JP2566913B2 - 抗菌組成物およびグリコペプチドの製造法 - Google Patents
抗菌組成物およびグリコペプチドの製造法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は活性成分としてグリコペチドおよび／又はオ
リゴサッカライドを含み、Ｉ型線毛（type I fimbria
e）を有する病原菌に対する抗菌組成物およびこれらの
活性成分の製造方法に関する。
リゴサッカライドを含み、Ｉ型線毛（type I fimbria
e）を有する病原菌に対する抗菌組成物およびこれらの
活性成分の製造方法に関する。
大部分の自然感染は病原性因子を移植させ、動物組織
をコロニー化することができる粘膜の上皮細胞に病原性
因子が固着することにより開始されることはほとんど疑
いがない。「Ｉ型線毛」として既知のタン白構造を供さ
れた細菌による感染プロセスでは、動物細胞に対するこ
れらの細菌の固着は「マンノースに過敏」と称され、こ
れらの構造は複合グリコシド基、恐らく細胞膜の表面に
グリコ配合体の部分を形成するオリゴマンノシドである
特定受容体を認識させるものであろう。
をコロニー化することができる粘膜の上皮細胞に病原性
因子が固着することにより開始されることはほとんど疑
いがない。「Ｉ型線毛」として既知のタン白構造を供さ
れた細菌による感染プロセスでは、動物細胞に対するこ
れらの細菌の固着は「マンノースに過敏」と称され、こ
れらの構造は複合グリコシド基、恐らく細胞膜の表面に
グリコ配合体の部分を形成するオリゴマンノシドである
特定受容体を認識させるものであろう。
Ｉ型線毛を供された細菌の上皮細胞に対する固着現象
およびモルモットに赤血球の血球凝集を生じさせるこれ
らの能力は膜受容体の特定構造に似た或る種のオリゴサ
ッカライドの存在で阻止できることが最近示された（下
記参考Ｉ参照）。こうして細菌はこのオリゴサッカライ
ドにおびきよせられ選択的に固定される。これらのオリ
ゴサッカライドは合成によつて得るか又は酵素的欠陥を
有する患者の尿から単離される。
およびモルモットに赤血球の血球凝集を生じさせるこれ
らの能力は膜受容体の特定構造に似た或る種のオリゴサ
ッカライドの存在で阻止できることが最近示された（下
記参考Ｉ参照）。こうして細菌はこのオリゴサッカライ
ドにおびきよせられ選択的に固定される。これらのオリ
ゴサッカライドは合成によつて得るか又は酵素的欠陥を
有する患者の尿から単離される。
同じ線で、例えば公表されたヨーロッパ特許出願第89
940号明細書は構造Galα１→3Galを含む組成物に関す
る。これは化学的に得られ、若い豚の腸管細胞に対する
大腸菌（Escherichia coli）K88＋の固着を「試験管
内」で阻止することができる。
940号明細書は構造Galα１→3Galを含む組成物に関す
る。これは化学的に得られ、若い豚の腸管細胞に対する
大腸菌（Escherichia coli）K88＋の固着を「試験管
内」で阻止することができる。
本発明の目的は活性成分として酵素的に得た植物又は
動物起源のグリコペプチドおよび／又はオリゴサッカラ
イドを含み、Ｉ型線毛により認識される正規の受容体に
代わり、こうしてこれらの線毛を有する病原菌の動物細
胞に対する固着を阻止又は交替することができる組成物
を供することである。
動物起源のグリコペプチドおよび／又はオリゴサッカラ
イドを含み、Ｉ型線毛により認識される正規の受容体に
代わり、こうしてこれらの線毛を有する病原菌の動物細
胞に対する固着を阻止又は交替することができる組成物
を供することである。
本考案による組成物は活性成分として次式： 〔式中、R1は水素原子、残基4GlcNAcβ１→ASN又は残基 （Ｒ′およびＲ″は同一又は異り、アミノ酸残基又はポ
リペプチドを表わす）であり、R2、R3およびR4は同一又
は異り、水素原子、マンノース残基又はオリゴマンノシ
ド鎖である〕に相当するグリコペプチドおよび／又はオ
リゴサッカライドを含むことを特徴とする。
リペプチドを表わす）であり、R2、R3およびR4は同一又
は異り、水素原子、マンノース残基又はオリゴマンノシ
ド鎖である〕に相当するグリコペプチドおよび／又はオ
リゴサッカライドを含むことを特徴とする。
Ｉ型線毛を有する病原菌の例は大腸菌、クレブシーラ
ニユーモニエ（Klebsiella pneumoniae）、サルモネ
ラ テイフイムリウム（Salmonella typhimurium）、シ
ゲラ フレツクスネリ （Shigella flexneri）、など
である。
ニユーモニエ（Klebsiella pneumoniae）、サルモネ
ラ テイフイムリウム（Salmonella typhimurium）、シ
ゲラ フレツクスネリ （Shigella flexneri）、など
である。
上記式（Ｉ）において、4GlcNAcβ１→ASNは２−位置
にアセチルアミノ基を有し、４−位置で末端グルコサミ
ンに結合し、β−配位を有する１−位置でアミノ酸又は
ポリペプチド鎖を置換することができるアスパラギンに
結合する２−デソキシグルコースを表わす。
にアセチルアミノ基を有し、４−位置で末端グルコサミ
ンに結合し、β−配位を有する１−位置でアミノ酸又は
ポリペプチド鎖を置換することができるアスパラギンに
結合する２−デソキシグルコースを表わす。
特に病原性コリ形の腸内細胞の同着阻止効果に対し好
