A 1型和A 2型聚糖的替代实施方式中，该基因工程化微生物细胞具有α-1,3-N-乙酰半乳糖氨基转移酶，能够合成UDP-N-乙酰半乳糖胺并将LNFP I或LNnFP I内化为中间寡糖。因此，当所需的寡糖是HBGA B 1型或HBGA B 2型时，所提供的中间寡糖是LNFP I或LNnFP I。用于修饰LNFP I和LNnFPⅠ作为中间寡糖的基因工程化微生物细胞具有α-1,3-半乳糖基转移酶，并能够合成UDP-半乳糖作为供体底物。
在还有的另一个实施方式中，所需的寡糖是乳糖-N-六糖(LNH)。通过第一发酵步骤获得的第一中间寡糖是LNT II。然后将所述LNT II提供给第二发酵步骤。在第二发酵步骤中用作加工助剂的基因工程化微生物细胞包含β-1,3-半乳糖基转移酶，并且能够合成UDP-半乳糖。第二个发酵步骤产生LNT，该LNT可以在第三个发酵步骤中使用包含α-1,6-N-乙酰葡糖胺基转移酶并能够合成UDP-N-乙酰葡糖胺的基因工程化微生物细胞扩增一个N-乙酰葡糖胺部分。在第四个发酵步骤中，使用或能够使用另一包含β-1,4-半乳糖基转移酶并能够合成UDP-半乳糖的基因工程化微生物细胞生产所需的寡糖LNH。由于半乳糖转移酶的非特异性副反应，导致产生LNT和LNnT作为被α-1,3和α-1,6-N-乙酰葡糖胺基转移酶随后进行各种延长的中间体，则通过使用含有所有酶和此前在该段落中提及的代谢途径的基因工程化微生物细胞在单个发酵步骤中由乳糖生产LNH是不可能的。因此，通过单个基因工程化微生物细胞由乳糖生产LNH将导致大量非所需的寡糖，而这些寡糖又由此将在所需LNH产物中构成杂质，从而影响所述LNH的产率和纯度。
在另外和/或可替代的实施方式中，所需的寡糖包含至少一个唾液酸部分。添加到基因工程化微生物细胞中而内化和唾液酸化的中间寡糖包含至少四个单糖部分。优选所述中间寡糖是LNT而获得乳糖唾液酸基四糖a或b(LST a或LST b)，或是LNnT而获得LST c。生产这些所需寡糖之一的基因工程化微生物细胞具有α-2,3-唾液酸基转移酶或α-2,6-唾液酸基转移酶，并能够合成CMP-N-乙酰神经氨酸。
在另外和/或可替代的实施方式中，所需寡糖包含岩藻糖部分和唾液酸部分。当提供给基因工程化微生物细胞而待内化的中间寡糖是3-岩藻糖基乳糖时，则因为该基因工程化微生物细胞具有α-2,3-唾液酸基转移酶，并能够合成CMP-N-乙酰神经氨酸，岩藻糖唾液酸基乳糖作为所需的寡糖进行生产。
可替代地，通过将3-唾液酸基乳糖作为中间寡糖提供给具有α-1,3-岩藻糖基转移酶并能够合成GDP岩藻糖的基因工程化微生物细胞，岩藻糖-唾液酸基乳糖作为所需的寡糖进行生产。
表1中显示了从内化的中间寡糖生产包含四个、五个或更多个单糖部分的不同所需寡糖的其他实施方式。即使在表1中没有针对每个实施方式明确确定出，则用于将单糖部分从供体底物转移到中间寡糖的合适供体底物和酶能够从本公开中推断出来。
本发明将对照具体实施方式并参照附图进行描述，但本发明不限于此，而仅由权利要求书限定。此外，在说明书和权利要求书中的术语“第一”、“第二”等用于区分相似要素，而无论是在时间、空间、排名上还是以任何其他的方式并非一定用于描述顺序。应当理解，如此使用的术语在适当的情况下是可互换的，并且本文所描述的本发明的实施方式能够以除本文所描述或图示说明之外的其他顺序进行操作。
需要注意的是，权利要求书中使用的术语“包括”不应该被解释为仅限于其后列出的措施；它不排除其他要素或步骤。因此，它被解释为指定所述特征、整数、步骤或组件的存在，但不排除一个或多个其他特征、整数、步骤或组件或其组群的存在或添加。因此，表达“包括装置A和B的设备”的范围不应该限于仅由组件A和B组成的设备。这意味着就本发明而言，该设备的唯一相关组件是A和B。
在整个说明书中，所指“一个实施方式”或“一实施方式”是指结合该实施方式描述的具体特征、结构或特性包括于本发明的至少一个实施方式中。因此，在本说明书的各个地方出现的短语“在一个实施方式中”或“在一实施方式中”并非一定都指同一实施方式，而也可以是指同一实施方式。此外，具体特征、结构或特性可以以任何合适的方式，如本领域普通技术人员根据本公开中是显而易见的，组合于一个或多个实施方式中。
