KR20010022739A

KR20010022739A - 헬리코박터 필로리의 정착 저해제

Info

Publication number: KR20010022739A
Application number: KR1020007001336A
Authority: KR
Inventors: 고다마요시까쓰; 기무라노부따께
Original assignee: 도꼬로 히데오; 겐 코오포레이션; 쇼다 오사무; 닛신 세이훈 가부시키가이샤
Priority date: 1998-06-09
Filing date: 1999-05-17
Publication date: 2001-03-26
Also published as: EP1002805A1; EP1002805A4; WO1999064469A1; AU3731399A; CA2300082A1

Abstract

헬리코박터 필로리 군락화 저해제는 활성 성분으로서 황산기를 갖는 다당류를 함유한다. 이 물질은 위에서 헬리코박터 필로리를 특이적으로 제균할 수 있으므로, 위염, 위궤양등의 예방 또는 치료를 위한 안전하고 유효한 약학 조성물을 제공할 수 있으며, 또한 이들 질환의 예방 또는 치료용 식품을 제공할 수 있다. 이 물질은 위산 분비 억제제와 함께 사용되어 Hp 를 더 효과적으로 제균할 수 있다.

Description

헬리코박터 필로리의 정착 저해제{FIXATION INHIBITORS FOR HELICOBACTER PYLORI}

헬리코박터 필로리에 의한 감염 질병은, 현재 소화계 임상분야에서 정력적인 연구가 실시되고 있다. 그 이유는, 위염 및 위궤양 등의 위질환의 원인이 이 균의 관여를 빼고 생각할 수 없고, 또, 세계인구의 약 절반이 이 균에 감염되어 있기 때문이다. 따라서, WHO 의 국제암연구기관 (IARC) 은 역학적연구를 근거로하여 명확한 발암원으로서 헬리코박터 필로리를 인정하고 있다.

헬리코박터 필로리는, 한쪽 끝에 여러개의 편모 (flagella) 를 가진 나선막대형 (spiral rod - shaped)을 한 그램-음성 균으로, 인체의 위 점막에 생식하는 균이다. 이 균은, 1983년 오스트레일리아의 Marshall,B.J. 와 Warren.J.R. 에 의해 위궤양환자의 위의 생검재료로부터 자주 검출되는 균으로 보고되었다. 그 후, 역학적연구를 근거로 하여 이 균은 위염, 위궤양, 및 십이지장궤양을 일으키는 균이며, 위암 등의 질환과 관련이 있다는 보고가 많이 발표되고 있다.

Hp 감염 질병의 병원인자 (virulence factor) 로서는, 지금까지, Hp 에 의해 생산되는 우레아제, 점막 뮤신층에서 자유롭게 운동하는 편모, 염증성 사이트카인으로서의 인터류킨-8 의 생산에 관여하는 Cag A 외막 단백질, 위 점막 상피세포의 공포화, 비란, 괴사 및 궤양형성에 관여하는 VacA 공포화 세포독을 포함하는 것으로 생각되었다. 이들 병원인자 중의 하나인 Hp 에 의해 생성된 우레아제는 암모니아의 생성에 의한 위내 강산 환경을 중화시켜 위내 Hp 의 증식환경을 확보하는 것 및 위 점막에 손상을 부여함으로써, 결과적으로 위염이나 위궤양, 나아가서는 위암을 유발하는 것으로 생각되었다.

소화성 궤양의 근본적인 치료에는 헬리코박터 필로리의 제균이 불가결한 것으로 생각되고 있다. 헬리코박터 필로리를 제균하기 위해, 항생물질과 위산 분비 억제제와의 병용요법이 일반적으로 사용되고 있다. Hp 가 일단 위 점막에 군락화하면 항생물질만으로 위에서 Hp 제균은 어렵다. 따라서, Hp 의 제균에는, 위산 분비를 강력하게 억제하는 프로톤 펌프 인히비터와 복수 항생물질의 병용의 형태로 자주 상용량을 초과하는 양으로 사용되고 있다. 그러나, 항생물질의 장기투여는, 그 부작용과 함께 항생물질 내성을 갖는 균주의 증가라는 매우 중대한 문제가 우려된다.

제균을 목적으로 한 항생물질의 처리에 의한 부작용 및 항생물질 내성을 갖는 균주의 증가 등의 문제를 해결하는 방법으로서, 경구 백신에 의한 면역요법의 방법이 제안되어 왔다. 그러나, 이 제안은 Hp 감염 모델 동물 및 실험조건의 복잡함이 장해가 되어, 새로운 예방 및 치료법의 확립을 목적으로 한 연구는 거의 진전되고 있지않다. 또한, 인체에의 실질적인 적용시 경구백신에 있어서 필수인 보조약의 안전성의 문제도 해결되지 않고 있다. 또한, 백신은 어디까지나 예방을 주체로 하는 것으로, 일단 Hp 가 감염된 환자에 대해서는 효과를 기대할 수 없다.

또한, 백신법 대신 면역요법의 형태로서, 항원으로 Hp 전체세포(whole cell) 에 대해 면역화된 계란으로 부터 얻어진 항체의 사용이 제안되고 있으나, Hp 전체세포에 대한 항체의 사용은 위에서의 완전한 Hp 제균은 기대할 수 없고, 또 이러한 항체가 실제로 위내에서의 Hp 제균을 할 수 있는지에 대하여는 확인되고 있지 않다.