ましい基は、上記式Ｉグリコペプチド〔式中、R1は4Glc
NAcβ１→ASN又は （Ｒ′およびＲ″は上記意味を有する）であり、R3およ
びR4は水素原子およびR2は水素原子又はマンノース残基
である〕により表わされる。
ましい基は、上記式Ｉグリコペプチド〔式中、R1は4Glc
NAcβ１→ASN又は （Ｒ′およびＲ″は上記意味を有する）であり、R3およ
びR4は水素原子およびR2は水素原子又はマンノース残基
である〕により表わされる。
特に病原性コリ形の腸内細菌の固着阻止効果に対し好
ましいオリゴサツカライドは式Ｉ（式中、R1、R3および
R4は水素原子であり、R2は水素原子又はマンノース残基
である）のオリゴサツカライドである。
ましいオリゴサツカライドは式Ｉ（式中、R1、R3および
R4は水素原子であり、R2は水素原子又はマンノース残基
である）のオリゴサツカライドである。
本発明は又植物起源のグリコタン白をタン白分解酵素
により消化させ、得たグリコペプチドを任意にはオリゴ
サツカライドにエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニ
ダーゼＨの作用により変換させ、得たグリコペチド又は
オリゴサツカライドを任意にはエキソ−α−マンノシダ
ーゼにより調整消化して２個のマンノース残基間のα１
→２結合を選択的に開裂させることを特徴とする式Ｉの
化合物の製造方法に関する。
により消化させ、得たグリコペプチドを任意にはオリゴ
サツカライドにエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニ
ダーゼＨの作用により変換させ、得たグリコペチド又は
オリゴサツカライドを任意にはエキソ−α−マンノシダ
ーゼにより調整消化して２個のマンノース残基間のα１
→２結合を選択的に開裂させることを特徴とする式Ｉの
化合物の製造方法に関する。
オリゴマンノシドの豊富な貯蔵グリコタン白を含むこ
とが既知の任意の植物穀粉は出発材料として使用すると
ができる。脱脂大豆又は豆粉を使用することが有利であ
る。
とが既知の任意の植物穀粉は出発材料として使用すると
ができる。脱脂大豆又は豆粉を使用することが有利であ
る。
脱脂粉をアルカリ性pH（８〜９）で抽出し、続いて例
えば文献記載の方法（下記参考２および４参照）と同じ
方法を使用し、pH4.5〜５でグリコタン白を選択的に沈
澱させることにより、大豆グリコタン白7S又は豆グリコ
タン白IIを豊富化した単離物を使用することが好まし
い。
えば文献記載の方法（下記参考２および４参照）と同じ
方法を使用し、pH4.5〜５でグリコタン白を選択的に沈
澱させることにより、大豆グリコタン白7S又は豆グリコ
タン白IIを豊富化した単離物を使用することが好まし
い。
グリコペプチドを得るために、グリコタン白を豊富化
したフラクシヨンはタン白分解酵素により、例えば文献
（下記参考３参照）記載の方法と同じ方法を使用して消
化させる。
したフラクシヨンはタン白分解酵素により、例えば文献
（下記参考３参照）記載の方法と同じ方法を使用して消
化させる。
酵素消化は酸性、中性又はアルカリ性pHで任意の活性
タン白分解酵素により行なう。酵素はかび起源、微生物
起源（例えばプロナーゼ、アルカラーゼ）、植物起源
（例えばブロメリン、フイシン、パパイン）又は動物起
源（例えばトリプシン、ペプシン、パンクレアチン）の
ものでよい。
タン白分解酵素により行なう。酵素はかび起源、微生物
起源（例えばプロナーゼ、アルカラーゼ）、植物起源
（例えばブロメリン、フイシン、パパイン）又は動物起
源（例えばトリプシン、ペプシン、パンクレアチン）の
ものでよい。
グリコペプチドからオリゴサツカライドを製造するた
めに本発明方法の第一態様では、上記消化物はエンド−
β−Ｎ−アセチルグリコサミニダーゼＨにより処理し、
式Ｉの２個のＮ−アセチルグルコサミン残基間のβ１→
４結合を選択的に開裂し、こうしてR1をＨに変換する。
めに本発明方法の第一態様では、上記消化物はエンド−
β−Ｎ−アセチルグリコサミニダーゼＨにより処理し、
式Ｉの２個のＮ−アセチルグルコサミン残基間のβ１→
４結合を選択的に開裂し、こうしてR1をＨに変換する。
本発明方法の第一態様の好ましい変法では、上記オリ
ゴサツカライドのオリゴマンノシド鎖を短縮しこれらの
活性を増加させるために、オリゴサツカライドを例えば
文献（下記参考５参照）記載の方法と同じ方法を使用し
てマンノース残基間のα１→２結合を選択的に開裂する
酵素、エキソ−α−マンノシダーゼにより調整処理す
る。
ゴサツカライドのオリゴマンノシド鎖を短縮しこれらの
活性を増加させるために、オリゴサツカライドを例えば
文献（下記参考５参照）記載の方法と同じ方法を使用し
てマンノース残基間のα１→２結合を選択的に開裂する
酵素、エキソ−α−マンノシダーゼにより調整処理す
る。
本発明方法の第二態様では、オリゴマンノシド鎖は上
記グリコペプチドをエキソ−α−マンノシダーゼにより
調整処理することにより短縮されるが、この方法は第一
態様で得られるものより高い活性を示す生成物が得られ
るので好ましい。別法では相当するオイゴサツカライド
はこれらのグリコペプチドをエンドＨにより処理するこ
とにより製造してもよい。本発明組成物はＩ型線毛を有
する細菌により惹起される感染病、特に例えば大腸菌の
ようなコリ形の腸内細菌により惹起される胃腸病の予