类似地，应当理解的是，在本发明的示例性实施方式的描述中，为了简化公开内容并有助于理解各种发明方面中的一个或多个各种本发明方面，本发明的各种特征有时一起被分组于单个实施方式、图或其描述中。然而，本公开的方法不应该解释为反映所要求保护的发明需要比每个权利要求中明确列举的更多特征的意图。相反，正如以下权利要求所反映，创新的方面在于少于单个前述公开的实施方式的所有特征。因此，在详细描述之后的权利要求在此被明确地引入到该详细描述中，每个权利要求独立地作为本发明的单独实施方式。
此外，虽然本文描述的一些实施方式包括一些，但不包括其他实施方式中包括的其他特征，但不同实施方式的特征的组合应落入本发明的范围内，并形成不同的实施方式，正如本领域技术人员所理解的情况。例如，在以下权利要求中，任何要求保护的实施方式都能够以任何组合使用。
此外，一些实施方式在本文中被描述为能够由计算机系统的处理器或通过执行该功能的其他手段实现的方法或各方法要素的组合。因此，具有用于执行这种方法或方法要素的必要指令的处理器就构成用于执行该方法或该方法要素的装置。此外，本文描述的设备实施方式的元件是用于实现由该元件执行的功能而实现本发明的装置的实施例。
在本文提供的说明书和附图中，阐述了许多具体细节。然而，应当理解的是，可以在没有这些具体细节的情况下实践本发明的实施方式。在其他情况下，为了不混淆对本说明书的理解，未详细显示众所周知的方法、结构和技术。
现在将通过对本发明的几个实施方式的详细描述而描述本发明。显而易见的是，在不脱离本发明的真正精神或技术教导的下，本发明的其他实施方式就能够根据本领域技术人员的认知进行构造设计，本发明仅受所附权利要求书的条款限制。
现在参考图1，依照生产LNnT的方法，示意性地图示说明了按序发酵的原理，该方法包括两个发酵步骤。在第一发酵容器(A)中进行第一发酵步骤。在第一发酵步骤中，提供了一种基因工程化微生物细胞(未显示)，其具有β-1,3-N-乙酰葡糖氨基转移酶，并能够在培养基中合成UDP-N-乙酰葡糖胺。该基因工程化微生物细胞生长于碳源如，例如，葡萄糖、果糖、甘油或蔗糖上。该基因工程化微生物细胞在作为N-乙酰葡糖胺部分的受体底物的乳糖存在下进行培养。在第一发酵容器中生长的微生物细胞摄取受体底物并将其转化为中间寡糖如乳糖-N-三糖II。该中间寡糖从第一发酵容器转移到第二发酵容器(B)中。在第二发酵容器中培养另一基因工程化微生物细胞。应当理解的是，所述另一基因工程化微生物细胞也生长于碳源如，例如，葡萄糖、果糖、甘油或蔗糖上。所述另一基因工程化微生物细胞内化该中间寡糖LNT II，具有β-1,4-半乳糖基转移酶，能够合成UDP-半乳糖，而由此将LNT II转化为所需的寡糖乳糖-N-新四糖。所需的LNnT可以从所述第二发酵容器的培养基和/或后者的基因工程化微生物细胞中进行回收。
图2图示说明了按序发酵的另一实施方式。根据该实施方式的方法包括用于生产五糖例如LNFP I的三个发酵步骤。在该实施方式中，图1中所示的按序发酵工艺过程通过另外的发酵步骤扩展，其中使用根据图1的实施方式的所需寡糖作为第二中间寡糖，被提供给另一发酵容器(C)中的第三发酵步骤。在第三发酵步骤中培养了一种基因工程化微生物细胞。该基因工程化微生物细胞内化在第三发酵步骤期间提供给该微生物细胞的LNnT。该基因工程化微生物细胞具有α-1,2-岩藻糖基转移酶，并且能够合成GDP-岩藻糖，从而将LNnT转化为LNFP I作为本实施方式中的所需寡糖。所需的LNFP I可以从第二发酵容器和/或后一基因工程化微生物细胞的培养基中进行回收。
生产所需寡糖的按序发酵方法包括至少两个发酵步骤。在初始发酵步骤中生产中间寡糖，在按序发酵方法的第二或最后一个发酵步骤中生产所需的寡糖。
