MXPA96005830A - Inhibicion de la infeccion de las celulas demamiferos por el virus sincicial respiratorio - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un producto nutricional entero líquido que comprende por lo menos una proteína no contenida en la leche humana, pero seleccionada del grupo que consiste de proteína de leche bobina y proteina vegetal en combinación con por lo menos en material seleccionado del grupo que consiste de -caseína aislada de la leche humana, una forma recombinante de la -caseína contenida en la leche humana e hidrolisatos de ambas en una cantidad terapéuticamente efectiva para inhibir la infección de las células de mamíferos por el virus sincitial respiratorio.

Description

INHIBICIÓN DE LA INFECCIÓN DE LAS CÉLULAS DE MAMÍFEROS POR EL VIRUS SINCICIAL RESPIRATORIO La presente invención se refiere, en términos generales a inhibir la infección de las células de mamíferos por el virus sincicial respiratorio, y más específicamente al uso de ß-caseína humana nativa o recombinante e hidrolisatos de las mismas para inhibir la infección de las células de mamíferos por el virus sincicial respiratorio. El virus sincicial respiratorio (RSV) es la causa sencilla más frecuente de la infección del tracto respiratorio agudo en lactantes y niños . Los lactantes de menos de seis meses de edad son los afectados con mayor frecuencia y más seriamente. En la mayoría de los sujetos normales inmunológicamente, la infección con virus sincicial respiratorio se limita a la mucosa respiratoria, y se asocia con el desarrollo de la broncjuiolitis, neumonía y enfermedad reactiva de las vías aéreas . La infección por el virus sincicial respiratorio en los sujetos inmunodeprimidos hasta recientemente se ha asociado con una mortalidad aumentada en los lactantes y morbilidad aumentada en otros grupos de edad. Recientemente, se ha reportado en PEDIATRIC NOTES. Vol. 18, No. 14, , 27 de enero de 1994, que los períodos de alta incidencia de la enfermedad respiratoria aguda y los números de muertes en personas ancianas fueron seguidas durante 2-3 semanas por reportes de altos números de aislados del virus sincicial respiratorio o del virus de influenza. Los análisis indican que el virus sincicial respiratorio es tan importante como los virus de la influenza para causar la morbilidad y muertes entre los ancianos. Se ha reportado que algunas enfermedades respiratorias se pueden evitar mediante el alimento al pecho, y que la "bronquilitis de los lactantes debida al virus sincicial respiratorio es menos frecuente en los lactantes alimentados al pecho que en los alimentados artificialmente" . Aunque la leche del pecho humano puede contener anticuerpos contra el virus sincicial respiratorio, se ha encontrado que la leche también tiene una actividad antiviral que no se debe a anticuerpos. Se ha establecido la teoría de que este efecto "puede ser producido por ciertos polisacáridos que se encuentran en una cantidad de constituyentes moleculares diferentes de la leche." Tyrrell, "BREAST FEEDING AND VIRUS INFECTIONS". THE IMMUNOLOGY OF INFANT FEEDING. editada por A.W. Wilkinson, Plenum Press, New York, NY páginas 55-62 (1981) . Okamato y colaboradores.. "Antiviral Factors in Human Milk: Implications in Respiratory syncytial Virus Infection". ACTA PEDIÁTRICA SCANDANAVICA SUPPLEMENT. 351:137-143 (1989) describe que aunque los mecanismos de la inmunidad protectora contra el virus sincicial respiratorio no se han definido claramente, la inmunidad adquirida a través de la placenta o vía la alimentación al pecho han sugerido que reducen el riesgo de la enfermedad del tracto respiratorio. Sin embargo, esta publicación se enfoca sobre el papel de los anticuerpos transmitidos en la leche de pecho o en el posible papel de la leche de pecho en modular una respuesta inmune al virus sincicial respiratorio del lactante. Laegrid y colaboradores.. "La actividad neutralizante en las fracciones de leche humana contra el virus sincicial respiratorio", ACTA PAEDIATRICA SCANDANAVICA. 