防、治療又は診断に対し使用することができ、投与様式
に適応した形で供することができる。
記グリコペプチドをエキソ−α−マンノシダーゼにより
調整処理することにより短縮されるが、この方法は第一
態様で得られるものより高い活性を示す生成物が得られ
るので好ましい。別法では相当するオイゴサツカライド
はこれらのグリコペプチドをエンドＨにより処理するこ
とにより製造してもよい。本発明組成物はＩ型線毛を有
する細菌により惹起される感染病、特に例えば大腸菌の
ようなコリ形の腸内細菌により惹起される胃腸病の予
防、治療又は診断に対し使用することができ、投与様式
に適応した形で供することができる。
例えば経口又は経腸投与に対しては、活性成分はシラ
ツプ、丸剤、カプセル、タブレツト、糖衣丸、溶液、サ
スペンジヨン、エマルジヨン又は水性媒体の添加により
再構成することができる粉末、例えば好ましくは療養食
製品形で、例えば粉乳として処方することができる。
ツプ、丸剤、カプセル、タブレツト、糖衣丸、溶液、サ
スペンジヨン、エマルジヨン又は水性媒体の添加により
再構成することができる粉末、例えば好ましくは療養食
製品形で、例えば粉乳として処方することができる。
非経口投与に対しては、物理的に安定で、無菌、無発
熱性溶液又はサスペンジヨンとして処方することができ
る。
熱性溶液又はサスペンジヨンとして処方することができ
る。
局所投与、例えば眼科学の適用に対しては、溶液、エ
アロゾル、又は軟膏として処方することができる。
アロゾル、又は軟膏として処方することができる。
活性成分が診断、確認又は病原菌の単離に対するもの
である場合、巨大分子支持体に、好ましくは共有結合に
より結合させることが有利である。
である場合、巨大分子支持体に、好ましくは共有結合に
より結合させることが有利である。
最後に、本発明組成物は表面殺菌に、例えばコンタク
トレンズ処置に対し溶液又はエマルジヨン形で使用する
ことができる。
トレンズ処置に対し溶液又はエマルジヨン形で使用する
ことができる。
これらの組成物では、活性成分は0.1〜90重量％を表
わす。
わす。
本発明は次例により例示される。例中、特記しない限
り部および％は重量による。
り部および％は重量による。
下記例１〜３では、式Ｉの活性成分の構造の証明は次
の特徴に基づく： （ａ）出発グリコタン白のグルサイド組成の分析は２個
のみのモノサツカライド成分、すなわちマンノースおよ
びグルコサミンの存在を示す。これらの２種の成分から
形成されるオリゴサツカライドはアスパラギンの窒素に
よりポリペプチド鎖に結合し（N−グリコシド結合）、
従つてこれらのオリゴサツカライドの「エンド」部分は
次の構造： に相当する。
の特徴に基づく： （ａ）出発グリコタン白のグルサイド組成の分析は２個
のみのモノサツカライド成分、すなわちマンノースおよ
びグルコサミンの存在を示す。これらの２種の成分から
形成されるオリゴサツカライドはアスパラギンの窒素に
よりポリペプチド鎖に結合し（N−グリコシド結合）、
従つてこれらのオリゴサツカライドの「エンド」部分は
次の構造： に相当する。
（ｂ）すべてのグリコペプチド物質はエンド−β−Ｎ−
アセチルグルコサミニダーゼＨ（エンドＨ）により完全
に加水分解される事実は、これらすべてがこのような酵
素分解に必要な最小構造に相当することを証明する（下
記参考６参照）： 上記２つの構造を重なると提案した一般構造の公式にな
る。
アセチルグルコサミニダーゼＨ（エンドＨ）により完全
に加水分解される事実は、これらすべてがこのような酵
素分解に必要な最小構造に相当することを証明する（下
記参考６参照）： 上記２つの構造を重なると提案した一般構造の公式にな
る。
例１ （ａ）グルリコタン白：グリコタン白7Sを豊富化したフ
ラクシヨンは脱脂大豆粉を0.5ミリモルNa2SO3溶液によ
りpH8.0で抽出し、pH5.7で沈澱させて第１フラクシヨン
（11Sの豊富な）を除去し、pH4.5で第２沈澱させ、続い
て同じpHで２回洗滌し、7Sの豊富なフラクシヨンを得る
ことにより製造する。
ラクシヨンは脱脂大豆粉を0.5ミリモルNa2SO3溶液によ
りpH8.0で抽出し、pH5.7で沈澱させて第１フラクシヨン
（11Sの豊富な）を除去し、pH4.5で第２沈澱させ、続い
て同じpHで２回洗滌し、7Sの豊富なフラクシヨンを得る
ことにより製造する。
（ｂ）グリコペプチド：タン白フラクシヨンの酵素消化
はトルエンの存在で2lのトリス−塩酸緩衝溶液（0.05モ
ル、pH8.0）中で40℃で24時間600mgのプロナーゼＥ（メ
ルクAG）を使用し、次に48時間別の300mg酵素を使用し
て30gのタン白により行なう。グリコペプチドはこの溶
液の濾過後、溶出液をダウエツクス50W−X8（商標）樹
脂（H+形）上を通し、グルサイドが洗滌水から消失する
まで樹脂を蒸留水により洗滌し、合せたフラクシヨンを
アンバライトIRA400（商標）樹脂（CO3 --形）により中
和して単離する。最終溶液は濃縮し、凍結乾燥する。生
成物は最後にセフアデツクスＧ−25（商標）カラムで分
画して精製してもよい。方法の全体の収量は88％である
（グリコペプチド混合物に含まれるマンノースの最終量
を規準にして）。上記（下記参考７に記載の方法によ
り）により得た混合物のグルサイド組成の分析はN−ア
セチルグルコサミンの２単位に対し平均7.6単位のマン
ノースの存在を示した。