또한, 어떤 종류의 비피더스균이나 유산균의 세포, 이들 세포로부터 추출된 다당류가 위궤양의 예방 또는 치료에 유용한 것 (일본 특허출원 공개 평4-5236호), 특정 종류의 해초유래의 람난, 람노스다당 및 람노스올리고당이 항궤양제로서 유용한 것 (일본 특허출원 공개 평6-247861호) 이 보고되어 있다. 또, 네마시스투스 유래의 다당류인 푸코이단의 사용이 Hp 의 위 점막으로의 군락화를 저해하고 항궤양 활성을 갖는 것으로 기술 되어 있으나 (일본 특허출원 공개 평7-138166호), 이 공보에 있어서, 궤양 치료 효과를 나타내기 위해서는 Hp 에 의한 궤양형성과는 병리발생이 기본적으로 다른 아세트산 유발궤양이 사용되고 있고, 따라서 이 공보에는 Hp 감염에 의한 위염 또는 궤양 형성의 억제효과를 나타내는 증거는 없다. 또한, 이 공보에는, 푸코스 (단당류) 가 군락화 (접착) 인자로 생각된다는 기재가 있고, 그 생각에 근거하여, Hp 군락화에 대한 푸코이단의 저해효과를 보이는 시험관내 실험에 있어서는 비오티닐화 푸코스가 접착인자로 사용되고 있으나, 현시점에서는 푸코스는 접착인자로는 생각되지않고 있으므로, 이실험은 Hp 군락화에 대한 푸코이단의 저해 효과를 나타내는 것은 아니다.

또한, 상술한 항궤양제 또는 저해제는 Hp 군락화의 메카니즘 해명을 근거로 한 것은 아니다. 지금까지, Hp 군락화의 메카니즘은 해명되지 않았다. 특히 더 Hp 의 접착 및 접착에 대응하는 위 점막상의 수용체에 대해서는 본 발명전에는 알려져있지 않았다. 따라서, Hp 군락화의 메카니즘에 대한 지견을 근거로한 유효한 Hp 군락화 저해제 또는 유효한 항궤양제의 개발은 행해지고 있지 않았다. 예를 들면, 상기 일본 특허출원 공개 평4-5236 호에서는 어떤 종류의 다당류가 항궤양작용을 나타내는 것인지가 불명확하고, 또한, 아세트산 유발 궤양 및 알콜성 스트레스 유발 궤양의 예방 또는 치료에 관한 것이다. 또한, 상기 일본 특허출원 공개 평6-247861호에서 사용된 다당류는 탈황산화된 다당류이며, 이것은 본 발명에서 발견된, Hp 의 군락화저해에는 황산기가 관여한다는 지견과는 상반되는 것이다.

상기 일본 특허출원 공개 평7-138166호에서는, 주로 푸코스 (단당류) 및 약간의 우론산을 함유하여, 구성 단당류의 일부가 황산화되어 있는 푸코이단의 사용과, 푸코이단은 Hp 군락화 저해 효과를 갖는다는 기재가 있다. 그러나, 이 공보는 다당류의 황산기가 Hp 군락화 저해에 유효하다는 것은 전혀 교시하거나 암시하지 않고 있으므로, Hp 군락화 저해의 메카니즘에 근거하여 약제를 제공한 것은 아니다. 더욱이, 상술한 바와 같이, 이 공보에는 푸코이단이 Hp 군락화에 대한 저해 효과가 있다는 증거는 없다.

상술한 바와 같이, Hp 를 제균하기 위해, 항생물질을 장기간에 걸쳐 사용하면 부작용과 함께 항체물질 내성균이 증가할 우려가 있는 등의 문제가 있으며, 백신 및 Hp 전체 세포에 대한 계란 항체로는 충분한 효과를 기대할 수 없다. 또, 각종 다당류를 사용한 경우의 항궤양 작용 및 푸코이단의 Hp 군락화 저해효과에 대한 메카니즘은 밝혀지고 있지 않다.

본 발명은 헬리코박터 필로리 (Helicobacter pylori ; 이하, "Hp" 로 약기함) 의 군락화 저해제, 헬리코박터 필로리의 감염에 의해 일어나는 위염, 위궤양 및 십이지장궤양을 예방 또는 치료하기 위한 경구 투여용 약학 조성물, 및 위염, 위궤양 및 십이지장궤양의 예방 또는 치료용 식품에 관한 것이다.

도 1 은 정제된 위 뮤신 및 MKN45 세포에 대한 우레아제의 접착 패턴을 나타내는 도면이다.

도 2 는 MKN45 세포에 대한 우레아제의 접착을 나타내는 도면이다.

도 3 은 각종 황산기를 갖는 다당류에 의한 우레아제 접착 억제율을 나타내는 도면이다.

도 4 는 각종 황산기를 갖는 다당류의 우레아제 접착 억제율을 나타내는 도면이다.

본발명을 실행하기 위한 최선의 방법

본 발명의 수행에 있어서 Hp 군락화의 저해제로서 황산기를 갖는 다당류를 사용할 수 있다. 이들 다당류는 천연에 존재하는 것이어도, 화학적으로 합성한 것이어도 된다. 여기에서 "다당류(polysaccharides)" 란, 올리고당을 포함하는 여러개 이상의 단당류를 함유하는 당질로, 호모다당, 헤테로다당, 복합당질을 구성하는 다당류를 포함한다. 황산기에는, O-황산기, N-황산기 (술포아미노기) 일 수 있고, 단당류의 어느 위치에 있어도 무방하다.

