JP4208799B2 - 炎症性サイトカイン産生抑制剤 - Google Patents
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Description
さらに、鉄吸収調節作用、抗菌作用、抗炎症作用、抗酸化作用、免疫賦活作用等の多様な生体機能の維持調節を行なっていることが報告されており、生体防御の重要な役割を果たす因子として注目されている。ラクトフェリンの生理活性物質としての認識が高まると共に、食品、飼料、医薬品等への応用も実現化されつつある。
しかしながら、ラクトフェリンはもちろんのこと、一般に牛乳・乳製品を摂取する場合、乳児が摂取する場合と成人が摂取する場合において、消化管の発達の程度が異なることは、その効果を評価する際に念頭に置いておかなければならない。例えば、乳児と成人では胃酸や消化酵素の分泌量、小腸における吸収能力等に大きな差がある。
発達した消化管においてラクトフェリンが消化酵素による分解を受けることにより、様々な問題を生ずることが指摘されている(例えば、特許文献1参照)。
特に、経口摂取されたラクトフェリンが小腸から取り込まれた後、吸収されて血中やリンパ中に運ばれ、生体内で生理活性作用がより効果的に発揮できるようになるには、経口摂取されたラクトフェリンが消化酵素の影響を受けても活性が低下することなく小腸に確実に運ばれなければならない。
炎症性サイトカインとはリンパ球やマクロファージなどから産生され、細菌やウイルス感染、腫瘍、組織損傷に伴う炎症反応に関与する物質である。例えばインターロイキン−1(IL−1)、インターロイキン−6(IL−6)、腫瘍壊死因子(TNF−α)、GM−CSF等がある。これらのサイトカインは生体内で肝臓に働き、急性期タンパク質の合成と分泌を誘導したり、好中球の内皮細胞への接着を亢進させるほか、インターロイキン−8(IL−8)、MCP−1などのケモカインを誘導することによって炎症部位に好中球、単球、あるいはリンパ球を遊走させ、炎症を惹起する作用がある(例えば、非特許文献4参照)。
炎症性サイトカイン産生抑制作用をより効果的に生体内で発揮できる方法を導き
出し、かつ連続摂取可能で、摂取に伴う副作用がほとんどない炎症性サイトカイ
ン産生抑制用医薬組成物を提供することを課題とする。
経口的に摂取されたラクトフェリンは胃内でペプシン消化を受け易く、ラクトフェリシンという塩基性の強いペプチド断片が生成し、抗菌作用などの生物活性を示すことが知られている。その一方で、経口摂取されたラクトフェリンの多くはそのままでは消化を受けるため、本来の機能を発揮し得ない可能性がある。本発明者らは、鉄−ラクトフェリンとすることで消化酵素による分解が限定的となり、ラクトフェリン分子が小腸のレセプターまで達し、吸収され、活性を失うことなく炎症性サイトカイン産生抑制作用を発揮することを見出した。
ラクトフェリンとLPSの非共存下で炎症性サイトカイン産生を抑制する評価系において、鉄−ラクトフェリンが消化酵素による分解を受けることにより、炎症性サイトカイン産生抑制作用が飛躍的に高まることを本発明者らは見出した。
このことは、鉄−ラクトフェリンを経口的に摂取した場合に、消化管内で消化酵素による分解を受けることでその分解物がより強い炎症性サイトカイン産生抑制作用を発揮することを示唆している。そこで、本発明者らは、動物実験を行って鉄−ラクトフェリンを経口摂取した場合に炎症性サイトカイン産生抑制効果があることを確認した。
したがって、鉄-ラクトフェリンを経口摂取することにより、炎症の予防から治療まで幅広く効果を発揮することができる。
用医薬組成物である。
また、本発明は鉄−ラクトフェリンが、ラクトフェリン1分子当たり、少なくとも3原子の鉄を保持した鉄−ラクトフェリンである炎症性サイトカイン産生抑制用医薬組成物である。
さらに、本発明は、鉄−ラクトフェリンが、ラクトフェリンに、炭酸及び/又は重炭酸と鉄とが結合した鉄−ラクトフェリン結合体及び/又は鉄−ラクトフェリン複合体である炎症性サイトカイン産生抑制用医薬組成物である。
また本発明の炎症性サイトカイン産生抑制用飲食品は、鉄−ラクトフェリンを牛乳、乳飲料、発酵乳、ジュース、ゼリー、ビスケット、パン、飴、麺類、ソーセージ等の飲食品、さらには、各種粉乳の他、乳幼児食品、栄養組成物等に配合する。
これらの剤及び飲食品は、炎症性サイトカインの産生抑制能を有するので、炎症性サイトカインの過剰産生により引き起こされるさまざまな病態の予防、治療、改善、再発防止に非常に有益となりうる。