はトルエンの存在で2lのトリス−塩酸緩衝溶液（0.05モ
ル、pH8.0）中で40℃で24時間600mgのプロナーゼＥ（メ
ルクAG）を使用し、次に48時間別の300mg酵素を使用し
て30gのタン白により行なう。グリコペプチドはこの溶
液の濾過後、溶出液をダウエツクス50W−X8（商標）樹
脂（H+形）上を通し、グルサイドが洗滌水から消失する
まで樹脂を蒸留水により洗滌し、合せたフラクシヨンを
アンバライトIRA400（商標）樹脂（CO3 --形）により中
和して単離する。最終溶液は濃縮し、凍結乾燥する。生
成物は最後にセフアデツクスＧ−25（商標）カラムで分
画して精製してもよい。方法の全体の収量は88％である
（グリコペプチド混合物に含まれるマンノースの最終量
を規準にして）。上記（下記参考７に記載の方法によ
り）により得た混合物のグルサイド組成の分析はN−ア
セチルグルコサミンの２単位に対し平均7.6単位のマン
ノースの存在を示した。
（ｃ）オリゴサツカライド：上記のように単離したグリ
コペプチドはエンド−β−N−アセチルグルコサミニダ
ーゼＨ（エンドＨ、生化学工業株式会社）により完全に
消化されることが証明された。この後の性質はオリゴサ
ツカライドを得るために使用する方法の基礎を形成す
る:7.5mgのオリゴマンノシドを含むグリコペプチド試料
を10mlのクエン酸塩−リン酸塩緩衝溶液（pH6.0、10ミ
リモル）に溶解し、そして100ミリ単位のエンドＨ（製
造者規定の単位）および0.5mlのトルエンを生成溶液に
添加する。37℃で24時間インキユベーシヨン後、酵素は
加熱して変性させる。こうして得た加水分解物は血液凝
集反応試験（例４参照）に対しこの形（粗製）で使用す
ることができる。同じ加水分解物はこうして遊離したオ
リゴサツカライドを単離するためにアンバーライトMB3
（商標）樹脂（H+およびOH-形）により処理することも
できる：樹脂の添加、撹拌およびデカンテーシヨン後、
グルサイドが洗滌水から消失するまで蒸留水により洗滌
し、合せたフラクシヨンは濃縮する。こうして精製した
オリゴサツカライドの分析は85％マンノースを含む生成
物にに対しＮ−アセチルグルコサミン１単位に対して７
〜８マンノース単位の存在を示した。酵素加水分解およ
びオリゴサツカライド単位の全体収量は実質的に定量的
である。エンドＨによる消化組生成物および精製オリゴ
サツカライド混合物の高性能薄層クロマトグラフイ（HP
TLC）による分析では同じ効果を得た：酵素はGlcNAc（M
an）6（18％）、GlcNAc（Man）7（26％）およびGlcNAc
（Man）8（56％）に相当する異る３種の生成物を遊離す
る（Manはマンノース残基を表わす）。これらの炭水化
物は出発グリコペプチドから完全に遊離する。
コペプチドはエンド−β−N−アセチルグルコサミニダ
ーゼＨ（エンドＨ、生化学工業株式会社）により完全に
消化されることが証明された。この後の性質はオリゴサ
ツカライドを得るために使用する方法の基礎を形成す
る:7.5mgのオリゴマンノシドを含むグリコペプチド試料
を10mlのクエン酸塩−リン酸塩緩衝溶液（pH6.0、10ミ
リモル）に溶解し、そして100ミリ単位のエンドＨ（製
造者規定の単位）および0.5mlのトルエンを生成溶液に
添加する。37℃で24時間インキユベーシヨン後、酵素は
加熱して変性させる。こうして得た加水分解物は血液凝
集反応試験（例４参照）に対しこの形（粗製）で使用す
ることができる。同じ加水分解物はこうして遊離したオ
リゴサツカライドを単離するためにアンバーライトMB3
（商標）樹脂（H+およびOH-形）により処理することも
できる：樹脂の添加、撹拌およびデカンテーシヨン後、
グルサイドが洗滌水から消失するまで蒸留水により洗滌
し、合せたフラクシヨンは濃縮する。こうして精製した
オリゴサツカライドの分析は85％マンノースを含む生成
物にに対しＮ−アセチルグルコサミン１単位に対して７
〜８マンノース単位の存在を示した。酵素加水分解およ
びオリゴサツカライド単位の全体収量は実質的に定量的
である。エンドＨによる消化組生成物および精製オリゴ
サツカライド混合物の高性能薄層クロマトグラフイ（HP
TLC）による分析では同じ効果を得た：酵素はGlcNAc（M
an）6（18％）、GlcNAc（Man）7（26％）およびGlcNAc
（Man）8（56％）に相当する異る３種の生成物を遊離す
る（Manはマンノース残基を表わす）。これらの炭水化
物は出発グリコペプチドから完全に遊離する。
例２ （ａ）グリコタン白：グリコタン白IIを豊富化したフラ
クシヨンは粉砕、脱脂シンゲン豆（フアゼオラス ブル
ガリス，Phaseolas vulgaris）をpH9.0で抽出し、pH5.0
で酸性化した水に対し透析し、グリコタン白フラクシヨ
ンを沈澱させ、分離しpH8.0で再溶解し、グリコタン白I
Iの豊富なフラクシヨンを合せた上澄液を２回遠心分離
し、凍結乾燥して得ることにより製造する。
クシヨンは粉砕、脱脂シンゲン豆（フアゼオラス ブル
ガリス，Phaseolas vulgaris）をpH9.0で抽出し、pH5.0
で酸性化した水に対し透析し、グリコタン白フラクシヨ
ンを沈澱させ、分離しpH8.0で再溶解し、グリコタン白I
Iの豊富なフラクシヨンを合せた上澄液を２回遠心分離
し、凍結乾燥して得ることにより製造する。
（ｂ）グリコペプチド：タン白フラクシヨンの酵素消化
