CZ292029B6

CZ292029B6 - Farmaceutický a kosmetický přípravek pro léčbu nebo prevenci stárnutí tkání a způsob jeho přípravy

Info

Publication number: CZ292029B6
Application number: CZ1996451A
Authority: CZ
Inventors: Ladislas Robert; Alexandre Robert; Elemer Moczar
Original assignee: Roc S. A.
Priority date: 1993-08-17
Filing date: 1994-08-16
Publication date: 2003-07-16
Also published as: JPH09501672A; PL313036A1; FR2709061B1; FI960585A7; BR9407305A; HU9600347D0; FR2709061A1; PL179432B1; PT714284E; CZ45196A3; AU7539394A; EP0714284A1; WO1995005155A1; SK18296A3; CA2169621C; HUT75337A; DE69426932T2; KR100273389B1; NZ271685A; EP0714284B1

Abstract

P°edm tem °eÜen je pou it jednoho nebo n kolika oligosacharid s 2 a 5 glykosidick²mi zbytky, nebo deriv t tohoto (t chto) oligosacharidu( ) obsahuj c ho (obsahuj c ch) hydrofobn zbytky, p°i em tento (tyto) oligosacharid(y) m (maj ) v termin ln poloze neredukuj c ho cukru jeden galakt zov² zbytek pro p° pravu p° pravku na l bu nebo prevenci symptom st rnut pojivov²ch tk n . D le je p°edm tem °eÜen zp sob p° pravy tohoto p° pravku.\

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká přípravy na léčbu nebo prevenci příznaků stárnutí, které obsahuje oligosacharidy nebo jejich deriváty mající v poloze terminálního neredukujícího cukru Dgalaktózy. Tyto oligosacharidy působí jako modulátory syntézy a/nebo exkrece fibroblastové elastázy.

Dosavadní stav techniky

Je známo, že pojivové tkáně v pokožce vznikají bios\Titézou ve fibroblastech vytvářejících mimobuněčnou matrici (Labat-Robert, J., et. al., Elsevier Science Publisher B. V., 248, 386-393 (1990)).

Mimobuněčná matrice je tvořena čtyřmi typy makromolekul. Jsou to kolageny a elastiny, které vytvářejí vláknitý materiál pokožky, strukturní glykoproteiny, které zajišťují soudržnost buněk a mimobuněčné matrice a dodávají mikrofibrilámí materiál elastických tkání, a proteoglykany, které zajišťují hydrataci tkání a ovlivňují tok molekul a jejich interakce.

V membráně fibroblastové buňky se nachází elastinový receptor obsahující podjednotku 67.10³s vazebným místem pro uhlovodíky.

A. Hinek a kol. (Science 239, 1539-1541 (1988)) ukázal, že podjednotky 67.10³ elastinového receptoru imobilizované na afinitní kloně s elastinovým ligandem nebo ligandem tvořeným elastinovými peptidy byly eluovány laktózou (1 mmol) a že galaktóza byla při nahrazování proteinu 67.10³ navázána na elastin stejně účinná.

Naproti tomu oligosacharidy neobsahující galaktózu, protein 67.10³ navázaný na elastinové afinitní koloně neeluovaly.

Autoři přihlášky z toho vyvozují, že elastinový receptor je protein s vazebnými schopnostmi ke galaktosidům.

Rovněž je známo, že elastiny v roztoku i v nerozpustné formě podléhají hydrolýze endoproteiázami, zejména elastázami.

Různé třídy proteázy a endopeptidáz byly podrobně specifikovány a publikovány v přehledném článku Barrettem a kol. (Barrett, A. J. Eds., North Holland, Amsterdam).

Elastázy jsou proteázy a endopeptidázy, jejichž vlastnosti jsou v poslední době důkladně studovány. Následující odborné články, které předkládaný text zahrnuje v odkazech, popisují následující vlastnosti:

- Bieth J. (1978) „Elastáza: struktura, funkce a patologie“. Front, of Matrix Biol. Cis., 1-82 a

- Homsy, R. a kol. (1988) „Charakteristika aktivity elastázy fibroblastů lidské pokožky.“ Joum. Invest. Dermatol. 91, 472-477.

Označení zmiňovaného enzymu jsou elastáza neznamená, že jde o proteázu specifickou kelastinu. Ve skutečnosti elastázy hydrolyzují nejrůznější proteinové substráty, leukocytámí

-1 CZ 292029 B6 elastáza je například schopná štěpit prakticky všechny makromolekuly pojivových tkání (Robert,

L. (1988), Patrh. Biol.; 36, 1101-1107).

Proteázy elastázového typu degradují elastická vlákna tkání stejně jako ostatní stavební složky jako jsou kolagenová vlákna nebo glykoproteiny, např. fíbronektin. Tento jev byl uveden mezi jevy související se stárnutím buněk; mnoho studií ukazuje, že syntéza a akumulace tohoto typu enzymů během stárnutí roste, zejména lze zdůraznit následující práce:

- Labat-Robert, J. etal., Ann. New York Acad. Sci. (1992), 673, 16-22,

- Robert, L. Sang Thrombose Vaisseaux (1991), 3, 267-330,

- Robert, L. Pathol. Biol. (1988), 36, 1101-1107.