75:696-701 (1986) esta acta reporta un estudio el cual confirma que la leche humana puede contener actividad neutralizante del virus sincicial respiratorio de una naturaleza no inmunoglobulógica así como también anticuerpos específicos contra el virus sincicial respiratorio. Sin embargo, la identidad y el mecanismo del componente del anti-RSV no inmunoglobulógico de la leche humana no está identificado. Aunque es importante notar que Laegrid y colaboradores describen que los componentes neutralizantes del virus sincicial respiratorio de la leche de pecho pueden llegar al tracto respiratorio de los lactantes directamente como resultado de la regurgitación y la inhalación de la leche durante y después de la alimentación. La mucosa del tracto respiratorio puede adquirir protección directa de esta manera. La patente WO 91/06308 presentada por Andersson y colaboradores para "ANTIBACTERIAL COMPOSITION" , y un artículo publicado por los mismos autores (Aniansson y colaboradores.. "Antiadhesive activity of human casein against Streptococcus pneumonía and Haemophilus influenzae" . MICROBIAL PATHOGENESIS. 8:315-323 (1990) describe el uso de una fracción de leche que tiene un peso molecular de cuando menos 5000 daltons para "therapeutic prophylactic and/or diagnostic use in infections caused by S. pneumonae and/or H. influenzae" , pero se sugiere en estas publicaciones que el efecto benéfico lo proporciona mediante la kappa-caseína. Sin embargo, la presente invención se refiere al uso de la ß-caseína humana nativa o recombinante, hidrolisatos de ambas para inhibir las infecciones del virus sincicial respiratorio. La patente WO93/04172 se refiere a la secuencia de ADN que codifica la ß-caseína humana, pero no describe la capacidad de la ß-caseína humana ya sea nativa o recombinante para inhibir la unión del virus sincicial respiratorio a las células humanas. La patente WO91/08675 describe una fórmula infantil que contiene formas recombinantes tanto de alfa-lactalbúmina humana como de ß-caseína humana. Sin embargo, esta publicación sólo describe que estas proteínas de la leche humana "proporcionarán una fórmula de leche materna humana simulada que no presenta las propiedades alergénicas asociadas con las fórmulas basadas en proteínas de vaca u otras proteínas extrañas." (página 3, líneas 20-22). El uso de ß-caseína para inhibir la unión del virus sincicial respiratorio a las células humanas no se expone o sugiere en esa publicación. Los dos ensayos (un ensayo de células HEp-2y el ensayo de células LLC-MK2) que se usaron para determinar la bioactividad de la ß-caseína se describen más adelante. Estos ensayos no se han publicado hasta ahora, aunque el ensayo de las células HEp-2 se basó en la metodología establecida. MATERIALES USADOS EN AMBOS ENSAYOS ß-caseína humana nativa La ß-caseína aislada de la leche humana se compró en Sybicom AB. P.O. Box 1451. S-901 24 Umea, Suecia. ß-caseína humana recombinante Los solicitantes obtuvieron el ADNc de la ß-caseína y el sistema de expresión de Symbicom AB. P.O. Box 1451. S-901 24 Umea, Suecia. El ADNc de la ß-caseína humana usada había sido clonado y secuenciado previamente por Lonnerdal y colaboradores Cloning and sequencing of a cDNA encoding human milk ß-casein. (SEQ ID NO: 1:) Federation of European Bioche ical Societies Letters 269. 153-156 (1990) . La ß-caseína humana recombinante se obtuvo de E. coli y se purificó de acuerdo con el método de Hansson y colaboradores .. Expression of Human Milk ß-Casein in Escherichia coli : Comparison of Recombinant Protein with Native Isoforms. Protein Expression and Purification 4, 373-381 (1993) . Para expresar la ß-caseína humana en E. coli , el ADNc de la ß-caseína se clonó bajo el control de un promotor T7 en dos vectores de expresión diferentes. Un vector pS26, fue diseñado para expresión intracelular. El otro vector, pS28, tiene una secuencia de señal para la expresión extracelular. El procedimiento seguido fue sustancialmente el descrito por Hansson y colaboradores. El ADNc de la ß-caseína humana fue aislada por Hansson y colaboradores como un fragmento de EcoRI de 1.1 -kb a partir de una biblioteca de glándula mamaria gt lambda humana, y se subclonó en pUC19 que fue designado pS21. El ADNc se modificó mediante la introducción de oligonucleótidos sintéticos en los términos 5 ' y 3 ' . Para introducir un sitio de clonación adecuado en el extremo 5', Ndel, un inicio de traducción, se insertó al frente de la secuencia que codifica la ß-caseína humana madura. Para adaptar la parte inicial de la secuencia traducida a la usanza del codón de E. coli , se construyeron y ligaron seis oligonucleótidos sintéticos. También se insertaron sitios PstI y EcoRI al frente del sitio Ndel. La secuencia del fragmento sintético fue 