KR100857500B1 - 신규한 갈락토올리고사카라이드 조성물 및 그 제조방법 - Google Patents

신규한 갈락토올리고사카라이드 조성물 및 그 제조방법 Download PDF

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Abstract

락토스를 신규한 갈락토올리고사카라이드의 혼합물로 전환하는 신규한 갈락토시다제 효소 활성을 생산할 수 있는 신규한 비피도박테리움 비피디움 균주. 상기 올리고사카라이드 혼합물은 장의 비피도박테리아의 성장을 촉진하고, 병원성 세균총의 성장을 억제함으로써 장의 건강을 증진시키기 위해 다수의 식품 또는 동물 사료에 혼입될 수 있다.
갈락토올리고사카라이드, 비피도박테리움 비피디움, 프로바이오틱, 프리바이오틱, 장.

Description

신규한 갈락토올리고사카라이드 조성물 및 그 제조방법 {NOVEL GALACTOOLIGOSACCHARIDE COMPOSITION AND THE PREPARATION THEREOF}
본 발명은 락토스를 신규한 갈락토올리고사카라이드의 혼합물로 전환할 수 있는 신규한 갈락토시다제 효소 활성을 생산하는 신규한 비피도박테리움 비피디움(Bifidobacterium bifidum) 균주에 관한 것이다. 갈락토올리고사카라이드는 비소화성 탄수화물로 이는 포유류의 위장관 소화효소에는 저항성이 있으나, 특정 결장 박테리아에 의해서는 발효된다. 본 발명은 또한 비피도박테리아 균주를 장에서 비피도박테리아의 성장을 촉진할 수 있는 신규한 갈락토올리고사카라이드 조성물의 생산에 사용하는 비피도박테리아 균주의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 갈락토올리고사카라이드 산물의 신규한 조성물에 관한 것이다.
인간 장의 세균총은 병원성, 양성 및 유익한 미생물 속을 포함한다. 병원성 미생물속의 우세는 급성 (예를 들면 위장염) 및 만성 (예를 들면 염증성 장질환, 과민성대장증후군 및 일부 장암)의 장 질환을 가져올 수 있다. 하나 이상의 유익한 미생물 균주, 예컨대 비피도박테리아를 적절한 식품 전달체에 첨가함으로써 이러한 유익한 미생물에 유리한 방향으로 장내 세균총의 균형에 영향을 주기 위한 노력이 있어왔다. 이러한 생미생물 식품 보충제는 프로바이오틱으로 공지되어 있다. 그러나, 식품 중 및 소화 후에 생박테리아의 생존을 보장하기는 어렵다.
음식을 이용한 장의 세균총 조정의 대안적 접근은 프리바이오틱을 사용하는 것이며, 이는 선별적으로 결장에 있는 하나 또는 제한된 수의 박테리아의 성장 및/또는 활성을 선별적으로 촉진함으로써, 숙주의 건강향상을 가져오는, 숙주에게 유익한 영향을 미치는 비소화성 식품 성분으로서 정의된다.
인간 대장의 세균총은 출생시 획득된다. 모유 수유 영아는 비피도박테리아가 우세하며, 이는 다른 속의 미생물과의 경쟁에서 쉽게 앞선다. 이는 인간 모유 성분이 촉진성이 있기 때문이다. 대조적으로, 분유 수유 영아는, 박테로이드, 클로스트리디아, 비피도박테리아, 락토바실리, 그람양성 콕사이, 콜리폼 및 기타 그룹의 미생물군들을 상당히 동일한 비율로 가지고 있다는 점에서 성인의 장과 유사한 다소 복잡한 세균총을 가진다. 비피도박테리아는 일반적으로 장 감염에 대한 보호작용을 하는 것으로 간주되며 이러한 차이가 아마도 분유 수유 영아와 비교한 모유 수유 영아의 훨씬 낮은 감염 발생률을 설명한다.
장 세균총의 특정 성분은 장 질환의 병인에 연루되어 있다. 예를 들면, 마이코박테리아는 크론병과 연관되어 있으며, 궤양성 대장염은 황산 환원 박테리아에 의해 촉발될 수 있으며, 장암의 발생에도 박테리아가 연루되어 있을 수 있다. 토착성의 유익한 장 박테리아의 선별적 성장이 프리바이오틱의 섭취로 증강될 수 있다면 이로울 것임은 명백하다. 이는 동시에 병원성 세균총이 억제되는 효과를 가질 것이다.
프리바이오틱으로 분류되는 한 그룹의 화합물이 갈락토올리고사카라이드이 며, 이는 n=2-5인 Glcαl-4[βGal 1-6]n 형태의 갈락토스-함유 올리고사카라이드이며, 효소 β-갈락토시다제의 트랜스갈락토실라제 활성을 이용하여 락토스 시럽으로부터 생산된다 (Crittenden, (1999) Probiotics: A Critical Review. Tannock, G. (ed) Horizon Scientific Press, Wymondham, pp. 141-156). 현재 약간 상이한 성분을 갖는 세 가지 제품이 시판되고 있다. 이들 중 첫 번째는, 트랜스갈락토실화 올리고사카라이드 (TOS)로 이는 아스퍼질러스 오리자에(Aspergillus oryzae)로부터 β-갈락토시다제를 사용하여 생산되며(Tanaka et al, (1983) Bifidobacteria Microflora, 2, 17-24), 트리-, 테트라-, 펜타- 및 헥사-갈락토올리고사카라이드로 구성된다. 두 번째는 Oligomate 55로 이는 A. oryzae 및 스트렙토코커스 써모필루스(Streptococcus thermophilus)로부터 β-갈락토시다제를 사용하여 생산되며 (Ito et al., (1990), Microbial Ecology in Health and Disease, 3, 285-292), 36% 트리-, 테트라-, 펜타- 및 헥사-갈락토올리고사카라이드, 16% 디사카라이드 갈락토실 글루코스 및 갈락토실 갈락토스, 38% 모노사카라이드 및 10% 락토스로 구성된다. 마지막으로, 트랜스갈락토실화 디사카라이드 (TD)는 S. thermophilus로부터 β-갈락토시다제를 사용하여 생산된다 (Ito et al., (1993), J. Nutritional Science and Vitaminolog 39,279-288).
비피도박테리아에 속하는 균들은 β-갈락토시다제 효소를 생산하며, 이는 락토스의 박테리아성 대사에 관여하는 것으로 공지되어 있다. Moller, P. L.등은 Appl.& Environ. Microbiol., (2001), 62, (5), 2276-2283에서 비피도박테리움 비피디움 균주에서 유래한 세 개의 β-갈락토시다제 유전자의 분리 및 특성규명에 관 해 개시한다.
US 특허출원공개 US 2002/0086358은 비피도박테리움 비피디움 유래의 새로운 β-갈락토시다제, 구체적으로 높은 트랜스갈락토실화 활성을 갖는 절단된 형태의 β-갈락토시다제 효소를 개시한다. 락토스와의 배양이 0.5-60% 락토스의 존재하에서 일어날 수 있는 반면, 트랜스갈락토실화 반응에서 생산된 갈락토올리고사카라이드의 예시된 최대 수율은 44% (첨가된 락토스 mg 당 생산된 올리고사카라이드의 mg)이었다. 나아가, 상기 미국 특허공보에 기재된 올리고사카라이드의 정의에 의하면 상기 산물은 적어도 3개가 연결되어 있는 슈크로스 분자로 구성되어 있음이 분명하다.
