KR100426832B1

KR100426832B1 - 위염, 위궤양 및 십이지장궤양의 예방 또는 치료에 사용되는 특이적 항체

Info

Publication number: KR100426832B1
Application number: KR10-1998-0012965A
Authority: KR
Inventors: 요시까쓰 고다마; 쥬니어 파우스티노 씨. 이카트로; 노부따께 기무라; 마사또 아리가
Original assignee: 겐 코오포레이션; 닛신 파마 가부시키가이샤
Priority date: 1997-04-11
Filing date: 1998-04-11
Publication date: 2004-07-19
Also published as: CA2234565C; US20010021393A1; KR19980081323A; US6419926B2; AU735418B2; JP3430853B2; EP0877032A1; US6793921B2; AU6076198A; CA2234565A1; DE69822919D1; JPH10287585A; DE69822919T2; US20020197259A1; EP0877032B1

Abstract

본 발명은 항원으로서 헬리코박터 필로리 (Helicobacter pylori)의 우레아제에 대하여 면역된 암탉이 낳은 계란으로부터 얻어지는 특이적 항체, 및 항원으로서 헬리코박터 필로리의 플라겔라 (flagella) 에 대하여 면역된 암탉이 낳은 계란으로부터 얻어지는 특이적 항체를 제공한다. 이 항체들은 헬리코박터 필로리의 감염에 의한 위염, 위궤양 및 십이지장궤양의 예방 또는 치료에 유용하다. 락트산 박테리아, 엔테로코쿠스 (Enterococcus), 이스트 및 바실루스로부터 선택된 1종 이상의 유기체가 상기 항체와 함께 사용될 수 있다.

Description

위염, 위궤양 및 십이지장궤양의 예방 또는 치료에 사용되는 특이적 항체

본 발명은 헬리코박터 필로리 (helicobacter pylori; 이하 H.필로리 (H.pylori)또는 Hp 라고 일컬음) 의 감염에 의해 야기되는 위염, 위궤양 및 십이지장궤양의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 제조, 및 위염, 위궤양 및 십이지장궤양 예방용 식품의 첨가제로 사용되는 특이적 항체에 관한 것이다.

현재 H.필로리를 위 내에서 근절시키는 것은 소화기관 궤양의 완전한 치료에 필수적이라고 생각된다. 항생제와 위산 분비 억제제의 병용은 하기와 같이 H.필로리의 효과적인 근절을 위한 요법으로 통상 제안되어 왔다.

H.필로리는 인간의 위점막에 서식하고 한쪽 말단에 플라겔라를 가지는 그램-음성의 나선 막대형 박테리아이다. 이 박테리아는 위궤양 환자의 위 생체 검사 표본으로부터 자주 검출된다는 것이 1983 년에 보고되었다(Marshall, B.J.; Warren, J.R.). 그 당시 이 박테리아는 그 형태 및 성장 특징이 캠필로박터 (Campylobacter) 와 유사하였으므로 캠필로박터 필로리(Campylobacter pylori) 로 명명되었다. 그 후 이 박테리아는 외막의 지방산 조성물 및 리보솜 16s-RNA 서열에서 캠필로박터와 다르다는 것이 발견되었다. 그러므로 이 박테리아는 현재 헬리코박터 필로리라고 불리우며, 헬리코박터의 새로운 류에 속한다.

그 이후, 이 박테리아는 위염, 위궤양 및 십이지장궤양을 일으키며, 위암과 같은 질병과 관련됨을 지적하는 많은 보고가 전염병학을 기초로 하여 발표되었다. 일단 H.필로리가 위점막에 이주하면, 비록 그의 감염에 대한 면역 반응이 강하더라도, 즉 항체 역가가 높더라도, 이것은 위 내에서 근절될 수는 없고 위에 계속 서식한다. 따라서 항체 요법에 의해 H.필로리가 위에서 완전히 제거되지 않는 한, 감염 조건은 항체 투여를 중지한 후 약 1 개월 내에 치료 전과 동일한 수준으로 되돌아갈 것이다. 또한 위의 pH 는 강산인 HCl 에 의해 매우 낮게 유지되므로 대부분의 항체는 비활성화되기 쉽다. 이러한 이유 때문에 항체 및, 위산 분비를 강하게 억제하는 프로톤 펌프 억제제가 H.필로리의 근절을 위해 통상적인 것보다 많은 투여량으로 종종 병용된다. 최근에는 비스무트 서브살리실레이트, 메트로니다졸 및 테트라사이클린을 병용하는 새로운 치료법이 H.필로리의 제거율이 높다는 것이 증명되었으나, 이 조합에서 메트로니다졸은 단독으로 사용될 때, 내항체성 균주의 빠른 출현을 야기시킨다. 개발도상국들에서 이 의약은 설사 환자의 치료에 광범위하게 사용되지만, 결과적으로 내-메트로니다졸성 H.필로리의 감염율이 높다. 그러므로 항체를 장기간 투여하는 것은 부작용은 물론 내항체성 균주를 증가시킨다는 심각한 문제가 있다.

현재 경구 백신을 사용하는 면역 요법 접근이, 박테리아의 근절을 위해 항체로 치료하는 것에 의한 부작용 및 내항체성 균주 증가와 같은 문제점들을 해결하기 위해 제안되고 있다. 그러나, 상기 목적을 위해서는 Hp 감염을 위한 모델 동물들을 설정하는 것이 필수적이다. Hp 감염 시험이 시궁쥐, 쥐, 토끼, 개, 돼지 및 원숭이를 사용하여 수행되었고, 개, 돼지 및 원숭이를 사용한 시험이 성공적이라는 보고가 있었다. 그러나, Hp 는 쥐 및 시궁쥐와 같은 작은 동물들에게는 쉽게 감염되지 않고, 감염 시험은 복잡한 조건을 필요로 한다. 예를 들면, 무균 동물들이 감염에 필요하고, 새로운 분리체들은 오랫동안 감염을 지속할 필요가 있다. 예방 및 치료를 위한 새로운 방법 개발을 향한 연구는 이 조건들에 의하여 방해를 받아왔다.

예를 들면 Hp 경구 백신의 효율을 평가하기 위한 쥐 모델을 사용하는 경구 면역에 의해 Hp 감염의 80 % 가 억제되는 것이 문헌 (Marchetti,M.et al.,Science, 267, 1655-1658,1995) 에 보고되었다. 그러나, 경구 백신 조합제는 보조제로서 E.콜리 (E.coli) 로부터 유도된 이열성 독소 (LT) 를 가진다. 통상 경구 백신을 사용하는 상기와 같은 실험에서는 백신 제제는 E.콜리로부터 유도된 LT 외에도 콜레라 독소를 가지며, 점막 면역은 이들 보조약 없이는 얻어질 수 없다. E.콜리로부터 유도된 LT 및 콜레라 독소는 고도의 독성을 가지며 이들 백신법은 인간에의 실제 적용시 안정성에 관한 많은 해결되지 않은 문제점을 가진다. 또한 백신은 예방에 우선적으로 사용되며, 따라서 Hp 에 이미 감염된 바 있는 환자에게는 효과가 없다.

