JP2001294600A - ヘリコバクター・ピロリ定着阻害作用を有する糖タンパク質 - Google Patents

ヘリコバクター・ピロリ定着阻害作用を有する糖タンパク質

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Abstract

(57)【要約】 【課題】 安全で効果的なヘリコバクター・ピロリの定
着阻害剤を得て、食品に添加して消化性潰瘍等に対する
予防、改善用食品や医薬を提供する。 【解決手段】 糖タンパク質含有物質、特に牛乳汁乳清
または鶏卵卵白から得た糖タンパク質含有物質より、ヘ
リコバクター・ピロリのウレアーゼを固定化したカラム
を用いたアフィニティークロマトグラフィーで分離精製
して、ウレアーゼに特異的に結合する糖タンパク質を得
る。この糖タンパク質はヘリコバクター・ピロリの定着
を極めて効果的に阻害し、消化性潰瘍の予防または改善
用食品や医薬として使用できる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、消化性潰瘍の発生
に関与するヘリコバクター・ピロリを胃内から排除しう
る糖タンパク質、この糖タンパク質を含有するヘリコバ
クター・ピロリ定着阻害剤、ならびにこの定着阻害剤を
含有する医薬および食品に関する。
【０００２】
【従来の技術】現在、消化性潰瘍の根治的治療にはヘリ
コバクター・ピロリ（Helicobacter pylori : 以下Ｈp)
の除菌が不可欠であると考えられており、その除菌方法
として以下に説明するように抗生物質と胃酸分泌抑制剤
との併用方法が広く提唱されている。
【０００３】Ｈp は、一端に数本の鞭毛(flagella)を持
つ、螺旋型をしたグラム陰性桿菌で、ヒトの胃粘膜に生
息する菌である。この菌は、1983年オーストラリアのMa
rshall,B.J. とWarren,J.Rによって胃炎、胃潰瘍患者の
胃生検材料から高率に検出されることが報告された。当
時は形態および増殖性状からカンピロバクターに類似し
ていたので、カンピロバクター・ピロリ(Campylobacter
pylori)と命名された。その後、外膜の脂肪酸組成やリ
ポゾームの16S-RNA 配列の相同性がカンピロバクターと
大きく相違していることが分かり、新たにヘリコバクタ
ー属が設けられて、今日、この菌はＨp と呼ばれてい
る。
【０００４】以来、疫学的研究から、この菌は胃炎、胃
潰瘍、十二指腸潰瘍の起因菌であり、さらには胃癌など
の疾患と関連があるとの報告が相次いで発表されてい
る。Ｈp が一旦胃粘膜に定着すると、感染に対する免疫
応答が強い (抗体価が高い) にもかかわらず、除菌され
ず胃内に生息し続ける。そのため、抗生物質による治療
によって完全に除菌できない限り、投薬を中止すると約
１ヶ月以内に治療前の感染状態に戻ってしまう。しかも
胃内は酸度の高い塩酸によってpHが非常に低く保たれて
いるので、多くの抗生物質は不活化される。このような
理由で、Ｈp の除菌には、胃酸分泌を強力に抑制するプ
ロトンポンプインヒビターと除菌薬 (抗生物質) が併用
の形で使用されている。しかし、このような抗生物質の
長期間投与は、その副作用に加え、耐性菌の増加という
非常に重大な問題が危惧される。
【０００５】特開平11-262731 号には、乳脂肪球被膜画
分がＨｐに対する感染防御剤として有効であると記載さ
れているが、その根拠としてはＨｐの赤血球凝集阻害効
果が示されているだけである。しかも、乳脂肪球被膜は
種々の成分を含むと記載されており、どの成分が作用す
るかも不明である。また、Siiri Himro et al, FEMSImm
unol. Medical Microbiology 20(1998) 275-281には、
胃ムチン、および乳汁糖タンパク質、具体的にはバター
ミルクから調製した脂肪球被膜画分がヘリコバクター・
ピロリのシアル酸特異的赤血球凝集を阻害することが述
べられているが、ヘリコバクター・ピロリの赤血球凝集
反応性と胃粘膜細胞への接着とは無関係であるとされて
いる（M.Clyne & B.Drumm, Infection and Immunity, O
ct. 1993, p.4051-4057)。従って、上記公報および論文
においては、Ｈｐの胃粘膜への接着を阻害しうる物質は
開示されていない。
【０００６】さらに、上記の公報および論文において
は、Ｈｐの感染阻止のための重要な標的となる、Ｈｐが
胃粘膜に接着する際の接着因子や胃粘膜における受容体
は解明されていない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】上述のように、Ｈp を
除菌するために、抗生物質を長期にわたり使用すると副
作用と共に耐性菌の増加の恐れがある等種々の問題があ
った。
【０００８】本発明の目的は、消化性潰瘍の発生に関与
するＨｐの胃内での定着を有効に阻害することができ、
しかも従来の抗生物質の使用に伴う副作用や耐性菌増加
等の欠点を持たず効果的で安全性の高いＨｐの定着阻害
剤を提供することである。また、本発明は消化性潰瘍の
改善または予防に有用な医薬や食品を提供するものであ
る。
【０００９】
【課題を解決するための手段】一般に細菌の感染が成立
するためには細菌が宿主細胞に接着し、そこで増殖する
ことによって定着することが感染の第一歩となる。細菌
が宿主細胞に接着するには接着因子(adhesin) が宿主細
胞表面の受容体(receptor)に結合しなくてはならない。
細菌の感染部位特異性はこの接着因子と受容体の組合せ
によって決まる。細菌が宿主細胞に接着する際に、受容
体分子が共存すると競合阻止(competitive inhibition)
が起こり感染は成立しない。
【００１０】Ｈp においても接着因子とヒト胃粘膜がも
つ受容体はいずれもＨp の感染阻止の標的分子と考えら
れる。本発明者等は、先に、Ｈp の接着機構に関する研
究を通して、これまで解明されていなかったＨp の接着
因子がＨｐが産生するウレアーゼであることを明らかに
した（特開平10−287585号公報) 。
【００１１】本発明者等はウレアーゼの胃粘膜への付着
を阻止しうる物質を種々検討した結果、牛乳汁糖タンパ
ク質や鶏卵卵白の糖タンパク質等の糖タンパク質が、Ｈ
