KR20010098578A

KR20010098578A - 헬리코박터 필로리의 정착에 대한 저해 작용을 갖는당단백질

Info

Publication number: KR20010098578A
Application number: KR1020010019826A
Authority: KR
Inventors: 코다마요시카츠; 키무라노부타케
Original assignee: 도꼬로 히데오; 겐 코오포레이션; 쇼다 오사무; 가부시끼가이샤 닛신 세이훈 그룹 혼샤
Priority date: 2000-04-14
Filing date: 2001-04-13
Publication date: 2001-11-08
Also published as: DE60104162D1; CA2344183A1; JP2001294600A; DE60104162T2; EP1145644B1; CN1195775C; CN1331250A; US6828298B2; EP1145644A2; EP1145644A3; US20010044120A1

Abstract

위 내헬리코박터 필로리 (Helicobacter pylori)정착의 저해제는헬리코박터 필로리우레아제에 특이적으로 결합하는 당단백질을 유효 성분으로서 함유한다. 상기 당단백질은 당단백질 함유 물질, 특히 우유 유장 또는 계란의 난백으로부터 유래한 물질로부터,헬리코박터 필로리우레아제가 고정화된 칼럼을 이용하는 친화성 크로마토그래피에 의해 단리 정제된다. 당단백질은헬리코박터 필로리정착을 효과적으로 저해할 수 있으므로, 위 궤양과 같은헬리코박터 필로리의 감염에 의해 일어나는 질환의 예방 또는 치료에 유용하다. 저해제를 함유하는 식품 및 의약품이 또한 제공된다.

Description

헬리코박터 필로리의 정착에 대한 저해 작용을 갖는 당단백질 {GLYCOPROTEIN HAVING INHIBITORY ACTIVITY AGAINST HELICOBACTER PYLORI COLONIZATION}

본 발명은 위 궤양의 발생과 연관되는, 위의헬리코박터 필로리를 박멸할 수 있는 당단백질에 관한 것이다. 또한, 당단백질을 함유하는헬리코박터 필로리의 정착 저해제, 및 저해제를 함유하는 의약품 및 식품에 관한 것이다.

현재, 위 궤양의 완전한 치료를 위해서는 위 내헬리코박터 필로리의 박멸이 필수적이라고 믿어지고 있다. 항생제 및 위산 분비 저해제의 병용은 하기 기재된 바와 같은헬리코박터 필로리의 박멸을 위한 요법으로서 일반적으로 제시되고 있다.

헬리코박터 필로리는 한쪽 말단에 편모를 갖고 인간 위점막에 정착하는 그람-음성, 나선 막대형 박테리아이다. 호주의 B.J. Marshall 및 J.R. Warren 은 1983 년, 상기 박테리아가 위염 또는 위 궤양 환자의 위 생검 표본에서 자주 검출됨을 보고하였다. 이 시기에, 상기 박테리아는 그 형태 및 성장 특성이 캄필로박터 (Campylobacter) 와 유사하였으므로,캄필로박터 필로리 (Campylobacter pylori)라고 명명되어 있었다. 후에, 상기 박테리아는 그 외부 세포막의 지방산 조성 및 리보솜 16S-RNA 의 서열이 캄필로박터와 상이함이 밝혀졌다. 따라서, 상기 박테리아는 이제헬리코박터 필로리로 명명되며, 신규 확립된 헬리코박터 속에 속한다.

그 이후, 상기 박테리아가 위염, 위 궤양 및 십이지장 궤양을 일으키며 위암과 같은 질환과 연관되어 있음을 시사하는 다수의 보고가 역학적 연구에 근거하여 발표되어 왔다. 일단헬리코박터 필로리가 위점막에 정착하면, 이 감염에 대한 면역 반응이 강력함에도, 즉, 항체 역가가 높음에도 불구하고, 위에서 생존 및 지속되며 박멸시킬 수 없다. 따라서,헬리코박터 필로리가 항생 요법에 의해 위로부터 완전히 제거되지 않는 한, 항생제 투여가 중단된 후 약 1 달 내에, 감염은 치료 전과 동일한 수준으로 돌아올 것이다. 또한, 위의 pH 는 강산인 HCl 에 의해 매우 낮게 유지되며, 따라서 대부분의 항생제가 불활성화되는 경향이 있다. 이런 이유로, 항생제 및 위산의 분비를 강력하게 저해하는 프로톤 펌프 저해제의 병용이헬리코박터 필로리의 박멸을 위해 사용된다.

그러나, 장기간의 항생제 투여는 부작용을 일으킬 뿐만 아니라, 항생제 내성균주를 증가시키는 심각한 문제점을 갖는다.

일본 특허 출원 공개 제 11-262731 호에는, 유지방 구 피막 (globule membrane) 분획이헬리코박터 필로리감염의 예방에 효과적임이 개시되어 있다. 그러나, 그 문헌에서는 단순히헬리코박터 필로리의 혈구응집 저해 효과를헬리코박터 필로리감염 예방의 증거로서 기술하고 있다. 또한, 그 문헌은 유지방 구 피막이 다양한 성분을 함유하고 있다고 말하면서, 어느 성분이 작용하는지는 말하지 못하고 있다. 또한, Siiri Hirmo 등은 위 뮤신 및 유즙 당단백질, 특히 소의 버터우유로부터 제조된 지방 구 피막이헬리코박터 필로리의 시알산 특이적 혈구응집을 저해한다고 말하고 있다 (FEMS Immunol. Medical Microbiology 20 (1998), pp. 275-281). 그러나,헬리코박터 필로리박테리아에 의한 헤마글루티닌의 발현 및 위 점막 세포에 대한 결합능 사이에는 아무런 상관관계가 없다고 보고된 바 있다 (M. Clyne & B. Drumm, Infection and Immunity, Oct. 1993, pp.4051-4057). 따라서, 상기 언급된 공보 및 논문은 위 점막에 대한헬리코박터 필로리의 접착을 저해할 수 있는 물질을 개시하거나 또는 제시하지 않는다.

나아가, 상기 공보 및 논문은,헬리코박터 필로리감염 저해의 중요한 표적인 위 점막에 대한헬리코박터 필로리의 접착을 위한 어드헤신 (adhesin) 및 위 점막 상의 그 수용체를 해명하지 못하였다.

본 발명의 목적은 위 궤양의 발생과 연관되는헬리코박터 필로리정착의 유효하고 안전한 저해제를 제공하고, 위 궤양의 치료 또는 예방에 유용한 의약품 및식품을 제공하는 것으로, 상기 저해제는 부작용의 문제 및 항생제의 사용과 결부된 약물 내성 균주의 증가가 없이헬리코박터 필로리의 정착을 효과적으로 저해할 수 있다.

본 발명의 성질 뿐만 아니라 다른 목적 및 장점은 하기 기술에서 명확해질 것이다.