Stejné proteázy a endopeptidázy též mohou degradovat stavební složky matric jiných orgánů, například plicní elastiny, což vede k rozedmě plic, nebo elastické plátky arterií a elastin a kolagen žil, což podporuje rozvoj cévních onemocnění: aterosklerózy, arteriosklerózy arterií a křečových žil. Všechny tyto patologické stavy se vyskytují a jejich závažnost a frekvence roste ve vyšším věku.

Jiné endopeptidázy tohoto druhu (Zn metalo-endopeptidázy), aktivují neaktivní angiotensin I na angiotensin II, který vyvolává závažnou tepelnou hypertenzi.

Konečně enkefalinázy, další Zn endopeptidázy tohoto typu, interferují s funkcí enkefalinů a podle míry nadbytku vedou k poruchám mozkové činnosti.

Společným rysem všech těchto endopeptidáz, které reagují s různými substráty a vedou k různým patologickým stavům, je aktivní místo obsahující Zn a vazba k buněčné membráně.

V následujícím popise je diskutována elastáza fíbroblastů pokožky, ale fyziologický mechanismus a principy léčby, které budou předkládány, jsou platné i pro ostatní endopeptidázy a patologické stavy, jejichž příklady byly uvedeny výše.

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález se týká použití nejméně jednoho oligosacharidu s 2 až 5 glykosidickými zbytky, nebo derivátu takového oligoglykosidu obsahujícího v terminální poloze neredukujícího cukru galaktózu na přípravu přípravku na léčbu nebo prevenci stárnutí pojivových tkání.

Předkládaný vynález se týká použití oligosacharidu s 2 až 5 glykosidickými zbytky, nebo derivátu takového oligosacharidu obsahujícího hydrofobní zbytek, přičemž tento oligosacharid má v terminální poloze neredukujícího cukru jeden galaktózový zbytek, pro přípravu přípravku pro inhibici membránového elastinového receptorů, který se účastní degradace fibrózní vazivové tkáně.

Rovněž se předkládaný vynález týká nejméně jednoho oligosacharidu s 2 až 5 glykosidickými zbytky, nebo derivátu takového oligosacharidu obsahujícího hydrofobní zbytek, přičemž tento oligosacharid má v terminální poloze neredukujícího cukru jeden galaktózový zbytek, na kosmetické ošetření příznaků stárnutí pojivových tkání.

Dále se týká použití těchto oligosacharidů nebo jejich derivátů v kombinaci s nosičem vyhovujícím kosmetické aplikaci, zejména povrchově pro přípravu přípravků určených na léčbu nebo prevenci symptomů stárnutí pokožky, jakož i pro kosmetické ošetření symptomů stárnutí pokožky.

-2CZ 292029 B6

Předkládaný vynález se týká příznaků určených na léčbu nebo prevenci symptomů zrychleného stárnutí pojivových tkání se zřetelem na fibrózní vazivové tkáně, doprovázející některé patologické stavy, zejména kardiovaskulární patologické stavy a rozedmu plic, přičemž tyto přípravky obsahují oligosacharidy nebo jejich deriváty mající vterminální poloze neredukujícího cukru galaktózu.

Vhodnými oligosacharidy obsaženými v přípravku na léčbu nebo prevenci symptomů stárnutí pokožky a zrychleného stárnutí pojivových tkání se zřetelem na fibrózní vazivové tkáně, jsou výhodně laktózy, malibióza nebo stachyóza, nebo jejich deriváty, případně směs.

Oligosacharidické deriváty přípravků předkládaného vynálezu všechny obsahují vterminální poloze neredukujícího cukru galaktózu a spadají do níže uvedených kategorií oligoglykosidických sloučenin obecného vzorce:

galaktóza-_n(a nebo β)-(//εχ)_η·, v němž n představuje polohu 1,2, 3,4 nebo 6,

Hex představuje pentózu nebo hexózu vázanou v konfiguraci a nebo β, n' je číslo laž 5;

a) glykosidy obecných vzorců:

(I) oligoglykosid-l-O-R, v němž R je lineární nebo rozvětvený C]-Ci₈ alkyl, (II) oligoglykosid-l-O-R-O-l-oligoglykosid, v němž R= (CH₂)_n, n je 2 až 10,

b) acylový glykosylamin některého z následujících obecných vzorců, v němž oligoglykosid je výhodně laktóza, melibióza nebo stachyóza:

- acylované glykosylaminy některého z následujících obecných vzorců:

(III) oligoglykosid-l-NH-CO-R, v němž R je Cr-Cis alkyl s žádnou, 1 nebo 2 dvojnými vazbami, (IV) oligoglykosid-l-NH-CO-R-CO-NH-l-oligoglykosid, v němž R = (CH₂)_n, n je 2 až 8,

c) alkylamin acylovaný kyselinou aldonovou získanou oxidací oligoglykosidu (V) oligoglykosid-CO-NH-R, v němž R má stejný význam jako ve vzorci III, (VI) oligoglykosid-CO-NH-R-NH-CO-oligoglykosid, v němž R má stejný význam jako ve vzorci III,

d) nebo produkt produkce Schiffových bází vzniklý reakcí oligoglykosidů s alifatickými mono- nebo diaminy a odpovídající některému z následujících obecných vzorců (VII) Gal-(Hex)_n-X-HN-R, (VIII) Gal-(Hex)_n-X-NH-R-NH-X-(Hex)_n-Gal, v němž

-3CZ 292029 B6

Hex je hexóza nebo pentóza, η - 0, 1 nebo 2,

X= l-NH₂-hexit a

R má stejný význam jako ve vzorci III.