p の菌体表層に局在している接着因子であるウレアーゼ
に特異的に結合することによって胃内に定着しているＨ
p を排除する機能のあることを見出し、さらに、これら
の糖タンパク質含有物質から、ウレアーゼへの特異的結
合を利用して分離精製した、Ｈｐのウレアーゼに特異的
に結合する糖タンパク質を用いれば、少量でも極めて効
果的なＨｐ除菌が可能となることを見出し、本発明を完
成させた。すなわち、本発明は、ヘリコバクター・ピロ
リのウレアーゼへの特異的結合を利用したアフィニティ
ーカラムによりウレアーゼに特異的に結合する糖タンパ
ク質を分離精製し、これをヘリコバクター・ピロリ阻害
剤として用いるものである。
【００１２】従って、本発明によれば、糖タンパク質含
有物質から、ヘリコバクター・ピロリのウレアーゼへの
特異的吸着を利用した方法により分離精製して得られ
る、ヘリコバクター・ピロリのウレアーゼに特異的に結
合する糖タンパク質、この糖タンパク質を有効成分とし
て含むヘリコバクター・ピロリ定着阻害剤および消化性
潰瘍の予防剤および治療剤、ならびにこの糖タンパク質
を添加した、消化性潰瘍の予防または改善のための食品
が提供される。
【００１３】上記におけるヘリコバクター・ピロリのウ
レアーゼへの特異的吸着を利用した方法としては該ウレ
アーゼを固定化したカラムを用いるアフィニティークロ
マトグラフィーが好ましい。また、カラムに固定化する
ヘリコバクター・ピロリのウレアーゼとしては組換え型
ウレアーゼを用いることができる。
【００１４】
【発明の実施の形態】以下に、本発明を詳細に説明す
る。本発明では、糖タンパク質含有物質から、ヘリコバ
クター・ピロリのウレアーゼへの特異的吸着を利用した
方法でウレアーゼに特異的に結合する糖タンパク質を分
離精製する。
【００１５】本発明において用いる糖タンパク質含有物
質としては、哺乳動物の乳汁、鳥類の卵の卵白、カラ
ザ、卵黄膜、卵黄等の糖タンパク質を含有するものであ
ればよいが、牛乳汁の乳清および鶏卵卵白、特にこれら
から得た高分子量乳清タンパク質濃縮物および高分子量
卵白タンパク質濃縮物が好適に使用できる。
【００１６】糖タンパク質は、糖部分が２〜６種類の単
糖から構成され、タンパク質と共有結合した複合タンパ
ク質であり、生体内に広く存在する。単糖にはＮ−アセ
チル−Ｄ−グルコサミン、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクト
サミン、Ｄ−マンノース、Ｄ−ガラクトース、Ｌ−フコ
ース、シアル酸等がある。糖タンパク質には分子量、分
子の形が様々なものが含まれ、また、糖鎖とタンパク質
との結合様式からは主にＮ結合型糖タンパク質とＯ結合
型（ムチン型）糖タンパク質に分けられる。存在する生
体内の場所によって糖鎖の種類、分子量、形態が異な
り、その機能や生理活性も様々である。
【００１７】例えば、牛乳汁に含まれる糖タンパク質に
は、ラクトフェリン、分泌型IgA 、IgG 、IgM 、遊離の
分泌成分(FSC) 、ミルクムチンなどがある。また鶏卵卵
白に含まれる糖タンパク質には、オボムコイド、オボア
ルブミン、オボトランスフェリン、フォスビチン、オボ
ムチンなどがある。
【００１８】糖タンパク質含有物質の調製は、任意の既
知の方法が使用できる。牛乳汁からの調製では、例え
ば、乳汁から常法により乳脂肪およびカゼインを除去し
て乳清を得て、これを限外濾過膜等により分画濃縮して
高分子量乳清タンパク質濃縮物を得、糖タンパク質含有
物質として用いることができる。あるいは乳清からリポ
タンパク質を除去し、必要に応じて濃縮、透析を行って
得られた材料から、セファロースカラム等を用いたゲル
濾過、膜処理等により精製して得られた物質を糖タンパ
ク質含有物質として用いることができる。さらに、低分
子化ムチンが必要であればプロテアーゼ処理、アルカリ
加水分解等の処理を行う。なお、牛乳汁は、初乳、常乳
のいずれも利用できる。
【００１９】鶏卵卵白から糖タンパク質含有物質を得る
には、例えば次のような方法がある。集めた卵白から濃
厚卵白を分離し、超遠心分離によりゲル状部分を回収
し、これをさらに超音波処理、ホモゲナイズ等の方法に
より可溶化し、得られた可溶化物からゲル濾過、膜処理
等の方法で糖タンパク質含有物質を調製する。さらに必
要であればゲル濾過等の処理により精製してもよい。
【００２０】消化管粘膜や粘膜ゲル層などに存在する糖
タンパク質の回収は、糖タンパク質をホモゲナイズや超
音波処理により可溶化した後、ゲル濾過やエタノール沈
殿により高分子量画分を分離回収する方法が一般的であ
る。糖タンパク質の可溶化は、グアニジン塩酸、尿素、
塩溶液、界面活性剤により抽出する方法や、還元剤やプ
ロテアーゼ処理によってもよい。また、糖タンパク質の
種類によっては、第４級アンモニウム塩と不溶性複合体
を形成させたり、酸性条件下で沈殿させて回収する方法
が使用できる。
【００２１】糖タンパク質含有物質の調製に牛乳汁また
は鶏卵卵白を用いる場合、これらの原料は安価にしかも
大量に入手でき、またこれらからの糖タンパク質含有物
質の調製は簡便な方法で容易に行うことができる点で有
利である。また、牛乳汁からの調製においては、これま
でチーズ等の製造工程で副産物として大量にでるにもか
かわらず、有効な利用方法がなく廃棄されていた乳清
（ホエー）を用いることもできるので、工業規模で大量
に製造することも可能であり、価格的にも実用的にも非
常に有利である。
【００２２】また、牛乳汁または鶏卵卵白中の糖タンパ
ク質は安定性が高く、加熱によっても、また低pHにおい
てもその生理活性を失わないので、原料からの回収、精
製が容易であるばかりでなく、食品や医薬品への配合、
加工、貯蔵においても有利である。
【００２３】糖タンパク質含有物質から、Ｈｐのウレア
ーゼに特異的に結合する糖タンパク質を分離精製する方
法は、ウレアーゼへの特異的吸着を利用する方法であれ
ば何ら限定されることなく任意の方法が使用できるが、
ウレアーゼを固定化したカラムを用いるアフィニティー
クロマトグラフィーが好ましい。カラムに固定化するウ
レアーゼとしては組換え型ウレアーゼを利用するのが、
大量に均質なウレアーゼを使用できる点で好都合であ
る。
【００２４】組換え型ウレアーゼの調製は常法により行
