JPH10500100A

JPH10500100A - 哺乳動物細胞のｒｓウイルス感染の阻害

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Publication number: JPH10500100A
Application number: JP7521458A
Authority: JP
Inventors: ムカージ，プラデイツプ; セオ，アマンダ・ユン−ヨン; アンダースン，ステイーブン・ニール; シヤラー，ジヨージフ・ポール
Original assignee: アボツト・ラボラトリーズ
Priority date: 1994-05-26
Filing date: 1995-03-27
Publication date: 1998-01-06
Also published as: AU2192095A; MX9605830A; CA2190609A1; EP0760674A1; WO1995032727A1; AU697616B2; NZ283578A

Abstract

(57)【要約】哺乳動物細胞のＲＳＶ感染は、天然ヒトβ−カゼイン、ヒトβ−カゼインの組換え形態及びそれらの水解物により阻害し得る。ヒトβ−カゼイン又は水解物は、乳児用配合物のような液体経腸栄養製品に含まれ得る。経腸栄養製品は、例えば、乳児の気道感染症の予防及び治療に用い得る。ヒトβ−カゼイン又は水解物は、滴剤又はスプレーを用い、のどスプレーとして又は経鼻的にも投与し得る。

Description

【発明の詳細な説明】哺乳動物細胞のＲＳウイルス感染の阻害本発明は概して、哺乳動物細胞のＲＳウイルス（ＲｅｓｐｉｒａｔｏｒｙＳｙｎｃｙｔｉａｌＶｉｒｕｓ）感染の阻害、より具体的には、哺乳動物細胞のＲＳウイルス感染を阻害するための天然又は組換えヒトβ−カゼイン及びその水解物の使用に関する。ＲＳウイルス（ＲＳＶ）は乳幼児の急性気道感染症の唯一最も頻繁な原因である。生後６ケ月未満の乳児の感染症が最も多く且つ重症である。殆どの免疫学的に正常な被験者におけるＲＳＶ感染は呼吸器粘膜に限定され、細気管支炎、肺炎及び反応性気道疾患の発症に係わる。免疫抵抗性減弱被験者におけるＲＳＶ感染は現在に至るまで乳児の高死亡率及び他の年齢層の高罹患率に係わってきた。最近になって、１９９４年１月２７日のＰＥＤＩＡＴＲＩＣＮＯＴＥＳ，第１８巻、第１４号に、多くの高齢者が急性呼吸器疾患に罹患し、死亡率が極めて高かった時期に続く２〜３週間の間に、多くのＲＳＶ又はインフルエンザウイルス分離株の報告が相次いだと発表された。この分析は、ＲＳＶが高齢者の罹患状態及び死の原因としてインフルエンザウイルスと同じく重要であることを示している。ある種の呼吸器疾患は母乳栄養により予防し得、「ＲＳウイルスによる乳児の細気管支炎は人工栄養で育てられた乳児より母乳栄養で育てられた乳児の方が発症率が低い」ことが報告された。ヒト母乳はＲＳＶに対する抗体を含み得るが、乳は抗体によるものではない抗ウイルス活性をも有していることが知見された。この作用は、「乳の多くの異なる分子成分に見いだされる特定の多糖により生じ得る」と理論上想定される。Ｔｙｒｒｅｌｌ，“ＢＲＥＡＳＴＦＥＥＤＩＮＧＡＮＤＶＩＲＵＳＩＮＦＥＣＴＩＯＮＳ”，ＴＨＥＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹＯＦＩＮＦＡＮＴＦＥＥＤＩＮＧ（Ａ．Ｗ．Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ編），ＰｒｅｎｕｍＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，ＮＹ，５５−６２ページ（１９８１）。