JPH10505828A

JPH10505828A - ヒトロタウイルス感染の阻害

Info

Publication number: JPH10505828A
Application number: JP8510160A
Authority: JP
Inventors: ミユカージー，プラデイツプ; プリート，ペドロ・アントニオ; セオ，アマンド・ユー−ヤン; バクスター，ジエフリイ・ハリス; カミングス，リチヤード・デイル
Original assignee: アボツト・ラボラトリーズ
Priority date: 1994-09-16
Filing date: 1995-05-05
Publication date: 1998-06-09
Also published as: CA2199707A1; AU711437B2; WO1996008269A1; EP0784479A1; AU2474495A; NZ285593A; MX9701979A

Abstract

(57)【要約】ヒト乳又は牛乳中の濃度より大きく、ヒトロタウイルスによる哺乳動物細胞の感染を阻害するのに十分な濃度で、ウシκ−カゼイン又はヒトκ−カゼインを含む経腸栄養組成物。

Description

【発明の詳細な説明】ヒトロタウイルス感染の阻害発明の背景発明の分野本発明は、ヒトロタウイルス（ＨＲＶ）の哺乳動物細胞への結合を阻害する分泌タンパク質であるカッパ−カゼイン（κ−カゼイン）に関する。従来の技術の説明ロタウイルスは、発展途上国と先進国の両方で、生活している子供での胃腸炎の原因となる最重要のウイルス体である(Yolkenら、“ヒト乳ムチンはロタウイルス複製を阻害し、実験的胃腸炎を予防する”Jounal of Clinical Investigati on 90,1984-1991，1992)。ロタウイルスはまた、ナーシングホーム及びデイケアセンターで、旅行者の間で、子供と接触のある大人で、免疫低下患者で下痢の原因となる。母乳で育てられている乳児を人工栄養で育てられている乳児と比較すると、母乳育児により腸感染に対するある程度の防御が生じる。発展途上国と先進国で生活している子供の研究によると、人工栄養で育てられている乳児よりも母乳で育てられている乳児のほうが胃腸炎に罹った経歴が少ない。母乳育児はまた、腸疾患に関連する下痢及び吐き気のひどさを軽減する。しかし、母乳育児により感染に対する完全な防御は生じないし、ロタウイルス感染は母乳で育てられている乳児でも観察される。母乳育児の防御効果の完全な原因となる唯一の因子は見出されていない。抗体がある役割を持つと考えられているが、ヒト乳中の抗ロタウイルス抗体のレベルは、乳によって与えられる防御の程度に関連しない。このことは、非免疫グロブリン因子が母乳の防御効果の原因であることを示唆し、これらの因子を同定するために、研究を行った。 Yolkenらは、ロタウイルスの複製を阻害する非免疫グロブリン天然物質である乳ムチンを報告している。ムチンはシアル酸含有糖タンパク質である。この報告で、Yolkenらは、ヒト乳中に見出されるムチンとムチンの成分は抗ロタウイルス活性を示すことを証明している。固相結合アッセイで精製された乳ムチン成分を使用して、Yolkenらは、ロタウイルスのヒト株及びサル株に感染したアフリカミドリザル腎細胞（ＭＡ−１０４）へのムチンの結合を初めて示した。彼らは次に、組織培養技術を使用して、ヒト乳のある分画、即ち次にヒト乳ムチン複合体と同定される分画がロタウイルスの複製を阻害することを示した。この分画は、ロタウイルスに感染した細胞に特異的に結合することを示すことにより、上記のことは更に証明された。活性分画を化学的加水分解により脱シアル酸化すると、ロタウイルス感染細胞への結合にかなりの減少があった。このことは、本明細書で報告する抗ウイルスシステムで、シアル酸は抗ロタウイルス活性に必要であることを示す。乳の脂肪分画にロタウイルス阻害活性の証拠をYolkenらは見出さなかった。