えばよい。例えば、ＨｐのゲノムDNA を抽出し、ウレア
ーゼ分子をコードする遺伝子を PCR法により増幅し、こ
れを大腸菌用の発現ベクター(pKK233-2 等) に既知の方
法で組み込む。このベクターを適応する宿主、大腸菌(X
LI-Blue 等) に導入し、組換え体を得る。この組換え体
を培養し、発現したウレアーゼを回収して、組換え型ウ
レアーゼを調製できる。組換え型ウレアーゼの調製に
は、酵母、哺乳動物細胞または昆虫細胞等を用いた発現
系を利用してもよい。組換え型ウレアーゼの調製は、例
えば、MolecularCloning. A Laboratory Mannual (2nd
ed.)(Cold Spring Harbor Press) 、DNACloning 2 (2nd
ed.)(IRL Press)等に記載されている。
【００２５】ウレアーゼのカラムへの固定化は、リガン
ド分子、すなわちウレアーゼ中のアミノ基(-NH3)、カル
ボキシル基(-COOH) 、チオール基(-SH) およびヒドロキ
シル基(-OH) に結合するリガンド固定化担体、例えばビ
ーズ状に成型したアガロースゲル (Sepharose など) を
用いて行うことができる。ウレアーゼ固定化カラムによ
る分離精製は、糖タンパク質含有物質を含む試料をこの
カラムに流した後、非特異的に吸着したタンパク質を洗
い流し、次いで、ウレアーゼに特異的に吸着した糖タン
パク質を溶出することにより行うことができる。
【００２６】上記方法により、種々の糖タンパク質から
ウレアーゼに特異的に結合する糖タンパク質のみを効率
的に分離精製することができる。こうして得られた糖タ
ンパク質は、以下の実験例で実証されるように、Ｈｐの
産生するウレアーゼが胃粘膜のムチンに接着するのを効
果的に抑制する。ウレアーゼはＨｐ菌体表面に局在して
いるので、上記方法で得られたウレアーゼに特異的に結
合する糖タンパク質（以下、本発明の糖タンパク質とい
う）は、胃内においてウレアーゼに優先的に結合するこ
とにより接着因子であるウレアーゼをマスクしてＨｐの
胃粘膜の受容体への接着を阻止することができる。これ
は、動物実験においても確認され、本発明の糖タンパク
質の胃内におけるＨｐ除菌効果が認められた。また、本
発明の糖タンパク質は、天然物由来であり安全性が高
い。従って、本発明の糖タンパク質はＨｐ定着阻害剤と
して使用でき、消化性潰瘍等の予防、改善に有用であ
る。
【００２７】本発明の糖タンパク質はＨｐ定着阻害剤と
して、医薬や食品に配合して利用することができる。特
に、牛乳汁由来または鶏卵卵白由来の糖タンパク質は食
経験があるので、食品に配合し、抗Ｈｐ作用を有する特
定保健用食品、高齢者用食品や病者用食品等の特別用途
食品、あるいは抗Ｈｐ作用を有する栄養調整食品や健康
食品としての利用に有用である。
【００２８】本発明の糖タンパク質を食品に添加して特
定保健用食品や特別用途食品として利用する場合、食品
へ通常0.005 〜0.5 重量％程度、好ましくは0.01〜0.1
重量％添加する。特定保健用食品としては、乳、乳製
品、食肉製品、マヨネーズ・ドレッシング類、飲料、ア
イスクリーム、豆腐、惣菜類、佃煮類、アン類、フラワ
ーペースト類、即席めん類、ふりかけ食品類、漬物、粉
末スープ類、乾燥スープ類、菓子類、缶詰、レトルト食
品、冷凍用食品等、継続して摂取できるものが好ましい
が、その種類は特に限定されない。病者用食品 (低ナト
リウム食品、低カロリー食品、低タンパク質食品等) と
しては、スープ、飲料、流動食等に本発明の糖タンパク
質を添加して各種形態の食品とすることができる。
【００２９】栄養調整食としては、一例として本発明の
糖タンパク質にデキストリン等の賦形剤、カゼインナト
リウムなどの粘着剤、必要に応じ、ビタミン類、ミネラ
ル類等の栄養剤、乳化剤、安定剤、香料等を添加し、流
動食の形態としうる。
【００３０】本発明の糖タンパク質を健康食品として利
用する場合は、この糖タンパク質を有効成分として0.1
〜３重量％程度含有させ、これに乳糖、トウモロコシデ
ンプン、結晶セルロース、PVP 等の賦形剤や結合剤を配
合し、必要に応じビタミン類やミネラル等の栄養剤を添
加して、細粒、錠剤、顆粒剤等の各種形態に成形して利
用することができる。
【００３１】本発明の糖タンパク質を消化性潰瘍の予防
剤や治療剤として用いる場合、通常の製剤化方法によ
り、本発明の糖タンパク質をそのままあるいは慣用の添
加剤と共に、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤、液剤な
どの経口用製剤とすることができる。添加剤には、例え
ば賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、抗酸化剤、着色
剤、矯味剤などがあり、必要に応じて使用する。
【００３２】賦形剤としては、例えば、カルボキシメチ
ルセルロースナトリウム、寒天、軽質無水ケイ酸、ゼラ
チン、結晶セルロース、ソルビトール、タルク、デキス
トリン、デンプン、乳糖、白糖、ブドウ糖、マンニトー
ル、メタ珪酸アルミン酸マグネシウム、リン酸水素カル
シウム等が使用できる。
【００３３】結合剤としては、例えば、アラビアゴム、
アルギン酸ナトリウム、エタノール、エチルセルロー
ス、カゼインナトリウム、カルボキシメチルセルロース
ナトリウム、寒天、精製水、ゼラチン、デンプン、トラ
ガント、乳糖、ヒドロキシセルロース、ヒドロキシメチ
ルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビ
ニルピロリドン等が挙げられる。
【００３４】崩壊剤としては、例えば、カルボキシメチ
ルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウ
ム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、結晶セル
ロース、デンプン、ヒドロキシプロピルスターチ等が挙
げられる。
【００３５】滑沢剤としては、例えば、ステアリン酸、
ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、
タルク、硬化油、ショ糖脂肪酸エステル、ロウ類等が挙