HP 의 억제를 위한 새로운 시도로서, 아이바 등 (Aiba et al) (제 30 회 일본 무균 동물 과학회, 프로그램 및 초록, 22 쪽, 제 18, 헬리코박터 필로리 억제를 위한 새로운 시도, 일본, 1997) 은 Hp 감염의 모델로서 무균 쥐를 사용하고, (i) 프로비오틱스로서 락토바실러스 살리바리우스 (Lactobacillus salivarius) 가 Hp 억제에 미치는 효과, 및 (ii) 포르말린으로 죽인 Hp 의 전 세포로 면역된 암탉이 낳은 계란의 노른자위로부터 얻어진 항- Hp 항체의 경구 투여가 Hp 억제에 미치는 효과를 연구하였다. (i) 의 경우, 투여군의 Hp 감염 쥐의 위 내 Hp 의 수는 대조군의 것보다 10 내지 1000 배 적어졌다. (ii) 의 경우, 투여군의 위 내 Hp 의 수는 대조군의 것보다 10 배 적어졌다.

그러나, 이 결과는 구강, 위 및 장에 정상적 세균군을 가지지 않는 쥐를 사용하여 얻어진 것이고, 정상적 세균군을 가진 일반 쥐에서도 얻어질 것이라고는 예상되지 않는다. 일반적으로 유전적 정상적 세균군을 가진 쥐에 인간의 락트산 박테리아를 접종하면, 박테리아는 정상적 세균군에 의해 제거되고, 이주되지 않는다. 또한 상기 실험에서 사용되는 항체는 Hp 의 전 세포에 대한 것이고, 위 내 Hp 의 수는 대조군에 비교하여 단지 10 배가 적을 뿐이어서, HP 는 완전히 제거되지 않았다. 더우기 Hp 의 감소와 위염의 경감 사이 관계에 대하여는 언급이 없다.

일본 특개평 제 4-275232 호 공보에서는 특이적 항체의 사용을 개시하였으나, 항원으로서 Hp 전 세포에 대하여 면역된 암탉이 낳은 계란으로부터 얻어진 항체만을 언급하고 있다. 이것은 항원으로서 Hp 전 세포에 대하여 면역된 암탉이 낳은 계란으로부터 얻어진, 항원에 특이성을 가진 항체를 활성 성분으로 함유하는, 위염, 위궤양 및 십이지장궤양의 예방용 식품을 기재하고 있으나, 특이적 항체의 효과가 불명료하다. 전 세포에 대한 얻어진 항체의 효율은 시험관 내 돼지 위점막의 뮤신에 Hp 가 유착되는 사실로써 평가할 수 있고, 그 결과는 Hp 전 세포에 대한 계란의 항체는 Hp 가 위점막에 유착되는 것을 억제한다는 것이다. 그러나, 시험관 내 시험은 pH 7.4 의 온건한 조건에서 실행된 것이므로, 얻어진 데이터가 위 내 pH 1 내지 3 의 강산성 조건에서 얻어질 수 있는 결과를 정확히 나타내는 것인지 의문이다. 위 내 강산성 조건에서 Hp 를 제거하는 효과의 확인은 실험에서 Hp 감염 모델로서의 동물을 필요로 한다. 상기 특허 출원은 그러한 실험을 언급하지는 않았으므로, Hp 전 세포에 대한 계란의 항체의 투여가 Hp 의 제거를 촉진시키는 지는 확실하지 않다. 또한 그 항체가 위염의 발생을 억제하는지의 여부도 언급되지 않았다.

Hp 전 세포 에 대한 계란의 항체가 Hp 성장에 억제 효과를 갖는다는 것이 문헌 (일본 농화학회 회보 71, pp52, 20p22 (1997)) 에 개시되어 있다. 그러나, 그 항체는 암탉을 면역시키는데 사용한 항원이 Hp 전 세포이므로 상기와 동일한 문제점을 가질 수 있다.

Hp 전 세포에 대한 항체는 소와 같은 포유류 동물의 유즙 또는 혈청으로부터 얻을 수 있음이 알려져 있다. 일본 특개평 제 4-169539 및 4-330099 호 공보를 참고로 할 수 있다. 이 방법들은 항체를 다량으로 저렴하게 생산할 수 없다. 또한, 포유류를 면역시키는데 사용되는 항원이 Hp 전 세포이므로, Hp 의 완전한 제거는 선행기술에서 상기의 아이바 등 (Aiba et al)이 언급한 바와 같이 기대될 수 없다.

상기한 바와 같이 Hp 의 제거를 위해 항체를 장기간 사용하는 것은 부작용은 물론, 내항체성 박테리아를 증가시키게 되고, 백신은 실용적 사용을 위하여 개발되지는 않았다. 또한 락트산 박테리아의 투여 또는 Hp 전세포에 대한 계란 항체 사용에 대한 시도는 Hp 를 근절시킬 수 없으므로, 위염, 위궤양 및 십이지장궤양의 예방 또는 치료용으로 효과적이지 않다.

본 발명의 목적은 부작용 및 내약품성 균주의 증가 없이, 안전하고 효과적인, H.필로리의 감염에 의한 위염, 위궤양 및 십이지장궤양의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 및 상기 질병의 예방용 식품을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 약학적 조성물 제조용 특이적 항체를 제공하는 것이다.

본 발명의 본질은 물론 다른 목적들과 잇점들은 하기 기술에서 명백해질 것이다.

도 1 은 Hp 우레아제가 농도-의존식으로 시궁쥐 위 뮤신에 결합하는 것을 나타낸 그래프이다.

도 2 는 헤파린에 의해 전유착된 쥐 위 뮤신에 우레아의 결합을 나타내는 그래프이다.

도 3 은 계란으로부터 얻어진 다양한 항체의 Hp 의 인간 위암 MKN 45 세포에의 유착에 대한 억제 효과를 나타내는 그래프이다.

본 발명자들은 완전히 밝혀지지 않았던 Hp 가 위점막에 이주하는 메카니즘을 발견하고, 이 발견을 근거로 본 발명을 완성하였다.

H.필로리는 대기 조건에서는 성장할 수 없고, 혐기성 조건에서 적합하게 생장하며, 미세 호기성 조건에서 최적으로 성장한다. 이러한 특이성 때문에 위 내에서 박테리아의 생태는 밝혀지지 않았었다. 특히, 위 내에서의 강한 성장력의 원인은, 강산성을 지닌 위 내에서의 성장의 요소인 Hp 의 위점막에의 이주에 대하여 많은 연구가 행하여 졌음에도 불구하고, 설명될 수 없었다. Hp 가 위점막에 이주하는 것은 위에서의 Hp 생장에 중요한 역할을 하므로, 이주 인자를 밝혀내는 것은 위염, 위궤양 및 십이지장궤양의 예방 또는 치료 방법 개발에 매우 중요하다.