본 발명에서 사용된 황산기를 갖는 다당류의 황산기함량은, 황 (sulfur) 으로서 통상 5% 이상이고, 바람직하게는 9 ∼ 20% 이다. Hp 의 위 점막으로의 군락화 저해능은 황 함량과 상관되어 있으므로, 황 함량이 10 ∼ 18% 정도인 다당류를 사용하는 것이 가장 바람직하다.

본 발명에서 사용된 황산기를 포함하는 다당류를 예시하면, 천연에 존재하는 다당류로는, 덱스트란황산, 콘드로이틴황산, 헤파린, 헤파리노이드, 만난황산, 카로닌황산, 카라게난 (κ-카라게난, λ-카라게난 등), 델마탄황산, 푸노란, 포르피란 등을 들 수 있고, 합성된 다당류로는, 황산화카드란, 황산화락토스, 황산화올리고당, 황산화렌티난, 황산화시조필란, 황산화이스트글루칸 등이다. 천연에 존재하는 다당류로서는 덱스트란황산, κ-카라게난, λ-카라게난, 헤파린이 바람직하고, 특히 바람직한 것은 덱스트란황산, 및 λ-카라게난이며, 합성 다당류로서는 황산화카드란이 바람직하다.

본 발명에서 사용된 황산기를 포함하는 다당류는, 시판품을 이용할 수 있다. 예를 들면, 콘드로이틴황산 및 카라게난은 식품첨가물 (증점제) 로서, 덱스트란황산 및 헤파린은 피하, 근육내, 또는 정맥주사용의 항혈액 응고제의 원료로서 사용되고 있다. 황산기를 포함하는 다당류로서는, 황산기를 포함하는 다당류를 함유하는 동물조직 또는 홍조류(Rhodophyta) 또는 갈조류 (Phacophyceae) 등의 해조류 등에서 얻어진 추출물 또는 그의 정제물을 사용하거나, 황산기 함량이 낮거나 전혀 함유되지 않은 천연의 다당류를 황산화하여 사용하여도 된다. 추출, 정제, 및 황산화의 방법은 통상적인 방법을 사용하면 된다.

황산기를 함유하는 다당류를 유효성분으로서 함유하는 Hp 군락화 저해제 및 상기 저해제를 함유하는 항궤양제는 경구로 투여할 수 있다. 황산기를 포함하는 몇몇 다당류는, 항 혈액 응고작용을 갖기 때문에, 주사에 의한 투여인 경우에는 부작용을 갖고 있지만, 경구투여의 경우에는 그와 같은 부작용은 발생하지 않아 안전하다. 물론, 식품첨가물로서 사용된 몇몇 다당류는 안전성이 확인되어 있다.

본 발명에서 사용된 황산기를 포함하는 다당류는, 후술하는 시험관내 실험 및 동물실험으로부터 명확한 바와 같이, Hp 의 위 점막으로의 군락화를 저해할 수 있고, 위로 부터의 우수한 Hp 제균효과를 발휘할 수 있다. 따라서, 황산기를 포함하는 다당류를 유효성분으로 함유하는 약학 조성물은, Hp 의 위 점막으로의 군락화에 의해 발생되는 위염, 위궤양 및 십이지장궤양의 예방 또는 치료에 유용하고, 또한 황산기를 포함하는 다당류를 함유하는 식품은 위염, 위궤양 및 십이지장궤양의 예방 또는 치료용 식품으로서 사용할 수도 있다.

종래, Hp 감염에 의해 생성된 우레아제는 Hp 감염에 의한 위염 또는 위궤양의 병리발생에 대한 병원인자의 하나로서 주목되고는 있었지만, 우레아제가 Hp 의 위 점막으로의 접착에 관여하는 인자인 것은 전혀 예상되지 않았었다. 이와 같은 상황에 있어서, 본 발명자들은 먼저, Hp 의 접착인자는 Hp 세포의 표면층에 국소존재하고 있는 우레아제인 것을 발견하고, 계란으로 부터의 항우레아제 항체를 위염, 위궤양 등의 예방 또는 치료용으로서 사용하는 것을 제안하였다 (일본 특허출원 공개평10-287585호). Hp 가 인체 위암 유래의 MKN-45 세포에 잘 부착하여, 염증성 사이토카인인 인터류킨 8 을 분비하는 것을 이용하여, 항우레아제 항체의 Hp 접착저해능을 검토 하였다. 또한 Hp 감염에 대한 고감수성을 갖는 헤어리스 (hairless) 마우스를 사용하여 Hp 군락화를 위한 항우레아제 항체의 저해능을 조사하였다. 그 결과, 이들 항체가 MKN 세포로의 Hp 의 접착을 효율적으로 저해함과 동시에, 동물실험에 있어서도 유의한 Hp 군락화 저해효과를 나타냈다. 이들 항우레아제 항체는, 의외로 우레아제의 효소활성을 거의 저해하지 않는다. 따라서, 우레아제는 종래 공지된 효소로서의 작용이외에, Hp 의 위 점막으로의 접착에도 관여하고 있는 것이 시사된다.