げられる。
【００３６】抗酸化剤としては、トコフェロール、没食
子酸エステル、ジブチルヒドロキシトルエン (BHT)、ブ
チルヒドロキシアニソール (BHA)、アスコルビン酸等が
挙げられる。
【００３７】さらに、必要に応じてその他の添加剤や薬
剤、例えば制酸剤（炭酸水素ナトリウム、炭酸マグネシ
ウム、沈降炭酸カルシウム、合成ヒドロタルサイト
等）、胃粘膜保護剤（合成ケイ酸アルミニウム、スクラ
ルファート、銅クロロフィリンナトリウム等）や消化酵
素（ビオジアスターゼ、リパーゼ等）を加えてもよい。
【００３８】消化性潰瘍の予防剤または治療剤の投与は
経口により行い、投与量は成人１日当たり本発明の糖タ
ンパク質として通常２〜30mg（乾物量）、好ましくは５
〜20mgである。
【００３９】また、本発明の糖タンパク質を含有する消
化性潰瘍の予防剤もしくは治療剤は、胃酸分泌抑制剤を
併用することにより一層その効果を高めることができ
る。使用できる胃酸分泌抑制剤としては、ファモチジ
ン、ニザチジン、ロキサチジン、ラニチジン、シメチジ
ン等のH2ブロッカーや、オメプラゾール、ランソプラゾ
ール、ラベプラゾールナトリウムなどのプロトンポンプ
インヒビターがある。胃酸分泌抑制剤の投与量は成人１
日当たり20〜30mgが好ましい。
【００４０】以下に、本発明を詳細に説明するために実
施例を示すが、本発明はそれらによって限定されるもの
ではない。
【００４１】
【実施例】〔実施例１〕 (1) ヘリコバクター・ピロリの組換え型ウレアーゼの調
製 ＨｐのTU130 株のゲノムDNA を抽出し、ウレアーゼ分子
をコードするDNA を PCR法により増幅した。増幅したウ
レアーゼ遺伝子を発現ベクターpKK233-2 (アマシャム・
ファルマシア・バイオテク社製) に組み込み、ウレアー
ゼ発現用ベクターを得た。このベクターを大腸菌XL1-Bl
ueに取り込み、ウレアーゼ発現用大腸菌を得た。この大
腸菌をアンピシリンを100 μｇ/ mlの濃度で添加した1.
0LのLB培地で37℃、100rpmで振盪培養し、菌が対数増殖
期に入ったところで、発現を誘発するためにイソプロピ
ル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド(IPTG)を0.5mM の
濃度で添加し、さらに同一条件で一晩振盪培養した。得
られた培養液を 4,000×gで20分 (+4℃）遠心し、大腸
菌の菌体を得た。
【００４２】この菌体を、菌体破砕用トリス緩衝液 (50
mM Tris-HCl(pH8.0), 100mM NaCl,1mM EDTA) に懸濁し
た後、リゾチームを0.1mg/mlの濃度で添加し、氷中にて
30分間放置した。次いで、懸濁液を−80℃で１時間以上
凍結した後、室温で融解させた。次いで、超音波で処理
した後、TritonX-100 を１％の濃度で添加し、30,000×
g で30分 (+4℃）遠心し、組換え型ウレアーゼの封入体
を得た。
【００４３】これらの封入体を、封入体洗浄用緩衝液
（0.1% SDS,1.0% TritonX-100, 1.0%デオキシコール酸
ナトリウムを含む50mM Tris-HCl(pH8.0), 150mM NaCl,
1mM EDTA) に懸濁した後、30,000×g で10分 (+4℃）遠
心し、沈殿した封入体についてこの洗浄をさらに２回繰
り返した。次に、これらの封入体を可溶化するために、
8M尿素溶液 (8M尿素, 50mM Tris-HCl(pH8.0), 1mM EDT
A, 1mM DTT)に懸濁した後、室温で１時間静置した。次
いで、この懸濁液を30,000×g で30分 (+4℃) 遠心した
後、上清を100 倍容量の1mM EDTA加20mMリン酸緩衝液(p
H6.5) で透析することにより、ウレアーゼの立体構造を
再生させ、組換え型ウレアーゼ精製用試料を得た。
【００４４】上記の組換え型ウレアーゼを精製するため
に、硫酸化セルロファイン-m (チッソ社製) をゲルの10
ベット容量の1mM EDTA加20mMリン酸緩衝液(pH6.5) で平
衡化した。次いで、上記ウレアーゼ精製用試料50mlのpH
を6.5 に再調整し、上記1mMEDTA加20mMリン酸緩衝液(pH
6.5) で平衡化された硫酸化セルロファイン-mに流した
後、1mM EDTA加20mMリン酸緩衝液(pH6.5) を流した。次
いで、ウレアーゼを含有するピークの分画を混和した
後、pHを5.5 に調整し、予めゲルの10ベット容量の1mM
EDTA加20mMリン酸緩衝液 (pH5.5)で平衡化された硫酸化
セルロファイン-mに流した後、20mMリン酸緩衝液 (pH5.
5)でゲルを洗浄した。次いで、0.15M NaCl加20mMリン酸
緩衝液(pH7.4) を流すことにより、ウレアーゼを抽出し
た。ウレアーゼを含有する分画を混合し、100 倍容量の
蒸留水で透析後、凍結乾燥で組換え型ウレアーゼ粉末を
得た。得られた組換え型ウレアーゼはSDS-PAGEおよびウ
エスターン・ブロッティングにより、ヘリコバクター・
ピロリの天然型ウレアーゼと同様のものであることを確
認した。
【００４５】(2) ヘリコバクター・ピロリ組換え型ウレ
アーゼ固定化カラムの作製 NHS-activated Sepharose 4 Fast Flow(アマシャム・フ
ァルマシア・バイオテク社製)2g を、約50mlの1mM 塩酸
に懸濁し、室温で約15分間膨潤させた。グラスフィルタ
ー上で吸引濾過した後、10倍容量の1mM 塩酸で２回洗浄
した。次いで、ゲルを50mlのカップリング用緩衝液(0.1
M NaHCO3, 0.5M NaCl, pH8.8) 50mlに懸濁させ、グラス
フィルター上で吸引濾過した。次いで、上記(1) で製造
した、精製組換え型ウレアーゼ粉末10mgをカップリング
用緩衝液10mlに溶解し、直ちにゲルと混合した後、振盪
機でゆっくりと攪拌しながら、４℃で一晩反応させた。
【００４６】次いで、吸引濾過で反応液を除去し、ブロ
ッキング用緩衝液 (0.2Mグリシン,pH8.3)に懸濁し、軽
く振盪しながら４℃で一晩、残りの反応基をブロックし
た。次いで、グラスフィルター上で吸引濾過した後、カ
ップリング用緩衝液50ml、洗浄用緩衝液 (0.1M酢酸, 0.