乳飲マウスでの実験的ロタウイルス胃腸炎の予防におけるムチン含有乳成分の効力をもYolkenらは証明する。国際公開94/09651(Newburgら、“抗下痢製品及びロタウイルス関連感染の治療法”)は、ロタウイルスに結合できる乳ムチン複合体及びその成分などの抗下痢剤を含有する製品及び哺乳動物細胞を上記薬剤に接触させることにより上記細胞へのロタウイルス感染を阻害する方法を開示する。米国特許第5,147,853号（Dosakoら、“感染防御物質”）は、大腸菌のヒト上皮細胞への吸着を、該細胞を牛乳由来のシアル酸結合タンパク質であるκ−カゼインで処理することで防止する方法を開示する。リスクのある群、特に乳児及び子供におけるロタウイルス感染の流行とその影響の重大さは、効果的治療の必要性を示す。有害な副作用を持たないロタウイルス感染の予防法及び治療法を開発することは特に重要である。本発明の概要本発明において、ヒト乳又は牛乳から精製することができ、又はｃＤＮＡを使用する組換え形式で製造することができる分泌タンパク質であるκ−カゼインが、ヒトロタウイルスの哺乳動物細胞への結合を阻害することを開示する。アッセイにおいて、上記細胞がヒト又はウシκ−カゼインで処理されると、ヒトロタウイルスの結合が６０−７０％阻害された。有害な副作用がないと考えられている乳産物であるκ−カゼインを使用してロタウイルス感染の予防及び治療ができる。図面の簡単な説明図１は、放射性ヨウ素標識ヒトロタウイルスの調製法を示す。図２は、ヒト及びウシκ−カゼインによるＭＡ−１０４細胞へのヒトロタウイルスの結合の阻害の程度を示す図である。図３は、ヒトκ−カゼインによるＭＡ−１０４細胞へのヒトロタウイルスの用量依存的阻害を示す。図４は、ヒトκ−カゼインが、ノイラミニダーゼ又はフコシダーゼ又は両者による処理後、ＭＡ−１０４細胞へのヒトロタウイルスの結合の阻害の能力を保持していたことを示す。図５は、ウシκ−カゼインが、ノイラミニダーゼによる処理後、ＭＡ−１０４細胞へのヒトロタウイルスの結合の阻害の能力を保持していたことを示す。図６は、ＭＡ−１０４細胞へのヒトロタウイルスの結合の阻の効果を示す。図７は、ウシκ−カゼインのＭＡ−１０４細胞の感染を阻害する能力によって測定されたヒトロタウイルスの用量依存的中和を示す。図８は、ヒトκ−カゼインのＤＮＡ配列とアミノ酸配列を示す。図９は、ヒトκ−カゼインの生物活性を有するアミノ酸配列を示す。発明の詳細な説明本発明は、哺乳動物、特にヒトにおけるロタウイルスが原因の腸感染を予防及び治療する方法の改良に関する研究から得られる。本発明は、ヒトロタウイルス（ＨＲＶ）のサル細胞への結合を阻害し、それにより該ウイルスが該細胞に侵入し、感染を起こすことを防止することにおけるκ−カゼインの効力を証明する。本発明の薬剤、即ちκ−カゼインは、乳児と子供の治療に特に有用である。何故ならば、κ−カゼインはヒト乳の正常の構成物であり、牛乳としてヒトの食餌に存在しているからである。従って、κ−カゼインは治療患者に毒性反応又はアレルギー反応の原因となることはありそうにない。ウシκ−カゼインは牛乳に濃度約３．３ｇ／Ｌで存在している。ウシκ−カゼインを食餌に加え、ロタウイルス感染のリスクのある大人と子供の両者に対し、もしあるとしてもほとんど免疫反応のリスクがなく、利用することができる。本出願で、ヒトロタウイルスが原因の哺乳動物細胞の感染の発病の予防もしくは阻止の方法又は該感染の治療方法であって、天然型又は組換え型の未加水分解ヒトカッパ−カゼイン及び天然型又は組換え型の未加水分解ウシカッパ−カゼインからなる群から選択される薬剤の有効量と該細胞を接触させることを含む方法を開示する。哺乳動物細胞のヒトロタウイルス感染の発病の予防もしくは阻止の方法又は該感染の治療方法であって、ヒト乳又は牛乳での濃度を超える濃度で天然型又は組換え型の未加水分解ヒトカッパ−カゼイン及び天然型又は組換え型の未加水分解ウシカッパ−カゼインからなる群から選択される薬剤の抗ロタウイルス感染の有効量を含む経腸(enteral) 栄養組成物を哺乳動物に投与することを含む方法をも開示する。