본 발명자들은 또한, 비오티닐화 우레아제가 헤파린, 위 뮤신, 또는 MKN-45 세포에 특이적으로 접착하는 것을 밝히고, 그리고, 이 우레아제의 접착이 황산기를 포함하는 다당류에 의해 특이적으로 억제될 수 있으며, 동물실험에 있어서 황산기를 포함하는 다당류의 경구투여에 의해 위내의 Hp 군락화가 용량의존적으로 및 특이적으로 저해될 수 있다는 것을 실증하였다 (이하의 실험예 참조). 이들로 부터, Hp 의 우레아제는 위내에서 암모니아를 생성하여 점막에 손상을 부여함과 동시에, 접착인자로서의 기능도 갖는 것을 알 수 있다. 또한, Hp 의 접착인자인 우레아제에 대응하는 수용체인 위 뮤신의 수용체분자는, 황산기 또는 황산에스테르를 함유하고 있는 것으로 생각된다.

본 발명에서는, Hp 의 접착인자와 그 수용체의 관계를 밝히고, 황산기를 포함하는 다당류가 Hp 군락화에 대한 저해활성을 갖는 다는 확인에 근거하여, 유용한 Hp 군락화 저해제, 위염, 위궤양 및 십이지장궤양의 예방 또는 치료용 약학 조성물, 그리고 위염, 위궤양 및 십이지장궤양의 예방 또는 치료용 식품을 제공하는 것이다.

황산기를 포함하는 다당류를 Hp 군락화 저해제, 또는 위염, 위궤양 등의 예방, 또는 치료용 약학 조성물의 유효 성분으로서 사용하는 경우, 다당류는 경구투여에 적합한 임의의 형태일 수 있다. 통상적으로, 주성분으로 황산기를 포함하는 다당류는, 이것에 관용의 담체 또는 부형제를 임의의 방법으로 배합하여 약학 조성물을 형성 할 수 있다. 필요에 따라, 그 외의 첨가제 또는 약제를 첨가할 수 있다. 예를 들면 제산제 (탄산수소나트륨, 탄산마그네슘, 침강탄산칼슘, 합성히드로탈사이트 등), 위 점막 보호제 (합성규산알루미늄, 스쿠랄페이트, 및 구리클로로필린나트륨 등) 및 소화 효소 (바이오디아스타제, 또는 리파제 등) 을 약학 조성물에 첨가할 수 있다. 황산기를 포함하는 다당류의 투여량은 특별히 제안되는 것은 아니지만, 예방의 경우에는 성인 1일당 1 ∼ 5 ㎎/㎏, 치료의 경우에는 성인 1일당 50 ∼ 500 ㎎/㎏ 의 범위가 바람직하다.

황산기 함유 다당류가 위염, 위궤양, 및 십이지장궤양의 예방 또는 치료용 식품으로 사용되는 경우에는, 다당류는 통상 0.1% 이상, 바람직하게는 0.5% 이상 함유될 수 있다.

위산 분비 억제제로서는, 시메티딘, 라니티딘, 및 파모티딘과 같은 H₂인히비터, 오메프라졸, 및 란소프라졸과 같은 프로톤 펌프 인히비터를 사용할 수 있다. 위산 분비 억제제의 투여량은 성인 1 일당 20 ∼ 30 ㎎ 이 바람직하다.

다음으로, 본 발명을 실시예에 의해 더욱 상세히 설명하는데, 본 발명은 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 목적은, 소화성 궤양의 발생에 관여하는 Hp 군락화의 위내 메카니즘을 해명하여 Hp 군락화 저해제를 제공하는 것이며, 또한, 항생물질의 사용에 따른 부작용 및 약제 내성 균주의 증가라는 결점을 가짐이 없이 Hp 감염에 의한 위염, 위궤양 등에 대하여 효과적이고 안전한 예방 또는 치료용 약학 조성물, 그리고 이들 질병의 예방 및 치료용 식품을 제공하는 것이다.

본 발명자들은, 지금까지 충분히 해명되지 않았던 Hp 의 위 점막으로의 군락화 메카니즘을 알아내었으며, 이러한 새로운 지견을 얻은 것에 기인하여 본 발명에 이르렀다.

증식조건의 특수성때문에, 위내에서의 Hp 의 생태에 관해서는 충분히 해명되어 있지 않았다. 특히, 강산성인 위내에서의 증식의 핵심이 되는 위 점막으로의 Hp 군락화에 관하여 여러가지의 연구가 이루어지고 있음에도 불구하고, 위내에서의 강한 증식능력의 이유는 명확하게 설명할 수 없었다. 위 점막으로의 Hp 접착은, 위내에서의 Hp 의 증식에 중요한 역할을 하는 것이므로, 접착인자의 해명은, Hp 에 의해 일어나는 위염, 소화성 궤양의 예방 또는 치료법의 개발에 큰 의의를 갖는다.

지금까지 제안되었던 병원인자 중 하나인, Hp 가 생산하는 우레아제에 대해서는, 상술한 바와 같이 위내의 요소를 암모니아로 변환하는 효소로서의 역할이 위염, 위궤양, 또는 위암 등을 일으킨다고 생각되었다, 또, 각종 실험으로부터, 우레아제는 위 점막에서의 Hp 군락화에는 관여하지 않는 것으로 보고되었다. 즉 우레아제는 접착인자로서의 기능은 갖지않는다고 보고되어 왔다. 본 발명자들은, Hp 의 접착인자에 관한 종래의 연구결과로부터 예상외의, 우레아제 그 자체가 위 점막에서 Hp 의 접착에 관여한다는 지견을 얻었다. 즉, 본 발명자들은 Hp 를 생산하는 우레아제는, 요소를 암모니아로 변환할 수 있는 효소로서의 작용과 함께, 주 접착인자로서 기능하고, 우레아제 자체가 위 점막 뮤신에 결합함으로써 Hp 의 증식이 가능해지는 것을 발견 하였다.