所述至少两个发酵步骤能够在空间上和/或时间上彼此独立地进行。也就是说，可以理解的是，所述一个或多个后续发酵步骤中的第一和至少一个步骤能够单独进行，即，其中在第一和可选的另加发酵步骤中生产的中间寡糖被转移到另一发酵容器中而随后生产另一中间寡糖或所需寡糖。还应理解的是，优选在一个发酵步骤中使用的基因工程化微生物细胞无一被转移到后续发酵步骤。
可选地，将相同的发酵容器用于按序发酵方法的所有发酵步骤也是可能的。使用单个发酵容器进行连续发酵方法的发酵步骤需要在发酵步骤完成后去除发酵容器的全部内容物，对发酵容器进行消毒，并将后续发酵步骤的所有元件提供给经过消毒的发酵容器。
在另一实施方式中，至少两个发酵步骤能够在空间上彼此分开而同时在单个发酵容器中进行。图3图示说明了在一个发酵容器中进行的按序发酵的原理，该发酵容器包含用于培养两个不同的基因工程微生物细胞的两个空间分隔开的隔室。单个发酵容器内的两个隔室通过半透膜相互隔离开，该半透膜防止不同的基因工程化微生物细胞从其隔室转移到另一隔室，但允许中间寡糖从生产其的隔室流到使用其的隔室。优选该半透膜还防止所需寡糖从生产它的隔室流到生成中间寡糖的隔室。不同隔室中不同基因工程化微生物细胞具有不同的酶，使微生物细胞能够转化不同的寡糖。例如，使用在单个发酵容器中同时进行两个发酵步骤的按序发酵方法能够用于生产LNT或LNnT，其中乳糖由第一基因工程化微生物细胞群落(显示为黑鞭毛细胞)转化为乳糖-N-三糖II，而所述乳糖-N-三糖II作为中间寡糖成工艺物流流动穿过半透膜(在发酵容器中显示为虚线)进入另一隔室，在该隔室中LNT II被另一不同的基因工程化微生物细胞群落(显示为白色鞭毛细胞)转化为乳糖-N-四糖。
在另外的实施方式中，例如，如图4中所示的是在按序发酵方法中生产的所需寡糖直接进行回收过程，所述回收过程涉及多个回收步骤，包括离心、微滤、超滤、纳滤、离子交换处理、电渗析、反渗透、溶剂蒸发、干燥等。图4图示说明了关于LNnT作为所需寡糖的生产的实施方式。在由LNT II生产所需寡糖LNnT的发酵步骤(B)结束时(见图1)，含所需寡糖的培养基要进行微滤(I)和超滤(II)，以从该培养基中去除细胞。随后，通过纳滤(III)从无细胞培养基中去除小分子，如水、单糖和盐，才能获得含寡糖的工艺物流。在一个进一步的回收步骤中，通过使用反渗透或蒸发(IV)浓缩含寡糖的工艺物流。通过使所浓缩的工艺物流与活性炭(V)接触进行处理而实施进一步的纯化步骤。由此获得的含所需寡糖的工艺物流可以可选地通过使用电渗析而进行去离子，并再次使用反渗透或蒸发进行浓缩，过滤而去除内毒素。在回收工艺过程结束时，可以干燥所需的寡糖产品而获得粉末产品形式的所需寡糖(VI)。
总之，本文所述的生产所需寡糖的方法是有利的，其中它容许最小化制备所需寡糖时由于副反应和竞争反应而生成的非所需的副产物(例如，通过用于将乳糖-N-三糖II转化为乳糖-N-新四糖的β-1-4-半乳糖基转移酶对乳糖进行半乳糖基化，或通过混杂的葡糖氨基转移酶将另外的葡糖胺残基转移到乳糖-N-新四糖)，因为它们在化学上与所需寡糖非常密切相关，而因此问题重重，并由此从所需寡糖中分离掉会变得成本高昂。
实施例
实施例1：LC/MS分析用于鉴定细菌菌株发酵生产的寡糖：
通过使用LCMS-8050系统的MRM(多重反应监测)验证细菌菌株发酵生产的LNFP-II和LNFP-III的分子特征。LCMS系统引入了一个在8℃下运行的Nexera X2 SIL-30ACMP自动进样器、一个LC-20AD HPLC泵、一个在35℃下运行的CTO-20AC柱温箱和一个三重四极(QQQ)质量分析仪(LCMS系统的所有部件均由日本京都岛津株式会社(Shimadzu Corporation,Kyoto,Japan)购买)。在LCMS分析之前，在离子交换基质(Strata ABW；Phenomenex，Aschaffenburg，Germany)上进行固相萃取(SPE)后，通过过滤(0.22μm孔径)纯化培养基上清液和细胞内提取物。对于每个分析流程，都将1μL样品体积注入仪器。