Ｏｋａｍｏｔｏら，“ＡｎｔｉｖｉｒａｌＦａｃｔｏｒｓｉｎＨｕｍａｎＭｉｌｋ：ＩｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｉｎＲｅｓｐｉｒａｔｏｒｙＳｙｎｃｙｔｉａｌＶｉｒｕｓＩｎｆｅｃｔｉｏｎ”，ＡＣＴＡＰＡＥＤＩＡＴＲＩＣＡＳＣＡＮＤＡＮＡＶＩＣＡＳＵＰＰＬＥＭＥＮＴ，３５１：１３７−１４３（１９８９）は、ＲＳＶに対する保護免疫機構は明確に解明されていなかったが、経胎盤又は母乳栄養経由で取得した免疫は下気道疾患のリスクを低減させると示唆されたことを開示している。しかし、この刊行物は、母乳で伝播される抗体の役割又は乳児のＲＳＶ免疫応答の調節における母乳の可能な役割に焦点を当てている。Ｌａｅｇｒｅｉｄら，“ＮｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇＡｃｔｉｖｉｔｙｉｎＨｕｍａｎＭｉｌｋＦｒａｃｔｉｏｎｓａｇａｉｎｓｔＲｅｓｐｉｒａｔｏｒｙＳｙｎｃｙｔｉａｌＶｉｒｕｓ”，ＡＣＴＡＰＡＥＤＩＡＴＲＩＣＡＳＣＡＮＤＡＮＡＶＩＣＡ，７５：６９６−７０１（１９８６）は、ヒト乳が非免疫グロブリン性ＲＳＶ中和活性並びにＲＳＶ特異的抗体を含み得ることを確認する研究を報告している。しかし、ヒト乳の非免疫グロブリン抗ＲＳＶ成分の同定及び機構は未だ解明されていない。しかし、Ｌａｅｇｒｅｉｄらが、母乳からのＲＳＶ中和成分が授乳中又は授乳後の乳の吐き出し及び吸い込みの結果として直接乳児の気道に到達し得ると開示していることは注目に値する。気道粘膜はこのようにして直接保護され得る。Ａｎｄｅｒｓｓｏｎらにより出願された“ＡＮＴＩＢＡＣＴＥＲＩＡＬＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮ”と題するＷＯ９１／０６３０８号及び同著者らによる刊行物（Ａｎｉａｎｓｓｏｎら，“Ａｎｔｉ−ａｄｈｅｓｉｖｅＡｃｔｉｖｉｔｙｏｆｈｕｍａｎｃａｓｅｉｎａｇａｉｎｓｔＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａａｎｄＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ”，ＭＩＣＲＯＢＩＡＬＰＡＴＨＯＧＥＮＥＳＩＳ，８：３１５−３２３（１９９０）は、「肺炎レンサ球菌及び／又はインフルエンザ菌により引き起こされる感染の治療、予防及び／又は診断用」に、少なくとも５，０００ダルトンの分子量を有する乳画分の使用を開示しているが、これらの刊行物には、その有益作用はκ−カゼインにより得られると示唆されている。しかし、本発明は、ＲＳＶ感染を阻害するための天然又は組換えヒトβ−カゼイン及びその水解物の使用に関する。ＷＯ９３／０４１７２号は、ヒトβ−カゼインをコードするＤＮＡ配列に関するが、ヒト細胞とＲＳＶとの結合を阻害する天然又は組換えヒトβ−カゼインの能力は開示していない。ＷＯ９１／０８６７５号は、ヒトα−ラクトアルブミン及びヒトβ−カゼインの組換え形態を含む乳児用配合物を開示している。しかし、該刊行物は、これらのヒト乳タンパク質により、「ウシ又は他の異種タンパク質をベースとする配合物に係わるアレルギー特性を示さない疑似ヒト母乳配合物が得られる」（３ページ，２０−２２行）ことを開示しているに過ぎない。該刊行物には、ＲＳＶとヒト細胞との結合を阻害するためのヒトβ−カゼインの使用は教示も示唆もされていない。 β−カゼインの生物活性の測定に用いた２種のアッセイ（ＨＥｐ−２細胞アッセイ及びＬＬＣ−ＭＫ２細胞アッセイ）を以下に説明する。これらのアッセイはこれまで公表されていないが、ＨＥｐ−２細胞アッセイは確立された方法に基づいている。両アッセイに用いた材料天然ヒトβ−カゼインヒト乳から分離したβ−カゼインは、ＳｙｍｂｉｃｏｍＡＢ，Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ１４５１，Ｓ−９０１２４Ｕｍｅａ，Ｓｗｅｄｅｎから購入した。組換えヒトβ−カゼイン本出願人は、β−カゼインｃＤＮＡ及びその発現系を、ＳｙｍｂｉｃｏｍＡＢ，前出、から得た。