위 내 Hp 의 발병 인자는 Hp 에 의해 생성된 우레아제, 점막 뮤신 층을 자유롭게 이동하는 프라겔라, 염증성 시토킨으로서 인터루킨 8의 생성에 연관된 Cag A 외막 단백질, 위점막 상피 세포의 액포화, 미란, 탈저 및 궤양 형성에 관련된 Vac A 액포 시토톡신이라고 생각되어 왔다.

발병 인자 중 하나인, Hp 에 의해 생성된 우레아제는 우레아를 위 내에서 암모니아로 전환시키고, 박테리아 세포 주변 강산성 환경을 중화시킴으로써, 위 내 Hp 성장에 유용한 환경을 제공할 수 있다고 생각되었다. 한편, Hp 가 위점막에 이주하는 것에 대하여, 무균 돼지를 사용한 실험에서 Hp 의 우레아제-양성 균주는 물론 Hp 의 우레아제-음성 균주가 위에 이주할 수 있다고 보고되었다 (Eaton, K. A.; Krakowka, S. Scand. J. Gastroenterol, 30, 434-437, 1995). 최근 보고에서는 Hp 의 우레아제-음성 균주가 인간의 위점막 상피 세포 및 위 아데노카르시노마 세포 라인으로부터의 세포 (Kato III 세포)에의 결합이 우레아제-양성 균주의 결합과 비교되었고, 2 종류의 균주의 상기 세포에 대한 유착성 사이에 차이가 없다는 것, 및 Hp 의 우레아제는 점착인자(adhesion)으로서 작용하지 않는다고 결론지어졌다(Clyne, M; Drumm, B.1996, Infect.Immun, 64, 2817-2820, 1996).

본 발명자는 Hp 의 이주에 대한 선행기술의 연구 결과에서는 예상되지 못했던, 우레아제 자체가 Hp 가 위 점막에의 이주에 참여함을 발견하였다. 즉, 본 발명자는 Hp 에 의해 생성된 우레아제는 우레아를 암모니아로 전환시킬 수 있는 효소로서 작용할 뿐 아니라, 주 점착인자로서 작용하고, 우레아제 자체를 위 점막 뮤신에 결합시키는 것이 Hp 를 성장할 수 있게 한다는 것을 발견하였다. 또한, 본 발명자는 Hp 의 프라겔라가 또한 Hp 의 위 점막에의 이주에 참여한다는 것을 제안하는 정보를 얻었다.

본 발명은 Hp 의 전 세포에 대한 항체는 충분하지 않고, Hp 의 우레아제 및/또는 프라겔라에 대한 항체가 Hp 의 위 점막에의 이주를 완전히 억제하여 Hp 의 위 내 성장을 억제하는데 효과적이라는 것을 제안하는 발견을 기초로 하여 만들어졌다. 또한 이들 항체 중 하나 또는 둘 다와, 락트산 박테리아, 엔테로코쿠스 (Enterococcus), 이스트 및 바실러스로부터 선택된 1종 이상의 유기체를 조합하면 상승 효과를 얻을 수 있다는 것도 발견하였다.

한 태양으로서 본 발명은, 항원으로서 헬리코박터 필로리의 우레아제에 대하여 면역된 암탉이 낳은 계란으로부터 얻어지고 상기 항원에 대하여 활성인, 헬리코박터 필로리의 우레아제에 대한 특이적 항체를 제공한다. 본 발명은 또한 항원으로서 헬리코박터 필로리의 플라겔라에 대하여 면역된 암탉이 낳은 계란으로부터 얻어지고 상기 항원에 대하여 활성인, 헬리코박터 필로리의 플라겔라에 대한 특이적 항체를 제공한다.

상기 항-우레아제 항체는 우레아제에 대하여 활성이고, 항-프라겔라 항체는 프라겔라에 대하여 활성이다. 그러므로, 항-우레아제 항체 및/또는 항-프라겔라 항체는 위 내에서의 H.필로리의 성장 억제에 효과적이다. 항-우레아제 항체는 락트산 박테리아, 엔테로코쿠스, 이스트 및 바실러스로부터 선택된 1종 이상의 유기체와 병용되어 H.필로리의 위 내에서의 성장을 억제시킬 수 있다. 항-우레아제 항체는 항-프라겔라 항체 및, 락트산 박테리아, 엔테로코쿠스, 이스트 및 바실러스로부터 선택된 1종 이상의 유기체와 병용되어 H.필로리의 위 내에서의 성장을 억제시킬 수 있다.

다른 태양으로서 본 발명은, 활성 성분으로서 상기 항-우레아제 항체 및/또는 항-프라겔라 항체를 함유하는, 위염, 위궤양 및 십이지장궤양의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 항-우레아제 항체는 락트산 박테리아, 엔테로코쿠스, 이스트 및 바실러스로부터 선택된 1종 이상의 유기체와 병용되어 위염, 위궤양 및 십이지장궤양의 예방 또는 치료용으로 사용될 수 있다. 항-우레아제 항체는 항-프라겔라 항체 및 락트산 박테리아, 엔테로코쿠스, 이스트 및 바실러스로부터 선택된 1종 이상의 유기체와 병용되어 위염, 위궤양 및 십이지장궤양의 예방 또는 치료용으로 사용될 수 있다.

본 발명은 또한 첨가제로서 으로서 상기 항-우레아제 항체 및/또는 항-프라겔라 항체를 함유하는, 위염, 위궤양 및 십이지장궤양의 예방용 식품을 제공한다. 락트산 박테리아, 엔테로코쿠스, 이스트 및 바실러스로부터 선택된 1종 이상의 유기체를 항-우레아제 항체 함유 식품 또는 항-우레아제 항체 및 항-프라겔라 항체함유 식품에 첨가할 수 있다.

본 발명의 특이적 항체를 제조하기 위하여, 암탉을 항원에 대하여 면역시킨다. 암탉을 면역시키기 위한 항원으로서, H.필로리의 우레아제 및 플라겔라가 제조되었다. 항원 제조용 H.필로리 균주는 ＃130 (Cag A+)(Vac A+), NSP＃305 (Cag A+)(Vac A+), NSP＃335 (Cag A+)(Vac A+), NSP＃355(Cag A-)(Vac A-) 와 같은 인체 임상 분리체를 포함한다. 선택된 균주를 배양한 후, 우레아제 성분 및 플라겔라 성분을 적당한 방법으로 제조한다.

피하주사 또는 근육내 주사와 같은 적당한 경로를 통하여 항원을 접종함으로써 암탉을 항원에 대하여 면역시킬 수 있다. 면역성을 증가시키기 위하여 항원과 함께 적당한 보조제를 투여하는 것이 바람직하다. 이 목적에 유용한 보조제로는, 프로인트 (Freund) 의 완전 (불완전) 보조제 (Difco), 콜레라 독소 BB (Sigma), 역가 맥스 (Titer Max, CytRx Corp. 제조) 등이 있다.