は大豆グリコタン白7Sと同じ方法（例1b）で正確に行な
う。得た混合物のグルサイド組成の分析（参考７参照）
はN−アセチルグルコサミン２単位に対し平均7.8単位の
マンノースの存在を示した。
は大豆グリコタン白7Sと同じ方法（例1b）で正確に行な
う。得た混合物のグルサイド組成の分析（参考７参照）
はN−アセチルグルコサミン２単位に対し平均7.8単位の
マンノースの存在を示した。
（ｃ）オリゴサツカライド：上記のように単離したグリ
コペプチドはエンドＨにより完全に消化されることがわ
かつた。オリゴサツカライドの酵素加水分解および単離
は大豆グリコペプチドと同じ方法で正確に行なう（例1c
参照）。この場合、HPTLCによる分析はGlcNAc−（Man）
5（５％）、GlcNAc−（Man）6（10％）、GlcNAc−（Ma
n）7（26％）、GlcNAc−（Man）8（15％）およびGlcNAc
−（Man）9（44％）に相当する異る５種の生成物の遊離
を示した。
コペプチドはエンドＨにより完全に消化されることがわ
かつた。オリゴサツカライドの酵素加水分解および単離
は大豆グリコペプチドと同じ方法で正確に行なう（例1c
参照）。この場合、HPTLCによる分析はGlcNAc−（Man）
5（５％）、GlcNAc−（Man）6（10％）、GlcNAc−（Ma
n）7（26％）、GlcNAc−（Man）8（15％）およびGlcNAc
−（Man）9（44％）に相当する異る５種の生成物の遊離
を示した。
例３ 例１および２の生成物から構造の小さいグリコペプチ
ドおよびオリゴサツカライドを製造するために、Manα
１→２結合を優先的にManα１→3Man結合に開裂するα
−マンノシダーゼ（カナバリア属植物,Canavaliaから、
シグマケミカル社）の能力を利用する。
ドおよびオリゴサツカライドを製造するために、Manα
１→２結合を優先的にManα１→3Man結合に開裂するα
−マンノシダーゼ（カナバリア属植物,Canavaliaから、
シグマケミカル社）の能力を利用する。
大豆グリコタン白7S（例1b）由来の350mgのオリゴマ
ンノシドを含むグリコペプチド試料を75mlのクエン酸塩
緩衝溶液（0.01モル、pH4.5）に溶解し、190単位のα−
マンノシダーゼ（カナバリアから、製造者規定の単位）
を生成溶液に添加する。25℃で１時間インキユベーシヨ
ン後、混合物を加熱処理し、冷却し、濾過する。次に濾
液は凍結乾燥する。凍結乾燥生成物は血球凝集反応試験
（下記例４参照）に対しそのままで（粗製）使用するこ
とができる。グリコペプチド混合物および酵素により遊
離したマンノースを効果的に分離するためにセフアデツ
クスＧ−25（商標）カラムで精製してもよい。
ンノシドを含むグリコペプチド試料を75mlのクエン酸塩
緩衝溶液（0.01モル、pH4.5）に溶解し、190単位のα−
マンノシダーゼ（カナバリアから、製造者規定の単位）
を生成溶液に添加する。25℃で１時間インキユベーシヨ
ン後、混合物を加熱処理し、冷却し、濾過する。次に濾
液は凍結乾燥する。凍結乾燥生成物は血球凝集反応試験
（下記例４参照）に対しそのままで（粗製）使用するこ
とができる。グリコペプチド混合物および酵素により遊
離したマンノースを効果的に分離するためにセフアデツ
クスＧ−25（商標）カラムで精製してもよい。
生成物のグルサイド組成の分析（参考７参照）は２個
のＮ−アセチルグルコサミンに対し4.8単位のマンノー
スの存在を示した。
のＮ−アセチルグルコサミンに対し4.8単位のマンノー
スの存在を示した。
植物起源（例1cおよび2c）の相当するオリゴサツカラ
イドから上記のように得た生成物のHPTLCによる分析
は、式GlcNAc−（Man）5に相当する化合物が実際に得た
混合物の主要成分であることを確証する。
イドから上記のように得た生成物のHPTLCによる分析
は、式GlcNAc−（Man）5に相当する化合物が実際に得た
混合物の主要成分であることを確証する。
例４ グリコペプチドおよびオリゴサツカライドの存在でイー
コリ固着菌株によるモルモツトの赤血球凝集反応の阻止 イーコリの２種の固着菌株を血球凝集反応試験および
血球凝集反応阻止試験に体系的に使用した。すなわち、
イーコリ16375の臨床単離菌（ユニフエルシテート ク
リニク フエル キンデルハイルクンデ、インスブルツ
ク）および菌株イーコリ0119.k69、L74-30(K69）であ
る。これらの細菌は食塩水（0.9％NaCl）により洗滌
し、サスペンジヨンは109細菌/ml濃度に調整した（光学
濃度測定により）。
コリ固着菌株によるモルモツトの赤血球凝集反応の阻止 イーコリの２種の固着菌株を血球凝集反応試験および
血球凝集反応阻止試験に体系的に使用した。すなわち、
イーコリ16375の臨床単離菌（ユニフエルシテート ク
リニク フエル キンデルハイルクンデ、インスブルツ
ク）および菌株イーコリ0119.k69、L74-30(K69）であ
る。これらの細菌は食塩水（0.9％NaCl）により洗滌
し、サスペンジヨンは109細菌/ml濃度に調整した（光学
濃度測定により）。
モルモツトの赤血球は１％濃度で食塩水にサスペンド
した。
した。
血球凝集反応および血球凝集反応阻止試験は25μｌ
（ミクロｌ）の細菌サスペンジヨン、50μｌの赤血球サ
スペンジヨンおよび25μｌの食塩水溶液を混合すること