特定の実施例で、κ−カゼインの製造法並びにヒト及びウシκ−カゼインによるＨＲＶ−結合能力の阻害を測定するのに使用される２つのアッセイを記載する。実施例は例示の目的のためにのみ記載するのであって、制限的であるつもりはない。実施例１：ヒト乳カッパ−カゼインの製造凍結ヒト乳約０．５Ｌを融解し、１５，０００×ｇ、４℃で１時間遠心し、最上層である脂肪パッドを除去した。上清及びペレットをホモゲナイズし、得られた物質のｐＨを、塩酸を添加して４．３に調整した。塩化カルシウムを最終濃度６０ｍＭ加えた。混合物を室温で１時間撹拌し、それから沈殿したカゼインを、１８，０００×ｇ、４℃で９０分間遠心して回収した。その後、カゼインペレットを、６Ｍ尿素及び２０ｍＭエタノールアミン、ｐＨ９．５、約９０ｍＬに溶解し、ヘキサン４倍量で３回抽出し、更に脂肪含量を減少させた。１２，０００分子量カット−オフ膜を使用して、水４Ｌに対し、水相を３回透析した。この粗カゼイン（収率は約２−３ｇ／Ｌであった）を、６Ｍ尿素、２０ｍＭｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−ｎ′−２−エタンスルホン酸(ＨＥＰＥＳ)(sigma Che mical Co.,St.Louis,Mo)、０．５％（ｖ／ｖ）２−メルカプトエタノール（２− ＭＥ）、ｐＨ７．５に溶解し、４℃で１時間撹拌した。ラム（Bio-Rad，Hercules，CA）のクロマトグラフィーにかけ、０．１％（ｖ／ｖ）の２−ＭＥを使用したこと以外は同一の緩衝液で平衡化した。洗浄緩衝液は６Ｍ尿素、２０ｍＭＨＥＰＥＳ、０．１％（ｖ／ｖ）２−ＭＥ、ｐＨ７．５であった。溶出液を波長２８０ＭＭでモニターした。結合物質の溶出を、０−０．３Ｍ塩化ナトリウムのリニアグラジエント、１００分間、流速２ｍＬ／分で行った。７ｍＬずつの分画を集め、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で標準品として使用した、ＳＹＭＢＩＣＯＭＡＢ、スウェーデンから得たヒトκ−カゼインと比較するか、イムノブロット解析で、κ−カゼインを検出した。その後、κ−カゼインを含む分画をプールし、前述のように水４Ｌに対し、３回透析し、凍結乾燥した。この物質を、６Ｍ尿素、２０ｍＭＨＥＰＥＳ、０．５％（ｖ／ｖ）２−ＭＥ、ｐＨ７．０に、濃度約１０ｍｇ／ｍＬ、４℃で溶解し、同一のカラムにかけた。カラムを、６Ｍ尿素、２０ｍＭＨＥＰＥＳ、０．１％（ｖ／ｖ）２−ＭＥ、ｐＨ７．０で洗浄し、それから０−０．６Ｍ塩化ナトリウムのリニアグラジエント、１４０分間、流速２ｍｌ／分で溶出した。２８０ＭＭで主要ピークを含む分画をプールし、前述のように透析し、それから凍結乾燥した。得られた物質は９０％を超える純度を有するものと評価した。実施例２：ウシκ−カゼイン源ウシκ−カゼインをＳｉｇｍａ（カタログ＃ＣＯ４０６）から購入したが、それは８０％を超える純度を有した。実施例３：ヒトロタウイルスの細胞結合阻害アッセイの方法アフリカミドリザル腎細胞であるＭＡ−１０４（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，ＭＤ）を２４ウエル組織培養プレートで１００％集密度まで生育させた。ＭＡ−１０４細胞の使用は、Kitamotoら、 “分化細胞における異なるロタウイルス株の生育の比較”、Virology184:729-73 7(1991)に記載されている。Kitamotoらによって報告された実験によると、ＭＡ−１０４細胞でＷａ株を含むヒトロタウイルスは生育し、抗原を生産する。該細胞を２回Ｈａｎｋｓ培地（Ｓｉｇｍａ）で洗浄し、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中の１％パラホルムアルデヒドで、室温で１５分間固定化した。この後、トリス緩衝化生理食塩水（ＴＢＳ）で３回洗浄した。