항원의 투여량은 항원 및 보조제의 종류 및 투여 경로에 따라 결정되어 항체가 과독성을 생성하지 않고 암탉이 면역 상태로 유도된다. 일반적으로 접종 (최초 면역) 후 수 주 이내에 암탉은 항원에 민감하게 되고, 즉 항원에 대하여 면역된다. 항원에 대한 특이적 항체는 암탉의 육체 내에서 생성되고, 암탉이 낳은 계란 특히 계란의 노른자위는 특이적 항체를 포함하고 있다.

항원에 대한 암탉의 최초 면역 후, 1회 이상의 재면역을 적당한 투여량 수준으로 하여 암탉의 높은 항원 역가를 유지한다.

암탉 및 암탉이 낳은 계란의 항체에 대한 특이적 항체의 존재 및 역가 수준은 면역 검정 업자들에게 공지된 방법, 예를 들면 엘리사 (ELISA) 또는 교착 반응을 사용하는 방법 등을 통하여 확인할 수 있다.

특이적 항체의 적당한 역가가 면역된 암탉이 낳은 계란에 존재한다는 것을 확인한 후, 암탉이 낳은 계란을 모아 목적하는 항체를 회수한다.

본 발명의 특이적 항체는 계란 전체 또는 계란의 노른자위에서 제조될 수 있다. 대부분의 항체는 계란의 노른자위에 포함되어 있고, 일반적으로 항체의 제조에 사용하기 위하여 계란으로부터 노른자위를 분리한다. 경우에 따라서는 계란 전체가 사용될 수도 있다.

계란 전체 또는 계란의 노른자위는 분획화 하지 않고 사용할 수 있다. 다른 방법으로는, 계란 전체 또는 계란의 노른자위를 분획화 또는 정제할 수 있다. 예를 들면, 히드록시프로필 메틸셀룰로오스 프탈레이트, 폴리에틸렌글리콜 등을 사용하는 방법과 같은 적합한 방법에 의해 탈지질화하여 노른자위로부터 지질 성분을 제거할 수 있다. 필요하다면, 암모늄 술페이트 또는 소듐 술페이트로 염석하거나, 찬 에탄올 침전과 같은 공지된 단백질의 정제 방법을 포함하는, 공지된 방법에 따라 정제를 더 할 수도 있다.

분획화 하지 않은, 또는 분획화 또는 정제한 계란 전체 또는 계란의 노른자위는 직접 사용되거나 또는 가공될 수 있다. 바람직한 태양에서, 계란 전체 또는 계란의 노른자위를 교반하여 또는 균일화하여 에멀젼으로 만들고, 분무 건조 또는 냉동 건조하는 공지된 기술에 따라 분말을 형성한다. 따라서, 다양한 형태의 항제가 그 목적에 따라 사용될 수 있다.

이렇게 얻어진 Hp 의 우레아제 또는 프라젤라에 특이성을 가진 항체는 하기 실시예에서 증명되는 바와 같이 Hp 감염 모델인 동물의 위점막에 유착된 Hp 를 근절하고, 궤양이 생성되는 것을 억제하는데 효과적이다. 즉 상기 항체는 Hp 가 위점막에 유착되는 것을 막고, Hp 의 위에서의 성장을 억제할 수 있다. 상기의 놀라운 효과는 Hp 전 세포에 대한 선행기술의 항체에서는 얻어지지 않았던 것이다. 또한 암탉이 낳은 계란으로부터 얻어진 항체는 하기 실험에서 보여지듯이 포유류로부터 얻어진 항체에 비하여 우수한 Hp 제거 능력을 가진다는 예상하지 못했던 결과를 나타낸다.

또한, 항-우레아제 항체 및 항-프라겔라 항체가 함께 사용되는 경우, 비교적 낮은 역가를 가진 항체도 상승 효과에 의하여 위로부터 Hp 를 제거하고 궤양을 억제하는데 충분한 효과를 나타낸다. 또한 락트산 박테리아, 엔테로코쿠스, 이스트 및 바실러스로부터 선택된 1종 이상의 유기체가 항-우레아제 항체와 함께 사용되는 경우, 또는 항-우레아제 항체 및 항-프라겔라 항체와 함께 사용되는 경우, 동일한 효과가 나타난다.

그러므로, 항-우레아제 항체 및/또는 항-프라겔라 항체는 위 내 Hp 의 억제에 효과적이고, 위염, 위궤양 및 십이지장궤양의 예방 또는 치료용으로 사용될 수 있거나 또는 위염, 위궤양 및 십이지장궤양의 예방용 식품에 첨가될 수 있다. 상기 항체는 락트산 박테리아, 엔테로코쿠스, 이스트 및 바실러스로부터 선택된 1종 이상의 유기체와 조합하여 상기 질병들의 예방 또는 치료용으로 사용되거나, 또는 상기 질병들의 예방용 식품에 첨가될 수 있다. 항체는 면역된 암탉이 낳은 계란 전체또는 계란의 노른자위로부터 직접 회수된 항체-함유 물질일 수 있고, 용액 또는 에멀젼 또는 건조된 분말 또는 과립과 같은 고체로 사용될 수 있다. 필요하다면 항체-함유 물질을 더 분획화 하거나 정제하여 정제된 항원을 얻을 수 있다.

본 발명에서 사용되는 락트산 박테리아의 예로서, 락토바실러스 아시도필루스 (Lactobacillus acidophilus) , 락토바실러스 가세리 (Lactobacillus gaceri), 락토바실러스 크리스파투스 (Lactobacillus cryspatus) 등이 있다. 엔테로코쿠스의 예로서, 엔테로코쿠스 파에칼리스 (Enterococcus faecalis), 엔테로코쿠스파에시움 (Enterococcus faecium) 등이 있고, 이스트의 예로서 칸디다 종이 있으며, 바실러스 종의 예로서 바실러스 섭틸리스 등이 있다.

본 발명의 특이 항체가 상기 질병들의 예방 또는 치료용으로 사용되는 경우, 항체는 항체 및 약학적으로 허용되는 담체를 함유하는 약학적 조성물의 형태로 투여될 수 있다. 그리고, 필요 또는 요구에 따라 제산제 (예: 탄산수소나트륨, 탄산마그네슘, 침전된 탄산칼슘, 합성 히로탈시트 등), 위점막 보호제 (예: 알루미늄 실리케이트, 수크랄페이트 및 소듐 구리클로로필린) 및 소화효소 (비오다이아스트라제, 리파아제) 가 약학적 조성물에 첨가될 수 있다. 약학적 조성물의 제조는 종래의 방법에 따라 실행될 수 있다. 상기 질병들의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 경구 투여될 수 있다.

본 발명의 항체의 투여량은 용법, 목적 및 증세의 조건에 따라 선택된다. 바람직하게는 성인 1 일 정제된 항체의 kg 당 0.25 내지 25.0 mg 이 위염, 위궤양 및 십이지장궤양의 예방용으로 투여될 수 있고, 성인 1 일 정제된 항체의 kg 당 1.25내지 125 mg 이 상기 질병들의 치료용으로 투여될 수 있다.