色谱分离使用XBridge Amide HPLC柱(3.5μm，50mm；Waters，Eschborn，Germany)进行，考虑以300μL/min的流速进行5分钟的等度洗脱(60％乙腈和0.1％(v/v)NH4OH)。将洗脱化合物直接引入考虑电喷雾电离(ESI)的三重四极质量分析仪。由此，在仪器四极杆1(Q1)中选择寡糖前体离子，并在四极杆3(Q3)中选择碎片离子之后在碰撞池(Q2)中使用氩气作为碰撞气体进行碎片化。在ESI负电离模式下进行MRM分析，从而使仪器在单位分辨率下运行。各自针对LNT II、LNnT、LNFP-II和III优化了碰撞能量、Q1和Q3预偏置。表2中提供了关于所选MRM跃迁和碰撞能量(CE)的细节。
为了支持来源于按序发酵方法的LNT II、LNnT、LNFP-II和LNFP-III的本征，将这些所需寡糖的相应MRM曲线图和保留时间与市售物质标准品(Dextra Laboratories Ltd，Reading，PA，USA)的MRM曲线图进行比较(图5-8)。
表2：Shimadzu LCMS-8050三重四极(QQQ)质量分析仪的负离子模式(CE＝碰撞能量)下鉴定LNT II、LNnT、LNFP-II和LNFP-III的MRM跃迁列表
图5表示通过LCMS-基MRM分析在本文所述的按序发酵方法中生产的LNFP-III的本征。图A显示了市售LNFP-III标准物(Dextra Laboratories Ltd，Reading，PA，USA)的MRM曲线图，显示出诊断跃迁：TIC(总离子电流)；#1＝[M-H]-852,30>364,10M/z，CE＝21；#2＝[M-H]-852,30>179,10M/z，CE＝35；#3＝[M-H]-706,20>382,30M/z，CE＝30。图B显示了通过按序发酵生产并从最后一个发酵步骤的培养基中回收的LNFP-III的相应MRM曲线图。图C显示了通过按序发酵生产并从生产所需寡糖LNFP-III的基因工程化微生物细胞的胞内部分回收的LNFP-III的相应MRM曲线图。
图6表示通过LCMS-基MRM分析在本文所述的按序发酵方法中生产的LNnT的本征。图A显示了市售LNnT标准物(Carbosynth，Berkshire，UK)的MRM曲线图，显示出诊断跃迁：TIC(总离子电流)；#1＝[M-H]-706,10>179,20M/z，CE＝29；#2＝[M-H]-706,20>263.25M/z，CE＝21；#3＝[M-H]-852,30>161,15M/z，CE＝17。图B显示了通过按序发酵生产并从最后一个发酵步骤的培养基中回收的LNnT的相应MRM曲线图。图C显示了通过按序发酵生产并从生产所需寡糖LNnT的基因工程化微生物细胞的胞内部分回收的LNnT的相应MRM曲线图。
图7表示通过LCMS-基MRM分析验证的LNT-II的本征。LNT II添加到大肠杆菌细胞的培养物中而转化为LNnT。图A显示了市售LNT-II标准品(Elicityl SA，Crolles，France)的MRM曲线图，显示出诊断跃迁：TIC(总离子电流)；#1＝[M-H]-544,20>161,00，CE＝16；#2＝[M-H]-544,20>382,10M/z，CE＝11；#3＝[M-H]-544,20>112,90M/z，CE＝28。图B显示了从培养基上清液中获得的LNT II。图C显示了从生产作为中间寡糖的LNT II的基因工程化微生物细胞中获得的胞内LNT II。
图8表示通过LCMS-基MRM分析在本文所述的按序发酵方法中生产的LNFP-II的本征。图A显示了市售LNFP-II标准品(Dextra Laboratories Ltd，Reading，PA，USA)的MRM曲线图，显示出诊断跃迁：TIC(总离子电流)；#1＝[M-H]-852,30>348,20，CE＝23；#2＝[M-H]-852,30>163.05m/z，CE＝40；#3＝[M-H]-852,30>288,20M/z，CE＝29。图B显示了通过按序发酵生产并从最后一个发酵步骤的培养基中回收的LNFP-II的相应MRM曲线图。图C显示了通过按序发酵生产并从生产所需寡糖LNFPII的基因工程化微生物细胞的胞内部分中回收的LNFP-II的相应MRM曲线图。