陽イオン交換樹脂のスルホン化キトパール(富士紡績社製)400gを充填したカラム(直径5cm×高さ30cm)を脱イオン水で十分洗浄した後、このカラムに未殺菌脱脂乳40L(pH6.7)を流速25ml/minで通液した。通液後、このカラムを脱イオン水で十分洗浄し、続いて0.7M塩化ナトリウムを含む0.02M炭酸緩衝液(pH7.0)で洗浄した後、0.98M塩化ナトリウムを含む0.02M炭酸緩衝液(pH7.0)で樹脂に吸着した画分を溶出した。そして、この溶出液を逆浸透(RO)膜により脱塩して、濃縮した後、凍結乾燥してラクトフェリン粉末11gを得た。なおこのラクトフェリン粉末には、ラクトフェリンが93重量%含まれていた。
このようにして得られたラクトフェリン10μmolと重炭酸ナトリウム1.2molとを含む溶液1LをA液として作製した。硫酸第二鉄を鉄イオンとして1.5mmol含む溶液1LをB液として作製した。A液にB液を加えた後、分子量5,000カットの限外ろ過膜にて脱塩、濃縮し、模擬緩衝液(pH8.9)にて鉄濃度が94mg/100mlになるように希釈して、鉄−ラクトフェリンを得た。
このようにして得られた鉄−ラクトフェリンは、溶液100ml当たりラクトフェリンを0.9g及び鉄を94mg含有しており、そのまま本発明の炎症性サイトカイン抑制剤として利用可能である。
実施例1で得られた鉄−ラクトフェリン及びラクトフェリンを0.2Mグリシン−塩酸緩衝液でpH4.0に調整し、ラクトフェリンのタンパク質1gあたりペプシン(ペプシンA、Porcine stomach mucosa由来、4,500 units/mg、SIGMA社)20mgを添加し、37℃で2時間反応させた。その後、水酸化ナトリウムでpH7.5に中和し、トリプシン(タイプI、Bovine pancreas由来、11,000 units/mg、SIGMA
社)20mgを添加し、37℃で3時間反応させた。これらの人工消化物の分解パターンは10−25%グラジエントゲル(TEFCO社)を用いた、ポリアクリルアミド電気泳動を行い、CBB染色にて確認した。なお、ここでいう人工消化とは、消化酵素のペプシン、トリプシンにより加水分解を行うことである。
対照として、実施例1で得られた鉄−ラクトフェリン及びラクトフェリンに、上記の酵素を添加しない以外は同様の処理を行い、未消化物の分解パターンを得た。この分解パターンを図1に示す。
図1にみられるように、ラクトフェリンの未消化物では、分子量8万の位置にインタクトな分子が確認できる。そして鉄−ラクトフェリンの未消化物も分子量が変わることなく同位置に同様に確認できる。一方、人工消化物に関しては、ラクトフェリンではほとんどが分子量1万以下の低分子となり、分子量4.3万の位置に一つのフラグメントが残存するのみであった。一方、鉄−ラクトフェリンではインタクトな分子も残存し、さらに分子量5.2万、4.3万、3.5万、2.5万、2万、1.5万の位置に複数の特徴的なフラグメントが量的にも多く残存していた。このように鉄−ラクトフェリンはラクトフェリンに比べて消化酵素による消化が限定的であることがわかった。さらにこの消化を受けた状態においても鉄は沈殿することなく可溶化状態であることも確認できた。
ヒト単球細胞株THP−1細胞(急性単球性白血病患者由来)を用いて鉄−ラクトフェリンのLPS誘導性のIL−6産生に対する影響を調べた。試験例1で作製した人工消化物を用いてTHP−1細胞に添加するという試験を行った。鉄−ラクトフェリンを経口摂取したときに、生体内で酵素による消化を受けた状態で、免疫担当細胞に働きかける状態の細胞実験でのモデル化を試みたものである。
実施例1及び試験例1で作製したラクトフェリン、人工消化ラクトフェリン、鉄−ラクトフェリン、人工消化鉄−ラクトフェリン間で比較した。THP−1細胞(大日本製薬社)を10%熱処理ウシ血清(FBS、インビトロジェン社)ならびにβ―メルカプトエタノールを含むRPMI−1640培地(ニプロ社)、5%CO2、37℃で培養した。分化したTHP−1細胞に、LPS刺激への感受性を高めるために、IFN−γを200U/mlになるように添加した後24時間培養した。その後、LPSを1μg/ml濃度で含むRPMI−1640培地に交換し、1.5×105細胞/ウェルになるように96穴プレートに100μl/ウェル播種した。さらに30分後に試験例1で作製した上記のラクトフェリン、人工消化ラクトフェリン、鉄−ラクトフェリン及び人工消化鉄−ラクトフェリンの各試験物質を終濃度各1、10、100μg/mlになるように各ウェルに100μl/ウェル添加し、24時間培養した。培養後、培養液を適度に希釈し、培養液中のIL−6濃度を、ELISAキット(Pharmingen社)で測定した。測定結果を図2に示す。