또한, 본 발명자들은, 위 점막 뮤신에서 우레아제의 수용체는 황산기가 수용체에서의 역할을 하고 있는 것을 시사하는 지견을 얻었다. 이와 같이, 접착인자와 그의 수용체와의 관계를 밝힘으로써, 항생물질 내성균주를 발생하지 않고 위로부터 Hp 를 제균하는 신규의 방법을 제공하는 것이 가능해졌다.

본 발명의 한 양상은, 황산기를 가지며 50 몰% 이상의 푸코스를 함유하는 다당류 이외에, 황산기를 갖는 다당류를 유효성분으로 함유하는 헬리코박터 필로리의 군락화 저해제를 제공하는 것이다. 또한, 본 발명은 황산기를 갖는 다당류 및 위산 분비 억제제를 유효성분으로 함유하는 헬리코박터 필로리 군락화 저해제 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 양상은, 황산기를 가지며, 50 몰% 이상의 푸코스를 함유하는다당류 이외의 황산기를 갖는 다당류를 유효성분으로 함유하는 헬리코박터 필로리 감염에 의해 유발된 위염, 위궤양, 및 십이지장궤양의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다. 또한, 본 발명은 황산기를 갖는 다당류 및 위산 분비 억제제를 유효성분으로 함유하는 헬리코박터 필로리 감염에 의한 위염, 위궤양 및 십이지장궤양의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명은, 황산기를 가지며, 50 몰% 이상의 푸코스를 함유하는 다당류 이외의 황산기를 갖는 다당류를 함유하는 위염, 위궤양 및 십이지장궤양의 예방 또는 치료용 식품도 제공한다.

본 발명에서 사용된 황산기를 갖는 다당류로서는, 덱스트란황산, κ-카라게난, λ-카라게난, 헤파린, 또는 황산화 카드란이 바람직하다.

실시예1

처방예 1: 미세입자 1.5g 중

덱스트란황산 100 ㎎

락토스 950 ㎎

옥수수전분 405 ㎎

PVP(K-30) 45 ㎎

상기의 성분을 배합하여, 통상적인 습식조립법으로 미세입자를 얻었다.

처방예 2: 3 정제 중

κ-카라게난 300 ㎎

락토스(200M) 250 ㎎

옥수수전분 50 ㎎

결정화 셀룰로스 180 ㎎

PVP(K-300) 22 ㎎

스테아르산마그네슘 8 ㎎

상기 성분을 배합하여, 통상적인 방법으로 정제를 얻었다.

처방예 3: 과립 1.5g 중

황산화 카드란 100 ㎎

락토스(200M) 900 ㎎

옥수수전분 450 ㎎

PVP(K-30) 50 ㎎

상기의 성분을 배합하여, 통상의 압출조립법으로 과립을 얻었다.

실험예 1 시험관내 실험

각종 황산기를 포함하는 다당류를 사용하여 Hp 에 의해 생산된 우레아제의 위 점막에서의 군락화 저해효과를 시험관내 실험계에서 조사 하였다.

(재료 및 방법)

위 뮤신으로의 우레아제 접착시험

본 발명자들은 먼저, Hp 의 접착인자가 Hp 에 의해 생산된 우레아제인 것을 발견 하였다. 이 우레아제는 이하에 나타낸 바와 같이 위 점막의 뮤신에 잘 결합한다.

우레아제 접착시험에 사용된 돼지 위 뮤신을 이하와 같은 방법으로 조제 하였다.

약 생후 2개월된 건강한 돼지를 도살시켜, 위부를 적출하여, 내부에 0.1M 인산염＋0.15M NaCl＋5 mM N-에틸말레이미드 (NEM)＋1 mM 페닐메틸술포닐플루오라이드 (PMSF)＋1 mM EDTA 함유 PBS(pH7.4) 로 세정 하였다. 위를 절개하고, 위 점막을 깍아내어, 상기의 완충액에 현탁시켰다. 이 점막 현탁액을 빙냉하면서 폴리트론 호모게나이저 (Polytron homogenizer) 를 사용하여 균일화 하고, 이것을 15,000×g 으로 원심하여 상청액을 얻었다. 이 상청액을 25,000×g 으로 다시 원심하여, 상청액을 회수하고, 증류수로 투석한 후, 동결건조하여 조정제 위 뮤신을 얻었다. 이어서, 이 동결 건조된 조정제 위 뮤신을 PBS(pH6.8)(6M 염산구아니딘 및 프로테아제 저해제 (5mM NEM, 1mM PMSF, 1mM EDTA) 를 함유한다) 에 용해하고, 이것을 염화세슘밀도 구배 (1.5g/㎖) 에 중층하여, 34,000×g 으로 48 시간 원심 하였다. 시알산 함유 분획의 검출은 니트로셀룰로스 막 블로팅과 과요오드산 쉬프시약에 의한 염색으로 실시 하였다. 염색된 분획을 풀(pooled) 하고, 염화세슘 밀도 구배에 중층하여 원심 하였다. 염색-포지티브 분획을 풀 및 동결건조 하였다. 이어서, 동결 건조된 생성물은 0.1M 인산완충액 (0.1M NaCl 함유, pH 6.8) 으로 평형화된 세파로스 (Sepharose) CL-4B 칼럼을 통해 겔여과 하여 분획 하였다. PAS 염색-포지티브로 단백질 농도가 높은 분획을 풀하고, PBS (pH6.8) 로 투석하여 정제된 돼지 위 뮤신을 얻었다. 이것을 사용할 때까지 -80 ℃ 로 보존 하였다. 얻어진 위 뮤신은 SDS-PAGE 로 66 kD 의 당단백질임을 확인 하였다.