Dumortier 등은 Carbohydrate Research, 201, (1990), 115-123에서 비피도박테리움 비피디움 DSM 20456을 사용하여 락토스 가수분해 동안 트랜스갈락토실화 반응에 의한 올리고사카라이드의 형성을 기술한다. 생산된 올리고사카라이드 혼합물의 구조분석으로 연결이 β-(l->3), β-(l->6) 및 β-(1->4)-D-갈락토실 연결인 것으로 나타났다. Dumortier은 비피도박테리움 비피디움에 의해 생산된 화합물은 대장에서의 박테리아의 부착에 관여함을 제시한다.
락토스를 갈락토올리고사카라이드의 혼합물로 전환하는 갈락토시다제 효소 활성을 생산할 수 있을 뿐만 아니라, 35% 이하의 디사카라이드 갈라비오스(Gal(αl-6)-Gal)를 포함하는 갈락토올리고사카라이드 혼합물을 또한 생산할 수 있는 비피도박테리움 균주를 발견하였다. 상기 갈락토올리고사카라이드 혼합물은 독소 예를 들면 시가(Shiga) 독소, 및 병원균 예컨대 E. coli의 장벽에의 부착을 방해할 수 있는 항부착성이 있는 것으로 알려졌다 (Paton, J. C. & Paton, A. W. (1989), Clin. Microbiol. Revs., 11, 450-479; Carlsson, K. A. (1989), Ann. Reviews Biochem., 58,309-350 참조).
본 발명에 따라, 락토스를 하나 이상의 디사카라이드, 하나 이상의 트리사카라이드, 하나 이상의 테트라사카라이드 및 하나 이상의 펜타사카라이드를 포함하는 락토스를 갈락토올리고사카라이드의 혼합물로 전환하는 갈락토시다제 효소 활성을 생산할 수 있는 비피도박테리움 비피디움 균주를 제공한다. 바람직하게, 상기 혼합물은 20 내지 35% w/v 의 디사카라이드, 20 내지 35% w/v 트리사카라이드, 15 내지 25% w/v 의 테트라사카라이드 및 10 내지 20% w/v 의 펜타사카라이드를 포함한다.
본 발명에서 갈락토시다제 효소 활성과 관련하여 사용된 용어 "효소 활성"은 하나 이상의 갈락토시다제 효소로부터 초래되는 활성이다.
한 측면에서, 갈락토올리고사카라이드 혼합물은 디사카라이드 Gal-Gal, 트리사카라이드 Gal-Gal-Glc, 테트라사카라이드 Gal-Gal-Gal-Glc 및 펜타사카라이드 Gal-Gal-Gal-Gal-Glc를 포함하는 것으로 밝혀졌으며, 여기에서 Gal은 갈락토스 잔기 및 Glc는 글루코스 잔기를 나타낸다.
메틸화 분석 및 효소 가수분해를 이용하여, 갈락토올리고사카라이드 혼합물은
Gal(β1-6)-Gal(β1-6)-Gal(β1-4)-Glc 테트라사카라이드; Gal(β1-6)-Gal(β1-4)-Glc 및 Gal (β1-3)-Gal(β1-4)-Glc 트리사카라이드; Gal(β1-3)-Glc, Gal(β1-3)-Gal, Gal(β1-6)-Gal 및 Gal(α1-6)-Gal 디사카라이드를 포함하는 것으로 밝혀졌다.
상기 정의된 락토스를 갈락토올리고사카라이드의 혼합물로 전환하는 갈락토시다제 효소 활성을 생산할 수 있는 비피도박테리움 비피디움 균주를 2003년 3월 31일자로 영국 애버딘 소재의 국립 산업 및 해양 박테리아 보관소 (National Collection of Industrial and Marine Bacteria, Aberdeen, UK)에 기탁번호 NCIMB 41171로 기탁하였다.
상기 기탁된 비피도박테리움 비피디움 균주, 또는 그의 생물학적 등가체는 상기 정의된 갈락토올리고사카라이드 혼합물의 생산에 사용될 수 있다. 갈락토올리고사카라이드 혼합물은 장의 비피도박테리아, 특히 오리진 생산 균주의 성장을 촉진하여 장의 건강을 증진시키기 위한 제품의 일부를 구성할 수 있다. 이러한 제품은 유제품 (예를 들면 액체 밀크, 건조된 밀크 분말, 예컨대 전유 분말, 탈지유 분말, 지방으로 채워진 밀크 분말, 유장 분말, 아기용 밀크, 아이스크림, 요구르트, 치즈, 발효유제품), 음료, 영아용 식품, 시리얼, 빵, 비스켓, 사탕류, 케이크, 식품보조제, 식이 보조제, 동물사료, 가금 사료 또는 실질적인 임의의 기타 식품 또는 음료로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다.
올리고사카라이드 혼합물은 병원균에 의해 생산된 독소 또는 병원균의 장벽에의 부착을 방해하는 의약의 제조용으로 또한 사용될 수 있다. 상기 혼합물은 종종 정상의 건강한 장의 세균총을 변경하거나 또는 파괴하기까지 하는 항생제의 치료과정 후에 환자에게 투여될 수 있거나, 또는 장 수술 후에 건강의 장의 정상적인 세균총을 장에 다시 "심어주거나", 또는 재확립하기 위해 투여될 수 있다. 갈락토올리고사카라이드 혼합물은 상기 언급한 비피도박테리움 비피디움 균주 또는 이의 생물학적 등가체와 조합으로 사용될 수 있다.
"생물학적 등가체"라는 구문은 상기 정의한, 락토스를 갈락토올리고사카라이드의 혼합물로 전환하는 갈락토시다제 효소 활성을 생산할 수 있는 비피도박테리움 비피디움 균주를 의미하는 것으로 해석된다.
본 발명의 다른 측면에서 본 발명은 유효한 성분으로서 하나 이상의 디사카라이드, 하나 이상의 트리사카라이드, 하나 이상의 테트라사카라이드 및 하나 이상의 펜타사카라이드를 포함하는 비피도박테리아의 성장 촉진용 갈락토올리고사카라이드 조성물을 제공한다.
상기 갈락토올리고사카라이드 조성물은 바람직하게는 상기 언급한 갈락토올리고사카라이드 혼합물을 포함한다.
바람직하게, 상기 갈락토올리고사카라이드 조성물은 20 내지 35% w/v 의 디사카라이드, 20 내지 35% w/v의 트리사카라이드(들), 15 내지 25% w/v 의 테트라사카라이드 및 10 내지 20% w/v 의 펜타사카라이드 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면에서 본 발명은 락토스 또는 락토스-함유 물질을 상기 정의된 비피도박테리움 비피디움으로 처리하는 것을 특징으로 하는 비피도박테리아 성장 촉진용 물질의 제조 방법을 제공한다.