5M NaCl, pH4.0) 50ml、0.5M NaCl 加20mMリン酸緩衝液
(pH7.5) 100mlで順に洗浄した。次いで、上で得たゲル
を約５倍容量の0.5M NaCl 加20mMリン酸緩衝液(pH5.5)
に懸濁し、直接カラムに流し込んで充填した。カラムを
低温室に移し、３ベット容量の0.1M NaCl 加20mMリン酸
緩衝液(pH5.5)で平衡化し、これを本発明の糖タンパク
質分離用ヘリコバクター・ピロリ組換え型ウレアーゼ固
定化カラムとして用いた。
【００４７】(3) 牛乳汁の乳清からの高分子量乳清タン
パク質濃縮物の調製 常乳20L を乳脂肪を除去するために 2,000×g で15分
(+4℃) 遠心し、その上清を得た。次に、カゼインを除
去するため1Mの酢酸をpHが4.6 になるまで滴下し、室温
に１時間静置し、その後遠心してカゼインを除去し牛乳
汁の乳清を得た。次に、この乳清のpHを6.0 に調整した
後、分画分子量 100万Daの限外濾過膜で20倍に分画濃縮
し、高分子量乳清タンパク質濃縮物を得た。
【００４８】(4) 鶏卵卵白からの高分子量卵白タンパク
質濃縮物の調製 白色レグホン種鶏の産卵１週間以内の無精卵50個から卵
白のみを集め、フルイにかけ濃厚卵白を分離した。さら
に、これをメンゼル緩衝液(pH9.5、イオン強度＝0.01)
に懸濁し、10W, 9kHz(+2℃) で10分間超音波処理するこ
とにより可溶化した。次いで、この可溶化物を分画分子
量30万Daの限外濾過膜で20倍に分画濃縮し、高分子量卵
白タンパク質濃縮物を得た。
【００４９】(5) ウレアーゼ固定化カラムによるウレア
ーゼに特異的に結合する糖タンパク質の分離 上記(3) および(4) で製造した高分子量乳清タンパク質
濃縮物および高分子量卵白タンパク質濃縮物の各１L を
とり、そのpHを5.5 に調整した。以下の操作はすべて低
温室で行った。上記(2) で作製したウレアーゼ固定化カ
ラムを予め10ベット容量の0.1M NaCl 加20mMリン酸緩衝
液(pH5.5) で平衡化した。次に、上記の各試料液をこの
カラムに流した後、ゲルの10ベット容量の0.5M NaCl 加
20mMリン酸緩衝液(pH5.5) をカラムに流し、非特異的に
吸着したタンパク質を洗い流した。次に、0.5M NaCl 加
20mMリン酸緩衝液(pH7.4) を流すことにより、カラムの
ウレアーゼに特異的に結合した糖タンパク質を溶出し、
100 倍容量の蒸留水で透析後、凍結乾燥によりヘリコバ
クター・ピロリのウレアーゼに特異的に結合する糖タン
パク質、すなわち本発明の糖タンパク質をそれぞれ約１
ｇずつ得た。
【００５０】〔実験例１〕インビトロ実験 上記実施例の(3) および(4) で得た高分子量乳清タンパ
ク質濃縮物および高分子量卵白タンパク質濃縮物と、上
記実施例の(5) で製造した本発明の糖タンパク質を用い
て、Ｈｐが産生するウレアーゼの胃粘膜への接着阻害効
果をインビトロ実験系において検討した。
【００５１】(実験材料および方法)本発明者等は、先
に、Ｈｐの接着因子がＨｐが産生するウレアーゼである
ことを見出している。このウレアーゼは胃粘膜のムチン
に結合するので、ウレアーゼの接着試験、およびウレア
ーゼ接着抑制試験に用いる豚胃ムチンを以下のようにし
て調製した。
【００５２】豚胃ムチンの調製 約２ヶ月齢の健康な豚を屠殺し、胃部を摘出し、内部に
0.1Mリン酸塩＋0.15MNaCl＋5mM N-エチルマレイミド(NE
M) ＋1mM フェニルメチルスルホニルフルオライド(PMS
F)＋1mM EDTA含有PBS(pH7.4)を加えて洗浄した。胃を切
開し、粘膜を削り取り、上記の緩衝液に浮遊させた。こ
の粘膜浮遊液を氷冷しながらポリトロンホモゲナイザー
を用いて均一にした。これを15,000×ｇで遠心し上清を
得た。この上清を25,000×ｇで再び遠心し、上清を回収
し、蒸留水で透析した後、凍結乾燥して粗精製胃ムチン
を得た。次いで、この乾燥粗精製胃ムチンをPBS(pH6.8)
(6M塩酸グアニジンおよびプロティアーゼインヒビター
(5mM NEM, mM PMSF, 1mM EDTA を含む) に溶解し、これ
を塩化セシウム密度勾配(1.5g/ml) に重層し、34,000×
ｇで48時間遠心した。シアル酸含有分画の検出はニトロ
セルローズ膜ブロッティングと過ヨウ素酸シフ試薬によ
る染色によって行った。発色した分画をプールし、再び
塩化セシウム密度勾配に重層して遠心した。染色陽性分
画をプールし、凍結乾燥した。次いで、0.1Mリン酸緩衝
液(0.1M NaCl含有、pH6.8)で平衡化したセファロースCL
-4B カラムを通してゲル濾過を行い、分画した。PAS 染
色陽性で、蛋白濃度の高い分画をプールし、PBS(pH6.8)
で透析し、精製豚胃ムチンを得た。これを使用時まで−
80℃に保存した (精製豚胃ムチン) 。なお、精製豚胃ム
チンはSDS-PAGEの結果、66kDの糖タンパク質であること
を認めた。
【００５３】豚胃ムチンへのウレアーゼ接着試験 ウレアーゼ接着試験用マイクロプレートは次のようにし
て作製した。96ウエルマイクロプレートの各々のウエル
に豚胃ムチン(1.27mg/ml) をウエル当たり50μl ずつ加
え、４℃で一晩静置することによって固相化した。使用
時には各々のウエルに３％BSA を加えて37℃で60分間反
応させることによってブロッキングした後、0.05％ツイ
ン20加PBS で３回洗浄したプレートをウレアーゼ接着試
験に供した。
【００５４】上記で作製したマイクロプレート上の固相
化された豚胃ムチンへのウレアーゼ接着試験は次のよう
に行った。HpTU130 株より調整した天然型ウレアーゼお
よび実施例１の(1) で調整した組換え型ウレアーゼをビ
オチン化した後、pH域の異なる接着培地(pH は予め2.0,
2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0 および6.5
に調整しておく) を用いて最終濃度が7.0 μg/mlとなる
ように希釈し、前述のムチン固相化マイクロプレートの
２穴ずつに加え、37℃で60分間感作した。次に、各々の
ウエルに接着したウレアーゼ量を測定するため、ストレ
プトアビジンHRP を各々のウエルに加え、37℃で60分間
反応させた。次いで、基質としてオルトーフェニレンジ
アミン２塩酸および過酸化水素水を加え反応させた。反
応停止液には3N硫酸を用いた。なお、ランニングプレー
トには２倍段階希釈した既知量のビオチン化ウレアーゼ