본 발명의 항체가 상기 질병들의 예방용 식품에 첨가제로서 사용되는 경우, 0.01 내지 0.1 중량 %, 바람직하게는 약 0.05 중량 % 의 정제된 항체가 식품에 함유될 수 있다.

하기 실시예들은 본 발명을 더 설명하기 위한 것이다. 본 발명은 하기 실시예의 특정적인 사실에 한정되지 않는다는 것이 이해되어야 할 것이다.

실시예 1

(1) Hp 항원의 제조

(i) Hp 전 세포 항원의 제조

위염 환자의 Hp＃130 균주 (도까이 대학교 의과대학에서 얻음) 을 5 % 말의 혈액이 첨가된 뇌 심장 혼합물 세균 배양기 배지에 접종한 후, 37 ℃ 의 가스 팩 무기성 용기에서 72 시간 동안 배양한다. 배양 후, 뚜렷한 윤기를 지니고 약한 α-용혈을 나타내는 부드러운 군(colony)을 모아서, 1 내지 10 % 의 소의 태아 혈청이 첨가된 브루셀라 (Brucella) 육즙에 현탁시키고, 기체상을 10 % 의 CO₂, 10 % 의 H₂및 80 % 의 N₂의 혼합기체로 교체시키면서 24 내지 48 시간 동안 흔들면서 배양한다. 재배양을 3 회 실시하여 매 배양 마다 양이 증가된 4 번째 새 배양액을 얻는다. 각각의 배양시, 배양균의 그램 염색성 및 운동성을 시험하고, 우레아제 시험, 카탈라제 시험 및 옥시다제 시험을 행한다. 재배양에 의하여 얻어진 4 번째 배양균은 (5.2 x 10⁸CFU/㎖) 은 20 분 동안 12,000 x g 에서 원심분리한다. 원심분리에의해 모아진 세포들을 배양 배지가 출발 배양 배지보다 100 배 적은 양이 되도록 하는 멸균 증류수에 현탁시킨 후, 생성된 현탁액을 15,000 rpm 의 속도의 초고속 균일화기 (Cinematica) 에서 60 초 동안 처리하여 세포들을 용해시킨다. 10 % 말의 혈액이 첨가된 세균 배양기 배지에 용해물을 놓은 후 세포의 성장을 관찰하여 세포가 용해된 것을 확인한다.

(ii) 프라겔라 항원의 제조

상기와 동일한 배양 과정에 의해 얻어진 브루셀라 육즙 (4.0 x 10⁸CFU/㎖)내 Hp＃130 균주의 배양균을 12,000 x g 에서 20 분 동안 원심 분리한다. 모아진 세포들을 증류수에 현탁시키고, 소용돌이 믹서로 교반하여 우레아제 성분을 제거한다. 그런 다음, 세포들을 트리스-HCl 완충액 (pH 7.2) 에 현탁시키고, 15,000 rpm 의 속도의 초고속 균일화기 (Cinematica)에서 60 초 동안 처리한 후, 6,700 x g 에서 6 분 동안 원심 분리하여 세포들을 프라겔라와 잔류 부분으로 분리한다. 프라겔라를 함유하는 상청액에 트립신을 첨가하고 (1 mg/㎖), 37 ℃ 의 온도에서 20 분 동안 처리하여 우레아제와 같은 오염된 단백질 성분을 제거한다. 프라겔라-함유 분획을 25 내지 65 % 수크로오스 밀도 그래디언트에 깔고, 90,000 x g 에서 22 시간 동안 원심 분리한다 (+4 ℃). 그런 다음, 분획 회수기를 사용하여 분획화하고, 각 분획의 단백질 농도를 농도계를 사용하여 기록하고, 프라겔라의 존재를 SDS-PAGE 를 사용하여 검출한다. 이 데이터를 기초로, 약 50 kDa 단백질을 함유하는 분획을 모으고, 이 분획을 증류수로 3 내지 10 배로 희석한 후, 180,000 x g 에서 60 분동안 원심 분리하여 펠릿을 얻는다. 펠릿을 증류수에 용해시키고, 6,700 x g 에서 2 분 동안 원심 분리한다. 얻어진 상청액은 SDS-PAGE 로 처리하여 프라겔라 A (53 kDa) 및 프라겔라 B (54 kDa) 를 함유하고 있음을 확인한다.

(iii) 우레아제 항원의 제조

상기 (i) 에서 언급된 것과 동일한 배양 과정에 의해 얻어진 브루셀라 육즙 (3.5 x 10⁸CFU/㎖) 내 Hp＃130 균주의 배양균을 12,000 x g 에서 20분 동안 원심 분리시킨다. 그런 다음, 모아진 세포들을 증류수에 현탁시키고, 소용돌이 믹서로 60 초 동안 교반한 다음, 원심 분리하여 우레아제 함유 상청액을 얻는다. 하기 방법에 따라 정제한다. 상청액을 완충액 (20 mM 포스페이트, pH 6.8, 1 mM EDTA, 1 mM 2-메르캅토에탄올 및 10 % PEG 300) 으로 평형화된 DEAE-세파셀 (Sephacel) 컬럼에 적용하고, 0.5 ㎖/분의 유동 속도로 겔을 통과시켜 겔이 우레아제를 흡착하도록 한다. 0 내지 0.5 M KCl 농도 그래디언트에 의해 용리를 행한다. 각 분획의 우레아제 활성을 기록한다. 우레아제 활성의 피이크를 가진 분획을 모으고 농축한다.

그런 다음, 농축액을 완충액 (20 mM 포스페이트, pH 6.8, 150 mM NaCl) 으로 평형화된 세파크릴 (Sephacryl) S-300 컬럼에 적용하여 용리를 행한다. 각 분획의 우레아제 활성을 측정한다. 우레아제 활성의 피이크를 가진 분획을 모으고 SDS-PAGE 를 사용하여 분석하여, 우레아제 A (32 kDa) 및 우레아제 B (60 kDa) 를 함유하고 있음을 확인한다.

(2) 암탉의 면역

백색 레그호온, 약 18 주령 하이 라인 W77 암탉을 사용하여 면역을 행한다. 실시예 1 에서 얻어진 3 가지 항원 각각 (0.5 내지 1.0 mg/㎖ 의 단백질을 함유하도록 조정) 을 유성 보조제와 혼합하고, 우흉근 및 좌흉근에 각각 0.5 ㎖ 투여량을 주사한다 (최초 면역). 최초 면역 6주 후에, 재면역으로서 동일한 항체를 동일한 방법, 동일한 투여량으로 주사한다. 재면역 약 2 주 후에, 상기 면역된 암탉이 낳은 계란의 노른자위의 항체 역가는 현저하게 향상되었고, 안정되었으며, 그런 다음 계란을 모으기 시작하여 4 주 동안 계속하였다. 항체 생성력의 안정성에 대하여 계란의 항체 역가는 4 내지 6 개월 동안 안정하다. 그 후, 항체 역가는 감소하였고, 상기와 동일한 과정을 사용, 주사를 반복하여 역가를 회복하였다.