우레아제 접착 시험용 마이크로플레이트는 다음과 같이 하여 제작 하였다.

96 웰 마이크로플레이트의 각각의 웰에 1.25 % 글루타르알데히드 용액을 100 ㎕ 씩 첨가하여 5 분간 감작(sensitization) 하였다. 이어서, 각각의 웰을 증류수로 3 회 세정한 후, 정제된 돼지 위 뮤신 (1.27 ㎎/㎖) 을 웰당 50 ㎕ 씩 첨가하여 4 ℃ 로 하룻밤 방치하여 부동화 하였다. 마이크로플레이트를 사용시에는 각각의 웰에 3 % BSA 를 첨가하여 37 ℃ 에서 60 분간 반응시킴으로써 블로킹한 후, 이 플레이트는 0.05 % 트윈 20 첨가 PBS 로 3 회 세정하였다.

우레아제접착시험은 상술한 바와 같이 제작한 마이크로플레이트를 사용하여 하기와 같이 수행하였다.

정제된 비오티닐화 우레아제는 pH 범위가 다른 접착배지 (20 mM 인산완충액은 0.01 % 트윈 20 및 0.15 M NaCl 을 함유한다. pH 는 2.0, 3.0, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0 또는 6.5 로 조정해 둔다.) 를 사용하여 최종농도가 7.0 ㎍/㎖ 가 되도록 희석 하였다. 상술한 바와 같이 제조된 각각의 우레아제 샘플을 상술한 뮤신 부동화 마이크로플레이트의 2 웰에 첨가하여 37 ℃ 에서 60 분간 감작 하였다. 이어서, 각각의 웰을 접착배지로 3 회 세정한 후, 바로 10 % 중성 포르말린 (pH 7.4) 을 각각의 웰에 첨가하여 플레이트를 37 ℃ 에서 30 분 방치하여 고정 하였다. 웰에 부착된 우레아제양을 측정하기 위하여 스트렙토아비딘 HRP 를 각각의 웰에 첨가하여 37 ℃ 에서 60 분간 반응시켰다. 이어서, 기질로서 오르토-페닐렌디아민 2 염산 및 H₂O₂를 첨가하여 반응시켰다. 반응 정지액에는 3N H₂SO₄를 사용 하였다. 러닝플레이트에는 2 배 단계 희석한 기지량의 우레아제를 두고 그 검정 곡선으로부터 샘플에 있는 우레아제의 양을 측정 하였다.

인체 위암 유래 MKN45 세포로의 우레아제 접착 시험

인체 위암 유래 MKN45 세포에 Hp 가 잘 접착하여 인터류킨-8 을 분비함이 밝혀졌다 (Kabir, A.M.A. et al., 1997, Gut 40:49-55) (세포는 도카이대학 의학부에서 분여). 이 세포를 이용하여 상술한 정제된 위 뮤신에서와 유사한 방식으로 비오티닐화 우레아제의 접착능을 검토 하였다.

단층 배양된 MKN 세포는 단층배양세포를 얻기 위하여 세포 현탁액을 96 웰 마이크로플레이트의 1 웰당 2 ×10⁴세포개가 되도록 접종하고 37 ℃ 의 5 % CO₂배양장치에서 약 7 일간 배양함으로써 얻었다.

우레아제 접착 억제시험

인체 위암 유래 MKN45 세포를 사용하여 각종 당류의 우레아제 접착 저해시험을 실시 하였다. 우선, 여러 농도를 갖는 샘플 (황산기를 함유하는 다당류) 를 각기 비오티닐화 우레아제와 혼합하고, 각각의 혼합물을 37 ℃ 에서 60 분간 진탕하여 감작 하였다. 이어서, 이 혼합물을 96 웰 마이크로플레이트의 단층배양세포 웰로 옮기고 플레이트를 진탕하면서 37 ℃ 에서 60 분간 감작 하였다. 그 후, 각각의 마이크로플레이트의 웰을 접착배지 (pH 3.0) 로 3 회 세정하고, 65 ℃ 에서 10 분간 가열함으로써 고정 하였다. 고정한 각각의 웰을 PBS-트윈 20 (0.5 %) (pH 6.8) 으로 3 회 세정하고, 각각의 웰에 스트렙토-아비딘 HRP 를 첨가한 후,세포에 접착된 비오티닐화 우레아제를 상기「위 뮤신으로의 우레아제 접착시험」에 기재된 ELISA 로 검출 하였다.