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）５ｍｇ／ｍｌを含むＴＢｓ中の阻害の可能性のある阻害剤の溶液をウエルに加え、それから¹²⁵Ｉ−標識ヒトロタウイルス（ＨＲＶ）懸濁液を添加した。放射性標識ウイルスを図１に記載した通りに調製した。プレートを３７℃で９０分間インキュベートし、３回ＴＢＳで洗浄した。それから、細胞を、０．２％水酸化ナトリウムと２％ＳＤＳ溶液で溶解した。溶解液の１分当りのカウント（ｃｐｍ）を、シンチレーションカウンターで測定し、細胞結合ＨＲＶを指示するものとして使用した。実施例４：ヒト及びウシカッパ−カゼインによる、ヒトロタウイルス株ＷａのＭＡ−１０４細胞への結合の阻害の測定図２に示す実験で、５個の薬剤の阻害ポテンシャルを、濃度１ｍｇ／ｍｌで試験した。ヒトκ−カゼインは、ＨＲＶ株ＷａのＭＡ−１０４細胞への結合を７０％を越えて阻害し、ウシκ −カゼイン（Ｓｉｇｍａ）は、６０％を越えて結合を阻害した。このとき、ＨＲＶと接触後、阻害の可能性のある阻害剤を添加しない対照細胞と比較した。ウシベータ−カゼイン（Ｓｉｇｍａ）とヒトベータ−カゼイン（ＳｙｍｂｉｃｏｍＡＢ，スエーデン）の、ＨＰＶＷａの結合を阻害する能力はずっと少なかった。ウシベータ−カゼインは４５％阻害、ヒトベータ−カゼインは２５％阻害を示した。ウシ下顎ムチン（Ｓｉｇｍａ）を同じ実験で試験し、それは５０％阻害を示したが、更なる実験によると、この阻害は用量依存的でなく、それ故特異的でなかった。このことを、図３に示す。対照的に、ヒトκ−カゼインは同じ実験で用量依存的であることが示された。実施例５：ヒト又はウシカッパ−カゼインによるヒトロタウイルス感染の阻害− シアル酸の作用実施例３に記載した方法を使用した別の実験で、ヒトＫ−カゼイン分子のグリカン鎖からシアル酸を除去するために、ヒトκ−カゼインをノイラミニダーゼで処理した。図４に示すように、脱シアル酸化ヒトκ−カゼインは、ロタウイルス阻害アッセイにおいて完全なヒトκ−カゼインと同様の効果を示した。このことは、この実験においてシアル酸残基はヒトκ−カゼインの阻害効果に必要でないことを示す。その後、完全及び脱シアル酸化ヒトκ− カゼインをフコシダーゼで処理した。両方で処理されたヒトκ−カゼインは阻害活性を保持したが、そのことは図４に示す。このことは、このアッセイの条件下、ヒトκ−カゼインのフコース残基はＨＲＶに対する阻害活性に必要ないことを示す。ウシκ−カゼインをノイラミニダーゼで処理し、シアル酸を除去すると、得られた脱シアル酸化ウシκ−カゼインは、図５に示すように、このアッセイで高度の活性を有した。ウシκ−カゼインのシアル酸残基もＨＲＶに対する活性に必要でないことが結論された。実施例６：ウシカッパ−カゼインによるヒトロタウイルス感染の阻害−加水分解の影響 La Jolla,CA)により、１６時間３７℃で、０．１Ｍトリス緩衝液ｐＨ８．０中で、ウシκ−カゼインを消化した。図６は、加水分解された該タンパク質のＨＲＶに対する用量依存的活性はこのアッセイで有意であったことを示す。この実験での添加量を、ウシκ−カゼインのグリカン鎖に存在するヘキソースのモル量で決定した。天然のウシκ−カゼインより加水分解されたウシκ−カゼインの７−８倍が、阻害の同じ程度を達成するのに必要であるが、ＨＲＶに対する阻害活性が、このアッセイの条件下加水分解された該タンパク質に保持されていた。実施例７：ヒトロタウイルス感染の阻害−第２のアッセイ法−ＭＡ−１０４細胞とヒトロタウイルスのＷａ株別のセットの実験を行い、ＨＲＶの細胞への感染を阻害するウシκ−カゼインの能力を測定した。使用したアッセイ法は以下の通りである。アフリカミドリザル腎細胞であるＭＡ−１０４のロタウイルスアッセイでの使用は、Kitamotoら、“分化細胞における異なるロタウイルス株の生育の比較”、 Virology184:729-737(1991)に記載されているが、そのＭＡ−１０４を BioWhitt aker,Inc.(Walkersville，MD)から得た。