により行なつた（それぞれ阻止剤を含み又は含まず、そ
の場合数種の異る濃度をシリーズで試験した）。４℃で
２時間放置後読みを行なつた。
（ミクロｌ）の細菌サスペンジヨン、50μｌの赤血球サ
スペンジヨンおよび25μｌの食塩水溶液を混合すること
により行なつた（それぞれ阻止剤を含み又は含まず、そ
の場合数種の異る濃度をシリーズで試験した）。４℃で
２時間放置後読みを行なつた。
結果は表Ｉに示す： 表Ｉについて： （ａ）最終混合物の最小阻止濃度は完全な血球凝集阻止
反応を生ずる。
反応を生ずる。
（ｂ）式からの阻止剤濃度の計算値（混合物の場合平
均）は生成物のグルサイド組成の分析から得られる。
均）は生成物のグルサイド組成の分析から得られる。
（ｃ）生成物GP IVおよびＶは文献（参考５参照）に従
つて分離され、命名され、収得されたアスパラギンに結
合した炭水化物に相当する。卵アルブミンからのグリコ
ペプチドの混合物は記載（参考５参照）のものに相当す
る。
つて分離され、命名され、収得されたアスパラギンに結
合した炭水化物に相当する。卵アルブミンからのグリコ
ペプチドの混合物は記載（参考５参照）のものに相当す
る。
（ｄ）ハンス パウルセン博士により提供された合成生
成物（インスチツート フエル オルガニツシエ ヘミ
ン ウント ビオヘミー デル ユニフエルシテート
ハンブルグ）。
成物（インスチツート フエル オルガニツシエ ヘミ
ン ウント ビオヘミー デル ユニフエルシテート
ハンブルグ）。
n.t.は試験しなかつたことを意味する。
他の試験は植物グリコペプチドは腸内病原菌株大腸菌
086.K61、B74-10および0111.K58、B75-44により惹起され
るモルモツトの赤血球凝集反応に対し匹敵できる阻止効
果を有することを示す。
086.K61、B74-10および0111.K58、B75-44により惹起され
るモルモツトの赤血球凝集反応に対し匹敵できる阻止効
果を有することを示す。
例５ ヒトの頬側部細胞に対する腸内病原菌大腸菌16375の固
着および固着阻止 細胞は実験室の多数のスタッフの口から塗抹採取によ
り集め、リン酸塩−緩衝生理塩溶液〔NaCl0.15モル、リ
ン酸塩0.01モル、（PBS）〕により４回洗滌し、最後に1
06細胞/mlの濃度に稀釈した。腸内病原細菌の臨床単離
大腸菌16375はPBSにより２回洗滌し、２・109細菌/mlの
濃度に稀釈した。
着および固着阻止 細胞は実験室の多数のスタッフの口から塗抹採取によ
り集め、リン酸塩−緩衝生理塩溶液〔NaCl0.15モル、リ
ン酸塩0.01モル、（PBS）〕により４回洗滌し、最後に1
06細胞/mlの濃度に稀釈した。腸内病原細菌の臨床単離
大腸菌16375はPBSにより２回洗滌し、２・109細菌/mlの
濃度に稀釈した。
インキユベーシヨンは500μｌの細菌サスペンジヨ
ン、250μｌの細菌サスペンジヨンおよび250μｌのPBS
（固着測定に対し）又は阻止剤（異る一連の濃度を阻止
測定に試験した）を混合することにより行なつた。混合
は環境温度で30分間ゆつくり回転して行つた。塗抹収集
およびグラム染色前にPBS（5ml）により４回洗滌した。
１細胞当りの細菌固着数は光学顕微鏡下で計数し、１試
験について50細胞を分解する。結果は下表IIに示す： 例６ 固体支持体に対するグリコペプチドの固着 プロナーゼによる消化により製造したグリコペプチド
（例1bおよび2b）は次の方法によりセフアロースゲルに
対し固定することができる:CNBr（フアーマシア フア
イン ケミカルズ）により活性化された2gのセフアロー
ス6MB（商標）は塩酸溶液（１モル、400ml）により洗滌
し、濾過した。同時に、豆グルコタン白II（例2b）から
の63mgのグリコペプチド（乾燥重量、25mgのオリゴマン
ノシドを含む）はNaCl（0.5モル）を含むNaHCO3緩衝溶
液（0.1モル、pH8.3）に溶解した。ポリペプチド溶液と
懸濁ゲルの混合は環境温度で２時間ゆつくり回転して行
なつた。NaHCO3/NaCl緩衝液、エタノールアミン溶液
（環境温度で２時間）、さらにNaHCO3/NaCl緩衝液、NaC
l（0.5モル）を含むアセテート緩衝溶液（0.1モル、pH
4.0）および最後にさらにNaHCO3/NaCl緩衝液により連続
洗滌してゲをグルコペプチドに結合させる。反応の収量
は48％の固定であつた（マンノース用量規準で）。
ン、250μｌの細菌サスペンジヨンおよび250μｌのPBS
（固着測定に対し）又は阻止剤（異る一連の濃度を阻止
測定に試験した）を混合することにより行なつた。混合
は環境温度で30分間ゆつくり回転して行つた。塗抹収集
およびグラム染色前にPBS（5ml）により４回洗滌した。
１細胞当りの細菌固着数は光学顕微鏡下で計数し、１試
験について50細胞を分解する。結果は下表IIに示す： 例６ 固体支持体に対するグリコペプチドの固着 プロナーゼによる消化により製造したグリコペプチド
（例1bおよび2b）は次の方法によりセフアロースゲルに
対し固定することができる:CNBr（フアーマシア フア
イン ケミカルズ）により活性化された2gのセフアロー
ス6MB（商標）は塩酸溶液（１モル、400ml）により洗滌
し、濾過した。同時に、豆グルコタン白II（例2b）から
の63mgのグリコペプチド（乾燥重量、25mgのオリゴマン
ノシドを含む）はNaCl（0.5モル）を含むNaHCO3緩衝溶