Společným rysem všech těchto výše uvedených oligosacharidů nebo jejich derivátů je nejméně 20% snížení syntézy a/nebo sekrece elastázy v kultuře fibroblastů.

Tento efekt je zřejmý z měřitelného snížení enzymové aktivity v buněčné kultuře příslušných buněk stejně jako v buňkách samých.

Použitý postup měření zahrnuje kultivaci fibroblastů lidské pokožky za standardních podmínek a kolorimetrické stanovení aktivity elastázy v buněčné kultuře s využitím syntetického substrátu (N-sukcinyltrialanyl-para-nitro-anilidu).

S využitím syntetického substrátu bylo též možné ukázat, že biosyntéza endopeptidáz elastázového typu se zvyšuje během následných pasáží fibroblastů, což je vlastně model stárnoucího systému in vitro podle Hayflicka (1980, Cell Adding In. Annual Review of Gerontology and Geriatrics; Springer, New York 1, 26-67); Labat-Robert J. a kol. (1988, Expert Gerontol, 23, 518).

Podstata enzymové aktivity je vázána na buněčnou membránu a může být obnovena po trypsinizaci fibroblastů v rozpustné frakci.

Enzymová aktivita v buněčné kultuře může být obnovena z 2 až 10 % a zbylou aktivitu, vázanou na buněčné zbytky lze do roztoku převést účinkem detergentu.

Předkládaný vynález se týká použití oligosacharidů nebo jejich derivátů uvedených výše k ovlivňování biosyntézy a sekrece proteáz elastázového typu z fibroblastů, cestou elastinového receptorů lidských fibroblastů, zvláště kožních fibroblastů. Toto ovlivňování má preventivní nebo léčebné účinky na příznaky stárnutí pokožky nebo na příznaky zrychleného stárnutí doprovázející patologické stavy, které jsou vyvolané přítomností nadbytku endopeptidáz.

Diskutovaná účinnost vychází ze skutečnosti, že struktura podjednotky 67 kD elastinového receptorů specificky reaguje s laktózovými nebo oligo- nebo polysacharidickými strukturami obsahujícími v terminální poloze galaktózu (Labat-Robert, J. a kol., citováno výše, a Mecham. R.P. et al., 1989, Biochem. 28, 3716-3722).

Oligosacharidické deriváty předkládaného přípravku lze syntetizovat chemicky, jak bude vysvětleno dále, nebo extrahovat z biologického materiálu, zejména mléka, krve nebo placenty, nebo alternativně z přírodních produktů jako je med, obsahujících galaktosidy vhodné pro přípravu předkládaných přípravků (R. Siddiqui, in Advance in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry, Ed: D.Horton, vol. 49, pp. 285-309).

Polysacharidy nebo jejich deriváty lze extrahovat standardními postupy (Frontiers of Matrix Biology (1985), vol. 10. S. Kargar Edition), poté provést buď enzymatickou degradaci nebo chemickou hydrolýzu a nakonec separovat žádanou sloučeninu vysolením, ionexovou chromatografií nebo gelovou chromatografíí na sefaróze, případně jinou vhodnou technikou.

Předkládaný vynález se rovněž týká postupu přípravy přípravku určeného na prevenci nebo léčbu účinků stárnutí na pokožku, což zahrnuje začlenění 0,5 až 6 % hmotn./obj. oligosacharidů

-4CZ 292029 B6 (vzhledem k přípravku), obsahujícího 2 až 5 glykosidických zbytků a v terminální poloze neredukujícího cukru jeden galaktózový zbytek, do přijatelného nosiče určeného na lokální aplikaci.

Tento přípravek lze vhodně použít v dermatologii a/nebo kosmetice na léčbu nebo prevenci účinků stárnutí na pokožku.

Podobně se předkládaný vynález týká způsobu přípravy přípravku určeného na léčbu nebo prevenci symptomů zrychleného stárnutí pojivových tkání se zřetelem na fibrózní vazivové tkáně, doprovázející některé patologické stavy související s abnormální syntézou elastázy, zejména rozedmu plic, aterosklerózu a arteriosklerózu arterií a křečové žíly, a dále určeného na léčbu nebo prevenci tepelné hypertenze, vyvolané aktivací neaktivního angiotensinu I na angiotensin II endopeptidázami elastázového typu; uvedenému použití vyhovují přípravky obsahující farmaceuticky přijatelné nosiče v kombinaci s oligosacharidem nebo oligosacharidickým derivátem, který má v terminálním poloze neredukujícího cukru galaktosid.