Kitamotoらにより報告された実験によると、Ｗａ株を含むヒトロタウイルスは、ＭＡ−１０４細胞で生育し、抗原を生産する。１０％熱不活化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）(Hyclone Laboratories，Logan ，UT)及び２ｍＭＬ−グルタミン（BioWhittaker）を補充したイーグル基礎培地（ＢＭＥ）（BioWhittaker）で、該細胞を培養した。細胞を剥がすためにトリプシン−ＥＤＴＡ（０．２５％トリプシン、１ｍＭＥＤＴＡ）（BioWhittaker）を使用して、細胞をルーチンに７５ｃｍ²フラスコで継代培養した。アッセイプレートをフィブロネクチン（Ｓｉｇｍａ）１μｇ／ウエルで処理し、培養支持体への細胞の吸着を助け、次にウイルス中和アッセイの洗浄段階で細胞を吸着させた。フィブロネクチンを蒸留水に溶解し、各ウエルに分配し、室温で１−３時間インキュベートし、フィブロネクチンをプラスチックウエルに結合させた。残りのフィブロネクチンを吸引し、アッセイプレートのウエルに細胞を分配した。生育培地を含むウエル当り密度10,000細胞で９６ウエルプレートに接種した細胞を、５％ＣＯ₂インキュベーター中で３７℃で３−４日維持し、ウイルス中和試験用の細胞の密集単層を得た。ヒトロタウイルスの血清型１のＷａ株をDr．Linda J.Saif(Ohio Agricultural Research and Development center，最初は Dr．R．Wyatt（National Institut es of Allergy and Infectious Diseases）から得られた）から得た。この研究で使用したウイルスストックは５代継代収集物であった。これらのアッセイで使用する前に、ＨＲＶを、１ｍｌＨＲＶ当り１０ＩＵ／ｍｌトリプシンで活性化し、３６℃で３０分間インキュベートした。２ｍＭグルタミン、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン硫酸塩(BioWhittaker)、１％ペニシリン−ストレプトマイシン溶液(Sigma)を補充したＢＭＥ培地で、ウイルスを希釈し、所望の最終ウイルス濃度の２倍である１：２５０希釈を行った。実施例８：ヒトロタウイルス感染の阻害−第２のアッセイ法−ウイルス中和等量の試験薬剤とトリプシン活性化ＨＲＶを混合し、室温で１時間プレインキュベーションを行い、試験薬剤をウイルスに結合させる。ＨＲＶ＋試験薬剤プレインキュベーションの間、ＭＡ−１０４細胞を含むプレートを１５μｌ希釈培地で３回洗浄し（１５０μｌ／ウエル／洗浄）、その後希釈培地を更に５０μｌ各ウエルに加えた。ＨＲＶ＋試験薬剤のプレインキュベーション時間が終わるまで、ＭＡ−１０４プレートを５％ＣＯ₂中、３７℃でインキュベートした。対照サンプル又はＨＲＶ＋試験薬剤のサンプル１００μｌを適切なウエルにピペットで入れ、希釈培地５０μｌと混合した。プレートを更に１２−１４時間３７℃でインキュベートし、ウイルスを細胞内に侵入させた。より長いインキュベーション時間の結果、子孫ウイルスのＭＡ−１０４細胞への感染が起こりうるが、それは望ましくない。３つのタイプの対照ウエルが各アッセイに含まれた。即ち、（１）ＭＡ−１０４細胞、ＨＲＶを含むが、試験薬剤を含まないウエル、（２）ＭＡ−１０４細胞、ＨＲＶ、及び公知のＨＲＶ阻害剤であるＨＲＶ抗体を含むウエル、及び（３）ＭＡ −１０４細胞を含むが、ウイルスを含まないウエル。試験薬剤又は抗体の各濃度で３重の試験を行った。インキュベーション時間後、アッセイプレートをダルベッコリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）(BioWhittaker)で２度洗浄し、冷７０％エタノール１５０μｌを各ウエルに加え、９５μｌを除去し、空気が細胞単層を乾燥させないようにした。冷無水エタノール（１９０μｌ）を７０％アルコール層に加え、プレートをゆすり、一晩冷蔵した。それから、アルコールを除去し、０．