液（0.1モル、pH8.3）に溶解した。ポリペプチド溶液と
懸濁ゲルの混合は環境温度で２時間ゆつくり回転して行
なつた。NaHCO3/NaCl緩衝液、エタノールアミン溶液
（環境温度で２時間）、さらにNaHCO3/NaCl緩衝液、NaC
l（0.5モル）を含むアセテート緩衝溶液（0.1モル、pH
4.0）および最後にさらにNaHCO3/NaCl緩衝液により連続
洗滌してゲをグルコペプチドに結合させる。反応の収量
は48％の固定であつた（マンノース用量規準で）。
例７ 活性成分の構造に対し特定受容体を有する細菌の確認に
対する診断試験 （ａ）細菌は例４による血球凝集反応に対しモルモツト
の赤血球と混合する。同時に、同じ混合物は生物学的活
性生成物の１種の溶液（表Ｉにより完全に阻止するのに
十分な濃度で）を添加して製造する。細菌サスペンジヨ
ンによる赤血球の凝集反応および１種の活性成分の添加
によるその阻止を確認する読みは、細菌がその成分の構
造に対し特定受容体を有する証拠を供する。
対する診断試験 （ａ）細菌は例４による血球凝集反応に対しモルモツト
の赤血球と混合する。同時に、同じ混合物は生物学的活
性生成物の１種の溶液（表Ｉにより完全に阻止するのに
十分な濃度で）を添加して製造する。細菌サスペンジヨ
ンによる赤血球の凝集反応および１種の活性成分の添加
によるその阻止を確認する読みは、細菌がその成分の構
造に対し特定受容体を有する証拠を供する。
（ｂ）別法では、細菌サスペンジヨンおよびグリコペプ
チドに結合したセフアロースゲル（例６）の混合物は顕
微鏡のスライド上で製造することができる。15分間イン
キユベーシヨン後、光学顕微鏡下の分析は細菌が特定受
容体を有する場合、これらはゲル粒子を被覆するが、反
対の場合には同じ粒子は細菌を全く固定しないことを示
す。
チドに結合したセフアロースゲル（例６）の混合物は顕
微鏡のスライド上で製造することができる。15分間イン
キユベーシヨン後、光学顕微鏡下の分析は細菌が特定受
容体を有する場合、これらはゲル粒子を被覆するが、反
対の場合には同じ粒子は細菌を全く固定しないことを示
す。
例８ 活性成分の構造に対し特定受容体を有する細菌の単離 例６により得たグリコペプチドと結合したセフアロー
スゲルをカラムに入れる。細菌混合物はカラムを通し、
ゲルと混合したグリコペプチドに対する特定受容体を有
する細菌は保留されるが、一方他の細菌は直接溶離され
る。すすいだ後、１種の活性成分を含む緩衝液は純粋形
で特定受容体を有する細菌を溶離するために使用され
る。
スゲルをカラムに入れる。細菌混合物はカラムを通し、
ゲルと混合したグリコペプチドに対する特定受容体を有
する細菌は保留されるが、一方他の細菌は直接溶離され
る。すすいだ後、１種の活性成分を含む緩衝液は純粋形
で特定受容体を有する細菌を溶離するために使用され
る。
参考 1.N.フイロン、I.オフエク アンド N.シヤロン、カー
ボハイドレート リサーチ 120（1983）、235〜249。
ボハイドレート リサーチ 120（1983）、235〜249。
2.M.シエーマー、H.L.クレイニン、R.E.マクドナルド
アンド W.E.アーウイン、セリアル ケミストリ 55
（1978）、383〜391。
アンド W.E.アーウイン、セリアル ケミストリ 55
（1978）、383〜391。
3.E.ヤマウチ、M.カワセ、M.カンベ アンドK.シバザ
キ、アグリカルチユラル バイオロ ジカル ケミスト
リ 39（1975）、873〜878。
キ、アグリカルチユラル バイオロ ジカル ケミスト
リ 39（1975）、873〜878。
4.A.プツタイ アンド W.B.ワツト、バイオケミ、バイ
オフイジオロジー アクタ 207（1979）、413〜431。
オフイジオロジー アクタ 207（1979）、413〜431。
5.T.タイ、K.ヤマシタ、Y.イノウエ アンドA.コバタ、
ジヤーナル オブ バイオロジカル ケミストリ 250
（1975）、8569〜8575。
ジヤーナル オブ バイオロジカル ケミストリ 250
（1975）、8569〜8575。
6.タレンチノ、R.B.トリンブル アンド F.マレイ、メ
ソツド イン エンチモロジー （V.ギンスブルグ、エ
デイター、アカデミツク プレス ニユーヨーク）50
（1978）574−580。
ソツド イン エンチモロジー （V.ギンスブルグ、エ
デイター、アカデミツク プレス ニユーヨーク）50
（1978）574−580。
7.J.R.ニーサー アンド T.F.シユワイツアー、アナリ
テイカル バイオケミストリ（1984）142（1984）58−6
7。
テイカル バイオケミストリ（1984）142（1984）58−6
7。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 1/12 Ｃ０８Ｂ 37/00 Ｚ Ｃ０８Ｂ 37/00 Ａ６１Ｋ 37/02 37/18
Claims (10)
- 【請求項１】Ｉ型線毛を有する病原菌用抗菌組成物であ
って、活性成分として次式： 〔式中、R1は水素原子、残基4GlcNAcβ１→ASN又は残基 （Ｒ′およびＲ″は同一又は異なり、アミノ酸残基又は
ポリペプチド鎖を表わす）であり、R2、R3およびR4は同
一又は異なり、水素原子、マンノース残基又はオリゴマ
ンノシド鎖を表わす〕に相当するオリゴサッカライドを