적합한 락토스-함유 물질은 시판되는 락토스, 전유, 반-탈지유, 탈지유, 유장 및 지방으로 채워진 밀크로부터 선택될 수 있다. 이러한 밀크 제품은 소, 버팔로, 양 또는 염소로부터 수득될 수 있다. 지방으로 채워진 밀크는, 탈지하여 유지방을 제거하고 후속적으로 식물성 지방 또는 식물성유로 대체된 전유로 정의된다.
락토스 이외의 탄수화물 기질로 보충된 성장배지를 사용하여, 본 발명에 따른 비피도박테리움 비피디움이 말토스, 라피노즈, 크실란 및 프럭토스를 이용할 수 있음을 발견하였다. 상기 탄수화물 중 한가지로 보충된 배지에서의 박테리아의 배양은 각각 α-글루코시다제, α-갈락토시다제, 크실로시다제 및 β-프럭토퓨라노시다제의 발현을 유도하여 그 결과 각각 α-글루코올리고사카라이드, α-갈락토올리고사카라이드, 크실로올리고사카라이드 및 프럭토올리고사카라이드의 생산을 초래한다.
본 발명에 이르는 연구에서, 갈락토시다제를 생산할 수 있으며 그 결과 갈락토올리고사카라이드(들) 생산의 최대 잠재력을 갖는 장 유래의 박테리아를 스크리닝하였다. 그 결과, 비피도박테리움 속네 속하는 특정 박테리아, 특히 비피도박테리움 비피디움이 갈락토시다제 효소 활성을 생산할 수 있을 뿐만 아니라 상기 효소가 락토스를 20 내지 35% w/v의 디사카라이드, 20 내지 35% w/v 트리사카라이드, 15 내지 25% w/v의 테트라사카라이드, 10 내지 20% w/v의 펜타사카라이드를 포함하는 갈락토올리고사카라이드 혼합물로 전환할 수 있음을 발견하였다. 특정 비피도박테리움 비피디움 시료를 2003년 3월 31일자로 영국 애버딘 소재의 국립 산업 및 해양 박테리아 보관소 (National Collection of Industrial and Marine Bacteria, Aberdeen, UK)에 기탁번호 NCIMB 41171로 기탁하였다.
상기 박테리아의 배양을 위해서는, 박테리아에 의해 동화될 수 있는 한 임의의 영양기원 물질을 사용할 수 있다. 적절한 배양 배지는, 예를 들면 탄수화물 예컨대 락토스, 슈크로스 또는 글루코스; 질소 함유 무기 또는 유기의 영양기원물질 예컨대 효모추출물, 트립톤, 고기 추출물 (Lab Lemco) 등; 무기 영양 기원 물질 예컨대 포스페이트, 포타슘 등과 함께 포뮬레이션될 수 있다. 배양을 위해, 상기 배양 배지의 pH는 6.0 내지 8.0의 범위이어야만 하며, 바람직하게 7.0이다. 배양은 35℃ 내지 40℃의 온도범위, 바람직하게는 37℃에서 40시간 내지 64시간, 바람직하게는 50시간 동안 혐기성으로 수행된다.
상기 균주는 임의의 공지된 방법 예컨대 정지 상 배양, 혐기성 잠수배양 또는 교반 배양으로 배양될 수 있다. 상기 박테리아 세포는 원심분리 또는 여과에 의해 수확되며 상기 세포를 추가의 처리없이 그대로 반응 촉매로 사용할 수 있다. 대안적으로 상기 세포는 적절한 고정 방법에 의해 고정 상태에서 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 비피도박테리움 비피디움은 락토스 자체의 전환에 또는 유제품에 포함된 락토스를 본 발명의 신규한 갈락토올리고사카라이드 조성물로 전환하는데 사용될 수 있다. 전환 후에 상기 박테리아 세포를 원심분리에 의해 제거할 수 있다. 존재하는 임의의 모노사카라이드를 예를 들면 효모인 사카로마이세스 서레비시에(Saccharomvces cerevisiae)와의 배양으로 제거할 수 있다. 상기 혼합물을 후속적으로 원심분리 및 미세여과할 수 있다. 수득된 GOS 용액은 이어서 분무건조되어 분말로 만들 수 있다.
상기 방식으로 생산된 본 발명의 갈락토올리고사카라이드 조성물을 포함하는 밀크를 어린이, 성인 또는 동물에게 직접 투여할 수 있다. 대안적으로, 이는 예컨대 빵, 사탕류 등의 제품을 생산하는데 사용될 수 있으며, 여기에서 갈락토올리고사카라이드 조성물은 산성 및 고온에서의 안정성으로 인해 분해되지 않고 사용이 가능하다. 대안적으로 상기 GOS 분말을 상기 열거된 제품에 첨가할 수 있다.
상기 GOS 분말은 염증성 장질환 및 과민성대장증후군과 같은 장질환을 앓고 있는 환자에게 투여할 수 있으며, 이 경우 상기 환자는 매일 2 내지 20g, 바람직하게는 5 내지 10g, 가장 바람직하게는 7g의 투여량을 2회로 나누어 섭취한다.
대안적으로, 본 발명의 갈락토올리고사카라이드 조성물은 본 발명에 따른 비피도박테리움 비피디움 배양물과 혼합으로 사용되어 장 건강 증진용 혼합물을 생산할 수 있다. 상기 혼합물은 신바이오틱(synbiotic)으로 분류되며, 이는 GI에서 생미생물 식이보조제의 생존 및 정착을 향상시켜 숙주에게 유익한 영향을 미치는 프로바이오틱 및 프리바이오틱의 혼합물로 정의된다 (Gibson and Roberfroid, 1995, Dietary modulation of the human microbiota: introducing the concept of prebiotics. Journal of Nutrition 125,1401-1412 참조). 이러한 조합은 사용가능한 선별된 기질을 제공함으로써 유해한 장의 환경에서 프로바이오틱의 생존을 향상시킨다. 상기 박테리아 프로바이오틱은 갈락토올리고사카라이드 프리바이오틱 중에 미세캡슐화되어 예를 들면 분말로 생산될 수 있으며, 이는 이어서, 예컨대 유제품, 요구르트에 첨가될 수 있거나 또는 식이보조제로 사용될 수 있다.
본 발명의 갈락토올리고사카라이드 조성물을 포함하는 밀크 또는 기타 제품의 섭취의 장점은 장내 세균총에 존재하는 기타 바람직하지 못한 박테리아, 예컨대 클로스트리디아는 자라지 못하게 하면서 장의 유익한 비피도박테리아의 농도 증가를 촉진한다는 것이다. 따라서, 개인의 건강에 악영향을 끼칠 수 있는 일부 토착성 박테리아가 감소된다. 이는 따라서 위장관 감염의 감소를 초래할 것이다. 이는 대장염을 예방 또는 치료하고, 설사발생을 줄이며, 만성 장질환 예컨대 궤양성 대장염 및 암의 발생 위험을 감소시킨다. 또한 과민성대장증후군의 완화에 도움을 줄 수 있다.