を置いて、その検定曲線から未知量のサンプルを測定し
た。
【００５５】ウレアーゼ接着抑制試験 本発明の糖タンパク質〔実施例１の(5) 〕、高分子量乳
清タンパク質濃縮物〔実施例１の(3) 〕および高分子量
卵白タンパク質濃縮物［実施例１の(4) ］を用いてウレ
アーゼ接着抑制試験を行った。まず、種々の濃度に調整
した試料とビオチン化豚胃ムチンとを混合し、ウレアー
ゼを固相化した96ウエルプレートのウエルに移し、37℃
で60分間感作した。その後マイクロプレートのウエルを
接着培地(pH4.0) で５回洗浄し、各々のウエルを65℃10
分間加熱することによって固定した。固定した各々のウ
エルを接着培地 (pH7.0)で１回洗浄し、ウレアーゼに接
着したビオチン化豚胃ムチンを検出するため、各々のウ
エルにストレプトアビジンHRP を加えた後、前述のELIS
A により測定した。
【００５６】(結果)精製豚胃ムチンに対するウレアーゼの接着パターン 図１に示すように豚胃ムチンに天然型および組換え型ウ
レアーゼは特異的に接着し、この接着パターンはpHに依
存している。pH3.0 領域でのウレアーゼ接着反応は胃粘
膜におけるＨp の定着性を反映していると考えられ、こ
のpH域でウレアーゼの接着が阻止できる物質はＨp の胃
内定着を阻止する機能があると考えられる。また、組換
え型ウレアーゼは天然型と同様の接着性を示すため、組
換え型ウレアーゼ固定化カラムにより精製された本発明
の糖タンパク質は、Ｈp のウレアーゼをマスクし、胃内
定着を阻止しうる物質であると考えられる。
【００５７】本発明の糖タンパク質によるウレアーゼ接
着阻止 図２に示したように、豚胃ムチンへのウレアーゼの接着
は高分子量乳清タンパク質濃縮物および高分子量卵白タ
ンパク質濃縮物、ならびにこれらの各々より製造した本
発明の糖タンパク質によって用量依存的に抑制された。
本発明の糖タンパク質による抑制は低濃度においてもほ
ぼ100 ％であり、かなり高いものであった。ウレアーゼ
はＨｐ菌体表面に局在しているので、胃内において、こ
れらのウレアーゼ結合性糖タンパク質が菌体のウレアー
ゼに結合することによって接着因子であるウレアーゼが
マスクされ感染阻止 (除菌) が起こりうる。 〔実験例２〕インビボ実験 実験例１の結果をさらに動物実験により確認した。
【００５８】(方法)実験動物としてＨp 感染に対して最
も高感受性を示すヘアレスマウス(NS: Hr/ICR 系、財団
法人動物繁殖研究所、受託番号 IAR-NHI-9701)（ATCC#7
2024)(Clin.Diagn.Lab.Immunol. 5: 578-582,1998)を用
いた。NSP335株(1×109 CFU/マウス) をマウスに経口接
種して１週間飼育した後、各種濃度で混餌した本発明の
糖タンパク質を４週間投与した。また、H2ブロッカー
(ファモチジン) またはプロトンポンプインヒビター
(オメプラゾール) をそれぞれ同時投与する群も設け
た。供試マウス数は各群とも10匹とした。投与終了後２
週間目に各群のマウスを屠殺し、胃を摘出し、内容物を
除去した後、粘膜部分全体をホモゲナイザーで乳剤と
し、Ｈp 検出用材料とした。Ｈp の検出は乳剤をＨp 検
出用培地 (ポアメディアＨp 分離培地、栄研化学) に接
種し、ガスパック法で37℃、５日間培養し、コロニー数
を計測することによって行った。
【００５９】(結果)Ｈp 定着マウスにおける本発明の糖タンパク質の除菌効
果 図３に示したように、Ｈｐ定着マウスにおいて本発明の
糖タンパク質は濃度依存的に胃内のＨp を除菌し、その
除菌率は最高用量（20μｇ/ ml) では100 ％、最低用量
(１μｇ/ ml) でも70〜75％で、インビトロ実験の結果
を反映してかなり高い除菌率であった。なお、対照群は
Ｈp に100 ％(10/10) 感染していた。これらの実験か
ら、Ｈｐ定着マウスにおいて本発明の糖タンパク質はＨ
ｐの産生するウレアーゼと優先的に結合することによっ
て接着因子であるウレアーゼをマスクし、感染阻止が起
こると考えられる。また、この効果は酸分泌抑制剤との
併用により一層高められることが分かった。
【００６０】以下に製造例を示すが、用いる糖タンパク
質は、実施例１の(5) で製造した本発明の糖タンパク質
である。 〔製造例１〕食品 (チューインガム) ガムベース 25.0 炭酸カルシウム 2.0 ソルビトール 54.0 マンニトール 16.0 香料 1.0 糖タンパク質 0.1水 残量 全量 100(重量％) (アイスクリーム) クリーム (脂肪率40％) 33.97 牛乳 (脂肪率3.7 ％) 33.16 無糖脱脂練乳 16.08 砂糖 11.75 コーンシロップ 4.67 安定剤 0.3糖タンパク質 0.02 全量 100(重量％)
【００６１】〔製造例２〕特別用途食品 (粉末スープ) 調理用豆粉末 67.5 小麦粉 3.9 小麦胚芽 2.5 乾燥酵母粉末 2.5 オニオンパウダー 4.8 肉エキス末 15.5 食塩 0.2 香辛料 (ホワイトヘ゜ッハ゜ー等) 1.8 調味料 (アミノ酸等) 0.2糖タンパク質 0.1 全量 100(重量％) (乾燥スープ) 10.0g/200ml 鶏卵 4.0 肉エキス 1.3 オニオンエキス 1.73 キャロットペースト 2.16 昆布エキス 0.1 乳化剤 0.1 食塩 0.2 香辛料 (レッドペッパー) 0.2 調味料 (アミノ酸等) 0.2糖タンパク質 0.01 全量 10.0ｇ
【００６２】〔製造例３〕 健康食品 処方例１ (細粒) 100g中 糖タンパク質 1ｇ 乳糖 (200M) 59ｇ トウモロコシデンプン 35ｇ PVP(K-30) 5ｇ 上記成分をとり、湿式造粒法を用いた通常の方法により
細粒を得た。 処方例２ (顆粒) 100g中 糖タンパク質 2ｇ 乳糖 (200M) 60ｇ トウモロコシデンプン 33ｇ PVP(K-30) 5ｇ 上記成分をとり、押し出し造粒法で通常の方法により顆
粒剤を得た。
【００６３】〔製造例４〕 栄養調整食 流動食 (200ml/パック) 糖タンパク質 0.01 マルトデキストリン 39.0 カゼインNa 13.0 植物油 12.0 ビタミン類 1.0 ミネラル類 1.5 乳化剤 0.2 乳タンパク質 10.3 リン酸Na 1.8 リン酸Ｋ 1.2 香料 0.5 安定剤 (カラギーナン) 1.5水 残量 全量 100(重量％) ドリンク剤 (スープタイプ) 糖タンパク質 0.02 人参 (キャロットヘ゜ースト) 10.0 生クリーム 12.0 乳糖 1.8 玉葱 (オニオンエキス) 1.5 乳タンパク質末 0.5 乳果オリゴ糖 1.5 コンソメパウダー 0.5 小麦胚芽 0.5 卵殻カルシウム 0.2 乳清カルシウム 0.1 食塩 0.2 乳化剤 0.2水 残量 全量 100(重量％)