図2にみられるように、LPSを予め培地に添加してIL−6を誘導し、その培地に試験物質も共に添加すると、ラクトフェリンではIL−6産生は濃度依存的に抑制されていることが認められた。しかしながら、人工消化ラクトフェリンではその効果は消失していることがわかった。一方、鉄−ラクトフェリンではラクトフェリンと同様に抑制が確認され、さらにその人工消化物においても効果が保持されていることがわかった。
LPS非共存下で、ヒト単球細胞株THP−1細胞(急性単球性白血病患者由来)を用いて鉄−ラクトフェリンのLPS誘導性のIL−6産生に対する影響を調べた。試験例2と同様に、培養したTHP−1細胞に、IFN−γを400 U/mlになるよう添加し、1.5×105細胞/ウェルになるように96穴プレートに100μl/ウェル播種した。そこへ試験例1で作製したラクトフェリン、人工消化ラクトフェリン、鉄−ラクトフェリン及び人工消化鉄−ラクトフェリンの各試験物質を終濃度が各100μg/mlになるように各ウェルに100μl/ウェル添加し、24時間培養した。その後3回洗浄し、LPSを0.5μg/ml濃度で含むRPMI−1640培地200μl/ウェルに交換し、さらに24時間培養した。培養後、培養液を適度に希釈し、培養液中のIL−6濃度を、ELISAにて測定した。測定結果を図3に示す。
図3にみられるように、試験物質を予め培地に添加し、その後十分な洗浄の後、LPSを培地に添加してIL−6を誘導すると、ラクトフェリン添加群では、未消化物にはIL−6抑制作用は認められず、人工消化物にはごく弱いIL−6抑制作用が認められた。鉄−ラクトフェリン群では、未消化の状態でも若干IL−6抑制作用は認められたが、人工消化物では強いIL−6抑制作用が確認された。このことは、鉄−ラクトフェリンの消化酵素による消化作用により、IL−6産生抑制活性の高い機能性フラグメントが生成したことを示している。なお、LPSと試験物質が非共存であるため、このIL−6産生抑制作用は、試験物質とLPSとの結合によるものではないことが推察される。
マウスを用いて鉄−ラクトフェリンのTNF−α産生に対する影響を調べた。5週齢の雄ddYマウス(日本エスエルシー社)に固形飼料および飲水を1週間自由摂取させ馴化させた。1群10匹として、体重の平均値が等しくなるようにラクトフェリン投与群(1.5mg/マウス)、鉄−ラクトフェリン投与群(1.5mg/マウス)を設けた。飼料は5日間連続して1日2回ゾンデを用いて経口投与した。最終投与から2時間後、眼窩採血し、末梢血リンパ球(PBMC)を単離した。PBMCはLPSを1μg/ml濃度で含むRPMI−1640培地で1.5×105細胞/ウェルになるよう希釈して96穴プレートに播種し、24時間培養した。培養後、培養液を適度に希釈し、培養液中のTNF−α濃度を、ELISAキット(GT)により測定した。マンホイットニー検定による統計学的処理により、有意差を検定した。結果を図4に示す。
図4にみられるように、鉄−ラクトフェリン投与群のTNF−α濃度は、ラクトフェリン投与群に対して、有意に低下(*p<0.05)していた。つまり、鉄−ラクトフェリンの経口摂取で炎症性サイトカインであるTNF−α産生を抑制できることを示している。
実施例1で得られた鉄−ラクトフェリン20g、糖類100g、アスコルビン酸1g、クエン酸1g、及び香料適量に、水を加えて、総量1kgとし、ろ過滅菌後、瓶に100mlずつ無菌的に充填して、本発明品である炎症性サイトカイン産生抑制用飲料を製造した。
実施例1で得られた鉄−ラクトフェリン10g、脱脂粉乳100g、バター20g、及び水を加えて、総量1kgとし、ろ過滅菌後、瓶に100mlずつ無菌的に充填して、本発明品である炎症性サイトカイン産生抑制用乳飲料を製造した。
Claims (2)
- ラクトフェリン1分子当たり、少なくとも3原子の鉄を保持した鉄−ラクトフェリンを有効成分とする炎症性サイトカインの産生を抑制する為の医薬組成物。
- 鉄−ラクトフェリンが、ラクトフェリンに、炭酸及び/又は重炭酸と鉄とが結合した鉄−ラクトフェリン結合体及び/又は鉄−ラクトフェリン複合体である請求項1記載の炎症性サイトカインの産生を抑制する為の医薬組成物。
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