(3) 계란의 노른자위의 항체 역가의 검정

각 계란의 노른자위를 흰자위로부터 분리하여 질량을 측정한다. 이 노른자위에 동일한 부피의 염수를 첨가하여 노른자위 성분을 용해시킨다. 이 혼합물에 동일한 부피의 클로로포름을 첨가하고, 혼합물을 격렬하게 흔들며 교반하고, 원심분리한다. 얻어진 상청액을 항체 역가를 결정하기 위한 표본으로 사용한다. 상청액의 항체 역가는 엘리사에 의해 결정한다. 엘리사 과정은 하기와 같다. 고정시킨 항체 및 서양고추냉이 퍼옥시다아제 및 조류의 IgG 의 접합개체 최적 농도를 체커판 적정으로 결정한다. 미세 희석판 (Immulon 2, Dynex) 을 판으로 사용하고, Hp 전 세포를 용해시켜 얻어진 항원을 고정화를 위하여 사용한다. 항원을 카르보네이트 완충액 (pH 9.6) 으로 희석하여 5 ㎍/㎖ 의 단백질을 함유하도록 하고, 100 ㎕ 의 희석된 항원은 각 웰에 넣어 4 ℃ 에서 18 시간 동안 방치한다.

시험 과정은 하기와 같다. 각 웰을 PBS-트윈으로 3 회 세척한 후, 2 % 스킴 우유 200 ㎕ 를 블로킹을 위하여 첨가하고, 각 웰을 37 ℃ 에서 60 분 동안 방치한다. 그런 다음 각 웰을 PBS-트윈으로 3 회 세척하고, 100 ㎖ 의 각 표본을 각 웰에 첨가하여 37 ℃ 에서 60분 동안 반응시킨다. 반응 후, 웰을 PBS-트윈으로 세척하고, 12,000 배 희석된 접합개체를 웰 당 100 ㎕ 의 양으로 첨가하여 37 ℃ 에서 60 분 동안 반응시킨다. 각 웰을 5회 세척한 후, 기재 (H₂O₂를 함유한 o-페닐렌디아민 히드로클로라이드) 를 웰에 첨가하여 실온에서 착색시킨다. 20 분 후, 웰 당 50 ㎕ 의 3N H₂SO₄를 첨가하여 반응을 종결시킨다. 그런 다음, 각 웰 에서 490 nm 에서의 흡수를 엘리사 자동리더로 측정한다. 표본의 항체 역가 는 측정된 값을 양성 및 읍성 대조 흡수를 기초로 하여 측정된 값을 보정함으로써 계산하였다.

(4) 계란 노른자위로부터 항체의 제조

면역된 닭을 세척 소독한 후, 각 계란의 노른자위를 흰자위로부터 분리하고, 다수의 계란으로부터 혼합된 노른자위를 8 kg 씩 군으로 나누고 사용할 때까지 -20 ℃ 미만의 온도에서 보관한다. 정제 과정은 하기와 같다. 출발물질로서 7,5 kg 의 노른자위에 10 배가 되는 양 (중량) 의 증류수를 첨가하여 탈지질화한다. 암모늄 술페이트를 상청액에 첨가하여 40 % 포화액을 만든다. 혼합물을 교반하고 원심분리하여 펠릿을 얻는다. 펠릿을 염수에 용해시킨 후, 30 % 포화액 염석을 하여 펠릿을 얻는다. 얻어진 펠릿을 소량의 물에 용해시키고, 이 혼합물에 에탄올을 -20 ℃ 에서 교반하며 첨가하여 최종 농도를 50 % 로 한다. 원심분리 후, 펠릿을 염수에 용해시키고 냉동건조한다. 결과적으로 11 g의 담황의 백색 분말을 얻는다. 항체의 회수율은 약 47 % 이고, IgG 의 순도는 95 % 이상이며, 물의 함량은 2 % 이하이다.

실험 1

Hp 가 감염된 쥐에서 계란으로부터 얻어진 다양한 항체의 효과

본 실험은 Hp 전 세포 에 대한 계란의 항체 (비교 실험), 우제아제에 대한 항체 (본 발명), 및 프라겔라에 대한 항체 (본 발명) 를 쥐에 경구투여 함으로써, 위점막에 유착된 Hp 가 위로부터 제거되어 궤양의 발생을 현저하게 억제되는지를 관찰하기 위하여 수행되었다. 쥐는 Hp 감염에 민감도가 높은 종래의 털이 없는 쥐의 감염 모델이다 (NS:Hr/ICR)(Research Institute for Human and Animal Propagation, Accession No.IRA-NHI-9701).

털이 없는 각각의 쥐 (숫쥐) 에게 임상 물질로부터 분리한 NSP 335의 1x10⁹CFU 를 3 일 연속 경구투여한다. 표 1 에 나타난 바와 같이, 감염 8 주 후, 전 세포, Hp 의 우레아제, 또는 Hp 의 프라겔라에 대하여 면역된 암탉이 낳은 계란으로부터 실시예 1 에서 제조된 다양한 항체들을 14 일 동안 1 일 1 회 강제로 경구투여 하였다. 14 일의 투여 후, 각 군의 쥐들을 죽이고 혈액을 모아, Hp 에 대한 항체 역가를 엘리사에 의해 검정한다. 부검에서 각 군의 쥐들의 위를 회수하여 위 내 Hp 세포의 수를 세고 발병 조직 표본을 제조하는데 사용한다. 위점막에 유착된 Hp 세포의 수는 하기와 같이 계산한다. 위의 내용물을 완전히 제거한 후, 위 조직을 PBS (pH 7.2) 로 8 회 세척하고, 균일화한다. 균일화된 조직을 Hp 를 검출하기위해선택한 배지 (Poremedia Hp 분리 배지, Eiken Kagaku) 에 놓고, 37 ℃ 에서 5 일 동안 가스 팩 방법에 의해 배양한다. 그런 다음, 눈에 보이는 Hp 의 수를 센다. 궤양의 존재는 위 조직을 포르말린으로 고정하고, 종래의 방법에 따라 헤마톡실린 에오신 스테이닝을 행하여 검사한다.

표 1 에 나타난 결과에서 명백하듯이, 계란 항체가 투여된 모든 군은 위 내 Hp 가 투여량에 의존하여 감소하는 경향을 나타낸다. 그러나, 항-전 세포 항체의 투여는 위 내 Hp 의 수를 약 10 배 만큼 감소시키고 Hp 를 위로부터 완전히 제거하지는 못한다. 반대로, 항-우레아제 항체 또는 항-프라겔라 항체가 투여된 군에서는, 위 내의 Hp 의 수가 투여량에 의존하여 현저히 감소하였고, 투여량 0.5 ㎖ 의 투여량에서 거의 완전히 제거되었다. 이것은 엘리사 에 의해 결정된 혈액 내 항체 역가 에 의하여서도 뒷받침되는 사실이다. 그러므로, 투여된 군의 혈액의 역가 는 투여량에 의존하여 감소하며, 항-우레아제 항체 및 항-프라겔라 항체가 투여된 군의 혈액의 역가 는 항-전 세포 항체 투여군과 비교하여 현저히 낮다.