일반적으로, 박테리아에 의한 감염 성립의 첫 번째 단계는 숙주 세포로의 박테리아 접착 및 그곳에서의 증식에 의한 박테리아의 정착이다. 박테리아가 숙주 세포에 접착하기 위해서는, 어드헤신이 숙주 세포 표면상의 수용체에 결합해야 한다. 박테리아 감염 부위의 특이성은 상기 어드헤신 및 수용체에 의해 결정된다. 만약 박테리아가 숙주 세포에 접착할 때 수용체 분자가 존재한다면, 경쟁적 저해가 일어나고 감염이 성립되지 못한다.

헬리코박터 필로리의 어드헤신 및 인간 위 점막 상의 수용체는헬리코박터 필로리감염 저해의 표적 분자로서 생각되고 있다. 본 발명자들은헬리코박터 필로리의 접착 기전에 대한 연구에 의해, 해명되지 못했던헬리코박터 필로리의 어드헤신이헬리코박터 필로리에 의해 생성되는 우레아제임을 밝혔다 (일본 특허 출원 공개 제 10-287585 호).

본 발명자들은 위 점막에 대한 우레아제 접착을 저해할 수 있는 물질을 연구하였고, 우유에서 유래된 당단백질 또는 계란의 난백에서 유래된 당단백질과 같은 당단백질들이,헬리코박터 필로리세포의 표층에 위치한 어드헤신인 우레아제에 특이적으로 결합함으로써, 위 내 정착된헬리코박터 필로리를 제거할 수 있음을 발견하였으며, 나아가 소량으로도 우레아제에 특이적으로 결합할 수 있는 당단백질의 사용이헬리코박터 필로리의 현저히 효과적인 제거를 가능케함을 발견하였고, 이 당단백질은 우레아제로의 특이적 결합을 이용하여 상기 당단백질 함유 물질로부터 단리 정제된다.

본 발명에 따라, 우레아제에 특이적으로 결합할 수 있는 당단백질은헬리코박터 필로리우레아제에 대한 특이적 결합을 이용하는 친화성 칼럼 기법에 의해 당단백질 함유 물질로부터 단리 정제되며, 단리 정제된 당단백질은헬리코박터 필로리정착의 저해제로서 사용된다.

한편으로, 본 발명은헬리코박터 필로리의 우레아제에 특이적으로 결합하는 당단백질을 제공하며, 이 당단백질은헬리코박터 필로리우레아제에 대한 특이적 흡착을 이용하는 방법으로 단리 정제된다.

다른 편으로, 본 발명은 상기 언급된 당단백질을 유효 성분으로서 함유하는헬리코박터 필로리정착 저해제를 제공한다. 본 발명은 또한, 상기 언급된 당단백질 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 함유하고, 인간을 포함하여 포유류에서, 위 궤양과 같은헬리코박터 필로리에 의해 야기되거나 또는 이와 결부된 질환의 예방 또는 치료에 적합한 약학적 조성물을 제공한다. 또한 본 발명은, 상기 언급된 당단백질을 함유하고, 유효량으로 소비되는 경우, 인간을 포함한 포유류에서, 위 궤양과 같은헬리코박터 필로리에 의해 야기되거나 또는 이와 결부된 질환을 예방 또는 치료하는 식품을 제공한다.

본 발명에 사용되는헬리코박터 필로리에 대한 특이적 흡착을 이용하는 방법은, 바람직하게는헬리코박터 필로리우레아제가 고정화된 칼럼을 이용한 친화성 크로마토그래피이다. 칼럼 상에 고정화된 우레아제는 재조합 우레아제일 수 있다.

도 1 은 정제된 돼지 뮤신에 대한 우레아제의 접착 패턴을 나타내는 도식이다.

도 2 는 우레아제 접착의 저해율을 나타내는 도식이다.

도 3 은헬리코박터 필로리정착 생쥐에서헬리코박터 필로리의 제거율을 나타내는 도식이다.

본 발명에 따르면,헬리코박터 필로리우레아제에 대한 특이적 흡착을 이용하는 방법에 의해, 우레아제에 특이적으로 결합하는 당단백질이 당단백질 함유 물질로부터 단리 정제된다.

본 발명에 사용되는 당단백질 함유 물질은 포유류의 유즙 또는 조류란의 난백, 난삭 (chalaza), 난황막 또는 난황과 같은, 임의의 당단백질 함유 물질일 수 있다. 바람직하게는, 우유의 유장 및 계란의 난백, 특히 고분자 유장 단백질 농축물 및 고분자 난백 단백질 농축물이 사용된다.

당단백질은 약 2-6 종류의 단당류로 구성된 당 사슬이 단백질에 공유 결합된 복합 단백질이다. 이는 개체 내에 넓게 분포되어 있다. 당단백질 내에 함유된 단당류로는 N-아세틸-D-글루코사민, N-아세틸-D-갈락토사민, D-만노오스, D-갈락토오스, L-푸코오스, 시알산 등이 있다. 상이한 분자량 및 분자형을 갖는 다양한 종류의 당단백질이 있다. 당 사슬 및 단백질 사이의 결합 양식의 관점에서 보면, 일반적으로 두 종류의 당단백질, 즉, N-결합형 당단백질 및 O-결합형 당단백질 (뮤신 (mucin) 타입) 이 있다. 기능 또는 생리 활성 뿐만 아니라, 당단백질의 당쇄의 종류, 분자량 및 형태는 당단백질이 존재하는 장소에 따라 다양하다.

우유 중에 함유된 당단백질에는 락토페린, 분비형 IgA, IgG, IgM, 유리 분비 성분 (FSC), 유즙 뮤신 등이 포함된다. 계란의 난백 중에 함유된 당단백질에는 오보무코이드 (ovomucoid), 오발부민 (ovalbumin), 오보트랜스페린 (ovotransferrin), 포스비틴 (phosvitin), 오보뮤신 (ovomucin) 등이 포함된다.

당단백질 함유 물질의 제조에 있어서, 어떠한 공지된 방법이라도 사용할 수 있다. 당단백질 함유 물질은 우유로부터, 예를 들어, 유즙의 유지방 및 카제인을 종래 방식으로 제거함으로써 유장을 수득한 뒤, 초미세여과막 처리와 같은 적절한 방법으로 유장을 분획 농축하여 고분자량 유장 단백질 농축물 (당단백질 함유 물질) 을 수득함으로써 제조될 수 있다. 당단백질 함유 물질은 또한 유장으로부터 지단백질을 제거한 뒤, 임의로 농축 및 투석하고, 이어서 생성 물질을 세파로스 칼럼 등을 이용한 겔 여과 및 막 처리와 같은 적합한 방법으로 정제함으로써 제조될 수 있다. 임의로, 프로테아제 처리, 알칼리 가수분해 등과 같은 추가 처리를 수행하여 저분자량 당단백질을 수득할 수 있다. 본 발명에 이용되는 우유는 초유 또는 상유일 수 있다.