【００６４】〔製造例５〕 医薬品 処方例１ (細粒剤) 1.5kg 中 糖タンパク質 15ｇ 乳糖 1,100ｇ トウモロコシデンプン 340ｇ PVP(K-30) 45ｇ 上記成分をとり湿式造粒法で造粒し、乾燥後、通常の方
法により細粒を得た。 処方例２ (錠剤) 1.糖タンパク質 15ｇ 2.乳糖 400ｇ 3.トウモロコシデンプン 150ｇ 4.結晶セルロース 210ｇ 5.PVP(K-300) 25ｇ 6.ステアリン酸マグネシウム 10ｇ 上記１〜５の成分をとり、湿式造粒法で顆粒を製造し、
その後ステアリン酸マグネシウムを混ぜ、打錠末を得
た。この粉末を用い、１錠270 mg重量の錠剤を製造し
た。
【００６５】処方例３ (顆粒剤) 1.5kg 中 糖タンパク質 20ｇ 乳糖 (200M) 950ｇ トウモロコシデンプン 480ｇ PVP(K-30) 50ｇ 上記成分をとり均一混合し押出造粒法で造粒し、乾燥
後、通常の方法により顆粒剤を得た。
【００６６】処方例４ (細粒剤) 1.5kg 中 糖タンパク質 15ｇ ファモチジン 20ｇ 乳糖 1,100ｇ トウモロコシデンプン 320ｇ PVP(K-30) 45ｇ 上記成分をとり湿式造粒法で造粒し、乾燥後、通常の方
法により細粒を得た。
【００６７】処方例５ (錠剤) 1.糖タンパク質 20ｇ 2.ファモチジン 20ｇ 3.乳糖 400ｇ 4.トウモロコシデンプン 135ｇ 5.結晶セルロース 200ｇ 6.PVP(K-300) 25ｇ 7.ステアリン酸マグネシウム 10ｇ 上記１〜６の成分をとり、湿式造粒法で顆粒を製造し、
その後ステアリン酸マグネシウムを混ぜ、打錠末を得
た。この粉末を用い、１錠270 mg重量の錠剤を製造し
た。
【００６８】処方例６ (顆粒剤) 1.5kg 中 糖タンパク質 20ｇ ファモチジン 30ｇ 乳糖 (200M) 950ｇ トウモロコシデンプン 450ｇ PVP(K-30) 50ｇ 上記成分をとり押出造粒法で造粒し、乾燥後、通常の方
法により顆粒剤を得た。
【００６９】
【発明の効果】上述のように、本発明によれば、安全で
優れたＨｐ定着阻害剤およびそれを含有する食品や医薬
が提供される。本発明においては、Ｈｐの接着因子であ
るウレアーゼに特異的に結合する糖タンパク質を分離精
製して用いるので、Ｈｐの胃粘膜への接着を少量で効率
的に阻止することができる。従って、Ｈｐによって引き
起こされる消化性潰瘍等を、副作用を生じることなく効
果的に予防・治療することができる。従来消化性潰瘍の
治療に用いられてきた抗生物質とは異なり、耐性菌の問
題も生じず、胃内のＨｐを特異的に除菌しうるものであ
る。また、本発明の糖タンパク質を得るための原料とし
て、安価で大量に入手しうる牛乳汁や鶏卵を用いること
もでき、これらから簡便な方法で効果の優れた糖タンパ
ク質を調製しうる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ウレアーゼの精製胃ムチンに対する接着パター
ンを示す図である。
【図２】ウレアーゼ接着抑制率を示す図である。
【図３】Ｈｐ定着マウスにおける除菌率を示す図であ
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ２３Ｌ 1/40 Ａ２３Ｌ 1/40 ４Ｂ０５０ Ａ６１Ｋ 38/00 Ａ６１Ｋ 45/00 ４Ｃ０８４ 45/00 Ａ６１Ｐ 1/04 ４Ｈ０４５ Ａ６１Ｐ 1/04 31/04 31/04 43/00 １０５ 43/00 １０５ Ｃ０７Ｋ 14/465 Ｃ０７Ｋ 14/465 Ｃ１２Ｎ 9/80 Ｚ // Ｃ１２Ｎ 9/80 11/12 11/12 (Ｃ１２Ｎ 9/80 Ｚ 15/09 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/80 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (72)発明者 木村 修武 埼玉県入間郡大井町鶴ケ岡５丁目３番１号 日清製粉株式会社ファインケミカル研究 所内 Ｆターム(参考） 4B014 GB13 GB18 GG07 GG11 GG14 GK05 GK08 GL01 GL09 4B018 LB07 LB10 LE03 MD20 ME08 4B024 AA20 BA11 CA03 DA06 EA04 GA11 HA03 4B033 NA01 NA12 NA26 NB03 NB12 NB47 NB62 NC03 NC12 ND03 ND20 4B036 LC06 LE01 LE02 LE03 LF01 LG01 LG06 LH01 LH10 LH15 LH24 LH25 LH29 LH33 LH39 LH41 LH48 LK01 LK03 4B050 CC03 DD02 FF05E FF12E GG10 JJ01 LL10 4C084 AA02 AA06 AA07 AA13 AA17 AA18 BA03 CA20 CA38 CA41 DC50 MA02 NA14 ZA662 ZA681 ZA682 ZB212 ZB352 4H045 AA10 AA30 BA53 CA40 CA43 EA01 EA25 FA74 GA01 GA10 GA15 GA22 GA26

Claims (11)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 糖タンパク質含有物質から、ヘリコバク
    ター・ピロリのウレアーゼへの特異的吸着を利用した方
    法により分離精製して得られる、ヘリコバクター・ピロ
    リのウレアーゼに特異的に結合する糖タンパク質。
  2. 【請求項２】 ヘリコバクター・ピロリのウレアーゼへ
    の特異的吸着を利用した方法が該ウレアーゼを固定化し
    たカラムを用いるアフィニティークロマトグラフィーで
    ある、請求項１記載の糖タンパク質。
  3. 【請求項３】 カラムに固定化するヘリコバクター・ピ
    ロリのウレアーゼが組換え型ウレアーゼである請求項２
    記載の糖タンパク質。
  4. 【請求項４】 糖タンパク質含有物質が牛乳汁の乳清由
    来である、請求項１ないし３のいずれかに記載の糖タン
    パク質。
  5. 【請求項５】 糖タンパク質含有物質が牛乳汁乳清から