또한 전 세포에 대한 항체의 투여가 쥐 내 Hp 를 어느 정도 감소시키더라도, 궤양의 발상을 억제하는 효과는 낮고, 1 마리의 쥐만이 0.5 ㎖ 의 투여량에서 궤양이 없었고, 나머지 쥐들은 모두 궤양을 가졌다. 반면, 항-우레아제 항체 또는 항-프라겔라 항체 투여는 0.5 ㎖ 의 투여량에서 모든 쥐의 궤양의 발생을 억제하였다.

따라서, 본 발명의 계란으로부터 얻어진 항체의 투여는 Hp 를 위로부터 근절 또는 제거하는 것, 및 Hp-감염 쥐의 궤양 억제에 월등한 효과를 가진다는 것이 확인되었다.

상기 아이바 등 (Aiba et al) 의 실험에서는, 임상 물질로부터 얻은 Hp ＃130 을 1x10⁹CFU 의 투여량으로 3 일 동안 4 주령 무균 BALB/c 쥐(숫쥐) 에게 경구투여 하였다. 감염 4 내지 7 주 후, 포르말린으로 죽인 Hp 전 세포 에 대한 계란으로부터 얻은 항체를 1 일 1 회 14 일 동안 경구 투여하고, 위 내 Hp 의 수를 대조군과 비교하였다. 결과적으로, Hp 전 세포에 대한 항체 투여는 대조군과 비교하여 위 내 Hp 의 수를 약 10 배 만큼 감소시켰다. 그러나, 완전히 제거하지는 못하였다. 또한 궤양 발생의 억제 효과에 관한 언급은 없다.

[표 1]

Hp 감염 쥐에게 투여된 다양한 계란 항체 (Ab)의 효과

실험 2

Hp-감염 쥐에서 계란으로부터 얻어진 항-우레아제 항체 및 항-프라겔라 항체의 조합의 효과

본 실험은 항-우레아제 항체 및 항-프라겔라 항체의 투여가 Hp 를 위로부터 제거하는 것에 미치는 상승 효과를 증명하였다.

항-우레아제 항체 및 항-프라겔라 항체를 조합하여 투여하고, 투여량은 1 일 1 회 0.1 ㎖ 씩 14 일 동안 투여하는 것을 제외하고는 실험 1 의 과정을 반복하였다. 대조군의 각 쥐에게는 멸균 염수 0.1 ㎖ 를 주었다.

표 2 에 나타난 바와 같이, 단독으로 투여된 항체는 2,560 의 항체 역가를 가지고, 그 양은 0.1 ㎖ 이다. 이 투여량에서, 항-우레아제 항체는 Hp 및 궤양을 어느 정도 억제하였으나, 항-프라겔라 항체가 투여된 쥐는 Hp 의 수에서 대조군과 뚜렷한 차이를 나타내지 않으며, 궤양의 억제에는 효과가 없다. 그럼에도 불구하고, 항-우레아제 항체 및 항-프라겔라 항체의 조합은, 사용된 항체가 640 이라는 낮은 항체 역가 를 가질 때라도, Hp 를 위로부터 완전히 제거하고, 모든 쥐에서 궤양의 발생을 억제할 수 있었다.

그러므로 이들 항체의 조합은 상승 효과를 나타낸다.

[표 2]

계란으로부터 얻어진 항-우레아제 항체 및 항-프라겔라 항체를 Hp-감염 쥐에 조합 투여하는 경우 상승효과

실험 3

Hp-감염 쥐의 항-우레아제 항체 및 락트산 박테리아의 조합에 의한 상승 효과

바티아 등 (Bhatia,S.J.et al, J.Clin.Micobil., 27,2328-2330,1989)은 락토바실러스 아시도필루스가 Hp 의 시험관 내 성장을 억제할 수 있으며, 그것은 락트산 때문이라고 발표하였다. 미돌로 등 (Midolo,P.D. et al, J.Appl.Bacteriol., 79, 475-479, 1995) 은 락토바실러스 카세이 (Lactobacillus casei), 락토바실러스 불가리쿠스 (Lactobacillus bulgaricus) , 페디오코쿠스 펜토사세우스 (Pediococcus pentosaceus), 및 비피도박테리움 비피두스 (Bifidobacteriumbifidus) 가 Hp 의 시험관 내 성장을 억제할 수 있고, 이 작용은 이 박테리아에 의해 생성된 유기산 때문이라고 보고하였다. 그러나, 이 실험들은 시험관 내에서 실시되었으므로, 위 내에서의 실제 결과는 예측할 수 없다.

또한 상기한 바와 같이, 아이바 등 (Aiba et al) 은, 임상 물질로부터 얻은 Hp ＃130 을 1x10⁹CFU의 투여량으로 3 일 동안 4 주령 무균 BALB/c 쥐(숫쥐) 에게 경구투여 하고, 감염 4 내지 7 주 후, 인간의 락토바실러스 살리바리우스 1x10⁸CFU 를 3 일 동안 경구투여 하였다. 4 주 후, 쥐들을 죽이고, 위 내 Hp 의 수를 대조군과 비교하였다. 위 내 Hp 의 수는 대조군에서 1x10⁵CFU/g, 감염 4 주 후 투여된 군에서 10²내지 10³CFU/g, 및 감염 6 주 후 투여된 군에서 10⁴CFU/g 이었다.

상기 아이바 등에 의한 데이터는 정상적인 세균군을 구강, 위 및 장에 가지지 않은 무균 쥐를 사용하여 얻어진 것이므로, 정상적인 세균군을 가진 종래의 쥐에게서 동일한 결과가 얻어질 지는 의문이다. 따라서, 만약 인간의 락트산 박테리아가 고유의 정상적 박테리아 세균군을 가진 종래의 쥐에게 주어질 경우, 그들은 쥐의 고유의 박테리아 세균군으로 인하여 위에 이주할 수가 없다.

정상적 박테리아 세균군을 가진 털이 없는 쥐에게, 인간의 L. 아시도필루스(JCM 1028) 이 단독으로, 및 계란으로부터 얻어진 항-우레아제 항체와 함께 주어지는 경우, 위로부터 Hp 의 제거 효과 및 궤양의 발생 사이의 관계를 연구하기 위하여 실험 3 을 실시하였다.

실험 2 와 동일한 실험 절차가 일반적으로 사용되었다. L. 아시도필루스는 브리그스 (Briggs) 간 육즙을 사용하여 배양하고, 미쓰오까의 방법 (Mitsuoka, 1979) 을 사용하여 세포의 수를 세었다. 세포 1x10⁸CFU를 14 일 동안 1 일 1 회 투여하였다. 결과적으로 표 3 에 나타냈듯이, L. 아시도필루스만 투여한 군의 각 쥐의 위 내 Hp 의 수는 대조군의 것과 거의 동일하였고, 2 개의 군 사이의 현저한 차이는 없었다. 또한 궤양 조건이 관찰되어, L. 아시도필루스는 궤양 억제에 효과가 없었다. 이에 대하여, 이 실험의 데이터는 무균 쥐를 사용한 아이바 등에 의해 얻어진 데이터와 매우 다르다. 그러므로, 정상적 박테리아 세균군을 가진 쥐의 위에서 Hp 를 제거하고 궤양을 억제하는 L. 아시도필루스의 효과는 관찰되지 않았다. 반대로, 14 일 동안 L. 아시도필루스와 항-우레아제 항체를 투여한 군에서는 Hp 대부분은 위로부터 제거되고 궤양 조건은 관찰되지 않았다. 사용된 항체는 항체 역가는 640 이다.