用いたヒトβ−カゼインｃＤＮＡは、Ｌｏｎｎｅｒｄａｌら，ＣｌｏｎｉｎｇａｎｄｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｏｆａｃＤＮＡｅｎｃｏｄｉｎｇｈｕｍａｎｍｉｌｋ β−ｃａｓｅｉｎ（配列番号１）ＦｅｄｅｒａｔｉｏｎｏｆＥｕｒｏｐｅａｎＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＳｏｃｉｅｔｉｅｓＬｅｔｔｅｒｓ２６９，１５３−１５６（１９９０）により既にクローン化・配列決定されている。Ｈａｎｓｓｏｎら，“ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＨｕｍａｎＭｉｌｋ β−ＣａｓｅｉｎｉｎＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ：ＣｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＰｒｏｔｅｉｎｗｉｔｈＮａｔｉｖｅＩｓｏｆｏｒｍｓ”，ＰｒｏｔｅｉｎＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ４，３７３−３８１（１９９３）の方法に従い、Ｅ．ｃｏｌｉから組換えヒトβ−カゼインを得、精製した。ヒトβ−カゼインをＥ．ｃｏｌｉ中で発現させるために、β−カゼインｃＤＮＡをＴ７プロモーターの調節下に２種の異なる発現ベクター中でクローン化した。一方のベクター、ｐＳ２６は、細胞内発現させるように設計し、他方のベクター、ｐＳ２８は、細胞外発現させるためのシグナル配列を有する。用いた方法は、Ｈａｎｓｓｏｎらが記載したものと実質的に同様である。Ｈａｎｓｓｏｎらに従って、ヒトλｇｔ乳腺ライブラリーから１．１−ｋｂのＥｃｏＲＩフラグメントとしてヒトβ−カゼインのｃＤＮＡを分離し、ｐＵＣ１９にサブクローン化し、これをｐＳ２１と称した。５′及び３′末端に合成オリゴヌクレオチドを導入して該ｃＤＮＡを修飾した。５′末端に適当なクローニング部位を導入するために、翻訳開始部位、ＮｄｅＩを成熟ヒトβ−カゼインをコードする配列の前に挿入した。翻訳配列の最初の部分をＥ．ｃｏｌｉコドンの使用に適合させるために、６個の合成オリゴヌクレオチドを構築して連結した。さらに、ＰｓｔＩ及びＥｃｏＲＩ部位をＮｄｅＩ部位の前に挿入した。該合成フラグメントの配列は、５′−ＣＴＧＣＡＧＡＡＴＴＣＡＴＡＴＧＣＧＴＧＡＡＡＣＣＡＴＣＧＡＡＴＣＣＣＴＧＡＧＣＴＣＧＡＧＣＧＡＡＧＡＡＴＣＧＡＴＣＡＣＣＧＡＡＴＡＣＡＡＡＡＡＡＧＴＴＧＡＡＡＡＡＧＴＴＡＡＡＣＡＣＧＡＧＧＡＣＣＡＧＧＡＴＣＣ−３′（配列番号２）であった（タンパク質コード配列には下線を付した）。該合成フラグメントをＰｓｔＩ／ＢａｍＨＩ消化ｐＵＣ１９にクローン化し、プラスミドｐＳ２４を得た。β−カゼインコード配列の残りの部分を挿入するために、３０３ｂｐのＡｃｃＩ／ＢｇｌIIフラグメントを分離し、ｐＵＣ１８誘導体にクローン化し、これをプラスミドｐＳ２２と称した。カルボキシ末端及び翻訳停止部位とそれに続くＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩ部位をコードする配列を含む４個の合成オリゴヌクレオチドを構築して、配列５′−ＡＧＡＴＣＴＡＣＣＣＴＧＴＧＡＣＴＣＡＧＣＣＡＣＴＴＧＣＣＣＣＡＧＴＴＣＡＴＡＡＣＣＣＣＡＴＴＡＧＴＧＴＣＴＡＡＴＡＡＧＧＡＴＣＣＧＡＡＴＴＣ−３′（配列番号３）（タンパク質コード配列には下線を付した）を得た。該合成フラグメントをＢｇｌII／ＥｃｏＲＩ消化ｐＳ２２にクローン化して、プラスミドｐＳ２３を得た。組換え修飾β−カゼインコードフラグメントを得るために、３つのフラグメント：ｐＳ２４からの８９ｂｐのＰｓｔＩ／ＡｖａIIフラグメント；ｐＳ２１からの１９７ｂｐのＡｖａ II／ＡｃｃＩフラグメント；及びＰｓｔＩ／ＡｃｃＩ消化ｐＳ２３を連結した。