본 발명의 갈락토올리고사카라이드 조성물, 예를 들면 분말 형태의 조성물로 보충된 사료를 먹은 농장 동물은 사료의 체중 전환율에 있어 향상을 보일 수 있다.
본 발명은 하기의 실시예를 참조로하여 추가로 기술될 것이다.
실시예 1
lO.Og/l 트립톤, 5.0 g/l Lab-LEMCO (고기 추출물), 5.0 g/l 효모 추출물, 3.0 g/l K HPO, 0.05 g/l 시스테인 HCL, 10 g/l 락토스 및 lml/1 Tween 80을 포함하는 배지(pH 7.0) 1리터를 121℃에서 15분 동안 멸균하였다. 멸균 후 상기 배지에 1.0% (v/v)의 신선한 비피도박테리움 비피디움 NCIMB 41171 배양물을 접종하고, 혐기성 조건으로 37℃에서 50시간 동안 배양하였다. 상기 박테리아 세포를 원심분리 (30000g에서 20분간)하였다. 상기 세포를 인산 완충액(0.02M. pH 7.0)으로 2회 세척 하여 올리고사카라이드 합성 반응에 사용할 준비를 하였다.
상기 박테리아 세포를(β-갈락토시다제 활성 40 유니트) 50 g의 락토스를 포 함하는 100ml 인산 완충액 (0.02M. pH 7.0)에 재현탁하였다. 반응을 40℃에서 진행하였고, 7시간 후에, 상기 혼합물은 35% (w/v)의 가수분해 산물 (글루코스, 갈락토스), 37% (w/v) 락토스 및 18% (w/v) 2-5사이의 중합도를 갖는 갈락토올리고사카라이드로 구성되었다. 박테리아 세포를 원심분리(30000g에서 20분간)하여 제거한 후, 모노사카라이드(글루코스 및 갈락토스)는 효모 사카로마이세스 서레비시에와 배양하여 제거하였다. 상기 효모는 이어서 원심분리 (10000g에서 10분간)로 제거하고, 제품의 미생물 질을 담보하기 위해 상기 혼합물을 0.1μm의 미세여과 필터를 통하여 여과하였다. 상기 슈가 용액을 이어서 분무 건조하여 분말을 수득하였다. 이어서 산물을 APEX 탄수화물 컬럼 (Jones Chromatography, Mid Glamorgan, UK) 및 Merck-Hitachi LaChrom RI 검출기가 장착된 Merck-Hitachi LaChrom system (Merck, Poole, Dorset, UK)을 사용하여 고성능 액상 크로마토그래피로 정량 분석하였다. 25℃에서 용출액으로서 70%(v/v)의 아세토니트릴를 사용하였으며, 유속은 0.8ml/min이었다. 상기 갈락토올리고사카라이드 혼합물은 25% Gal-Gal, 35% Gal-Gal-Glc, 24 % Gal-Gal-Gal-Glc 및 16% Gal-Gal-Gal-Gal-Glc을 함유하였다.
실시예 2
비피도박테리움 비피디움 NCIMB 41171 세포를 실시예 1에 따라 제조하여 교반 탱크에서 500ml의 탈지유에 첨가하였다 (300 유니트의 β-갈락토시다제 활성). 락토스 전환 반응은 40℃에서 수행하였다. 8시간 후에, 갈락토올리고사카라이드 농도는 22% (w/v)이었으며 상기 혼합물은 28% Gal- Gal, 32% Gal-Gal-Glc, 21% Gal-Gal-Gal-Glc 및 19% Gal-Gal-Gal-Gal-Glc을 함유하였다.
실시예 3
시험관내 장 모델
건강한 인간 공여자 유래의 대변 균질화물(homogenate) 10% (w/v)로 접종된실시예 1에 따라 제조된 1% (w/v) GOS 혼합물을 포함하는 배양 배지 및 이를 포함하지 않는 배양 배지에서 3단계 연속 발효기로 결장 조건을 재현하였다(Macfarlane et al., 1998, Microbial Ecology, 35, 180-187) (표 2). 상기 모델은 각각 작동 부피 270,300 및 300 ml의 세 개의 관 VI, V2 및 V3으로 구성된다. 온도를 37℃로 맞추고 pH와 함께 자동으로 조절하였다. 세 개관의 배양 pH는 각각 5.5, 6.2 및 6.8로 유지하였다. 각 발효기를 자석을 이용하여 교반하고 연속적으로 산소가 없는 N2를 주입(15ml/min)하면서 혐기성 조건하에 두었다. 성장 배지는 하기를 포함하였다: 전분 8g/1, 뮤신 4g/1, 카제인 3g/1, 펩톤수 5g/l, 트립톤수 5g/l, 담즙 No3 0.4g/1, 효모, 4.5 g/l, FeS04 0.OO5g/1, NaCl 4.5g/l, KCl 4.5g/1, KH2PO4 O.5g/1, MgS04. 7H20 1.25g/l, CaC12.6H20 0.15g/l, NaHC03 1.5g/l, Tween 80 lml, 헤민 0.05g/l, 시스테인.HCl 0.8g/l. 상기 배지를 연동 펌프를 통하여 VI으로 주입하고, 연이어 VI는 일련의 관을 통하여 V2 및 V3에 배지를 공급하였다. 상기 시스템은 약 36시간의 보유시간(retention time)으로 작동되었다. 상기 장 모델은 하룻밤 방치하여 평형화시킨 후 상기 배지 펌프를 켜서 10일 이상 작동시키고 이어 서 검사용 기질을 포함하는 배지를 도입하고 추가로 10일 동안 방치하였다. 시료를 각 사이클의 시작 및 종료시에 취하였다. 채취한 시료의 부피는 5ml 이었고, 상기 양을 박테리아그룹의 계수를 위해 사용하였다.
제자리 혼성화 형광분석 ( FISH )
박테리아 집단의 차이를 평가하기 위해 검출부위인 16S rRNA를 표적으로 고안된 올리고뉴클레오타이드 프로브로 하여 FISH를 수행하였다. 상기 프로브는 시중에서 합성되어 형광 염색물질 Cy3 (Eurogentec UK Ltd 제공)으로 표지되었다. 사용된 분자 프로브는 표 1에 제시되었다. 총 박테리아의 계수를 위해, 핵산 염색 4,6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI)을 사용하였다. 발효 관에서 수득한 시료를 4% (w/v) 파라포름알데하이드로 희석하고 4℃에서 하룻밤 고정하였다. 상기 세포를 이어서 1500 x g에서 5분간 원심분리하고 인산 완충 식염수(PBS ; 0.1M, pH 7.0)로 2회 세척하고, PBS/99% 에탄올 (1:1 w/v)의 혼합물에 재현탁하고 -20℃에서 1시간 이상 보관하였다. 상기 세포 현탁액을 이어서 혼성화 혼합물에 첨가하고 각각의 프로브에 대하여 적절한 온도에서 하룻밤 방치하였다. 혼성화 혼합물을 0.2μm Isopore 막 필터 (Millipore Corporation, Herts, UK)를 사용하여 진공여과하였다. 상기 필터를 제거하고 이를 SlowFade (Molecular Probes, Eugan, OR, USA)유리 슬라이드(Molecular Probes, Eugan, OR, USA)에 올려놓고 형광 현미경(Nicon Eclipse, E400)으로 관찰하였다. DAPI 염색된 세포는 UV광 하에서 관찰하고 혼성화된 세포는 DM510 필터를 이용하여 관찰하였다. 각각의 슬라이드에 대하여 15개 이상의 상이한 시야를 계측하였다.