实施例2：用于生长转基因大肠杆菌细胞的培养基：
用于生长生产所需寡糖的细胞的培养基含有：3g·L-1KH2PO4、12g·L-1K2HPO4、5g·L-1(NH4)2SO4、0.3g·L-1柠檬酸、0.1g·L-1NaCl、2g·L-1MgSO4×7·H2O和0.015g·L-CaCl2×6·H2O，补充有1mL·L-1微量元素溶液(54.4g·L-1柠檬酸铁铵、9.8g·L-1MnCl2×4·H2O、1.6g·L-1CoCl2×6·H2O、1g·L-1CuCl2×2·H2O、1.9g·L-1H3BO3、9g·L-1ZnSO4×7·H2O、1.1g·L-1Na2MoO4×2·H2O、1.5g·L-1Na2SeO3、1.5g·L-1NiSO4×6·H2O)。培养基的pH值为7.0。
实施例3：生产寡糖的转基因大肠杆菌
通过删除编码降解受体底物、供体底物或干扰糖基转移酶反应中使用的核苷酸活化糖合成的酶的基因，因此，编码β-半乳糖苷酶的基因lacZ、分别编码岩藻糖异构酶和墨角藻糖激酶的基因fucI和fucK和编码大肠杆菌结肠酸生物合成途径中第一酶的基因wcaJ被缺失，将大肠杆菌BL21(DE3)工程化，用于岩藻糖基化寡糖的生物合成。为了增强大肠杆菌中GDP-岩藻糖的从头合成，编码磷酸甘露糖突变酶、甘露糖-1-磷酸鸟苷基转移酶、GDP-甘露糖4,6-脱水酶和GDP-L-岩藻糖合成酶的基因manB、manC、gmd和wcaG过表达于该细胞中。为了赋予该菌株使用补救途径合成GDP-岩藻糖的能力，将来自脆弱拟杆菌而编码双功能性岩藻糖激酶/鸟苷-5-磷酸焦磷酸化酶的基因fkp功能性地整合到大肠杆菌菌株(大肠杆菌菌株I)的基因组中。
为了在大肠杆菌BL21(DE3)ΔlacZ中合成乳糖-N-新四糖，编码磷酸葡萄糖突变酶的基因pgm，以及编码有利于合成UDP-半乳糖的UTP-葡萄糖-1-磷酸尿苷基转移酶和UDP-葡萄糖-4-差向异构酶的基因galU和galE进行过表达。为了催化半乳糖从UDP-半乳糖转移到中间寡糖LNT II上而获得乳糖-N-新四糖，将来自嗜沫凝聚杆菌(Aggregatibacteraphrophilus)的β-1,4-半乳糖基转移酶lex-1组成型地表达于大肠杆菌菌株(大肠杆菌菌株II)中。
实施例4：通过转糖基化合成LNFP II和LNFP III
上述大肠杆菌BL21(DE3)衍生菌株I通过来自长双歧杆菌婴儿亚种(Bifidobacterium longum subsp infantis)的编码环工程化α-1,3/4-L-岩藻糖苷酶AfcB的功能基因基因组整合(Zeuner et al，2018)进行工程化。岩藻糖苷酶基因由启动子Ptet组成型地进行表达。该菌株在含有2％甘油作为唯一碳源和能量的矿物盐培养基中，在30℃的带挡板摇瓶中生长24小时。将含有具有2％甘油作为碳源以及28mM 3-岩藻糖基乳糖和28mM乳糖-N-四糖或28mM乳糖-N-新四糖的相同培养基的主培养物从预培养物接种至0.2的光密度。该培养物在30℃的有氧条件下培养。培养48小时后，对培养物取样，通过离心沉淀细胞，用冷NaCl(0.9％(w/v))洗涤一次，再悬浮于冰冷的50％(v/v)甲醇中，并在-20℃下冷冻。对细胞培养物的上清液进行LC/MS-分析，以鉴定分泌到培养基中的反应产物LNFP II和LNFP III。冷冻细胞进行解冻，再次离心而沉淀细胞碎片，并通过LC/MS分析所生产的胞内LNFP II和LNFP III。
LNFP II和LNFP III在各自的培养物中以及在上清液中和在大肠杆菌细胞的细胞质部分中都检测到。通过将分馏模式与商业标准物质进行比较而鉴定出戊糖。
实施例5：使用岩藻糖基转移酶反应由LNnT和L-岩藻糖生产LNFP III