당단백질 함유 물질은 계란의 난백으로부터 예를 들어, 하기 방법에 의해 제조될 수 있다. 농후 난백을 수집된 난백으로부터 분리한다. 젤라틴성 부위를 초원심분리로 회수하고, 초음파 처리 또는 균일화와 같은 기법으로 가용화시킨다. 생성 가용화 물질을 겔 여과, 막 처리 또는 임의의 다른 기법으로 처리하여 당단백질 함유 물질을 수득한다. 이렇게 수득된 당단백질 함유 물질을, 필요하다면 겔 여과와 같은 기법으로 보다 정제할 수 있다.

소화관 내의 점막 또는 그 겔 층의 당단백질 함유 물질은 통상 균일화 또는 초음파 처리에 의해 당단백질을 가용화시킨 뒤, 겔 여과 또는 에탄올 침전법으로고분자량 분획을 단리함으로써 회수될 수 있다. 당단백질 함유 물질의 가용화는 염산구아니딘, 요소, 염 용액 또는 계면활성제로 추출하거나 또는 환원제 또는 프로테아제를 처리함으로써 수행될 수 있다. 일부 종류의 당단백질 함유 물질은 제 4 급 암모늄 염과 불용성 복합체를 형성하거나 또는 산성 조건하에서 침전시킴으로써 회수될 수 있다.

유리하게는, 우유 또는 계란의 난백이 당단백질 함유 물질의 원료로서 사용되며, 이는 상기 물질이 저비용으로 그리고 대량으로 입수될 수 있고, 이로부터 당단백질 함유 물질의 제조가 간편하게 그리고 용이한 방법으로 수행될 수 있기 때문이다. 또한, 유즙으로부터의 당단백질 함유 물질의 제조에는 유장이 사용될 수 있다. 과거에는, 유장의 유효한 이용 방법이 없었으므로, 치즈 등의 제조 공정 중에 부산물로서 대량 생성되었음에도 불구하고, 유장을 폐기하여 왔다. 따라서, 유장으로부터의 당단백질 함유 물질은 공업규모로 대량 제조될 수 있으며, 유즙으로부터의 당단백질 함유 물질의 사용은 비용 및 실용적 측면에서 매우 유리하다.

또한, 우유 또는 계란 난백의 당단백질은 안정성이 높고, 열이나 또는 낮은 pH 로 인해 그 생리학적 활성을 잃지 않으므로, 원료로부터 용이하게 회수 및 정제될 수 있고, 식품 또는 의약품으로의 배합, 가공 및 저장의 관점에서 유리하다.

우레아제에 대한 특이적 흡착을 이용하는 어떠한 방법이라도, 당단백질 함유 물질로부터의헬리코박터 필로리우레아제에 특이적으로 결합하는 당단백질의 단리 정제를 위해 사용될 수 있다. 바람직하게는,헬리코박터 필로리우레아제가 고정화된 칼럼을 이용하는 친화성 크로마토그래피가 사용된다. 칼럼 상에 고정화되는우레아제로서, 균일한 우레아제의 대량 사용가능성으로 인해, 재조합 우레아제가 바람직하게 사용된다.

재조합 우레아제는 종래 방법으로 제조될 수 있다. 예를 들어, 공지된 방법으로헬리코박터 필로리의 게놈 DNA 를 추출할 수 있고, 우레아제 분자를 코딩하는 유전자를 PCR 법에 의해 증폭시켜 증폭된 DNA 를 수득할 수 있고, 이어서 이것을이. 콜라이 (E. coli)(예로, pKK233-2) 용 발현 벡터내로 삽입시킬 수 있다. 수득된 벡터를 적합한 숙주,이. 콜라이(예로,E.coliXL1-Blue) 내로 도입하여 재조합체를 생성시킬 수 있다. 재조합체를 적합한 배양 배지 중에서 배양하여 우레아제를 발현시킬 수 있다. 재조합 우레아제를 발현된 우레아제의 회수에 의해 수득할 수 있다. 재조합 우레아제의 제조에 있어서, 효모, 포유류 세포 및 곤충세포를 이용한 발현 시스템을 사용할 수 있다. 재조합 우레아제의 제조 방법은, 예를 들어 문헌 [Molecular Cloning, Laboratory Mannual (2nd ed.) (Cold Spring Harbor Press)] 및 [DNA Cloning 2 (2nd ed.) (IRL Press)] 에 기재되어 있다.

칼럼 상 우레아제의 고정화는 우레아제 내에 포함되어 있는 아미노기 (-NH₃), 카르복실기 (-COOH), 티올기 (-SH) 또는 히드록실기 (-OH) 에 결합할 수 있는, 아가로오스 겔의 비드 (예로, 세파로스) 와 같은 리간드 고정화 담체 (예로, NHS-활성화 세파로스 4 패스트 플로우 (Sepharose 4 Fast Flow)) 를 이용해 수행될 수 있다. 우레아제 고정화 칼럼에 의한 당단백질의 단리 정제는, 당단백질 함유 물질을 함유하는 시료를 상기 칼럼을 통해 통과시킨 뒤, 비특이적 흡착 단백질을세정 제거하고, 이어서 우레아제에 특이적으로 흡착된 당단백질을 적절한 용출 용액으로 칼럼으로부터 용출시켜 수행될 수 있다.

상기 언급된 방법에 따라, 우레아제에 특이적으로 결합하는 당단백질만이 다양한 종류의 당단백질 함유 물질로부터 효율적으로 단리 정제될 수 있다. 이렇게 수득된 당단백질은, 하기 실시예에 실증되는 바와 같이,헬리코박터 필로리에 의해 생성되는 우레아제가 위 점막의 뮤신에 접착하는 것을 저해할 수 있다. 우레아제는헬리코박터 필로리세포의 표면상에 위치하므로, 우레아제에 특이적으로 결합하고, 상기 언급된 방법에 의해 생성된 당단백질 (이하, 본 발명의 당단백질로 언급함) 은 위 내 우레아제에 우선적으로 결합함으로써, 어드헤신, 즉, 우레아제를 차폐시켜헬리코박터 필로리가 위 점막상의 수용체에 접착하는 것을 저해한다. 이는 동물 실험에서 확인되었으며, 위로부터의헬리코박터 필로리제거에 대한 본 발명의 당단백질의 효과가 관찰되었다. 또한, 본 발명의 당단백질은 천연 유래이며, 매우 안전하다. 따라서, 본 발명의 당단백질은 위 내헬리코박터 필로리정착 저해제로서 사용될 수 있고, 위 궤양과 같은헬리코박터 필로리에 의해 야기되거나 또는 이와 결부된 질환의 예방 또는 치료에 유용하다.

따라서, 본 발명의 당단백질은 의약품 또는 식품으로 배합되어,헬리코박터 필로리정착 저해제로서 사용될 수 있다. 특히, 유즙 또는 계란 난백의 당단백질이 과거에도 섭취되어 왔으므로, 이를 항헬리코박터 필로리작용을 갖는 특정 보건용 식품, 고령자용 식품 또는 병자용 식품을 포함하는 특별 용도 식품 또는 항헬리코박터 필로리작용을 갖는 영양 조정 식품 또는 건강 식품과 같은 식품내로배합할 수 있다.