(결과)

정제된 위 뮤신 및 MKN45 세포에 대한 우레아제 접착 패턴

도 1 에 나타낸 바와 같이 정제된 위 뮤신에 대한 우레아제 접착 패턴은 MKN45 세포에 대한 우레아제의 접착패턴과 유사하다. 즉, MKN 45 세포로의 우레아제의 접착은 위 뮤신의 경우와 마찬가지로 pH 에 의존하고 있으며, 이것은 MKN 45 세포가 위 뮤신에서 인식되는 것과 같은 동일한 수용체를 세포 표면에 발현하고 있음을 시사하고 있다 (우레아제의 위 뮤신으로의 접착패턴에는 pH 4.5 정도에서도 숄더피크 (shoulderpeak) 가 관측된다는 점에서 MKN45 세포의 경우와 약간 다르다. 그러나, 이것은 MKN45 세포의 표면에는 충분한 양의 우레아제 수용체가 발현하고 있지 않거나, 또는 수용체 분자의 구성이 약간 다르기 때문이라고 생각된다). pH 3.0 정도 에서의 우레아제 접착반응은 위 점막에 있어서의 Hp 의 군락화 특성을 반영하고 있다고 생각되며, 이 pH 범위에서 우레아제의 접착을 저해할 수 있는 물질은 Hp 의 위내 군락화를 저해하여 결과적으로 위염 및 위궤양을 예방 또는 치료할 수 있는 가능성이 있다.

MKN45 세포로의 우레아제 접착

도 2 에서 알 수 있는 바와 같이 MKN45 세포로의 우레아제 접착반응은 용량의존적으로 S 자형 커브를 나타낸다.

황산기를 함유하는 다당류에 의한 우레아제 접착의 억제

도 3 및 도 4 에 나타낸 바와 같이 MKN45 세포로의 우레아제 접착반응은 황산기를 함유하는 다당류에 의해 특이적으로 저해되었다. 도 3 에는 황산기를 함유하는 다당류로서 덱스트란황산, 헤파린, γ-카라게난, 및 κ-카라게난을 사용한 경우의 평균 우레아제 접착 억제율이 나타나 있으며, 이들 황산기를 함유하는 다당류는 우레아제 접착을 특이적으로 및 용량의존적으로 저해하고 있음을 나타낸다. 한편, 대조물질로서 사용한 황산기를 함유하지 않은 덱스트란은 접착을 저해하지 않았다. 또한, 도 4 는 대조물질로서 카드란 및 황산기를 함유하는 다당류로서 황산화카드란을 사용한 경우의 평균 우레아제 접착 억제율을 나타내며, 황산화카드란이 접착을 특이적으로 및 용량 의존적으로 저해하고 있음을 나타낸다.

이상의 결과에서 Hp 에 의해 생산된 우레아제는 위 뮤신 및 MKN 45 세포에 특이적으로 및 용량 의존적으로 접착하며, 이 우레아제 접착은 황산기를 함유하는 다당류에 의해 특이적으로 및 용량 의존적으로 저해됨이 분명하다. 우레아제는 Hp 세포의 표면에 국재하고 있기 때문에, 황산기를 함유하는 물질을 경구투여하면 위내의 Hp 의 우레아제에 특이적으로 결합함으로써 Hp 를 제균할 수 있을 것이다.

실험예 2 생체내 실험

이 실험은 실험예 1 의 결과를 다시 확인하기 위해 수행 하였다.

실험동물로서 Hp 감염에 대하여 높은 감수성을 갖는 헤어리스 마우스 (NS : Hr/ICR, Research Institute for Human and Animal propagation, 수탁번호 IRA-NHI-9701) (ATCC#72024) 를 사용 하였다. 이하의 표 1 에 나타낸 스케쥴에 의거하여 동물실험을 실시 하였다. 각각의 샘플은 공격 2 일전부터 도살시까지 음료에 용해시켜 자유 투여 하였다. 마우스 한 마리의 1 일당 음료량은 4 ∼ 8 ㎖ 였다. 인체 임상재료에서 단리된 NSP335 (Cag A⁺및 Vac A⁺) 1 ×10⁹CFU 로 각각의 마우스를 공격 하였다. 샘플 투여 완료시에 각군의 마우스를 도살한다. 마우스의 위를 적출하고, 내용물을 제거한 후, 위는 보르텍스 믹서를 사용하여 PBS (pH 7.2) 로 8 회 세정하고, 호모게나이저로 균일화하여 에멀션을 형성한 후, Hp 검출용으로 사용 하였다. Hp 의 검출은 에멀션을 Hp 검출용 배지 (포어미디어 Hp 단리배지, 에이켄가가꾸) 에 넣고, 가스팩법으로 37 ℃ 에서 5 일간 배양하여 콜로니수를 계측함으로써 수행 하였다. 사용된 샘플은 덱스트란황산, 덱스트란, 카라게난, 카드란 및 카드란황산을 사용 하였다.

이하의 표 2-1 및 표 2-2 는 생체내 실험 결과를 나타낸다. 이들 표에서 알 수 있는 바와 같이 황산기를 함유하는 다당류 (κ-카라게난, γ-카라게난, 덱스트란황산, 황산화카드란) 은 Hp 의 위내 군락화를 저해하고 위로부터 우수한 Hp 제균 효과를 얻을 수 있다. 또한, 다당류의 황산기의 함량과 군락화 저해능은 상관하는 경향이 인정되었다 (표 2-2). 이에 비하여, 황산기를 함유하지 않는 다당류는 무투여의 대조군과 마찬가지로 Hp 의 군락화를 저해할 수 없었다.