Má-li oligosacharidický derivát hydrofobní zbytek, jsou vhodným nosičem lipozómy dovolují povrchové umístění glykosidické frakce derivátu.

V následujících příkladech je podrobněji vysvětlen účinek laktózy, melibiózy, stachyózy a jejich derivátů na syntézu a sekreci elastázy lidských fibroblastů, které byly podrobeny 15 až 20 pasážím: takto připravené buňky vstupují do fáze stárnutí podle Hayflickova modelu (viz odkaz výše) jsou modelem stárnutí in vitro.

Pozorované snížení syntézy a sekrece elastázy v těchto systémech, vyvolané podáním oligosacharidických derivátů předkládaného vynálezu, je ukazatelem účinnosti těchto sloučenin působících proti stárnutí, neboť jak bylo uvedeno výše, je zvýšená syntéza a sekrece elastázy rysem souvisejícím se stárnutím fibroblastů.

Uvedené příklady nemají omezit účinnost předkládaných sloučenin pouze na kožní fibroblasty. Účinky těchto sloučenin lze zobecnit na jakýkoli typ fibroblastových buněk i jiných endoteliálních buněk, buněk hladkého svalstva a leukocytů, které obsahují v membráně elastinový receptor jehož podjednotka 67 kD má afinitu ke galaktosidům.

Příklady provedení vynálezu

Materiály a postupy:

Lidské kožní fibroblasty byly získány z kožních biopsií odebraných v průběhu chirurgické plastiky prsu žen ve věku 16 až 24 let.

Buňky byly kultivovány v Dulbeccově modifikaci Eagleova média (DMEM) obsahujícího 10 % fetálního telecího séra, 200 pg/ml penicilinu a 200 jednotek/ml streptomycinu v atmosféře 90/10 % kyslík/dusík v plastikových lahvích NUNCLON-DELTA 35 x 10 mm.

Pokusy byly prováděny mezi 18 a 21 pasáží, neboť na této úrovni dochází ke zvýšení elastázové aktivity, což odráží proces stárnutí buněk.

Dvacet čtyři hodin před započetím pokusů bylo médium odstraněno a přidán 1 ml čerstvého média DMEM a laktóza do konečné koncentrace 10 mmol. V určených časových intervalech bylo médium odebráno, vrstvy buněk opláchnuty 2 x 1 ml PBS (fosfátový pufr) a roztok přidán k médiu.

Na vrstvy buněk se dále nechal působit čerstvý roztok trypsinu (Wothington) v koncentraci 20 pg v 1 ml PBS po dobu 5 minut při 37 °C a následovala centrifugace při 100 G, 5 min, 4 °C.

-5 CZ 292029 B6

Po dekantaci a promytí 1 ml PBS byly zbývající buňky suspendovány v 1 ml 0,1 mol pufru

Tris-HCl, pH 7,4, s obsahem 0,1% Tritonu x-100 a homogenizovány v Porterově homogenizátoru.

Supematant této suspenze (buněčný extrakt) byl užit pro stanovení enzymové aktivity vázané na buňky.

Stanovení enzymové aktivity elastázového typu bylo provedeno přidáním substrátu N-sukcinyltrialanyl-para-niroanilindu (nebo N-suc-ala₃ p-Na) o koncentraci 125 mmol vdimethylformamidu k alikvotu buněčných extraktů postupem popsaným v práci Bieth, J. 1978 (viz výše).

μΐ kultivačního média bylo přidáno do 89 μΐ 0,1 mol pufru Tris-HCl, pH 7,8 a 10 μΐ roztoku substrátu.

μΐ trypsinizovaného roztoku nebo 50 μΐ buněčného extraktu bylo přidáno do 940 μΐ pufru Tris a 10 μΐ substrátu.

Inkubace byly prováděny při 37 °C 3 hod u kultivačního média a 1 hod u trypsinizovaného vzorku a u buněčného extraktu.

Během reakce enzymu se substrátem vznikalo žluté zabarvení, jehož optická hustota byla měřena spektrofotometrem při 410 nm.

Všechny pokusy byly prováděny paralelně na 4 až 6 kulturách a střední hodnoty statisticky porovnávány s využitím Studentova t-testu.

Enzymová aktivita (EA) je vyjádřena v nmol substrátu hydrolyzovaného na 1 hod na 10⁶ buněk, dle vztahu:

OD X Vcelk.

EA =-----------------------------χ 10⁶

8,8 x v„_ork χ N χ T kde

- OD j e optická hustota,

- N je počet buněk v objemu reakce,

- T je doba inkubace, a

- 8,8 je molámí extinkční koeficient odpovídající optické hustotě molámího roztoku substrátu v kyvetě o tloušťce 1 cm.