본 발명의 당단백질이 특정 보건용 식품으로 또는 특별 용도 식품으로서 사용될 식품에 첨가되는 경우, 당단백질은 통상 식품의 약 0.005-0.5 중량% 및 바람직하게는 0.01-0.1 중량% 의 양으로 식품에 첨가될 수 있다. 본 발명의 당단백질이 첨가되는 특정 보건용 식품에는 유즙, 유제품, 식육 제품, 마요네즈, 드레싱, 음료, 아이스크림, 두부 (콩 응유), 일상 요리 (daily dishes), 츠쿠다니 (tsukudani, 콩 소스 중에 끓인 저장용 식품), 콩 잼, 밀가루 페이스트, 인스탄트 국수, 쌀 위에 뿌려지는 분말 식품, 절인 야채, 분말 스프, 건조 스프, 절임 (confections), 통조림 식품, 레토르트 파우치보관 (retort pouched) 식품, 냉동 식품 등이 포함된다. 이중, 지속적으로 소비될 수 있는 식품이 바람직하지만, 반드시 필요한 것은 아니다. 저나트륨 식품, 저에너지 식품 또는 저단백 식품과 같은 병자용 식품에 첨가되는 경우, 본 발명의 당단백질은 스프, 음료, 유동식 등에 첨가되어 다양한 형태의 식품을 제조할 수 있다.

영양 조정 식품은 예를 들어, 본 발명의 당단백질에 덱스트린과 같은 부형제, 카제인산나트륨과 같은 점착제 및 필요하다면, 영양분 (예로, 비타민, 미네랄), 유화제, 안정제, 향료 등을 첨가하여 유동식을 제조할 수 있다.

본 발명의 당단백질이 건강 식품으로서 이용되는 경우, 당단백질은 유효 성분으로서 식품의 약 0.1-3 중량% 의 양으로 함유될 수 있다. 당단백질은 락토오스, 옥수수 전분, 결정성 셀룰로오스 또는 PVP 와 같은 부형제, 또는 결합제와, 임의로 비타민 및 미네랄과 같은 영양분과 함께 배합되어 미립자, 정제 및 과립과 같은 다양한 형태의 식품을 형성할 수 있다.

본 발명의 당단백질을 단독으로, 또는 위 궤양 등의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물로서의 종래 첨가물과 함께 사용할 수 있다. 당단백질을 단독으로 또는 첨가제와 함께, 종래 방법으로 정제, 과립제, 산제, 캡슐제 또는 액제와 같은 경구 투여용 제제로 형성할 수 있다. 사용될 수 있는 첨가제에는 부형제, 결합제, 붕해제, 활택제, 항산화제, 착색제, 감미제 등이 포함된다.

약학적 조성물 중에 사용될 수 있는 부형제로는, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스, 한천, 경질 무수 규산, 겔라틴, 결정성 셀룰로오스, 소르비톨, 활석, 덱스트린, 전분, 락토오스, 수크로오스, 글루코오스, 만니톨, 마그네슘 메탈실리케이트 알루미네이트, 칼슘 히드로겐포스페이트 등이 포함된다.

사용될 수 있는 결합제로는 아라비아 고무, 알긴산나트륨, 에탄올, 에틸 셀룰로오스, 카제인산나트륨, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스, 한천, 정제수, 겔라틴, 전분, 트라가칸트 (tragacanth), 락토오스, 히드록시셀룰로오스, 히드록시메틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈 등이 포함된다.

사용될 수 있는 붕해제로는 카르복시메틸셀룰로오스, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스, 칼슘 카르복시메틸셀룰로오스, 결정성 셀룰로오스, 전분, 히드록시프로필전분 등이 포함된다.

사용될 수 있는 활택제로는 스테아르산, 스테아르산칼슘, 스테아르산마그네슘, 활석, 수소화 오일, 수크로오스 지방산 에스테르, 왁스 등이 포함된다.

사용될 수 있는 항산화제로는 토코페롤, 갈륨산 에스테르, 디부틸 히드록시톨루엔 (BHT), 부틸 히드록시 아니솔 (BHA), 아스코르브산 등이 포함된다.

만약 요망된다면, 제산제 (예로, 탄산수소나트륨, 탄산마그네슘, 침전 탄산칼슘, 합성 히드로탈시트 (hydrotalsite)), 위 점막 보호제 (예로, 합성 규산알루미늄, 수크랄페이트 (sucralfate) 및 나트륨 구리 클로로필린 (chlorophyllin)) 및 소화효소 (예로, 생디아스타제 (biodiastase) 또는 리파아제) 와 같은 다른 부가적인 첨가제 또는 제제를 첨가할 수 있다. 위 궤양 등의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물의 투여는 경구 경로에 의할 수 있다. 본 발명의 당단백질의 용량은, 성인 1 일 당 통상 2-30 ㎎, 바람직하게는 5-20 ㎎ (건조 중량으로) 일 것이다.

또한, 위 궤양 등의 예방 또는 치료를 위해 상기 언급된 약학적 조성물은 위산 분비 저해제를 더 함유할 수 있다. 당단백질 및 위산 분비 저해제의 병용은 위로부터의 헬리코박터 필로리의 제거에 보다 효과적이다. 사용될 수 있는 위산 분비 저해제의 예에는 파모티딘 (famotidine), 니자티딘 (nizatidine), 록사티딘 (roxatidine), 라니티딘 (ranitidine) 또는 시메티딘 (cimetidine) 과 같은 H₂차단제 및 오메프라졸 (omeprazol), 란소프라졸 (lansoprazol) 또는 나트륨 라베프라졸 (rabeprazole) 과 같은 프로톤 펌프 저해제가 포함된다. 위산 분비 저해제의 용량은, 성인 1 일 당 바람직하게는 20-30 ㎎ 이다.

하기 실시예는 본 발명을 더 예시하기 위해 주어진다. 본 발명이 실시예에 제시된 구체적 사항에 국한되지 않음이 이해되어야 한다.

실시예 1

(1) 헬리코박터 필로리 의 재조합 우레아제의 제조

헬리코박터 필로리균주 TU130 의 게놈 DNA 를 추출하고, 우레아제 분자를 코딩하는 DNA 를 PCR 법으로 증폭시켰다. 증폭된 DNA 를 발현 벡터 pKK233-2 (Amersham Pharmacia Biotec) 내로 삽입하여 우레아제의 발현에 사용할 벡터를 수득하였다. 벡터를이. 콜라이XL1-Blue 내로 도입시켜 우레아제를 발현할 수 있는이. 콜라이를 수득하였다. 재조합 박테리아를 100 ㎍/㎖ 의 암피실린을 함유하는 1.0 리터의 LB 배지 중에서, 37℃ 에서 100 rpm 으로 진탕 배양하였다. 박테리아 세포가 대수증식기로 늘어나는 성장 단계에 도달하면, 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드 (IPTG) 를 0.5 mM 의 농도로 첨가하여 발현을 유발하고, 세포를 상기와 동일한 조건 하에서 밤새 더 진탕 배양하였다.이. 콜라이를 4,000 ×g 에서 20 분간 (+4℃) 원심분리함으로써 수확하였다.