０５％ニワトリ卵アルブミンを含むＰＢＳ１５０μｌ（ＰＢＳ−ＣＥＡ）（Ｓｉｇｍａ）を各プレートに加え、非特異的結合部位をブロックした。プレートを染色するために、ＰＢＳ−ＣＥＡを除去し、抗ロタウイルスＩｇＧを各ウエルに希釈１：２５００で加えた。プレートを室温で３０分間インキュベートした。プレートをＰＢＳ−ＣＥＡで３回洗浄し、抗ウシＩｇＧ(Cappel Organon Teknika，Durham，NC) に結合したペルオキシダーゼ２００μｌを各ウエルに希釈１：２０００で加えた。プレートにカバーをし、室温で３０分間インキュベートした。それから、プレートを３回ＰＢＳ−ＣＥＡで洗浄し、ジアミノベンジジン(Sigma)基質１００μ ｌを各ウエルに加えた。プレートを室温で２０分間インキュベートし、ＰＢＳ− ＣＥＡで２回洗浄し、その後蒸留水で洗浄した。実施例９：ウシカッパ−カゼインによるヒトロタウイルス感染の阻害−第２のアッセイ法−感染細胞のカウント実施例７及び８の方法により調製されたプレートを、ウエル当り蒸留水１５０ −２００μｌを添加して、再水和させ、顕微鏡観察をした。プレートを１００％倍率で光学顕微鏡観察した。黒く染色され、特徴的な茶色で顆粒状の細胞質領域を含む細胞を、ウイルス感染細胞としてカウントした。各ウエルの感染細胞の代表的なカウントは、各ウエルの表面の約２０％に当たる統一された区域内の全ての染色細胞をカウントして得た。ウイルスを加えなかった対照ウエルを観察し、感染細胞のないことを確認した。試験薬剤＋ＨＲＶで処理した集団の感染細胞の平均数を、ウイルスだけと接触させた集団の感染細胞の平均数と比較して得られた％阻害として、結果を報告した。結果を図７に示す。試験薬剤であるウシκ−カゼインはヒトロタウイルスを用量依存的に中和した。ウシκ−カゼインの濃度を増加させると、濃度１．６ｍｇ／ｍｌまで感染のレベルを対応して減少させたが、濃度１．６ｍｇ／ｍｌでは、感染は細胞のほとんど９０％で阻害され、１０％だけが感染した。実施例１０：ウシカッパ−カゼインによるヒトロタウイルス感染の阻害−第２のアッセイ法−加水分解の影響（Calbiochem）で、４時間又は２０時間、及び表１と２に示してある濃度において消化したが、表１と２は異なる日の実験ランを示す。プレートを、実施例８の方法により３７℃でインキュベートし、実施例９の方法でプレートの染色、カウントを行った。表１と２に示される異なる日に行った実験の結果によると、プロテアーゼによるウシκ−カゼインの加水分解は、ＨＲＶのＭＡ−１０４細胞への感染の阻害を除去した。未消化のウシκ−カゼインは、Ｗａ細胞へのウイルス結合を８６〜９３％阻害した。加水分解されたウシκ−カゼインは、このアッセイで全く阻害しないか、又はほんのわずか阻害した。プロナーゼ場合、用量に無関係に種々の阻害の程度を示した。を変性させ、その活性を無くした。それ故、観察されたＨＲＶ作用に帰すことができる。実施例６に記載のアッセイでは、プのアッセイの結果は、加水分解は阻害を完全になくしてはしまわないことを示した。その場合には、プロテアーゼは完全には不活化されす、観察された阻害は、加水分解されたウシκ−カある。実施例１１：カッパ−カゼインの有用性と投与ヒトκ−カゼインは、ヒト乳から抽出できるか、又は組換えＤＮＡ法及び原核細胞もしくは真核細胞でのクローニングにより、又は HanssonらのＤＮＡ配列と発現系を使用するトランスジェニック哺乳動物から得られる。ウシκ−カゼインは牛乳から抽出することができるが、牛乳では濃度約３．３ｇ／Ｌで存在する。ヒト乳タンパク質κ−カゼインをコードするＤＮＡ配列は、ＰＣＴ国際公開ＷＯ 93/15196（Hanssonら、“カッパ−カゼインをコードするＤＮＡ、該タンパク質を得る方法、及びその使用”）に開示されているが、ヒトκ−カゼインの生物活性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の発現系を構築する方法を教示する目的のために、該国際公開は引用により本明細書に含まれるものとする。