FISH 를 사용한 장 세균총의 특징화에 사용된 올리고뉴클레오티드 프로브
프로브 서열서 표적 속 온도 참조
Bac303 5'-CCAATGTGGGGGACCTT-3' 박테리오데스 spp. 45℃ Langendijk etal. (1995)
Bifl64 5'-CATCCGGCATTACCACCC-3' 비피도박테리움 spp. 50℃ Manz etal. (1996)
Chis 150 5'-AAAGGAAGAUUAAUACCGCAUA-3' 클로스트리디움 히스톨리티쿰 spp. 50℃ Franks et al. (1998)
Lab 158 5'-GGTATTAGCA(T/C) CTGTTTCCA-3' 락토바실러스/엔테로코커스 spp. 45℃ Harmsen et al. (1999)
결과
시판되는 GOS ( Vivinal ( RTM ))를 하루에 7g씩 기질로서 사용한 경우 시험관내 장 모델에서의 FISH 로 측정된 박테리아 집단
V1 V2 V3
시간(일) 1 10.5 21 1 10.5 21 1 10.5 21
총 박테리아(log no.) 9.5 9.5 9.6 9.5 9.4 9.5 9.5 9.4 9.6
비피도박테리움 spp. 8.0 7.9 8.3 8.0 8.0 8.3 8.0 8.0 8.2
락토바실러스 spp. 7.2 7.2 7.1 7.0 7.0 7.1 7.0 7.0 6.9
박테로이데스 spp. 8.1 8.1 7.5 8.0 8.2 7.5 8.0 8.1 7.9
클로스트리디움 히스톨리티쿰 그룹 6.8 6.9 7.1 6.9 6.8 7.0 6.9 6.8 7.0
본 발명에 따라 합성된 GOS 를 하루에 7g씩 기질로서 사용한 경우 시험관내 장 모델에서의 FISH 로 측정된 박테리아 집단
V1 V2 V3
시간(일) 1 10.5 21 1 10.5 21 1 10.5 21
총 박테리아(log no.) 9.4 9.7 9.6 9.4 9.5 9.6 9.6 9.5 9.5
비피도박테리움 spp. 8.1 8.0 8.9 8.0 8.0 8.7 8.2 8.2 8.4
락토바실러스 spp. 7.4 7.6 7.6 7.3 7.3 7.5 7.4 7.3 7.3
박테로이데스 spp. 8.0 8.2 8.2 8.0 8.1 8.1 7.8 7.8 7.8
클로스트리디움 히스톨리티쿰 그룹 6.9 7.0 6.8 6.8 6.8 6.7 7.0 7.0 6.9
결론
표 3으로부터, 본 발명의 GOS 혼합물이 시판되는 GOS 등가물 (표 2 참조) 보다 더 우수한 프리바이오틱 성질, 즉, 더 높은 비피도박테리아의 증가 및 박테로이드의 감소를 나타냄을 알 수 있다. 상기 프리바이오틱 효과는 관 1(V1) 및 2 (V2)에서 더욱 강했으며, 이는 본 발명의 GOS 가 저분자량의 올리고사카라이드로 구성되는 사실에 의해 설명된다.
실시예 4
메틸화 분석
실시예 1에 따라 제조된 갈락토올리고사카라이드 합성 산물을 Biogel P2 (Pharmacia) 상에서 3 ml min-1 속도의 물로 용출하는 겔 여과에 의해 정제하였다.
각각의 갈락토-올리고사카라이드 제조물의 연결 위치를 메틸화분석으로 결정하였다. 동결 건조 시료(5-6mg)를 아르곤 가스로 플러쉬한 후에 20℃에서 16시간 동안 드라이 디메틸-설폭시드(DMSO) 중에 분산시켰다. 이들을 분말의 수산화나트륨(0.5g) 및 이오도메탄 (4ml)을 연이어 첨가하여 메틸화하였다(Ciucanu and Kerek, 1984; MacCormick et al, 1993). C18-결합 카트리지 (Sep-Pak, Waters, Watford, UK) 상에서 용출-추출 후에, 상기 메틸화 탄수화물을 건조하고, CHC13/CH30H (1 : 1, v: v)로 추출하고, 증발하여 건조시켰다. 상기 시료를 트리플루오로아세트산을 이용하여 가수분해하고(Blakeney et al, 1983), NaBD4 환원 및 아세트산 무수물로의 아세틸화 및 N-메틸이미다졸에 의해 부분적으로 메틸화된 알디톨 아세테이트(PMAA)로 전환하였다(Alberscheim et al, 1967).
상기 PMAA를 교차-결합된 50%의 시아노프로필 메틸-50% 페닐 메틸 폴리실록산 컬럼(Thames Chromatrography, Maidenhead, UK) 상에서 불꽃 이온화 검출기 및 온도 프로그램: 55℃(2 min), + 45℃ min-1(1.9 min), 140℃(2min), + 2℃ min-1 (35 min), 210℃ (40 min)를 사용하여 GC로 분석하였다. 상기 PMAA는 미오-이노시톨 헥사아세테이트에 상대적인 이들의 보유시간을 측정하고, 상대적 보유시간을 외부 표준과 비교하여 규명하였다. 각 슈가에 대한 표준 혼합물은 메틸 글리코시드를 의도적으로 메틸화하여 제조하였다 (Doares et al, 1991). 피크 면적은 유효한 탄소반응 인자를 사용한 상대적 몰라(molar)양으로서 대표된다(Sweet et al, 1975).
PMAA의 동정은 이들의 전자-이온화 질량 분광분석으로 확인하였다(Carpita and Shia, 1989). GC-MS 분석은 Fisons Analytical Trio IS 질량 분광분석기와 시리즈인 동일한 GC 상에서 기원 온도 200℃ 및 이온화 전위 70eV를 이용하여 수행하였다.
합성된 산물의 아노머 구성(anomeric configuration)을 결정하기 위해, 상기 올리고사카라이드를 제시된 적절한 온도에서 30분간 α-갈락토시다제 또는 β-갈락토시다제(Melibiase; Sigma)로 처리하였다. 상기 반응 산물은 HPLC로 분석하였다.