수득된 세포를 용해용 트리스 완충액 (50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 100 mM NaCl, 1 mM EDTA) 중에 현탁시켰다. 리소자임을 1.0 ㎎/㎖ 의 농도로 첨가한 뒤, 현탁액을 빙중에 30 분간 방치하였다. 그 다음, 현탁액을 -80℃ 에서 1 시간 이상 동결시키고, 실온에서 융해시켰다. 현탁액을 초음파로 처리하고, 트리톤 X-100 을 1 % 의 농도로 첨가하였다. 재조합 우레아제의 봉입체를 30,000 ×g 로 30 분간 (+4℃) 원심분리하여 수집하였다.

상기 봉입체를 봉입체 세정용 완충액 (50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 0.1 % SDS 를 함유한 1 mM EDTA, 1.0 % Triton X-100, 0.1 % 나트륨 데옥시콜레이트) 중에 현탁시키고, 30,000 ×g 로 10 분간 (+4℃) 원심분리하였다. 침전된 봉입체를 동일한 방식으로 두번 더 세정하였다. 상기 봉입체를 8 M 요소 용액 (8 M urea, 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA, 1 mM DTT) 중에 현탁시켜 용해시킨 뒤, 현탁액을 실온에서 1 시간 동안 방치하였다. 생성 현탁액을 30,000 ×g 로 30 분간 (+4℃) 원심분리한 뒤, 상청액을 100 배 용량의, 1 mM EDTA 가 보강된 20 mM 인산염 완충액 (pH 6.5) 에 대해 투석하여 우레아제의 입체구조를 재생시켜, 정제할 재조합 우레아제 함유 물질을 수득하였다.

상기 재조합 우레아제 함유 물질의 정제를 위해, 셀룰로파인 술페이트-m (Cellulofine sulfate-m, (Chisso Inc.)) 을 10 겔 베드 용량의, 1mM EDTA 가 보강된 20 mM 인산염 완충액 (pH 6.5) 으로 평형화시켰다. pH 6.5 로 재조정된 50 ㎖ 의 이 물질을 1 mM EDTA 가 보강된 20 mM 인산염 완충액 (pH 6.5) 으로 평형화시킨 상기 셀룰로파인 술페이트-m 에 적용한 뒤, 1 mM EDTA 가 보강된 20 mM 인산염 완충액을 겔을 통해 통과시켰다. 우레아제를 함유하는 피크를 갖는 혼합 분획을 pH 5.5 로 조정하고, 10 겔 베드 용량의, 1 mM EDTA 가 보강된 20 mM 인산염 완충액 (pH 5.5) 으로 사전 평형화시킨 셀룰로파인 술페이트-m 에 적용하였다. 그 후에, 겔을 20 mM 인산염 완충액 (pH 5.5) 으로 세정하였다. 그 다음, 0.15 M NaCl 을 함유하는 20 mM 인산염 완충액, pH 7.4 를 겔을 통해 흘려보내 우레아제를 추출하였다. 우레아제를 함유하는 혼합 분획을 100 배 용량의 증류수에 대해 투석하고 동결건조시켜, 분말화된 재조합 우레아제를 형성하였다. 수득된 재조합 우레아제는 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯팅에 의해헬리코박터 필로리의 천연 우레아제와 동일함을 확인하였다.

(2) 고정화된 헬리코박터 필로리의 재조합 우레아제를 포함하는 칼럼의 제조

2 g 의 NHS-활성화된 세파로스 4 패스트 플로우 (Amersham Pharmacia Biotec Inc.) 를 약 50 ㎖ 의 1 mM HCl 중에 현탁시키고 실온에서 15 분간 팽윤시켰다. 팽윤된 겔을 유리 필터 상에서 흡인하면서 여과하고, 10 배 용량의 1 mM HCl 로 두번 세정하였다. 그 다음, 겔을 50 ㎖ 의 결합용 완충액 (0.1 M NaHCO₃, 0.5 M NaCl, pH 8.8) 중에 현탁시키고, 유리 필터 상에서 흡인하면서 여과하였다. 상기 (1) 에서 제조된 10 ㎎ 의 분말 정제된 재조합 우레아제를 10 ㎖ 의 결합용 완충액 중에 용해시켰다. 생성 용액을 즉시 겔과 혼합하고, 진탕기로 약하게 진탕하면서 4 ℃ 에서 밤새 반응시켰다.

반응 혼합물을 흡인 여과로 제거한 뒤, 생성 겔을 차단용 완충액 (0.2 M 글리신, pH 8.3) 중에 현탁시키고, 약하게 진탕하면서 4 ℃ 에서 밤새 방치하여 잔류 반응기를 차단하였다. 겔을 유리 필터 상에서 흡인하면서 여과한 뒤, 50 ㎖ 의 결합용 완충액, 50 ㎖ 의 세정용 완충액 (0.1 M 아세트산, 0.5 M NaCl, pH 4.0) 및 0.5 M NaCl 이 보강된, 100 ㎖ 의 20 mM 인산염 완충액 (pH 7.0) 으로 연속 세정하였다. 생성 겔을 약 5 배 용량의, 0.5 M NaCl 을 함유하는 20 mM 인산염 용액, pH 5.5 중에 현탁시키고, 직접 칼럼 내로 부어 이를 충진하였다. 칼럼을 저온실로 옮기고, 3 베드 용량의, 0.1 M NaCl 을 함유하는 20 mM 인산염 용액, pH 5.5 로 평형화시켜, 본 발명의 당단백질을 단리하기 위한, 고정화된헬리코박터 필로리의 재조합 우레아제를 포함하는 칼럼으로서 사용한다.

(3) 우유 유장으로부터 고분자량 유장 단백질 농축액의 제조

20 리터의 우유을 2,000 ×g, 4 ℃ 에서 15 분간 원심분리하여 유지방을 제거하고, 상청액을 회수하였다. 그 다음, 상청액에, pH 가 4.6 이 될 때까지 1 M 아세트산을 적가하여 카제인을 제거하였다. 상청액을 실온에서 1 시간 동안 방치한 뒤, 카제인을 원심분리에 의해 제거하여 소 유장을 수득하였다. 그 다음, pH 6 으로 조정된 유장을 1000,000 Da 에 대해 초미세여과함으로써 분획화시켜 1/20 부피로 농축하고, 고분자량 유장 단백질 농축물을 수득하였다.

(4) 계란의 난백으로부터 고분자량 난백 단백질 농축물의 제조

산란한지 1 주일 이내의, 흰 레그혼 암탉의 50 개 무정란으로부터 난백만을 수집하고 체에 걸러 농후 난백을 분리하고, 이를 멘셀 완충액 (pH 9.5, 이온강도=0.01) 중에 현탁시키고, 10 W 및 9 kHz(+2℃) 에서 10 분간 초음파 처리를 하여 가용화시켰다. 상기 가용화된 물질을 300,000 Da 의 분획 분자량에 대한 초미세여과막으로 분획화하여 1/20 부피로 농축하고, 고분자량 난백 단백질 농축물을 수득하였다.