使用大肠杆菌BL21(DE3)菌株I工程化细胞而使用合适的岩藻糖基转移酶生产LNFP III。编码来自幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)的α-1,3/4岩藻糖基转移酶的基因(Yu，H.et al(2017).H.pyloriα1-3/4-fucosyltrans ferase(Hp3/4FT)-catalyzed one-pot multienzyme(OPME)synthesis of Lewis antigens and human milkfucosides.Chemical Communications,53(80),11012-11015)整合到大肠杆菌宿主的基因组中，并由转录启动子Ptet组成型地进行表达。
该菌株在含有2％甘油作为碳源的矿物盐培养基中在30℃下生长约24小时。将含有相同碳源以及2％ LNnT和10mM L-岩藻糖的新鲜培养基从预培养物中接种至0.04的光密度，并在30℃有氧条件下培养48小时。
培养48小时后，对培养物取样，通过离心沉淀细胞，用冷NaCl(0.9％(w/v))洗涤一次，再悬浮于冰冷的50％(v/v)甲醇中，并在-20℃下冷冻。对来自细胞培养物的上清液进行LC/MS分析，以鉴定分泌到培养基中的反应产物LNFP III。将冷冻细胞解冻，再次离心而沉淀细胞碎片，并通过LC/MS分析胞内LNFP III。
实施例6：从人类粪便样品的宏基因组DNA中鉴定出用于生产LNnT的有效LNT II内向转运子
根据生产方案，使用(Quick-DNA Fecal/Soil Microbe Kits，Zymogen，Freiburg，Germany)分离母乳喂养婴儿粪便样品的基因组DNA。将基因组DNA可选地共享至约40kbp的片段，并根据采用pCC1FOSTM载体的CopyControlTMFosmid Library Production Kit(Lucigen,Epicentre,Madison,USA)的方案进行末端修复。转导也根据Lucigen方案在上述大肠杆菌BL21(DE3)衍生菌株II中进行。获得了1×104cfu's的转导效率/噬菌体滴度。将细胞接种到含有12.5μg/mL氯霉素的2YT培养基(Sambrook and Russel，Molecular Cloning:A Laboratory Manual 3rd ed.，Cold Spring Harbor Laboratorie Press(Cold SpringHarbor，N.Y.2001))上，以选择用于福斯质粒(fosmid)载体的繁殖。将殖生群落转移到含有200μL具有2％作为碳源的葡萄糖、12.5μg/mL用于抗生素选择的氯霉素的矿物盐培养基的96-孔井孔板中。在30℃下生长24小时后，将50μL培养物转移到含有2％葡萄糖、20mM乳糖-N-三糖II(HPLC测定纯度为98％)、0.1mM IPTG(异丙基-β-硫代半乳吡喃糖苷)和12.5μg/mL氯霉素的新鲜培养基中。在30℃下生长约30小时后，通过离心收获细胞，将上清液在95℃下加热5分钟，并通过离心沉淀不溶性颗粒。对澄清的上清液进行LC/MS分析而检测LNnT的生产。约0.5％对LNnT生产进行筛选的克隆物显示出与基线相比LNnT产量提高了3-5倍。
从细胞中分离出显示出LNnT生产的克隆物的福斯质粒DNA，再转化到同一菌株中并进行第二次测试。如果证实了LNnT生产的增强，则对质粒DNA进行测序，亚克隆所关注的基因，并通过测量LNT II内化和LNnT生产而再次验证其功能。
Claims (15)
1.一种用于生产包含多于三个单糖部分的所需寡糖的方法，其中，所述方法包括：
-提供基因工程化微生物细胞，其具有：
○糖内向转运子，所述糖内向转运子用于由所述微生物细胞摄取中间寡糖，所述中间寡糖由至少三个单糖部分组成但单糖部分少于所需寡糖构成，和
○酶，所述酶能够将单糖部分从供体底物转移到所述中间寡糖；
-在含有用于所述基因工程化微生物细胞的所述中间寡糖的培养基中培养所述基因工程化微生物细胞，以摄取所述中间寡糖并将至少一个单糖部分转移到所述中间寡糖，从而合成所述所需寡糖；以及