V následujících příkladech byl studován účinek galaktózy a jejích derivátů na aktivitu fibroblastové elastázy měřením změny aktivity vlivem elastinového peptidu: kappa-elastinu (KE); tento peptid byl získán alkalickou hydrolýzou elastinu z šíjového vaziva hovězího dobytka ve vodném ethanolu, postupem uvedeným v práci Robert L., Poullain N. (Etudes sur la structure de Télastine et le mode ďaction de 1'élastase. I. Novelle méthode de préparation de dérivativés solubles de lélastine. [Studie struktury elastinu a účinku elastázy. I. Nový postup přípravy rozpustných derivátů elastinu]. Bull. Chim. Biol. 45, 1317-1326 (1963)).

-6CZ 292029 B6

Tento peptid působí na elastinový receptor podobně jako elastin, to znamená, že vyvolává zvýšení elastázové aktivity fibroblastů v kultuře.

Tabulka 1 uvádí kinetiku účinků kappa-elastinu při 1 mg na lamelu, na aktivitu elastázy lidských fibroblastů z dvacáté pasáže, jako funkci doby inkubace.

Tabulka 1

DOBA INKUBACE S KE

	0 hod	2 hod	6 hod	24 hod	48 hod
EA DMEM	0,04	0,04	0,03	0,21	0,99
EA TRYPS	0,267	0,2	0,207	0,190	0,123

Velké zvýšení elastázové aktivity bylo zaznamenáno v kultivačním médiu (sekrece) po 24 hod latence. Ve stejné době klesla membránová aktivita trypsinizovaného vzorku. Z toho vyplývá, že zvýšení enzymové aktivity v médiu souvisí s uvolněním enzymu z membrány do média.

Příklad 1

Studium účinků laktózy

Laktóza byla použita v koncentraci 10 mmol/1 nebo 3,6 mg/ml. Tabulka 2 dokumentuje účinek laktózy 10 mmol/1 na aktivitu elastázy lidských fibroblastů z dvacáté první pasáže, a na její distribuci mezi formu volnou, formu membránovou (po trypsinizaci) a formu buněčnou (po reakci s Tritonem).

Aktivita je vyjádřena jako optická hustota hydrolyzovaného substrátu násobená 10³/hod pro 10⁶ buněk.

Byla vypočítávána střední hodnota ze čtyř paralelních měření různých kultur.

Rozdělení aktivity na uvedené tři frakce je vyjádřeno v procentech celkové aktivity, podobně inhibice laktózou je vyjádřena v procentech aktivity systému bez laktózy.

Tabulka 2

Kontrola Laktóza

	Aktivita	% z celk.	Aktivita	% z celk.	%
Celková aktivita	588,1	100	262,2	100	55
Kultivační médium	56,1 ± 7,6	10	18,8 ±1,1	7	66
Trypsinizovaný vzorek	359,1 ±41,7	61	91,9 ±31,7*	35	74
Buněčný extrakt	172,5 ± 16,8	29	151,5 ±28,8	28	12

* p < 0,05 srovnání kontroly s laktózou

Z tabulky vyplývá 55% snížení celkové enzymové aktivity a změna distribuce enzymové aktivity ve třech hodnocených frakcích.

Aktivita volného enzymu měřená v kultivačním médiu klesla o 66 % ve srovnání s kontrolní kulturou, enzymová aktivita vázaná na membrány uvolněná trypsinizaci klesla o 74 %, zatímco zbylá aktivita buněčného extraktu nevykazovala ve srovnání s kontrolou výraznější změnu.

Selektivní inhibice enzymu vázaného na membránu a uvolněného do média mění distribuci celkové enzymové aktivity.

V kontrolních kulturách je hlavní podíl celkové aktivity vázán na buněčnou membránu (61 %) a lze jej uvolnit trypsinizací; v kulturách s laktózou lze uvolnit trypsinizací pouze 35 % celkové aktivity; 58 % aktivity je vázáno na buněčné zbytky.

Uvedené výsledky dokládají účinek laktózy na pokles syntézy enzymu a jeho uvolňování.

Příklad 2

Studium účinků melibiózy na syntézu elastázy

Melibióza byla přidána do kultivačního média v koncentraci 10 mmol/1, tj. 3,4 mg/ml za stejných podmínek jako laktóza.

Vlivem melibiózy došlo k 60% snížení enzymové aktivity v kultivačním médiu ve srovnání s kontrolou, k 80% snížení aktivity v trypsinizovaném vzorku a k mírnému snížení aktivity v buněčném extraktu.

Celkově došlo k 50% snížení enzymové aktivity.

Příklad 3

Studium účinků stachyózy

Stachyóza je tetrasacharid, který lze připravit postupem dle Wolfroma M.L. a Thompsona A., uvedeným v Methods of Carbohydrate Chemistry I. p.368-369, Academie Press, 1962.

Stachyóza byla přidána do kultivačního média v koncentraci 10 mmol/1, tj. 6,6 mg/ml.

Vlivem stachyózy došlo k 30% snížení enzymové aktivity v trypsinizovaném vzorku ve srovnání s kontrolou a k mírnému zvýšení aktivity v kultivačním médiu.