결과
상기 분석으로부터 올리고사카라이드 구조는 테트라사카라이드 분획의 경우 Gal(β1-6)-Gal(β1-6)-Gal(β1-4)-Glc, 트리사카라이드 분획의 경우 Gal(β1-6)-Gal(β1-4)-Glc; Gal(β1-3)-Gal(β1-4)-Glc 및 디사카라이드 분획의 경우 Gal(β1-4)-Glc (락토스 기질); Gal(β1-3)-Glc; Gal(β1-3)-Gal; Gal(β1-6)-Gal; Gal (α1-6)-Gal(갈라비노스)인 것으로 추정되었다. Gal: 갈락토스, Glc : 글루코스
참조문헌
1. Albersheim P. D. , D. J. Nevins , P. D. English , and A. Karr. 1967. A method for the analysis of sugars on plant cell-wall polysaccharides by gas-liquid chromatography. Carbohydr Res 5: 340-345
2. Blakeney A. B. , P. J. Harris , R. J. Henry and B. A. Stone. 1983. A simple and rapid preparation of alditol acetates for monosaccharide analysis. Carbohydr Res 113: 291-299
3. Carpita N. C. , and E. M. Shia. 1989. Linkage structure of cabohydarte by gas chromatography-mass spectroscopy (GC-MS) for partially methylated alditol acetates, p.157-216. In C. J. Biermann and G. D. McGinnis (ed.), Analysis of 탄수화물 by gas- liquid chromatography and mass spectroscopy. CRC Press Poca Raton, Fla.
4. Ciucanu I. , and F. Kerek. 1984. A simple and rapid method for the permethylation of carbohydrate. Carbohydr Res 131: 209-217
5. Doares S. H. , P. Albersheim , and A. G. Darvill. 1991. An improved method for the preparation of standards for the glycosyl-linkage analysis of complex carbohydrate. Carbohydr Res 210 : 311-317
6. MacCormick C. A. , J. E. Harris , A. P. Cunning , and V. J. Morris. 1993.
Characterization of a variant of polysaccharide acetan produced by a mutan of Acetobacter xylinumstrain CR 1/4. J Appl Bacteriol 74: 196-199
7. Sweet D. P., R. Shapiro , and P. Albersheim. 1975. Quantitative analysis by various GLC response-factor theories for partially methylated and partially ethylated alditol acetates. Carbohydr Res 40: 217-225
실시예 5
재료 및 방법
HT29 세포주는 European Collection of Cell Cultures for Applied Microbiology and Research로부터 수득하였다. 세포 스톡을 5% 소태아 혈청(FBS), 100 mM 페니실린, 0.1M 스트렙토마이신, 비필수아미노산 (NEAA x100) 및 200mM α-글루타민으로 보충된 고글루코스 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)포함하는 표준 배지에서 가습된 5% CO2, 37℃에서 배양하였다. 세포의 배지를 매 48시간 마다 바꾸어 주고 무성(confluence)하게 되기 전에 계대배양하였다.
올리고사카라이드 민감성 분석
상이한 농도의 올리고사카라이드 (0.01, 0.1, 1, 10, 100 mM)로 보충된 혈청 표준 배지 (1% v/v)를 Olano-Martin et al., 2003에 따라 올리고사카라이드 민감성 분석에 사용하였다. 세포를 실험용 배지(관심 있는 올리고사카라이드 함유)로 매일 갈아주었으며, 부착된 세포는 실험용 배지를 제거하고 세포를 칼슘이 들어 있지 않은 인산 완충 식염수(pH 7, 9.6 gL-1)로 세척하여 측정하였다. 부착된 세포를 이어서 트립신으로 처리하고 동일 부피의 혈청 표준 배지로 중화하였다. 상기 세포 현탁액을 Isoton II로 희석하고 세포의 수를 Coulter Counter로 세었다. 세포의 생존 백분율을 하기와 같이 계산하였다 (도 1): % 생존률 = (처리된 세포의 평균 흡광도/대조군의 평균 흡광도) x 100.
부착분석
HT29 세포를 12-웰 조직 배양 접시 중에서 표준 배지를 사용하여 >90% 무성도로 키웠다. 분석 수행 전 마지막 공급한 배양 배지에는 항생제를 사용하지 않았다.
병원균을 무항생제 세포 배양 배지에서 3계대 이상 혐기성 조건하에서 키웠다. 분석 당일에, 새로운 미리-감소된 조직배양 배지를 10%의 하룻밤 키운 병원균 배양물로 접종하고 분석전에 4시간 동안 배양하였다.
시험 올리고사카라이드의 원액은 인산 완충 식염수 중에 5M의 농도로 제조하여 필터 멸균하였다.
상기 4시간 배양 병원균 배양물을 PBS로 1/1000로 희석하여 플레이트 카운팅으로 계측하였다. 상기 배지를 조직 배양 접시로부터 흡입하여 제거하고 상기 세포를 PBS (lml)로 일회 세척하였다.
각각의 검사용 올리고사카라이드에 대하여, 0.5 ml 올리고사카라이드 (5M) 용액을 세 개의 웰에 첨가하였다. 어떤 올리고사카라이드가 들어 있지 않은 인산 완충 식염수 (PBS)를 대조군으로 포함시켰다. 5 ml의 배양 현탁액을 모든 웰에 첨가하고, 상기 플레이트를 가볍게 앞뒤, 좌우로 흔들어 혼합하고 37℃에서 두 시간 혐기성 조건에서 배양하였다.
상기 배양물을 흡입하여 제거하고, 모든 웰을 멸균 PBS(웰당 lml)로 3회 세척하였다. 마지막 세척 후에, PBS를 흡입하여 제거하고 70μl 트립신/EDTA 용액을 각 웰에 첨가, 혼합하고 37℃에서 5분간 방치하였다.
lml PBS를 각 웰에 첨가하고 파이펫으로 혼합하여 모든 세포가 웰의 바닥에서 떨어지고, 덩어리진 세포는 분리되도록 하였다.
lml의 세포 현탁액을 한 병의 범용 MRD (Maximum Recovery Diluent, 최대 회수 희석제)에 파이펫으로 옮겨 넣고 적절하게 추가로 희석하였다. 희석물을 플레이트 카운트 아가 (plate count agar, PCA)상에 도말하고 37℃에서 24시간 배양하였다.
배양 후, 콜로니수를 계측하고, 부착의 억제를 대조군(PBS)에 대한, 시료 중에 존재하는 박테리아 (c.f.u ml-1)의 비로서 계산하였다(도 2).
결론
도 2의 결과는 디사카라이드 분획의 존재하에 E. coli EPEC 및 S. typhimurium의 부착의 강한 억제를 나타내며, 본 억제는 GOS 혼합물에서도 또한 존재한다. 트리사카라이드보다 큰(>트리) 혼합물 분획은 S. typhimurium에 대한 항-부착 효과가 낮다.
올리고사카라이드 민감성 분석은 올리고사카라이드 혼합물이 HT29 세포에 독성이 없음을 확인하기 위해 수행된 것이다(도 1).
참고문헌
Olano - Martin E. , Williams M. R. , Gibson G. R, Rastall RA. 2003. Pectins and pectic-oligosaccharide inhibit Escherichia coli 0157 : H7 Shiga toxin as directed towards the human colonic cell line HT29. FEMS Microbiol Letters 218 (1) : 101-105
실시예 6
본 조사에 사용된 GOS 산물은 종전에 기술된 대로(실시예 1) 제조되었으며, 이눌린은 Orafti (Belgium)로 부터 수득하였다.