-从所述培养基和/或所述基因工程化微生物细胞中回收所述所需寡糖。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，能够将单糖部分从供体底物转移到所述中间寡糖的所述酶是糖基转移酶或转糖苷酶。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述供体底物是核苷酸活化糖或寡糖。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述核苷酸活化糖选自由GDP-岩藻糖、UDP-半乳糖、UDP-葡萄糖、UDP-N-乙酰葡糖胺、UDP-N-乙酰半乳糖胺、CMP-N-乙酰神经氨酸组成的组。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，所述供体底物由所述基因工程化微生物细胞合成和/或被外源性添加到所述培养基中。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中，所述中间寡糖被外源性添加到所述培养基中。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中，所述中间寡糖通过微生物发酵进行生产。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中，所述基因工程化微生物细胞缺乏易于降解所述中间寡糖的酶活性。
9.根据权利要求2-8中任一项所述的方法，其中，所述糖基转移酶选自由岩藻糖基转移酶类、半乳糖基转移酶类、葡糖氨基转移酶类、唾液酸基转移酶类、N-乙酰葡糖氨基转移酶类、N-乙酰葡糖胺基转移酶类组成的组。
10.根据权利要求2-8中任一项所述的方法，其中，所述转糖苷酶选自由α-1,2-岩藻糖苷酶、α-1,3/1,4-岩藻糖苷酶、α-1,4-葡萄糖苷酶、α-1,6-葡萄糖苷酶、α-1,3-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶和缺乏水解酶活性的转糖苷酶的变体组成的组。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中，所述中间寡糖是LNT-II，并且所述所需寡糖是选自由LNT和LNnT组成的组的四糖。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中，所述中间寡糖是LNnT以及所述所需寡糖是LNFP-III，或其中，所述中间寡糖是LNT以及所述所需寡糖是LNFP-II。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中，所述基因工程化微生物细胞是酵母细胞，优选为选自酵母属、裂殖酵母属、毕赤酵母属、汉逊酵母属的酵母细胞，或原核细胞，优选为选自由埃希氏菌属、芽孢杆菌属和弯曲杆菌属组成的组的细菌细胞。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中，所述供体底物是核苷酸活化糖，优选为选自由GDP-岩藻糖、UDP-半乳糖、UDP-葡萄糖、UDP-N-乙酰葡糖胺、UDP-N-乙酰半乳糖胺和CMP-N-乙酰神经氨酸组成的组的核苷酸活化糖，或寡糖。
15.一种用于生产乳糖-N-新四糖的方法，其中，所述方法包括：
-提供基因工程化微生物细胞，其具有：
a.促进LNT-II摄取的转运蛋白，和
b.β-1,4-半乳糖基转移酶；
-在含有用于所述基因工程化微生物细胞的LNT-II的培养基中培养所述基因工程化微生物细胞，以摄取LNT-II并通过所述β-1,4-半乳糖基转移酶将半乳糖部分从UDP-半乳糖转移到LNT-II，从而合成LNnT；以及
-从所述培养基和/或所述基因工程化微生物细胞中回收所述LNnT。
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