ＤＮＡ配列は図８に示され（配列番号１）、該ＤＮＡ配列がコードするポリペプチドのアミノ酸配列は図９に示される（配列番号２）。コードされたポリペプチドは、ヒトκ−カゼインの抗微生物活性又はオピオイド活性を有することが決定された。示されたＤＮＡ配列を使用して、原核系又は真核系を使用して組換えヒトκ−カゼインを生産できるし、又はトランスジェニック非ヒト哺乳動物を作製できる。組換えヒトκ−カゼインを乳児用調合乳の構成物として使用して、その調合乳の栄養価値及び生物的価値を改善できるし、又は本発明の場合のように、ヒトロタウイルスによる腸感染に対する防御を与えることができる。 Hanssonらによって開示されたＤＮＡ配列は、ヒト乳腺ｃＤＮＡライブラリーから単離されたｃＤＮＡクローンから決定された。発現系の構築とその分子生物学的キャラクタリゼーションには標準的組換えＤＮＡ法を使用した。使用した方法は以下の通りであった。大腸菌Ｙ１０９０細菌を、カルベニシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ(Luria-Bertoni)プレート上で生育させた。一つのコロニーを単離し、０．２％マルトース及び１０ｍＭＭｇＳＯ₄を含むＬＢで一晩生育させた。それから、培養液０．４ｍｌを希釈したライブラリーファージと混合し、３７℃で１５分間吸着させた。感染した培養液を軟寒天（ＬＢ中０．７５％アガロース及び１０ｍＭＭｇＳＯ₄）７ｍｌと混合した。軟寒天混合液を１５０ｍｍＬＢプレートに注いだ。プレートを４２℃で約３．５時間インキュベートすると、プラークが目で見えた。その後、各プレートに、予め１０ｍＭＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド）で飽和を重層し、３７℃で一晩インキュベートした。膜上の位置に印を付け、膜を取除いた。膜をＴＴＢＳ（０．０５％ツイーン２０を含むトリス緩衝化生理食塩水（ＴＢＳ））中で洗浄し、２０％ＦＣＳとウサギで作製し、精製し、１：２５に希釈したκ−カゼイン抗血清を含むＴＴＢＳ中で、室温で２時間インキュベートした。膜を、室温でＴＴＢＳ中５分間２回洗浄した。ＴＢＳ（５０ｍＭトリス−塩酸ｐＨ７．９，１５０ｍＭＮａＣｌ）中のビオチニル化ヤギ−抗ウサギＴｇＧを加え、膜を室温で１時間インキュベートした。膜を再度室温で５分間、２回ＴＴＢＳで洗浄した。ＴＴＢＳ中のストレプトアビジンとビオチニル化アルカリ性ホスファターゼの結合物を加え、室温で１時間インキュベートした。その後、膜を４回ＴＴＢＳ中、５分間洗浄し、５０ｍＭトリス−塩酸ｐＨ９．８、３ｍＭＭｇＣｌ₂、５０μｇ／ｍｌＸＰ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイルホスフェート）、１００μｇ／ｍｌＮＢＴ（ニトロブルーテトラゾリウムグレードIII）を含む緩衝液で３回濯いだ。約１００個の陽性プラークを同定した。単離されたプラークを、希釈及びスクリーニングの繰返しによって精製した。ファージＤＮＡを調製し、そのＤＮＡ調製物をＥｃｏＲＩで消化した。消化されたＤＮＡをアガロース電気泳動で分離し、多数のＥｃｏＲＩフラグメントを、ＥｃｏＲＩ消化・アルカリ性ホスファターゼ処理ｐＵＣ１８プラスミドにクローン化し、次に大腸菌ＴＧ２を形質転換した。形質転換体を、カルベニシリン５０μ ｇ／ｍｌ、Ｘ−ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイル−β−Ｄ−ガラクトシド）４０μｇ／ｍｌ、１ｍＭＩＰＴＣ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド）を含むプレートで選択した。多数の形質転換体からのプラスミドＤＮＡを分析した。ヒトκ−カゼインをコードする完全長のｃＤＮＡフラグメントを含むプラスミドを有する形質転換体をｐＳ２７０と命名した。プラスミドｐＳ７０ＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼ分析した。