40마리의 젖을 뗀 수컷 돼지를 JSR Genetics Ltd, Southburn, Driffield, Yorkshire로부터 수득하였다. Y025 9ED
Reading 대학에 도착시, 상기 돼지를 한 그룹당 10마리씩 4개의 그룹으로 7일간 우리에 넣어 두어 운송 후 안정을 찾을 시간을 주고 유니트 및 음식에 적응하도록 하였다. 배달시 돼지의 평균 체중은 14.70 kg이었다.
7일의 적응기간 후에, 상기 돼지를 동일한 유니트내의 개별적 우리로 옮겼다. 개별적 우리에서의 돼지의 평균 체중은 17.46kg이었다.
돼지를 각 돼지에 유일한 귀 문신으로 구별하였고, 또한 돼지를 물에 지워지지 않는 가축 마커를 이용하여 개별적으로 번호를 매겼다. 각 돼지의 표시에 사용한 번호와 동일한 확인 숫자로 각각의 개별적 우리에 번호를 매겼다.
10마리의 돼지에게 4가지 사료 중 한 가지, 대조군 사료(NEG), 대조군 사료에 실시예 1에 따라 제조된 1.6% (w/w) GOS을 보충한 사료, 대조군 사료에 4% (w/w)GOS로 보충한 사료 또는 대조군 사료에 1.6% (w/w) 이눌린을 보충한 사료를 할당하였다.
연구하는 내내 돼지는 톱밥 위에서 지냈으며, 장난감이 무료함을 덜어주는 것처럼 풍요한 환경으로서 짚을 또한 제공하였다.
연구 내내, 성장하는 돼지에게 임의대로 먹일 수 있는 완전한 사료인 Deltawean 15 NGP pellet (ABN, ABN House, PO Box 250, Oundle Rd, Woodston, Peterborough. PE 9QF)을 먹였다.
Deltawean 15 NGP 의 영양소/무기질 성분
영양소 포함량
기름 3. 3 %
단백질 19.2%
섬유소 2.8%
회분 4.8%
수분 13.8%
비타민 A 9500i.u./kg
비타민 E, 알파 토코페롤 100i.u./kg
비타민 D3 1850i.u./kg
셀레늄, 소디움 셀레나이트 0.3mg/kg
리신 1.32%
구리, 황산구리 170mg/kg
돼지 사료는 또한 사용이 허가된 항산화제, 부틸레이티드 히드록시아니솔(BHA), 부틸레이티드 히드록시톨루엔(BHT) 및 에톡시퀸을 포함하였다.
돼지에게 사료 처방은 무작위로 할당하였으며, 다만 동일한 사료 처방을 받는 둘 또는 세 마리의 돼지를 동일한 그룹의 우리 지역 내에 개별적으로 가두어 두었다. 돼지를 이러한 방식으로 그룹화하여 만약 돼지가 개별적 우리로부터 탈출할 경우의 처방의 혼동을 피하였으며, 즉 탈출하더라도 그 특정 돼지에 맞는 정확한 사료 처방을 포함하는 음식만을 먹을 수 있다.
개시시 및 테스트 사료를 먹은 지 4주 후에 각 돼지로부터 대변시료를 수집하고, 대변의 미생물 집단을 종전에 기술된 대로 (실시예 3) FISH(표 4)를 이용하여 결정하였다. 실험 종료시에, 돼지를 도살하여 결장 앞 및 뒷부분의 내용물 시료를 수득하였다. 결장 앞 및 뒷부분 내용물의 pH 값(표 5), 단쇄지방산 (SCFA) (표 6) 및 미생물 집단 (표 7)을 측정하였다. 데이터는 평균±표준편차로 나타낸 상기 차이는 Student's t-test로 분석하였다. 차이는 P<0.05에서 유의한 것으로 간주하였다.
개시 및 4주의 시험기간 후의 돼지 유래 대변의 미생물 집단에 대한 프리바이오틱 처리 및 식이의 효과
개시 시간 0* 시간 4주
NEG† 1.6% GOS† 4% GOS† 이눌린†
총박테리아 8.75 ±0.22 8.97±0. 24 8.99±0. 23 8.97±0. 28 8.95±0. 28
비피도박테리움 spp. 6.48±0. 29 6.91±0. 25o 7.07±0. 23o 7.34±0. 21a,o 7.45±0.24a,b,o
락토바실러스 spp. 6.33±0. 25 6.55±0. 23 6.93±0. 16o 7.17±0. 24a,o 6.94±0. 26a,o
박테로이데스 spp. 7.27±0. 23 7.75±0. 24o 7.84±0. 27o 7.85±0. 22o 8.04±0. 18o
클로스트리디움히스톨리티쿰 7.43±0. 33 8.04±0. 24o 8.14±0. 25o 8.33±0. 28o 8.22±0. 23o
cfu log10/g 대변; 각 값은 평균±SD, *n=40, †n=10 ; 차이는 Student t-test로 분석하였다. 위첨자가 표시된 각 열의 평균이 a는 NEG와, b는 GOS 1.6%와, o는 시간 0과 유의한 차이가 있음(P<0.05).
결장의 앞 및 뒷부분 시료 pH 에 대한 프리바이오틱 처리 및 식이의 효과
NEG 1.6% GOS 4% GOS 이눌린
결장 앞부분 5.71±0.16 5.6±0.11 5.49±0.14a,b,c 5.90±0.27
결장 뒷부분 7.16±0.04 7.16±0.03 7.16±0.04 7.12±0.02
각 값은 평균±SD이며, n=10이다. 차이는 Student t-test로 분석하였다. 윗첨자가 표시된 각 열의 평균이 a는 NEG와, b는 GOS 1.6%와, c는 이눌린과 유의한 차이가 있음(P<0.05).
Figure 112005053818666-pct00001
Figure 112005053818666-pct00002
결론
표 5: GOS의 존재하에서 (1.6% 및 특히 4%의 경우) 뒷부분 결장 pH의 하락이 있으며, 이는 SCFA 데이타 (표 6)와 함께 GOS 산물이 결장 뒷부분까지 도달함(발효산물이 증가하였음)을 나타내는 것이다.
표 7: GOS의 존재(4%)는 뒷부분 결장에서의 유익한 박테리아(비피도박테리아, 락토바실리) 집단 개체수의 상당한 증가를 보여준다. 이러한 집단 개체수의 증가는 결장 뒷부분 및 대변 시료에서 더 낮으며, 이는 GOS 산물이 결장 앞 부분에서 주로 발효되는 것으로 보이는 사실에 의해 설명될 수 있다. 1.6% GOS 처리도 유사한 경향을 보였다.
결장 뒷부분에서의 비피도박테리아 집단 개체수의 증가는 아세트산 (비피도박테리아의 주요 발효 산물) 생산의 증가로도 또한 알 수 있다. 이는 GOS 산물이 비피도박테리아 종에 대하여 매우 선별적임을 암시한다.
실시예 7 사례 연구
사례 연구 1- 염증성 장질환 ( IBD )
궤양성 대장염(두 가지 주요 IBD 유형 중 하나)으로 진단된 43세의 여자 환자에 대하여 실시예 1에 따라 제조된 GOS 산물의 효과에 대한 사례 연구를 한다.