得られたプラスミドｐＳ２５をＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩで消化し、６４１ｂｐのフラグメントを分離し、ベクターｐＥＴ−３ａにクローン化した。得られた発現ベクターをｐＳ２６と称した。細胞外発現を媒介するベクターを構築するために、エンテロトキシンＳＴII遺伝子のＥ．ｃｏｌｉシグナル配列を β−カゼインコード配列の前に導入した。合成ヌクレオチド、５′−ＣＡＴＧＡＡＡＡＡＧＡＡＴＡＴＣＧＣＡＴＴＴＣＴＴＣＴＴＧＣＡＴＣＧＡＴＧＴＴＣＧＴＴＴＴＴＴＣＴＡＴＴＧＣＴＡＣＡＡＡＴＧＣＡＴＡＴＧ−３′（配列番号４）を用い、ＮｃｏＩ及びＮｄｅＩ適合性末端及び内部ＣｌａＩ部位を含む修飾ＳＴII配列を得た。該シグナル配列をβ−カゼインコード配列の前に挿入するために、ｐＳ２５をＡｖａＩ／ＥｃｏＲＩで消化し、６１９ｂｐのフラグメントを分離した。該フラグメントを、合成オリゴヌクレオチドフラグメント、５′−ＣＡＴＡＴＧＣＡＣＧＴＧＡＡＡＣＣＡＴＣＧＡＡＴＣＣＣＴＧＡＧＣＴＣＧＡＧ− ３′（配列番号５）及びＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩ消化ｐＵＣ１９と連結した。得られたプラスミドをｐＳ２７と称した。３つのフラグメント：ｐＳ２７から分離した７００ｂｐのＮｄｅＩ／ＨｉｎｄIII β−カゼインフラグメント；ＳＴIIシグナル配列；及びＮｃｏＩ／ＨｉｎｄIII消化ｐＡＣＡＴ７ベクターを連結して、最終発現ベクター、ｐＳ２８を構築した。発現ベクター、ｐＳ２６及びｐＳ２８を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ及びＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＥを形質転換した。該細菌を、５０μｇ／ｍｌのカルベニシリンを含むルリア増殖培地中で増殖させ、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ及びＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＥを用いた場合には、該培地を２５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールで補足した。発現を誘発させるために、波長６００ｎｍでの光学密度（ＯＤ）（ＯＤ₆₀₀）０．６を得る密度に培養株を増殖させ、次いで、０．４ｍＭＩＰＴＧを加えてＴ７系を誘発させた。誘発後約９０分して細胞を収穫した。標準法を用いて組み換えβ−カゼインを分離した。誘発性Ｔ７ベース発現系により、組換えβ−カゼインの高レベル発現を得た。細菌を収穫し、細胞を遠心してペレット化した。上清は、細胞周辺タンパク質及び細胞質画分のペレットを含んでいた。得られた組換えタンパク質を、イオン交換クロマトグラフィー及びその後の逆相ＨＰＬＣか、又はゲル濾過を含む標準法を用いて精製しておいた天然 β−カゼインと比較した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウエスターンブロット法、アミノ酸分析、ペプチドマッピング、リン酸塩分析及び質量分析法を含む標準生化学技術を用いて組換えβ−カゼインと天然β−カゼインとを比較した。Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現させた組換えβ−カゼインは、７種の天然アイソフォームの１つである全長の非リン酸化天然ヒトβ− カゼインと同時移動することが知見された。ｐＹＥＳ２．０ベクター（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＣｏｒｐ．，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）を用い、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中でも組換えヒトβ−カゼインを発現させたが、発現レベルは、Ｅ．ｃｏｌｉの約１０％であった。しかし、Ｈａｎｓｓｏｎらは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅがリン酸化ヒト乳β−カゼインを発現するらしいことを発見した。β−カゼイン水解物グルタミン酸残基のＣ末端でペプチド結合の加水分解を触媒する特異的エンドプロテイナーゼＧＬＵ−Ｃ（Ｓｉｇｍａ，配列決定グレード）を用い、ヒトβ− カゼイン（天然及び組換え体）を消化した。高圧液体クロマトグラフィーを用いて消化産物をモニターした後、０．１ＭＮＨ₄ＨＣＯ₃，ｐ７．８中３７℃で３０時間の消化のために、１：１００（重量／重量）の酵素対タンパク質比を選択した。これらの消化産物を乾燥し、上記アッセイに用いる前に適切な緩衝液に再懸濁した。ＨＥｐ−２細胞のヒトＲＳＶ感染の阻害長いＲＳＶ株を、２％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むイーグル最少必須培地（ＭＥＭ）下にＨＥｐ−２細胞中で増殖させた。細胞変性効果（ＣＰＥ）３〜４⁺でウイルスを収穫し、Ｍｉｃｒｏｓｏｎ超音波ベル破壊装置（ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｂｅｌｌｄｉｓｒｕｐｔｅｒ）（ＨｅａｔＳｙｓｔｅｍｓ−Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ，Ｎ．Ｙ．）を用いて５０％電力で１０秒間音波処理し、部分に分割して−７０℃で保存した。同一のウイルス調製物を一連のテストに用いたが、テスト毎に新鮮な試料を用いた。９６ウエルの平底組織培養マイクロタイタープレート（カタログ番号３５９６：Ｃｏｓｔａｒ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓ．）中で中和テストを実施した。５６℃で３０分間熱失活した腹水液形態の血清又はモノクローナル抗体（ＭＡｂ）を二つのウエルに加え、マイクロタイタープレート中で４倍に階段希釈した。希釈は全てＭＥＭ−２％ＦＢＳで行い、最終容量はウエル当たり７５μｌであった。次いで、２５μｌのＭＥＭ−２％ＦＢＳ中約６０の５０％組織培養感染用量のウイルスを各ウエルに加え、混合物を４℃で２時間インキュベートした。１００μｌのＭＥＭ−５％ＦＢＳ中約１５,０００ＨＥｐ−２細胞を各ウエルに加え、プレートをセロファンで覆い、湿潤化ＣＯ₂インキュベーター中３５．５℃で３日間インキュベートした。ウエルの内容物を吸引してプレートを固定し、０．５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７．２で３回洗浄し、アセトン−ＰＢＳの８０％（容量／容量）溶液７５μｌを加え、４℃で１５分間インキュベートした。インキュベーション後、内容物を吸引し、プレートを風乾した。固定化と同じ日に酵素免疫抗体法（ＥＬＩＳＡ）を実施するか、又はプレートを４℃で一晩保存し、翌日ＥＬＩＳＡを実施した。ＥＬＩＳＡの実施には、０．５％ゼラチンを含む２００μｌのＰＢＳで３０分間３５℃でウエルを予備コーティングし、内容物を吸引、０．５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（ｐＨ７．２）でウエルを洗浄し、０．５％ゼラチン、０．５％Ｔｗｅｅｎ２０及び２％正常ヤギ血清を含むＰＢＳに希釈したウシ抗ＲＳＶ血清（ＢａＲＳＶ）（ＢｕｒｒｏｕｇｈｓＷｅｌｌｃｏｍｅＣｏ．，ＲｅｓｅａｒｃｈＴｒｉａｎｇｌｅＰａｒｋ，Ｎ．Ｃ．）７５μｌを加え、３５．５℃で１時間インキュベートした。