(5) 우레아제 고정화 칼럼을 이용한 우레아제 특이적 결합 당단백질의 단리

상기 방법 (3) 및 (4) 에서 제조된 각 1 리터의 고분자량 단백질 농축물을 pH 5.5 로 조정하였다. 하기 방법을 저온실에서 수행하였다. 상기 방법 (2) 에서 제조된 우레아제 고정화 칼럼을 10 베드 용량의, NaCl 함유 20 mM 인산염 완충액 (pH 5.5) 로 사전 평형화시켰다. 상기 언급된 각각의 시료를 이 칼럼을 통해 통과시켰다. 그 다음, 칼럼에 10 베드 용량의 0.5 M NaCl 을 함유하는 20 mM 인산염완충액 (pH 5.5) 을 흘려보내, 비특이적으로 흡착된 단백질을 제거하였다. 칼럼 내의 우레아제에 특이적으로 결합된 당단백질을 0.5 M NaCl 을 함유하는 20 mM 인산염 완충액 (pH 7.4) 으로 칼럼으로부터 용출하였다. 100 배의 증류수로 투석하고 동결건조 한 뒤, 본 발명의 당단백질, 즉,헬리코박터 필로리우레아제 특이적 결합 당단백질을 한번에 약 1 그램 수득하였다.

실험예 1 시험관 내 실험

위 점막에 대해,헬리코박터 필로리가 생성한 우레아제의 접착 저해 효과를, 실시예 1 의 상기 기재된 방법 (3) 에 의해 제조된 고분자량 유장 단백질 농축물, 방법 (4) 에 의해 제조된 고분자량 난백 단백질 농축물 및 방법 (5) 에 의해 제조된 본 발명의 당단백질을 이용한 시험관 내 실험에서 조사하였다.

(재료 및 방법)

본 발명자들은 이미헬리코박터 필로리의 어드헤신이헬리코박터 필로리에 의해 생성되는 우레아제임을 발견하였다. 상기 우레아제가 위 점막의 뮤신에 잘 결합하므로, 하기와 같이 제조된 돼지 위 뮤신을 우레아제 접착 시험을 위해 사용하였다.

돼지 위 뮤신의 제조

약 2 개월된 건강한 돼지를 도살하고, 그들의 위를 적출하여 그 내부를 0.15 M NaCl, 5mM N-에틸 말레이미드 (NEM), 1mM 페닐메틸술포닐 플루오라이드 (PMSF) 및 1mM EDTA 를 함유하는 0.1 M 인산염 완충액 (pH 7.4) 으로 세정하였다. 위를 절개하고 위 점막을 긁어내어 상기 언급된 완충 용액 중에 부유시켰다. 상기 점막의 부유액을 빙냉하면서, 폴리트론 (Polytron) 균일화기로 균일화시키고, 15,000 ×g 에서 원심분리하여 상청액을 회수하였다. 상청액을 25,000 ×g 에서 다시 원심분리하여 상청액을 회수하고, 이를 증류수에 대해 투석하고 동결건조하여 조정제 위 뮤신을 수득하였다. 그 다음, 상기 동결건조된 조정제 위 뮤신을 0.15 M NaCl, 6 M 염산구아니딘 및 프로테아제 저해제 (5mM NEM, 1mM PMSF, 1mM EDTA) 를 함유하는 0.1 M 인산염 완충액 (pH 6.8) 중에 용해시키고, 염화세슘 밀도 구배상에 중층한 뒤, 34,000 ×g 에서 48 시간 동안 원심분리하였다. 시알산 함유 분획을 니트로셀룰로스 막 블로팅 및 과요오드산 시프 시약 (Schiff's reagent) 으로 염색하여 검출하였다. 발색 분획을 모아 염화세슘 밀도 구배상에 중층한 뒤 원심분리하였다. 염색 양성 분획을 모아 동결건조하였다. 그 다음, 동결건조된 생성물을 0.1 M 인산염 완충액 (0.1M NaCl, pH 6.8) 로 사전 평형화시킨 세파로스 CL-4B 칼럼을 통해 겔 여과시켜 분획화하였다. PAS 염색 양성이고 고농도로 단백질을 갖는 분획을 모아 PBS (pH 6.8) 에 대해 투석하여, 정제된 위 뮤신을 수득하였고, 이를 사용 전까지 -80℃ 에서 보관하였다. 수득된 돼지 위 뮤신은 SDS-PAGE 에 의해 66 kD 의 당단백질임을 확인하였다.

돼지 위 뮤신에 대한 우레아제 접착 시험

우레아제 접착 시험을 위한 마이크로플레이트를 하기와 같이 제조하였다.

96 웰 마이크로플레이트의 각 웰에, 정제된 돼지 위 뮤신 (1.27 ㎎/㎖) 의 50 ㎕ 분을 각 웰에 첨가하고, 4 ℃ 에서 밤새 방치하여 고정화시켰다. 마이크로플레이트를 우레아제 접착 시험에 사용할 때, 각 웰에 3% BSA 를 첨가하여 37℃ 에서 60 분간 반응시킴으로써 차단을 수행한 뒤, 플레이트를 0.15 M NaCl 및 0.05% 트윈 20 을 함유하는 20 mM 인산염 완충액으로 3 회 세정하였다.

상기 제조된 마이크로플레이트를 이용해 우레아제 접착 시험을 수행하여, 마이크로플레이트 상에 고정화된 돼지 위 뮤신에 대한 우레아제의 접착을, 하기와 같이 관찰하였다.

헬리코박터 필로리균주 TU130 으로부터 제조된 천연 우레아제 및 실시예 1 의 방법 (1) 에 의해 제조된 재조합 우레아제에 바이오틴을 붙이고, 바이오틴화 우레아제를 희석하여 상이한 pH 범위 (2.0, 3.0, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0 또는 6.5 로 사전 조정된 pH) 를 갖고, 0.15 M NaCl 및 0.05% 트윈 20 을 함유하는 20 mM 인산염 완충액으로 구성된 접착 매질로 최종 농도 7.0 ㎍/㎖ 을 맞추었다. 이렇게 제조된 각 우레아제 시료를 상기 언급된 뮤신 고정화 마이크로플레이트의 2 개씩의 웰에 첨가하여 37 ℃ 에서 60 분간 감작시켰다. 그 다음, 웰에 접착된 우레아제의 양을 측정하기 위해, 스트렙토아비딘 HRP 를 각 웰에 첨가하여 37℃ 에서 60 분간 반응시켰다. 이어서, 오르토-페닐렌디아민 2HCl 을 기질로서 및 H₂O₂를 첨가하여 반응시켰다. 3N H₂SO₄를 반응 정지액으로 사용하였다. 기지량의 바이오틴화 우레아제를 순차적으로 2 배씩 희석하여 연속 플레이트 내에 위치시키고 그의 검정 곡선을 이용하여 시료 내 우레아제의 양을 측정하였다.