상기 환자는 궤양성 대장염을 5년 동안 앓아 왔으며, 테스트 기간 전 및 테스트 동안에 약을 복용하지 않았다. 항-염증제 설파살라진이 종전에 사용되었지만 긍정적 효과는 없었다. 상기 환자는 음식물 소화에 어려움에 있었으며, 표준 식이요법을 하였고, 메스꺼움, 설사 및 복통으로 고생하였다. 후자는 대장염에 기본을 둔 내림창자의 감염증 진단과 상관이 있는, 좌측의 대장이었다.
총 하루 GOS 투여량 7g/d(2회로 나누어 섭취)을 섭취하였다. 섭취 후 4일 내에, 증상이 향상되기 시작하였다. 환자는 음식물을 더 잘 소화할 수 있었으며, 장의 통증도 약해지기 시작하였고, 메스꺼움도 감소하였다. 내시경에 의한 임상적 분석은 없었으나, 그럼에도 환자의 나이진 기분은 현저하게 향상되었다. 식이의 단 하나의 변화는 GOS의 첨가였다. 6주 후에도, 이러한 효과는 유지되었다.
플라시보 대조군을 테스트하지 않았어도, 본 사례연구는 한 가지 주요 형태의 IBD에서 프리바이오틱 GOS의 긍정적 효과에 대한 일화 속 증거를 제공한다.
사례 연구 2- 과민성대장증후군 ( IBS )
3년 동안 IBS를 앓고 있는 27세의 남자는 실시예 1에 따라 제조된 GOS를 3주 동안 하루 7g/d 을 2회로 나누어 섭취하였다. 본 기간 전에 그는 팽만감, 변비, 장 통증 및 피로감을 경험하였다. 이들은 IBS와 연관된 전통적인 증상들이다. 상기 환자는 6개월 동안 항생제를 섭취하지 않았으며 밀/글루텐 및 설탕이 없는 식이요법을 하고 있었다.
프리바이오틱의 섭취 후, 3일 내에 이러한 증상이 현저히 완화되기 시작하여 계속 유지되었다. 대상체는 전반적 기분 및 장 건강에 있어 현저한 증진을 보고 하였다, 즉: "나는 이제 마라톤을 할 준비가 되었다". 그는 어려움 없이 정상적 음식을 섭취할 수 있다.
상기 결과는 통제된 시험은 아니지만, 그러나 GOS가 IBS 증상을 향상시킬 수 있으며, 고통을 겪는 사람에게 보다 나은 삶의 질을 회복시켜줄 수 있음을 보여주는 일화 속 증거가 된다.

Claims (25)

  1. 비피도박테리움 비피디움(Bifidobacterium bifidum) 균주로서,
    상기 균주는 2003년 3월 31일자로 영국 애버딘 소재의 국립 산업 및 해양 박테리아 보관소(National Collection of Industrial and Marine Bacteria, Aberdeen, UK)에 기탁번호 NCIMB 41171로 기탁된 것이며,
    락토스를 갈락토올리고사카라이드 혼합물로 전환할 수 있는 갈락토시다제 효소 활성을 나타내며,
    상기 혼합물은 디사카라이드 Gal(αl-6)-Gal; Gal(β1-6)-Gal(β1-4)-Glc 및 Gal(β1-3)-Gal(β1-4)-Glc로 부터 선택되는 하나 이상의 트리사카라이드; 테트라사카라이드 Gal(β1-6)-Gal(β1-6)-Gal(β1-4)-Glc; 및 펜타사카라이드 Gal(β1-6)-Gal(β1-6)-Gal(β1-6)-Gal(β1-4)-Glc를 포함하는, 비피도박테리움 비피디움 균주.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 갈락토올리고사카라이드 혼합물은 20 내지 35% w/v 의 디사카라이드, 20 내지 35% w/v 의 트리사카라이드, 15 내지 25% w/v 의 테트라사카라이드 및 10 내지 20% w/v 의 펜타사카라이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 비피도박테리움 비피디움 균주.
  5. 삭제
  6. 디사카라이드 Gal(αl-6)-Gal; Gal(β1-6)-Gal(β1-4)-Glc 및 Gal(β1-3)-Gal(β1-4)-Glc로 부터 선택되는 하나 이상의 트리사카라이드; 테트라사카라이드 Gal(β1-6)-Gal(β1-6)-Gal(β1-4)-Glc; 및 펜타사카라이드 Gal(β1-6)-Gal(β1-6)-Gal(β1-6)-Gal(β1-4)-Glc을 함유하는 혼합물을 유효성분으로서 포함하는, 비피도박테리아 특이적 성장 촉진용 갈락토올리고사카라이드 조성물.
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 제 6 항에 있어서, 20 내지 35% w/v 의 디사카라이드, 20 내지 35% w/v 의 트리사카라이드, 15 내지 25% w/v 의 테트라사카라이드 및 10 내지 20% w/v 의 펜타사카라이드를 포함하는 것을 특징으로 하는, 비피도박테리아 특이적 성장 촉진용 갈락토올리고사카라이드 조성물.
  10. 제 1 항에 따른 비피도박테리움 비피디움 균주 배양물을 제 6 항에 따른 조성물과 조합으로 포함하는 장 건강 증진용 조성물.
  11. 치료 요법에서 인간 또는 동물의 치료 방법에 사용되는 제 6 항 또는 제 9 항에 따른 비피도박테리움 성장 촉진용 조성물.
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 제 6 항에 있어서, 장 건강 증진용 제품 조성물.
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 제 14 항에 있어서, 상기 제품은 유제품, 음료수, 영아용 식품, 시리얼, 비스켓, 사탕류, 케익, 식품 보충제, 식이 보충제, 사료, 가금 조류 사료 또는 기타 식품 또는 음료인 것을 특징으로 하는 제품 조성물.
  18. 락토스 또는 락토스-함유 물질을 제 1 항에 따른 비피도박테리움 비피디움 균주로 처리하는 것을 특징으로 하는, 비피도박테리아 성장 촉진용 물질의 제조 방법.
  19. 제 18 항에 있어서, 상기 락토스 함유 물질은 시판되는 락토스, 전유(whole milk), 반-탈지유, 탈지유, 유장 및 지방-충진유로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 비피도박테리아 성장 촉진용 물질의 제조 방법.
  20. 제 19 항에 있어서, 상기 유(milk)는 소, 버팔로, 양 또는 염소로부터 수득되는 것을 특징으로 하는, 비피도박테리아 성장 촉진용 물질의 제조 방법.
  21. 제 18 항에 있어서, 비피도박테리움 비피디움 균주의 제거 후, 상기 물질을 분무건조하여 분말을 생산하는 것을 특징으로 하는 비피도박테리아 성장 촉진용 물질의 제조 방법.
  22. 삭제
  23. 삭제
  24. 제 10 항에 있어서, 장 건강 증진용 제품 조성물.
  25. 제 24 항에 있어서, 상기 식품은 유제품, 음료수, 영아용 식품, 시리얼, 비스켓, 사탕류, 케익, 식품 보충제, 식이 보충제, 사료, 가금 조류 사료 또는 기타 식품 또는 음료인 것을 특징으로 하는 제품 조성물.
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