κ−カゼインをコードする領域の両鎖の完全ヌクレオチド配列を、販売元により記載された通り、二本鎖鋳型上でＴ７配列決定キット(Pharmacia,Uppsala，スエーデン）を使用して決定した。ｐＵＣ１８又はκ−カゼイン配列に相補的な特異的オリゴヌクレオチドを、配列決定反応のプライマーとして使用した。ヌクレオチド配列は、１６２アミノ酸とシグナルペプチド２０アミノ酸からなるκ−カゼイン前駆体タンパク質の完全アミノ酸配列をコードするのに十分な読取り枠を含んでいた。ｐＳ２７０と命名したプラスミドＤＮＡを、Deutsche Sammlung von Mikro organismen und Zellkulturen GmbH，Mascheroder Weg １b，D.3300 Brauns chweig，独のコレクションに寄託したが、該プラスミドＤＮＡは受託番号＃ＤＳＭ６８７８として同定される。精製されたヒトもしくはウシκ−カゼイン又はそれらの誘導体を、経口粘膜投与単位形態で、又は栄養チューブにより、例えば鼻経由空脳で、もしくは空腸内に投与できる。経口使用の場合、κ−カゼインは、組成物の２−５０重量％であるべきである。医薬製剤の場合、κ−カゼインは、乳糖、ソルビトール、澱粉又はゼラチンなどの固体粉状担体と混合し、錠剤剤型に圧縮すべきである。多数回 −単位投与剤型も製造できる。胃腸管での溶解速度を変えるポリマーなどの物質で、錠剤及び顆粒をコートできる。コーティングの例には、約５．５のｐＫａを有するアニオン性ポリマーがある。ヒト又はウシκ−カゼインの液体製剤を、活性化合物０．２重量％とグリセロールとして製造できる。活性化合物の１日の投与量は投与経路で変わる。分泌乳タンパク質であるκ−カゼインの抗ウイルス活性という本明細書で開示した発見により、乳児用調合乳として、リスクのある全ての群のロタウイルス感染の予防及び治療に有用な医薬物質として、抗生物質治療を受けている患者の栄養補給として、及び他の生物活性の経腸栄養製品での成分として、該薬剤の使用が容易になる。上記の例は示唆的であり、κ−カゼインの可能性ある使用を制限するものとして理解すべきでない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＪＰ，ＭＸ，ＮＺ (72)発明者セオ，アマンド・ユー−ヤンアメリカ合衆国、オハイオ・43230、ガハナ、シルバー・ロツド・レイン・4157 (72)発明者バクスター，ジエフリイ・ハリスアメリカ合衆国、オハイオ・43021、ゲリーナ、ビツグ・ウオルナツト・ロード・ 6515 (72)発明者カミングス，リチヤード・デイルアメリカ合衆国、オクラホマ・73003、エドモンド、サンタ・フエ・アベニユー・ 5215

Claims

【特許請求の範囲】１．ヒト乳又は牛乳での濃度を超える濃度で、天然型又は組換え型の未加水分解ヒトカッパ−カゼイン及び天然型又は組換え型の未加水分解ウシカッパ−カゼインからなる群から選択される薬剤の抗ロタウイルス感染の有効量を含む経腸栄養組成物。２．経腸栄養組成物が乳児用調合乳である請求項１に記載の組成物。３．ヒトロタウイルスが原因の胃腸管の感染の治療処置又は予防処置用の、天然型又は組換え型の未加水分解ヒトカッパ−カゼイン及び天然型又は組換え型の未加水分解ウシカッパ−カゼインからなる群から選択される薬剤の治療上有効量を含む医薬組成物。４．ヒトロタウイルスが原因の哺乳動物細胞の感染の発病の予防もしくは阻止の方法又は該感染の治療方法であって、天然型又は組換え型の未加水分解ヒトカッパ−カゼイン及び天然型又は組換え型の未加水分解ウシカッパ−カゼインからなる群から選択される薬剤の有効量と該細胞を接触させることを含む方法。５．小児の胃腸炎の発病の予防もしくは阻止の方法又は該疾患の治療方法であって、請求項４に記載の方法で、上記疾患のリスクのある又は上記疾患に罹患している乳児又は子供を治療することを含む方法。６．患者が免疫不全患者である、請求項４に記載の方法。