含むことを特徴とする、上記抗菌組成物。 - 【請求項２】活性成分として式Ｉ〔式中、R1は残基4Glc
NAcβ１→ASN又は残基 （式中、Ｒ′およびＲ″は同一又は異なり、アミノ酸残
基又はポリペプチド鎖を表わす）であり、R3およびR4は
水素原子を表わし、R2は水素原子又はマンノース残基で
ある〕を有する化合物を含む、請求項１記載の組成物。 - 【請求項３】活性成分として式Ｉ（式中、R1、R3および
R4は水素原子であり、R2は水素原子又はマンノース残基
である）を有する化合物を含む、請求項１記載の組成
物。 - 【請求項４】巨大分子支持体に共有結合により結合した
式Ｉ（式中、Ｒ′、Ｒ″およびR1、R2、R3およびR4は特
許請求の範囲第１項に規定した意味を有する）を有する
グリコペプチドを含む、請求項１記載の組成物。 - 【請求項５】療養食製品形、好ましくは粉乳形である、
請求項１から３のいずれか１項に記載の組成物。 - 【請求項６】式： 〔式中、R1は水素原子、残基4GlcNAcβ１→ASN又は残基 （Ｒ′およびＲ″は同一又は異なり、アミノ酸残基又は
ポリペプチド鎖を表わす）であり、R2、R3およびR4は同
一又は異なり、水素原子、マンノース残基又はオリゴマ
ンノシド鎖を表わす〕に相当するグリコペプチドの製造
方法において、植物起源のグリコタン白をタン白分解酵
素により消化させ、得たグリコペプチドをエンド−β−
Ｎ−アセチルグルコースアミニダーゼＨの作用によりオ
リゴサッカライドに変換し、そして次に得たオリゴサッ
カライドをエキソ−α−マンノシダーゼにより調整消化
して２個のマンノース残基間にα１→２結合を開裂する
ことを特徴とする、上記オリゴサッカライドの製造法。 - 【請求項７】出発グリコタン白は脱脂植物穀粉から単離
し、大豆グリコタン白7S又は豆グリコタン白IIを豊富化
した単離物形である、請求項６記載の方法。 - 【請求項８】有効成分として、巨大分子支持体に共有結
合として結合している、式： 〔式中、R1は残基4GlcNAcβ１→ASN又は残基 （Ｒ′およびＲ″は同一又は異なり、アミノ酸残基又は
ポリペプチド鎖を表わす）であり、R2、R3およびR4は同
一又は異なり、水素原子、マンノース残基又はオリゴマ
ンノシド鎖を表わす〕に相当するグリコペプチドを含有
するＩ型線毛を有する病原菌用抗菌組成物の製造方法に
おいて、活性巨大支持体をグリコペプチド溶液と反応さ
せる、上記抗菌組成物の製造法。 - 【請求項９】式： 〔式中、R1は水素原子、残基4GlcNAcβ１→ASN又は残基 （Ｒ′およびＲ″は同一又は異なり、アミノ酸残基又は
ポリペプチド鎖を表わす）であり、R2、R3およびR4は同
一又は異なり、水素原子、マンノース残基又はオリゴマ
ンノシド鎖を表わす〕に相当するグリコペプチドの製造
方法において、植物起源のグルコタン白をタン白分解酵
素により消化させ、得たグリコペプチドをエキソ−α−
マンノシダーゼにより調整消化して２個のマンノース残
基間のα１→２結合を開裂することを特徴とする、上記
オリゴサッカライドの製造法。 - 【請求項１０】出発グリコタン白は脱脂植物穀粉から単
離し、大豆グリコタン白7S又は豆グリコタン白IIを豊富
化した単離物形である、請求項９記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CH5136/84-6 | 1984-10-26 | ||
| CH5136/84A CH660557A5 (fr) | 1984-10-26 | 1984-10-26 | Composition anti-bacterienne et procede de preparation de ses constituants actifs. |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61103829A JPS61103829A (ja) | 1986-05-22 |
| JP2566913B2 true JP2566913B2 (ja) | 1996-12-25 |
Family
ID=4288552
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60238555A Expired - Fee Related JP2566913B2 (ja) | 1984-10-26 | 1985-10-24 | 抗菌組成物およびグリコペプチドの製造法 |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4939123A (ja) |
| EP (1) | EP0179324B1 (ja) |
| JP (1) | JP2566913B2 (ja) |
| KR (1) | KR910008798B1 (ja) |
| AT (1) | ATE68501T1 (ja) |
| AU (1) | AU577411B2 (ja) |
| CA (1) | CA1280987C (ja) |
| CH (1) | CH660557A5 (ja) |
| DE (1) | DE3584414D1 (ja) |
| ES (2) | ES8800360A1 (ja) |
| FI (1) | FI86081C (ja) |
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