    得た高分子量乳清タンパク質濃縮物である、請求項４記
    載の糖タンパク質。
  6. 【請求項６】 糖タンパク質含有物質が鶏卵卵白から得
    た高分子量卵白タンパク質濃縮物である、請求項１ない
    し３のいずれかに記載の糖タンパク質。
  7. 【請求項７】 請求項１ないし６のいずれかに記載の糖
    タンパク質を有効成分として含むヘリコバクター・ピロ
    リ定着阻害剤。
  8. 【請求項８】 請求項１ないし６のいずれかに記載の糖
    タンパク質を有効成分として含む消化性潰瘍の予防剤お
    よび治療剤。
  9. 【請求項９】 請求項１ないし６のいずれかに記載の糖
    タンパク質を添加した、消化性潰瘍の予防または改善の
    ための食品。
  10. 【請求項10】 請求項１ないし６のいずれかに記載の糖
    タンパク質および胃酸分泌抑制剤を有効成分とするヘリ
    コバクター・ピロリ定着阻害剤。
  11. 【請求項11】 請求項１ないし６のいずれかに記載の糖
    タンパク質および胃酸分泌抑制剤を有効成分とする消化
    性潰瘍予防剤および治療剤。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006325447A (ja) * 2005-05-24 2006-12-07 Nisshin Pharma Inc 抗ヘリコバクター・ピロリ飲食品
JP2007077090A (ja) * 2005-09-15 2007-03-29 Kyodo Milk Industry Co Ltd ヘリコバクター・ピロリ剥離作用を有する組成物

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2002307448A1 (en) * 2001-04-20 2002-11-05 President And Fellows Of Harvard College Methods and compositions for the modulation of biofilm formation
JP4474581B2 (ja) * 2002-01-28 2010-06-09 日清ファルマ株式会社 ヘリコバクター・ピロリ接着阻害剤
CA2483476A1 (en) * 2002-04-22 2003-10-30 Absorber, Ab Fusion polypeptides and methods for inhibiting microbial adhesion
US20060134132A1 (en) * 2004-12-20 2006-06-22 Watkins Jackie M Protective barriers for micronutrients, phytochemicals, and nutraceuticals
WO2009006948A1 (en) * 2007-07-12 2009-01-15 Michael Laurence Murphy A hydroalcoholic fat emulsion and emulsifier for use therein
WO2011139226A1 (en) * 2010-05-06 2011-11-10 Karolinska Institutet Innovations Ab Compounds, medicaments and methods of treatment for helicobacter pylori infection.
CN105764355A (zh) * 2013-11-25 2016-07-13 雀巢产品技术援助有限公司 乳基营养组合物与胃部不适
CN110403012A (zh) * 2018-04-27 2019-11-05 鼎赫生物科技股份有限公司 一种鱼针草内酯用于制备抑制胃幽门螺旋杆菌的蛋白质合成的组合物的用途
CN111436617B (zh) * 2020-05-12 2022-12-23 西北大学 基于牛血清白蛋白的岩藻糖拟糖蛋白在抑制惰性凝集杆菌方面的用途及制备方法
CN117503800B (zh) * 2024-01-04 2024-04-05 北京益华生物科技有限公司 一种胃黏膜上皮细胞提取液及其制备方法与应用

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5116821A (en) * 1990-11-20 1992-05-26 The Procter & Gamble Company Sulfated glyceroglucolipids as inhibitors of bacterial adherence
WO1994009651A1 (en) * 1992-10-30 1994-05-11 Cancer Research Fund Of Contra Costa Anti-diarrheic product and method of treating rotavirus-associated infection
JPH10130164A (ja) * 1996-09-04 1998-05-19 Snow Brand Milk Prod Co Ltd 胃腸障害予防及び／又は治療剤
JP3430853B2 (ja) 1997-04-11 2003-07-28 株式会社ゲン・コーポレーション 胃炎、胃潰瘍および十二指腸潰瘍の予防剤並びに治療剤
JPH11263731A (ja) 1998-03-16 1999-09-28 Snow Brand Milk Prod Co Ltd 感染防御剤
JP4318765B2 (ja) * 1998-04-01 2009-08-26 雪印乳業株式会社 ピロリ菌感染防御剤
KR100460173B1 (ko) * 1998-12-11 2004-12-04 겐 코오포레이션 헬리코박터 파일로리 정착 억제제

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006325447A (ja) * 2005-05-24 2006-12-07 Nisshin Pharma Inc 抗ヘリコバクター・ピロリ飲食品
JP2007077090A (ja) * 2005-09-15 2007-03-29 Kyodo Milk Industry Co Ltd ヘリコバクター・ピロリ剥離作用を有する組成物

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