内容物を吸引し、ウエルを洗浄、ＰＢＳ／０．５％Ｔｗｅｅｎ２０／２％正常ヤギ血清に希釈したペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウシ免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ及びＰｅｒｒｙＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）７５μｌを加え、３５．０℃で１時間インキュベートした。ウエルの内容物を再び吸引し、ウエルを洗浄、０．１５Ｍクエン酸リン酸緩衝液（ｐＨ５．５）中１２５μｌの基質（０．０１５％Ｈ₂Ｏ₂１ｍｌ当たり０.４ｍｇのｏ−フェニレンジアミンジヒドロクロリド）を加え、室温で４０〜４５分間インキュベートした。３．５ＭＨＣｌを加えて反応を停止し、マイクロプレート読み取り装置でＡ₄₉₀を読み取った。抗体の希釈はそれぞれ２回行い、各プレートは、非感染細胞を含む対照ウエル、逆滴定、即ち、ＭＥＭ−２％ＦＢＳ中のウイルス接種物の滴定、及び免疫前又は非中和抗体の滴定を含んでいた。吸光度の読み取り値が１５の対照ウエルの平均より３標準偏差以上であれば、ウイルス複製の証拠であると考えた。初期の実験に用いたＢａＲＳＶの希釈度（１：１，０００）及びヤギ抗ウシＩｇＧの希釈度（１：５，０００）をチェッカー盤（ｃｈｅｃｋｅｒｂｏａｒｄ）滴定により測定した。このアッセイは、Ａｎｄｅｒｓｏｎら，“ＭｉｃｒｏｎｅｕｔｒａｌｉｚａｉｔｏｎＴｅｓｔｆｏｒＲｅｓｐｉｒａｔｏｒｙＳｙｎｃｙｔｉａｌＶｉｒｕｓＢａｓｅｄｏｎａｎＥｎｚｙｍｅＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙ”，ＪＯＵＲＮＡＬＯＦＣＬＩＮＩＣＡＬＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ，１９８５年１２月，１０５０−１０５２ページの開示に基づくものであった。ＨＥｐ−２細胞アッセイの結果先ず、２０ｍＭエタノールアミン、６Ｍ尿素、ｐＨ９．５中のヒト及びウシ β−カゼインの各溶液を調製し、次いで３，０００ダルトンのカットオフを有するＣｅｎｔｒｉｃｏｎメンブランフィルター（Ａｍｉｃｏｎ，ＭＡ）を用いて限外濾過によりＰＢＳ中で２回洗浄した。これらの試料を上記ＨＥｐ−２細胞アッセイに適切な緩衝液に再懸濁した後、該アッセイでテストした。別々の指定数の実験を別々の日に実施した。表１に示されているように、ヒトβ−カゼインは０．４ｍｇ／ｍｌ以上の濃度で感染／ウイルス複製を５０％以上阻害した。表１を参照する場合、高阻害％が「薬剤」の高レベル生物活性を示し、低阻害％が「薬剤」の低レベル活性を示すことに留意されたい。ウシβ−カゼインは、１．６ｍｇ／ｍｌの濃度でさえ有意な活性を示さなかった。これらの結果は、ヒト乳由来のβ−カゼインが牛乳由来のβ−カゼインとは異なる生物活性を有することを示した。ＬＬＣ−ＭＫ２細胞のヒトＲＳＶ感染の阻害ＲＳＶ阻害アッセイにより、マイクロタイタープレート中のサル腎臓細胞（ＬＬＣ−ＭＫ２）（ＡＴＣＣＣＣＬ７）の感染を阻害するテスト試薬（抗体又は他の生物活性化合物）の能力を定量的に測定する。感染細胞は免疫ペルオキシダーゼ法を用いて同定した。該方法を以下に簡単に説明する。ＬＬＣ−ＭＫ２細胞をフィブロネクチン処理したＣｏｓｔａｒマイクロタイタープレート（５．０×１０³細胞／ウエル）に接種し、感染価減少アッセイに用いる前に３〜４日インキュベートした。アッセイ当日、長いＲＳＶ株を１０〜２０，０００感染細胞単位（ＩＣＵ／ｍｌ）になるようにＭＥＭに希釈し、適当な濃度（例えば、０．５、１．０及び２．０ｍｇカゼイン／ｍｌ）で階段希釈した等量（２００μｌ）の試料調製物に加えた。次いで、希釈テスト試料とウイルスの混合物を、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞に加える前に、４℃で２時間インキュベートした。