V přítomnosti kappa-elastinu v koncentraci 1 mg/ml došlo k snížení enzymové aktivity v kultivačním médiu (52 %) ve srovnání s kontrolou obsahující pouze kappa-elastin.

V trypsinizovaném vzorku došlo ke zvýšení aktivity o 32 % ve srovnání s kontrolou obsahující pouze kappa-elasitn.

V aktivitě v buněčném extraktu nedošlo k výraznější změně.

Příklad 4

Studium účinků oleoyllaktosylaminu

Oleoyllaktosylamin je sloučenina obecného vzorce X a její syntéza je nová.

-8CZ 292029 B6

a) Syntéza oleoyllaktosylaminu:
1-Aminolaktóza se nechala reagovat s oleoylchloridem za	vzniku laktobionyl-oleoylaminu
následujícího vzorce:
l ClžLOH Tv	Ta	^NH CO
Galaktóza	Glukóza

3,3 g laktosylaminu bylo rozpuštěno v 30 ml methanolu při 80 °C a přidáno 1,2 diethylaminu. K tomuto roztoku byly přidány 4 g oleoylchloridu za stálého míchání při teplotě nepřevyšující 30 °C.

Hodnota pH směsi byla upravena přídavkem HC1 na 3. Kyselina olejová byla odstraněna extrakcí heptanem. Vodná methanolická fáze byla odstraněna extrakcí pentanem. Vodná methanolícká fáze se nechala postupně protéci sloupcem kyselého a bazického iontoměniče a rozpouštědla byla vakuově odpařena.

Získaný produkt stále obsahoval asi 20 % laktózy. Oleoyllaktosylamin lze přečistit na sloupci oktyl-sepharózy.

Rf (MeOH tenká vrstvy silikagelu) : 0,8 (chloroform/methanol 1:1, v/v).

b) účinek na stárnoucí kulturu fibroblastů:

Oleoyllaktosylamin byl přidán v koncentraci 0,5 mmol/1. Při této koncentraci došlo k mírnému zvýšení aktivity v trypsinizovaném vzorku a 20% poklesu aktivity v buněčném extraktu.

Příklad 5

Účinek dimelibionityldiaminohexanu

a) příprava dimelibionityldiaminohexanu:

Tato látka byla syntetizována novým postupem uvedeným níže.

374 g melibiózy (1,1 mmol) a 116 g (0,5 mmol) diaminohexanu bylo rozpuštěno v 5 ml 0,2 mol/1 fosfátového pufru, pH 8 a přidáno 270 mg kyanoborohydridu sodného (4,4 mmol). Reakční směs se nechala stát při laboratorní teplotě 11 dní a potom byla 2 dny zahřívána na 37 °C. Roztok se nechal protéci sloupcem kyselého iontoměniče (TÉ) a sloupec byl promyt vodou.

Produkt byl potom eluován 0,5 mol/1 čpavkem a roztok lyofilizován s výtěžkem 200 mg dimelibionityldiaminohexanu.

R_fna silikagelu: 0,2 (butanol/kys. octová/voda, h=l: 1).

-9CZ 292029 B6

Schéma 1 dokumentuje reakční postup vedoucí k derivátům dimelibionityldiaminohexanu.

b) Účinek dimelibionityldiaminohexanu na enzymovou aktivitu kultur lidských fibroblastů:

Účinek dimelibionityldiaminohexanu došlo ke zvýšení enzymové aktivity v kultivačním médiu a k 40% snížení aktivity v trypsinizovaném vzorku ve srovnání s kontrolou.

V přítomnosti kappa-elastinu došlo k 71% snížení aktivity v kultivačním médiu, ale zvýšení aktivity v trypsinizovaném vzorku nenastalo.

Naproti tomu obnovená aktivita buněčného extraktu mírně vzrostla ve srovnání se systémem obsahujícím samotný kappa-elastin, ale v aktivitě kontroly nedošlo ke změně.

c) Porovnání různých účinků:

Tabulka 3 shrnuje výsledky účinků různých galaktosidových derivátů na aktivitu elastázy lidských fibroblastů:

Tabulka 3: Účinky na aktivitu elastázy

Testovaná látka	celkem	DMEM	Trypsiniz. vzorek	Buněčný extrakt
Laktóza	Φ 27 %	1 30 %	4 70 %	30 %
Laktóza+KE	Ť 13,5 %	T 20 %	t 50 %	Φ 30 %
Melibióza	4 58 %	160 %	l 80 %	130 %
Melibióza+KE	Ť 15%	i 27 %	Ť 31 %	Ť9%
Stachyóza	Φ 17%	T 14 %	i 35 %
Stachyóza+KE	4 17%	Φ 56 %	Ť32 %
Carrageenan	Ť 28 %		Ť 66 %	Ť'30 %
Carrageenan+KE	-	i 28 %	Ť 29 %
LOamin	4 15 %	Ť 44 %	Ť 61%	i 19 %
LOamin+KE	1 27 %		Ť 41 %	Φ 32 %
MLamin	Ť 13 %	Φ 10%	i 15%	Ť 50 %
MLamin+KE	Ť 40 %	Ť 11 %	Ť 17%	Ť 50 %
MBA	i 23 %	t 67 %		i 35 %
MBA+KE	4,7%	Φ 60 %	Φ 20 %	123 %
DMDAH	-	Ť 67 %	4 53 %
DMDAH+KE	Ť 23 %	Ť 70 %	Φ 18%	Ť 34 %
MDH	Ť 58 %	Φ 60 %	137 %	Ť 60 %
MDH+KE	Ť 54 %	1 80 %	Ť 14 %	Ť 56 %