샘플	비감염 마우스	제균율(%)	유의수준
κ-카라게난(250㎍/㎖)	10/15	67	P＜0.001
γ-카라게난(250㎍/㎖)	13/15	87	P＜0.001
덱스트란황산(25㎍/㎖)	19/20	95	P＜0.001
덱스트란(25㎍/㎖)	0/20	0	NS
대조	0/20	0

샘플	투여양(음료중)	비감염 마우스	제균율(%)	유의수준
황산카드란	0.1㎍/㎖	15/20	75	P＜0.001
	1.0㎍/㎖	17/20	85	P＜0.001
	10.0㎍/㎖	19/20	95	P＜0.001
	100.0㎍/㎖	20/20	100	P＜0.001
카드란	10.0㎍/㎖	0/20	0	NS
대조	…	0/20	0

실험예 3 생체내 실험 (황산기를 함유하는 다당류와 위산 분비억제제의 병용)

이실험은 황산기를 함유하는 다당류와 위산 분비 억제제 (H₂인히비터, 프로톤 펌프 인히비터) 를 병용하여 얻어진 시너지 효과를 입증하기 위하여 동물에서 수행 하였다. 이 실험에서 황산기를 함유하는 다당류로서, 덱스트란황산 및 황산화카드란을 사용하였고, 이들 물질은 실험예 2 에서와 같이 높은 제균율을 나타낸다.

동물실험의 방법은 상기 실험예 2 와 동일하나, 실험의 스케쥴은 이하의 표 3 에 나타내는 바와 같고, 샘플의 투여는 공격 1 주일후부터 도살시까지로 한다.

황산기를 함유하는 다당류로서 덱스트란황산 또는 황산화카드란과 위산 분비억제제로서 시메티딘 (H₂인히비터) 또는 오메프라졸 (프로톤 펌프 인히비터) 을 병용한 경우의 Hp 제균효과를 표 4 에 나타낸다. (Hp 의 군락화가 안정화되었을 때) 공격 1 주일후부터의 투여에도, 이러한 병용은 높은 제균율을 나타내며, 이러한 병용은 황산기를 함유하는 다당류 단독 투여보다 더 우수한 제균효과를 나타내는 것을 의미한다.

투여군	비감염 마우스	제균율(%)
덱스트란황산 (2.5㎍/㎖)+ 시메티딘 (200㎍/㎖)	8/10	80
덱스트란황산 (2.5㎍/㎖)+ 오메프라졸 (15㎍/㎖)	9/10	90
황산화카드란 (0.1㎍/㎖)+ 시메티딘(200 ㎍/㎖)	9/10	90
황산화카드란 (0.1㎍/㎖)+ 오메프라졸 (15㎍/㎖)	10/10	100
대조	0/10	0

상술한 동물실험 결과로 부터 황산기를 함유하는 다당류는 Hp 의 위내 군락화를 효율적으로 저해할 수 있다는 점, 및 H₂인히비터나 프로톤 펌프 인히비터 등의 위산 분비 억제제와 황산기를 함유하는 다당류의 병용은 보다 효과적인 제균효과를 나타냄이 명확해졌다. 이들 물질은 항생물질과 달리 약제 내성의 문제가 발생하지 않기 때문에 Hp 제균을 위한 유용한 방법을 제공할 수 있다.

상술한 바와 같이, 본 발명은 헬리코박터 필로리의 위 점막에서의 유효한 군락화 저해제를 제공한다. 이 저해제는 Hp 감염에 의해 일어나는 위염, 위궤양 등의 예방 또는 치료에 대하여 안전하고 효과적인 약학 조성물의 형태 및 이들 질환의 예방 또는 치료용 식품의 형태로 사용할 수 있다. 본 발명은 Hp 의 위 점막으로의 접착에 관여하는 인자 및 위내에서의 그의 수용체를 발견한 것에 의거하여 Hp 군락화 저해에 황산기를 함유하는 다당류를 사용하는 것에 관한 것이다. 따라서, 약제 내성을 발생시키지 않고 위에서 Hp 를 특이적으로 제균할 수 있으며, 위염, 위궤양 등을 효과적으로 억제할 수 있다. Hp 제균효과는 위산 분비 억제제와의 병용에 의해 더욱 높아진다.

Claims

황산기를 가지며, 50 몰% 이상의 푸코스를 함유하는 다당류 이외의 황산기를 갖는 다당류를 유효성분으로 함유하는 헬리코박터 필로리 (Helicobacter pylori) 의 군락화 저해제.
황산기를 갖는 다당류 및 위산 분비 억제제를 유효성분으로 함유하는 헬리코박터 필로리의 군락화 저해제 조성물.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 황산기를 갖는 다당류가 덱스트란황산, κ-카라게난, γ-카라게난, 헤파린 또는 황산화카드란인 저해제.
황산기를 가지며, 50 몰% 이상의 푸코스를 함유하는 다당류 이외의 황산기를 갖는 다당류를 유효성분으로 함유 하는 헬리코박터 필로리에 의해 유발된 위염, 위궤양, 및 십이지장궤양의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
황산기를 갖는 다당류 및 위산 분비 억제제를 유효성분으로 함유하는 헬리코박터 필로리에 의해 유발된 위염, 위궤양, 및 십이지장궤양의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제 4 항 또는 제 5 항에 있어서, 황산기를 갖는 다당류가 덱스트란황산, κ-카라게난, γ-카라게난, 헤파린 또는 황산화카드란인 약학 조성물.
제 1 항에 따른 저해제를 함유하는 위염, 위궤양, 및 십이지장궤양의 예방 또는 치료용 식품.
제 7 항에 있어서, 황산기를 갖는 다당류가 덱스트란황산, κ-카라게난, γ-카라게난, 헤파린 또는 황산화카드란인 식품.