希釈試料／ウイルス混合物をマイクロタイタープレートに加える前に、培養培地を取り出し、単層をＭＥＭで一回リンスした。全ての希釈試料／ウイルス混合物を三つのウエル中でテストした。希釈試料／ウイルス混合物を湿潤ＣＯ₂インキュベーター中３７℃で２時間ＬＬＣ−ＭＫ２単層に吸収させた。インキュベーション後、全てのウエルに１５０μｌのＭＥＭを加え、プレートをＣＯ₂インキュベーター中３７℃で１６時間インキュベートした。一晩インキュベートした後、培養培地を取り出し、単層を冷エタノールで固定した。固定した後、マイクロタイタープレートを１ウエル当たり２００μｌのダルベッコのＰＢＳで１回リンスし、全てのウエルにウシ抗ＲＳＶ抗体（２００μｌ）を加えた。室温で３０分間インキュベートし、ＰＢＳ／０．５％ヒヨコアルブミン（ＰＢＳ／ＣＥＡ）で３回リンスした後、ペルオキシダーゼ標識ウサギ抗ウシＩｇＧを全ウエルに加え、室温で３０分間インキュベートした。次いで、マイクロタイタープレートをＰＢＳ／ＣＥＡで３回リンスし、ジアミノベンザジン基質を加え、２０分間インキュベートした。次いで、プレートを上記のようにＰＢＳ／ＣＥＡでリンスし、倒立顕微鏡を用いて１ウエル当たりの染色ＲＳＶ感染細胞の数を測定した。ＬＬＣ−ＭＫ２細胞アッセイの結果このアッセイで、表１に示されているタンパク質をＲＳＶ感染の阻害についてもテストした。該アッセイの結果を表２に示す。この場合もまた、天然ヒト乳β −カゼインは１ｍｇ／ｍｌ以上の濃度で活性であることが判明したのに対し、ウシβ−カゼインは有意な活性を示さなかった。天然及び組換えヒトβ−カゼインの両方のＧＬＵ−Ｃ水解物は０．７５ｍｇ／ｍｌ以上の濃度で活性であった。従って、これらの結果は、組換えヒトβ−カゼイン、天然ヒトβ− カゼイン及びそれらの水解物がＨＥｐ−２哺乳動物細胞及びＬＬＣ−ＭＫ２哺乳動物細胞のどちらのＲＳＶ感染をも阻害することを示した。上記の実験から、ヒト乳から分離したβ−カゼイン、ヒト乳に含まれているβ −カゼインの組換え形態及びそれらの水解物は哺乳動物細胞のＲＳＶ感染を阻害するという結論を得た。さらに、ＲＳＶが呼吸器感染に係わりがあることが文献で確認されているので、上記同定形態のヒトβ−カゼインは、ヒト、特にヒト乳児の呼吸器感染症の予防及び治療に用い得るとの結論を得た。ヒトβ−カゼインを含む経腸摂取ヒト乳の呼吸器感染に対する治療効果を考えれば、上記同定形態のヒトβ−カゼインは経腸（経口）摂取すると治療効果があると推断される。上節に記載の治療効果は、ヒト乳には含まれていない１種以上のタンパク質と、治療上有効量の上節記載の少なくとも１種の形態のヒトβ−カゼインとの組合わせを含む乳児用配合物のような経腸液体栄養製品によって得ることができる。さらに、哺乳動物細胞のＲＳＶ感染は、経鼻経路を介して又はのどスプレーとして、上節で同定された少なくとも１種の形態のヒトβ−カゼインを治療上有効量含む組成物を投与することにより阻害し得る。そのような経鼻投与組成物は、滴剤又はスプレーの形態であってよい。経腸栄養のどスプレー及び経鼻製品並びに方法は、ヒトβ−カゼインとＲＳＶとの相互作用がβ−カゼインの消化・吸収後よりもむしろ直接接触により生じると考えられるので、哺乳動物細胞のＲＳＶ感染の阻害に有効であると確信する。上記同定形態のヒトβ−カゼインは、ヒト乳には含まれていない少なくとも１種のタンパク質を含む標準又は特殊化経腸液体栄養製品、例えば牛乳ベース又は大豆ベースの乳児用配合物及び乳児が消費する他の飲料に配合し得る。好ましい実施態様においては、ヒト乳に含まれている、β−カゼイン以外のいずれのタンパク質又はその水解物も該液体経腸栄養製品には含まれない。そのような製品は、ヒト乳児の気道感染症の治療及び予防に有効である。本発明の好ましい実施態様を開示したが、当業者には、本発明の精神又は範囲を逸脱しなければ、種々の変更及び改変が可能であることが明らかであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＪＰ，ＭＸ，ＮＺ (72)発明者アンダースン，ステイーブン・ニールアメリカ合衆国、オハイオ・43147、ピカーリントン、ストーンミル・ロード・401 (72)発明者シヤラー，ジヨージフ・ポールアメリカ合衆国、オハイオ・43232、コロンバス、ノエ・ビツクスバイ・ロード・ 1547