[표 3]

항-우레아제 항체 및 L.아시도필루스 (JCM 1028) 를 Hp-감염 쥐에 조합 투여하는 경우 상승 효과

실험 4

계란으로부터 얻어진 항-우레아제 항체의 효과와 토끼의 혈청으로부터 얻어진 항-우레아제 항체의 효과의 비교

본 실험은 암탉이 낳은 계란으로부터 얻어진 항체가 포유류로부터 얻어진 항체보다 위로부터 Hp 를 제거하는 효과가 더욱 뛰어나다는 것을 증명한다.

암탉이 낳은 계란으로부터 얻어진 항-우레아제 항체 및 토끼의 혈청으로부터 얻어진 항-우레아제 항체가 각각 사용될 때, Hp 의 제거 효과를 비교하였다. 사용된 방법은 실험 2 와 일반적으로 동일하다. 항체는 1 일 1 회 14 일 동안 0.5 ㎖씩 투여하였다.

표 4 에 나타난 바와 같이, 2 개 군의 각 쥐의 항체 역가 는 거의 유사하였으나, 암탉이 낳은 계란으로부터 얻어진 항체 투여 군에서만, Hp 는 위로부터 완전히 제거되고, 궤양 발생이 억제되었다. 반대로, 토끼로부터 얻어진 항체 투여군에서는 위 내 Hp 의 수가 약간만 감소하였고, 궤양은 억제되지 않았다. 포유류와 이종 구조인 계란의 항체는 포유류로부터 얻어진 항체 보다 허성 면역법에 의한 Hp 제거 효과가 뛰어나다는 것이 예상밖으로 분명해졌다.

암탉이 낳은 계란으로부터 얻어진 항체는 물론 토끼의 혈청으로부터 얻어진 항체는 비록 이들 항체가 항원으로서 우레아제로 면역시킴으로써 얻어지지만, 정제된 우레아제의 효소 작용을 완전히 제거하지는 않는다.

[표 4]

계란으로부터 얻어진 항-우레아제 항체와 토끼의 혈청으로부터 얻어진 항-우레아제 항체가 Hp 감염 쥐에게 경구 투여되는 경우 효과들의 비교

실험 5

Hp 의 정제된 우레아제의 시궁쥐 위 뮤신에의 특이적 결합

상기와 같이 선행 연구로부터 얻어진 결과는 Hp 에 의해 제조된 우레아제가, Hp 세포의 위 내에서의 성장을 위한 환경을, 우레아를 위에서 암모니아로 전환시키고, 세포가 이주하는 영역의 pH 를 중성으로 조절함으로써, 제공할 수 있다고 제안하였다. 또한 이튼 등 (Eaton, K.A. et al; Clyne, M. et al) 에 의한 연구는 Hp 에 의해 생성된 우레아제는 Hp 가 위점막에 이주하는, 점착인자로서의 작용을 하지 않는다고 결론지었다.

그러나, 상기 실험 1 에서, 계란으로부터 얻어진 항-우레아제 항체는 다른 항원에 대한 항체 (전 세포 항체 및 프라겔라 항체) 보다 위로부터 이주화된 Hp 를 더욱 효과적으로 제거하며, 궤양 발생 억제가 뚜렷하다. 또한, Hp 에 대한 항체 역가 의 증가가 항-우레아제 항체의 투여에 의해 억제된다. 이 실험은 Hp 의 우레아제가 가장 강한 독성 요인이라고 제안한다.

본 발명자는 또한 시험관 내에서의 실험을 통하여, 정제된 우레아제를 사용하여 Hp 의 우레아제가 위 점막에 점착인자로서 작용하는지 시험하였다. 결과적으로 우레아제는 도 1 과 같이, 투여량에 의존하여 시궁쥐 위 뮤신에 유착된다. 그런 다음, 도 2 에 나타난 것과 같은 실험을 행하여, 뮤신의 글리코프로테인이 우레아가 결합된 곳에 결합부위를 결정하고, 얻어진 결과는 결합부위가 뮤신의 술파티드라는 것을 제안한다.

또한 계란으로부터 얻어진 항체가, Hp 의 인간의 위암 MKN 45 세포의 유착에 미치는 억제 효과를 연구하여, 항-우레아제 항체가 Hp 의 유착에 가장 높은 억제효과를 갖고, 항-프라겔라 항체는 그 다음으로 높은 효과를 갖는다는 것이 발견되었다 (도 3). 정제된 프라겔라가 실제로 시궁쥐의 위 뮤신에 특이적으로 유착하는지는 확인되지 않았지만, 실험 1 의 결과로부터 Hp 의 프라겔라가 유착과 관련이 가지는 것은 가능하다.

상기로부터, 계란으로부터 얻어진 항-우레아제 항체는 Hp 세포의 표면층 우레아제에 특이적으로 유착하므로 Hp 가 위 뮤신에 유착하는 것을 억제하고, 항체는 Hp-감염 쥐로부터 Hp 를 제거하는데 가장 높은 효과를 나타낸다는 가정할 수 있다. 즉, Hp 의 우레아제는 위 뮤신에 점착인자로서 작용한다.

상기로부터 명백하듯이, 본 발명은 Hp 감염에 의한 위염, 위궤양 및 십이지장궤양의 예방 또는 치료용의 안전하고 효과적인 약학적 조성물, 및 상기 질병들의 예방용 식품을 제공한다. 본 발명의 항체는 Hp 의 위에의 이주에 기여하는 요인의 발견을 기초로 얻어지므로, 항체는 위의 Hp 를 근절하고, 위염, 위궤양 및 십이지장궤양을 효과적으로 억제할 수 있다. 또한 본 발명에 따라 항체는 암탉이 낳은 계란으로부터 얻어지고, 따라서 목적하는 특이적 항체는 다량으로 저렴하게 단순한 방법에 의해 제조될 수 있다.

Claims

항원으로서 헬리코박터 필로리 ( Helicobacter pylori )의 우레아제 A 및 B에 대하여 면역된 암탉이 낳은 계란으로부터 얻어지고 상기 항원에 대하여 활성인, 헬리코박터 필로리의 우레아제 A 및 B에 대한 난황 항체.
항원으로서 헬리코박터 필로리의 플라겔라 (flagella) A 및 B에 대하여 면역된 암탉이 낳은 계란으로부터 얻어지고 상기 항원에 대하여 활성인, 헬리코박터 필로리의 플라겔라 A 및 B에 대한 난황 항체.