LOamin = laktobionyloleylamin

MLamin = myristoyllaktosylamin

MBA = kys. melibionová

DMDAH = dimelibionitoyldiaminohexan

MDH = dimelibiityldiaminohexan

Zvýrazněné deriváty jsou zmiňovány v následujících příkladech.

-10CZ 292029 B6

Příklad 6

Účinek laktózy a melibiózy na nahé krysy

Testy byly prováděny na dvou skupinách krys a porovnány. Jedna skupina dostávala laktózu nebo melibiózu, druhá placebo.

Poté byly krysy ozářeny dávkou 3 MED (minimální erythematózní dávka)

Elastázová aktivita byla stanovena na biopsiích odebraných z ozářených krys postupem uvedeným v oddíle materiály a postupy.

Průmyslová využitelnost

Předkládaný přípravek je využitelný jako léčivo na léčbu a prevenci příznaků stárnutí pojivových tkání. Jako účinné složky obsahuje oligosacharidy nebo jejich deriváty, které inhibují syntézu a/nebo exkreci fibroblastové elastázy, jejíž nadbytek s příznaky stárnutí souvisí.

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims

1. Použití nejméně jednoho oligosacharidu s 2 až 5 glykosidickými zbytky, nebo derivátu takového oligosacharidu obsahujícího hydrofobní zbytek, přičemž tento oligosacharid má v terminální poloze neredukujícího cukru jeden galaktózový zbytek, pro přípravu přípravku pro léčbu nebo prevenci stárnutí pojivových tkání.

2. Použití oligosacharidu podle nároku 1 s 2 až 5 glykosidickými zbytky, nebo derivátu takového oligosacharidu obsahujícího hydrofobní zbytek, přičemž tento oligosacharid má v terminální poloze neredukujícího cukru jeden galaktózový zbytek, pro přípravu přípravku pro inhibici membránového elastinového receptoru, který se účastní degradace fíbrózní vazivové tkáně.

3. Použití nejméně jednoho oligosacharidu s 2 až 5 glykosidickými zbytky, nebo derivátu takového oligosacharidu obsahujícího hydrofobní zbytek, přičemž tento oligosacharid má v terminální poloze neredukujícího cukru jeden galaktózový zbytek, na kosmetické ošetření příznaků stárnutí pojivových tkání.

4. Použití oligosacharidu podle jednoho z nároků 1 a 2 nebo jeho derivátů v kombinaci s nosičem vyhovujícím povrchové aplikaci, pro přípravu přípravku pro prevenci nebo léčbu příznaků stárnutí pokožky.

5. Použití oligosacharidu podle nároku 3 nebo jeho derivátů v kombinaci s nosičem vyhovujícím povrchové aplikaci, na kosmetické ošetření příznaků stárnutí pokožky.

6. Použití podle kteréhokoli z nároků 1 až 5, kde oligosacharid je sloučenina obecného vzorce A galaktóza-_n(a nebo β)-(Χ)η’ (^A)>

-11 CZ 292029 B6 v němž:

n představuje polohu 1,2,3,4 nebo 6,

X představuje pentózu nebo hexózu vázanou v konfiguraci a nebo β, n' je číslo 1 až 5.

7. Použití podle nároku 6, ve kterém oligosacharidem je melibióza.

8. Farmaceutický přípravek, vyznačující se tím, že obsahuje oligosacharid nebo jeho derivát nesoucí hydrofobní radikál jako účinnou složku a farmaceuticky přijatelný excipient, přičemž uvedený oligosacharid je sloučenina obecného vzorce A galaktóza-_n(a nebo β)-(Χ)η· (A), v němž:

n představuje polohu 1, 2, 3, 4 nebo 6,

X představuje pentózu nebo hexózu vázanou v konfiguraci a nebo β, n' je číslo laž 5, za předpokladu, že pokud oligosacharid není substituován, nejde o laktózu, a za předpokladu, že derivát oligosacharidu pochází z jedné z následujících kategorií:

a) glykosid některého z následujících obecných vzorců I nebo II, v nichž oligosacharid je oligoglykosid, výhodně laktóza, melibióza nebo stachyóza:

(I) oligoglykosid-l-O-R, v němž R je lineární nebo rozvětvený C]-Ci8 alkylový zbytek, za předpokladu, že:

pokud v obecném vzorci A jeAgal a n je rovno 1, Rje jiná skupina než ethyl nebo methyl, pokud je oligosacharidem laktóza, je skupina R jiná než Ci-C₆ alkylový zbytek, (II) oligoglykosid-l-O-R-l-oligoglykosid, v němž R = (CH₂)_n, n je 2 až 10,

b) acylovaný glykosylamin některého z následujících obecných vzorců ΙΠ nebo IV, v nichž oligoglykosid je výhodně laktóza, melibióza nebo stachyóza:

(III) oligoglykosid-l-NH-CO-R, v němž Rje Cr-Cis alkylový zbytek s žádnou, 1 nebo 2 dvojnými vazbami, (IV) oligoglykosid-l-NH-CO-R-CO-NH-l-oligoglykosid, v němž R = (CH₂)_n, n je 2 až 8,

c) alkylamin acylovaný kyselinou aldonovou získanou oxidací oligoglykosidů, obecných vzorců V nebo VI, (V) oligoglykosid-CO-NH-R, v němž R má stejný význam jako ve vzorci III,

-12CZ 292029 B6 (VI) oligoglykosid-CO-NH-R-NH-CO-oligoglykosid, v němž R má stejný význam jako ve vzorci III,

d) nebo produkt redukce Schiffových bází vzniklý reakcí oligoglykosidů s alifatickými mono- nebo diaminy a odpovídající některému z následujících obecných vzorců VII nebo VIII, (VII) Gal-(Hex)_n-X-HN-R, (VIII) Gal-(Hex)_n-X-HN-R-NH-X-(Hex)_n-Gal, v němž:

Hex je zbytek hexózy (nebo pentózy), n = 0, 1 nebo 2,

X = zbytek hexitu (nebo pentitu) a

R má stejný význam jako ve vzorci III.

9. Farmaceutický přípravek podle nároku 8, vyznačující se tím, že jako účinnou složku obsahuje nejméně jeden oligosacharid volený z melibiózy, stachyózy a jejich směsi.

10. Kosmetický přípravek, vyznačující se tím, že jako účinnou složku pro stárnutí pojivových tkání obsahuje sloučeninu zvolenou ze skupiny látek zahrnující melibiózu a oligosacharidické deriváty obsahující 2 až 5 glykosidických zbytků a vterminální poloze neredukujícího cukru galaktózu a substituované hydrofobním radikálem, deriváty pocházející zjedné z následujících kategorií:

(I) oligoglykosid-l-O-R, v němž R je lineární nebo rozvětvený Ci-C]g alkyl, (II) oligoglykosid-l-O-R-O-l-oligoglykosid, v němž R = (CH₂)_n, n je 2 až 10,

b) acylovaný glykosylamin některého z následujících obecných vzorců III nebo IV, v nichž oligoglykosid je výhodně laktóza, melibióza nebo stachyóza:

(III) oligoglykosid-l-NH-CO-R, v němž R je C₂-Ci₈ alkylový zbytek s žádnou 1 nebo 2 dvojnými vazbami, (IV) oligoglykosid-l-NH-CO-R-CO-NH-l-oligoglykosid, v němž R = (CH₂)_n, n je 2 až 8,

c) alkylamin acylovaný kyselinou aldonovou získanou oxidací oligoglykosidů obecných vzorců V nebo VI (V) oligoglykosid-CO-NH-R, v němž R má stejný význam jako ve vzorci III, (VI) oligoglykosid-CO-NH-R-NH-CO-oligoglykosid, v němž R má stejný význam jako ve vzorci III,

d) nebo produkt redukce Schiffových bází vzniklý reakcí oligoglykosidů s alifatickými mononebo diaminy a odpovídající některému z následujících obecných vzorců VII nebo VIII,

- 13CZ 292029 B6 (VII) Gal-(Hex)_n-X-HN-R, (VIII) Gal-(Hex)_n-X-HN-R-NH-X-(Hex)_n-Gal, v němž:

Hex je hexóza (nebo pentóza), n = 0, 1 nebo 2,

X = zbytek hexitu (nebo pentitu) a

R má stejný význam jako ve vzorci III.

11. Kosmetický přípravek podle nároku 10, vyznačující se tím, že obsahuje melibiózu.

12. Způsob přípravy kosmetického přípravku podle kteréhokoliv z nároků 8 až 10, vyznačující se tím, že se použijí oligosacharidické deriváty, které jsou připraveny chemickou syntézou.

13. Způsob přípravy kosmetického přípravku podle kteréhokoliv z nároků 8 až 11, vyznačující se tím, že se použijí oligosacharidické deriváty, které jsou připraveny následujícím způsobem:

a) z biologického materiálu, zejména mléka, krve nebo placenty, se extrahují cukry,

b) extrahované cukry se enzymaticky degradují nebo chemicky hydrolyzují,

c) separuje se požadovaný oligosacharid.

14. Způsob přípravy kosmetického přípravku podle kteréhokoliv z nároků 8 až 11 určeného na léčbu nebo prevenci účinků stárnutí, vyznačující se tím, že se začlení 0,5 až 6 % výhodně 1 až 4 % hmotn. oligosacharidu vztaženo k objemu kosmetického přípravku, obsahujícího 2 až 5 glykosidických zbytků a vterminální poloze neredukujícího cukru galaktózu, do přijatelného nosiče určeného na lokální aplikaci.