Claims

【特許請求の範囲】１．ヒト乳から単離されたβ−カゼイン、ヒト乳に含まれているβ−カゼインの組換え形態及びそれらの水解物からなる群から選択された、哺乳動物細胞のＲＳＶ感染を阻害するのに治療上有効量の少なくとも１種の物質と組合わせて、ヒト乳には含まれていない少なくとも１種のタンパク質を含む液体経腸栄養製品。２．前記製品が乳児用配合物である、請求項１に記載の液体経腸栄養製品。３．ヒト乳から単離されたβ−カゼイン、ヒト乳に含まれているβ−カゼインの組換え形態及びそれらの水解物からなる群から選択された、哺乳動物細胞のＲＳＶ感染を阻害するのに治療上有効量の少なくとも１種の物質と組合わせて、ヒト乳には含まれていない少なくとも１種のタンパク質を含み、ヒト乳に含まれている他のタンパタ質は含まない、乳児用液体経腸栄養配合物。４．ヒト乳から単離されたβ−カゼイン、ヒト乳に含まれているβ−カゼインの組換え形態及びそれらの水解物からなる群から選択された少なくとも１種の物質を哺乳動物細胞のＲＳＶ感染を阻害するのに治療上有効量含む経鼻投与性配合物。５．ヒト乳から単離されたβ−カゼイン、ヒト乳に含まれているβ−カゼインの組換え形態及びそれらの水解物からなる群から選択された少なくとも１種の物質を哺乳動物細胞のＲＳＶ感染を阻害するのに治療上有効量含むのどスプレー配合物。６．ヒト乳から単離されたβ−カゼイン、ヒト乳に含まれているβ−カゼインの組換え形態及びそれらの水解物からなる群から選択された治療上有効量の少なくとも１種の物質と組合わせて、ヒト乳には含まれていない少なくとも１種のタンパク質を含む液体栄養製品を経腸摂取させることによる、哺乳動物細胞のＲＳＶ感染を阻害する方法。７．ヒト乳から単離されたβ−カゼイン、ヒト乳に含まれているβ−カゼインの組換え形態及びそれらの水解物からなる群から選択された治療上有効量の少なくとも１種の物質と組合わせて、ヒト乳には含まれていない少なくとも１種のタンパク質を含む乳児用配合物をヒト乳児に経腸投与することによる、ヒト乳児における哺乳動物細胞のＲＳＶ感染を阻害する方法。８．ヒト乳から単離されたβ−カゼイン、ヒト乳に含まれているβ−カゼインの組換え形態及びそれらの水解物からなる群から選択された治療上有効量の少なくとも１種の物質と組合わせて、ヒト乳には含まれていない少なくとも１種のタンパク質を含む経腸栄養製品をヒトに投与して哺乳動物細胞のＲＳＶ感染を阻害することによる、ヒトの気道感染症を治療及び予防する方法。９．ヒト乳から単離されたβ−カゼイン、ヒト乳に含まれているβ−カゼインの組換え形態及びそれらの水解物からなる群から選択された治療上有効量の少なくとも１種の物質と組合わせて、ヒト乳には含まれていない少なくとも１種のタンパク質を含む経腸配合物をヒト乳児に投与して哺乳動物細胞のＲＳＶ感染を阻害することによる、ヒト乳児の気道感染症を治療及び予防する方法。１０．ヒト乳から単離されたβ−カゼイン、ヒト乳に含まれているβ−カゼインの組換え形態及びそれらの水解物からなる群から選択された少なくとも１種の物質を治療上有効量含む配合物を経鼻経路を介して投与することによる、哺乳動物細胞のＲＳＶ感染を阻害する方法。１１．ヒト乳から単離されたβ−カゼイン、ヒト乳に含まれているβ−カゼインの組換え形態及びそれらの水解物からなる群から選択された少なくとも１種の物質を治療上有効量含むのどスプレー配合物を投与することによる、哺乳動物細胞のＲＳＶ感染を阻害する方法。