우레아제 접착의 저해 시험

우레아제 접착의 저해 시험을, 본 발명의 당 단백질 (실시예 1 의 방법(5)), 고분자량 유장 단백질 농축물 (실시예 1 의 방법 (3)) 및 고분자량 난백 단백질 농축물 (실시예 1 의 방법 (4)) 을 이용하여 수행하였다. 일차로, 다양한 농도의 시료를 각각 바이오틴화 돼지 위 뮤신과 혼합하고, 각 혼합물을 우레아제가 고정화된 96 웰 플레이트의 웰로 옮기고, 37℃ 에서 60 분간 감작시켰다. 그 다음, 마이크로플레이트 내의 각 웰을 접착 매질 (pH 4.0) 로 5 회 세정하고, 65℃ 에서 10 분간 가열하여 고정화시켰다. 고정화된 웰을 접착 매질 (pH 7.0) 로 한번 세척하고, 스트렙토아비딘 HRP 를 각 웰에 첨가하여 우레아제에 접착된 바이오틴화 돼지 위 뮤신을 상기 기재된 ELISA 로 검출하였다.

(결과)

정제된 돼지 위 뮤신에 대한 우레아제 접착 패턴

도 1 에서 보이는 바와 같이, 천연 우레아제 및 재조합 우레아제는 돼지 위 뮤신에 특이적으로 접착하며, 상기 접착 패턴은 pH 에 의존한다. 약 pH 3.0 에서의 우레아제 접착 반응이 위 점막에서헬리코박터 필로리의 정착성을 반영한다고 생각되므로, 상기 pH 범위 내에서 우레아제의 접착을 저해할 수 있는 물질은 위 내헬리코박터 필로리의 정착을 저해할 수 있을 것이다. 재조합 우레아제가 천연 생성 우레아제와 동일한 접착성을 나타냈으므로, 재조합 우레아제가 고정화된 칼럼을 이용하여 정제된 본 발명의 당단백질은,헬리코박터 필로리우레아제를 차폐함으로써, 위 내헬리코박터 필로리의 정착을 저해하는 것으로 생각된다.

본 발명의 당단백질에 의한 우레아제 접착의 저해

도 2 에서 보이는 바와 같이, 돼지 위 뮤신에 대한 우레아제 접착은 고분자량 유장 단백질 농축물, 고분자량 난백 단백질 농축물 및 각 단백질 농축물로부터 정제된 본 발명의 당단백질에 의해, 용량 의존적으로 저해되었다. 본 발명의 당단백질은 낮은 농도에서도 약 100% 의 저해 작용을 나타내었으며, 이는 현저히 높은 유효성이다. 우레아제는헬리코박터 필로리세포 표면에 존재하므로, 본 발명의 우레아제 결합 당단백질은헬리코박터 필로리의 감염을 저해할 수 있고, 즉,헬리코박터 필로리세포의 우레아제에 결합하고, 위 내 어드헤신인 우레아제를 차폐함으로써,헬리코박터 필로리를 제거할 수 있다.

실험예 2 생체 내 실험

이 실험은 실험예 1 의 결과를 보다 확실히 하기 위해 동물 모델에서 수행되었다.

(방법)

실험 동물은헬리코박터 필로리감염에 고감수성을 갖는 무모 생쥐 (NS:Hr/ICR, Research Institute for Human and Animal Propagation, Accession No. IRA-NHI-9701)(ATCC #72024)(Clin. Diagn. Lab. Immunol. 5:578-582, 1998) 였다. 각 생쥐에 1 ×10⁹CFU 의 NSP 335 균주를 경구접종으로 감작하였다. 1 주간 사육한 뒤, 다양한 농도로 사료에 첨가된 본 발명의 당단백질을 생쥐에게 4 주간 투여하였다. 다른 군에는 본 발명의 당단백질을 H₂차단제 (파모티딘) 또는 프로톤 펌프 저해제 (오메프라졸) 와 동시 투여하였다. 각 군에는 10 마리씩의 생쥐가 있었다. 시료의 투여 종료 후, 각 군의 생쥐를 도살하였다. 생쥐의 위를 적출하여내용물을 제거한 뒤, 전량 점막을 균일화기로 균일화시켜 유액을 형성하고, 이를헬리코박터 필로리의 검출에 사용하였다.헬리코박터 필로리의 검출은헬리코박터 필로리의 단리용 배지 (Poremedia헬리코박터 필로리isolation medium, Eiken Kagaku) 상에 유액을 옮기고, 기체 팩 방법으로 37℃ 에서 5 일간 인큐베이팅시켜 콜로니의 수를 계측함으로써 수행되었다.

(결과)

헬리코박터 필로리 정착 생쥐에서 헬리코박터 필로리의 제거에 대한 본 발명의 당단백질의 효과

도 3 에서 보이는 바와 같이, 본 발명의 당단백질은 농도 의존적인 방식으로 위로부터헬리코박터 필로리를 제거할 수 있었다. 제거율은 최고 용량 (20 ㎍/㎖) 에서 100% 및 최저 용량 (1 ㎍/㎖) 에서 70-75% 였으며, 이는 시험관 내 실험 결과에 상응하는 현저히 높은 제거율이다. 대조군 생쥐 (10/10) 의 100 % 는헬리코박터 필로리에 감염되었다. 상기 결과로부터, 본 발명의 당단백질이헬리코박터 필로리에 의해 생성되는 우레아제에 우선적으로 결합하고 어드헤신인 우레아제를 차폐함으로써,헬리코박터 필로리의 감염을 저해할 수 있다고 생각된다. 또한, 당단백질 및 위산 분비 저해제의 병용은 향상된 유효성을 나타내었다.

하기, 다양한 제형예가 주어진다. 제형예들에 사용되는 당단백질은 실시예 1 의 방법 (5) 에 의해 제조된 당단백질이다.

제형예 1 (식품)

(츄잉 껌)

껌 기재 25.0

탄산칼슘 2.0

소르비톨 54.0

만니톨 16.0

향료 1.0

당단백질 1.0

물 100.0 이 되도록 적량으로 (중량%)

(아이스크림)

크림 (40% 지방율) 33.97

우유 (3.7% 지방율) 33.16

무당 탈지 연유 16.08

설탕 11.75

옥수수 시럽 4.67

안정제 0.3

당단백질 0.02

전량 100.0 (중량%)

제형예 2 (특별 용도 식품)

(분말 스프)

조리용 두 분말 67.5

소맥분 3.9

소맥 배아 2.5

건조 효모 분말 2.5

양파 분말 4.8

고기 추출 분말 15.5

소금 0.2

향신료 (흰 후추 등) 1.8

조미료 (아미노산 등) 0.2

당단백질 0.1

전량 100.0 (중량%)

(건조 스프) 10.0 g/200 ㎖

계란 4.0

고기 추출물 1.3

양파 추출물 1.73

당근 페이스트 2.16

콤부 (kombu) 추출물 0.1

유화제 0.1

소금 0.2

향신료 (홍후추) 0.2

조미료 (아미노산 등) 0.2

당단백질 0.01

전량 10.0 g

제형예 3 (건강 식품)

조성 1: 미립자 100 g 중에

당단백질 1 g

락토오스 (200M) 59 g

옥수수 전분 35 g

PVP (K-30) 5 g

상기 성분들을 통상적인 습식 조립법에 의해 미립자로 배합하였다.

조성 2: 과립 100 g 중에

당단백질 2 g

락토오스 (200M) 60 g

옥수수 전분 33 g

PVP (K-30) 5 g

상기 성분들을 통상적인 압출 조립법에 의해 과립으로 배합하였다.

제형예 4 (영양 조정 식품)

유동식 (200 ㎖/팩)

당단백질 0.01

말토덱스트린 39.0

카제인 Na 13.0

식물성 오일 12.0

비타민 1.0

미네랄 1.5

유화제 0.2

우유 단백질 10.3

인산나트륨 1.8

인산칼륨 1.2

향료 0.5

안정제 (카라그히난) 1.5

물 100.0 이 되도록 적량으로 (중량%)

토닉 (스프 타입)

당단백질 0.02

당근 (당근 페이스트) 10.0

중크림 12.0

락토오스 1.8

양파 (양파 추출물) 1.5

우유 단백질 분말 0.5

우유 올리고당 1.5

콘소메 분말 0.5

소맥 배아 0.5

계란껍질 칼슘 0.2

유장 칼슘 0.1

소금 0.2

유화제 0.2

물 100.0 이 되도록 적량으로 (중량%)

제형예 5 (의약)

조성 1: 미립자 1.5 kg 중에

당단백질 15 g

락토오스 1,100 g

옥수수 전분 340 g

PVP (K-30) 45 g

상기 성분들을 습식 조립법으로 과립화한 뒤, 건조하여 통상적인 방식으로 미립자를 형성하였다.

조성 2: 정제

1. 당단백질 15 g

2. 락토오스 400 g

3. 옥수수 전분 150 g

4. 결정성 셀룰로오스 210 g

5. PVP (K300) 25 g

6. 스테아르산마그네슘 10 g

상기 성분 1-5 를 습식 조립법에 의해 과립으로 제형화한 뒤, 스테아르산마그네슘을 첨가하여 정제 제조용 분말을 형성하고, 다음에 상기 분말을 정제로 압축하였다 (200 ㎎/정제).

조성 3: 과립 1.5 kg 중에

당단백질 20 g

락토오스 (200M) 950 g

옥수수 전분 480 g

PVP (K-30) 50 g

상기 성분들을 잘 섞고, 압출 조립법으로 과립화한 뒤, 건조시켜 통상적인 방식으로 과립을 형성하였다.

조성 4: 미립자 1.5 kg 중에

당단백질 15 g

파모티딘 20 g

락토오스 1,100 g

옥수수 전분 320 g

PVP (K-30) 45 g

상기 성분들을 습식 조립법에 의해 과립화한 뒤, 건조시켜 통상적인 방법으로 미립자를 형성하였다.

조성 5: 정제

1. 당단백질 20 g

2. 파모티딘 20 g

3. 락토오스 400 g

4. 옥수수 전분 135 g

5. 결정성 셀룰로오스 200 g

6. PVP (K-300) 25 g

7. 스테아르산마그네슘 10 g

상기 성분 1-6 를 습식 조립법에 의해 과립으로 제형화한 뒤, 스테아르산마그네슘을 첨가하여 정제 제조용 분말을 형성하고, 다음에 상기 분말을 정제로 압축시켰다 (200 ㎎/정제).

조성 6: 과립 1.5 kg 중에

당단백질 20 g

파모티딘 30 g

락토오스 (200M) 950 g

옥수수 전분 450 g

PVP (K-30) 50 g

상기 성분들을 압출 조립법으로 과립화한 뒤, 건조시켜 통상적인 방식으로 과립을 형성하였다.

상기에서 알수있듯이, 본 발명에 따라헬리코박터 필로리정착의 안전하고 효과적인 저해제, 저해제를 함유하는 식품 및 의약품이 제공된다. 본 발명에서, 어드헤신인 우레아제에 특이적으로 결합하는 당단백질이 당단백질 함유 물질로부터단리 정제되고 사용됨으로써, 위 점막에 대한헬리코박터 필로리접착을 소량의 당단백질을 사용하는 경우에도 효과적으로 차단할 수 있다. 따라서, 위 궤양과 같은헬리코박터 필로리에 의해 일어나는 질환을 부작용의 발생 없이 효과적으로 저해할 수 있다. 위 궤양 치료에 사용되어 온 항생제들과는 달리, 본 발명의 당단백질은 약물 내성 박테리아를 만들지 않으면서, 위로부터 특이적으로헬리코박터 필로리를 제거할 수 있다. 본 발명의 당단백질의 원료로서, 저가로 및 대량으로 수득될 수 있는 유즙 및 계란을, 간단한 방식으로 우수한 효과를 나타내는 당단백질을 제조하는 데 사용할 수 있다.

Claims

헬리코박터 필로리 (Helicobacter pylori)우레아제에 대한 특이적 흡착을 이용하는 방법을 사용하여, 당단백질 함유 물질로부터 단리 정제하여 수득되며,헬리코박터 필로리의 우레아제에 특이적으로 결합하는 당단백질.
제 1 항에 있어서,헬리코박터 필로리우레아제에 대한 특이적 흡착을 이용하는 방법이 우레아제가 고정화된 칼럼을 사용하는 친화성 크로마토그래피인 것을 특징으로 하는 당단백질.
제 2 항에 있어서, 칼럼 상에 고정화된헬리코박터 필로리의 우레아제가 재조합 우레아제인 것을 특징으로 하는 당단백질.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 당단백질 함유 물질이 우유의 유장에서 유래된 물질인 것을 특징으로 하는 당단백질.
제 4 항에 있어서, 당단백질 함유 물질이 우유의 유장에서 유래된 고분자량의 유장 단백질 농축물인 것을 특징으로 하는 당단백질.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 당단백질 함유 물질이 계란의 난백에서 유래된 고분자량의 난백 단백질 농축물인 것을 특징으로 하는 당단백질.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 따른 당단백질을 유효 성분으로서 함유하는,헬리코박터 필로리정착 저해제.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 따른 당단백질을 함유하고, 인간을 포함하여 포유류에서,헬리코박터 필로리에 의해 야기되거나 이와 결부된 질환을 예방 및/또는 치료하기 위한 약학적 조성물.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 따른 당단백질을 함유하고, 유효량을 소비하는 경우 인간을 포함하여 포유류에서,헬리코박터 필로리에 의해 야기되거나 이와 결부된 질환을 예방 및/또는 치료하는 식품.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 따른 당단백질 및 위산 분비 저해제를 함유하는헬리코박터 필로리정착의 저해 조성물.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 따른 당단백질 및 위산 분비 저해제를 함유하고, 인간을 포함하여 포유류에서헬리코박터 필로리에 의해 야기되거나 이와 결부된 질환을 예방 또는 치료하기 위한 약학적 조성물.