5'-CTGCAGAATTCATATGCGTGAAACCATCGAATCCCTGAGCTCGAGCGAAGAATCGATCAC CGAATACAAAAAAGTTGAAAAAGTTAAACACGAGGACCAGGATCC -3 ' . (SEQ ID NO : 2:) La secuencia que codifica la secuencia está subrayada. El fragmento sintético se clonó en pUC19 digerido por PstI/BamHI dando como resultado un plásmido pS24. Para insertar el resto « de la secuencia codificadora de la ß-caseína, se aisló y un fragmento AccI/BglII de 303 pares de bases se clonó en un derivado de pUC18 y se designó como plásmido pS22. Se construyeron cuatro oligonucleótidos sintéticos que contienen la secuencia que codifica el extremo terminal carboxi y la detención de la traducción seguido por los sitios BamHI y EcoRI dando como resultado la secuencia 5 ' -A G A T C T A C C C TG T GA C T CAG C CA C T T G C C C C AGTTCATAACCCCATTAGTGTCTAATAAGGATCCGAATTC - 3' (SEQ ID NO: 3:) en donde la secuencia que codifica a la proteína está subrayada. El fragmento sintético se clonó en pS22 digerido por BglII/EcoRI, dando como resultado el plásmido pS23. Para obtener el fragmento que codifica a la ß-caseína modificada recombinante, se ligaron tres fragmentos: un fragmento PstI/AvalI de 89 pares de bases a partir de pS24; un fragmento Avall/Accl de 197 pares de bases de pS21; y pS23 digerido por PstI/AccI. El plásmido resultante pS25 se digirió con Ndel/BamHI y un fragmento de 641 pares de bases se aisló y se clonó dentro del vector pET-3a. El vector de expresión resultante se designó pS26. Con el fin de construir un vector que mediara la expresión extracelular, la secuencia de la señal de E. coli del gen STII de la enterotoxina se introdujo al frente de la secuencia que codifica la ß-caseína. Una secuencia de STII modificada con extremos compatibles Ncol y Ndel y un sitio interno Clal se obtuvo usando un oligonucleótido sintético. 5" CATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTGCATCGATGTTCGTTTTTTCTATTGCTACAAA TGCATATG -3' (SEQ ID NO: 4:). Para insertar la secuencia de señal al frente de la secuencia de codificación de la ß-caseína, se digirió el pS25 con Aval/EcoRI y se aisló un fragmento de 619 pares de bases. Este fragmento se ligó con un fragmento de oligonucleótidos sintéticos: 5'- CATATGCACGTGAAA CCATCGAATCCCTGAGCTCGAG -3' (SEQ ID NO: 5), y pUC19 digerido por Ndel/EcoRI. El plásmido resultante se designó pS27. El vector de expresión final pS28, se construyó ligando tres fragmentos: un fragmento de ß-caseína Ndel/HindIII de 700 pares de bases aislado de p527. la secuencia de señal STII, y un vector pACAT7 digerido por NcoI/HindIII . Los vectores de expresión pS26 y pS28 se usaron para transformar las cepas de E. coli BL2KDE3), BL21 (DE3)pLysS, y BL21 (DE3)pLysE. las bacterias fueron cultivadas en medio de cultivo Luria Broth que contiene 50µg/mililitro de carbenicilina, y cuando se usaron BL21 (DE3)pLysS, y BL21 (DE3)pLysE el medio se complementó con 25 µg/mililitro de cloranfenicol . Para la inducción de la expresión se cultivaron los cultivos a una densidad produciendo una densidad óptica (OD) de 0.6 a una longitud de onda de 600 nanómetros (OD,^) , luego se agregó 0.4 mM de IPTG para inducir el sistema T7. Las células se cosecharon aproximadamente 90 minutos después de la inducción. La ß-caseína recombinante se aisló usando procedimientos estándar. El sistema de expresión basado en T7 inducible dio como resultado un alto nivel de expresión de la ß-caseína recombinante. Las bacterias se cosecharon y las células se granularon mediante centrifugación. El sobrenadante contenía las proteínas periplasmáticas y el granulo de la fracción citoplasmática. Las proteínas recombinantes obtenidas se compararon con la ß-caseína nativa, que se había purificado mediante métodos estándar incluyendo ya sea cromatografía por intercambio de iones seguida por la fase HPLC inversa o filtración en gel. La ß-caseína recombinante y nativa se compararon mediante técnicas bioquímicas estándar que comprenden SDS-PAGE, manchado Western, análisis de aminoácidos, mapeo de péptidos, análisis de fosfato, y espectrometría de masa. Se encontró que la ß-caseína recombinante expresada en E. coli comigra con la ß-caseína humana nativa en toda su longitud, no fosforilada, la cual es una de siete isoformas nativas . La ß-caseína humana recombinante también se ha expresado en S. cerevisiae usando el vector pYES 2.0 (Invitrogen Corp.. San Diego, CA) , pero el nivel de expresión fue aproximadamente del 10 por ciento del obtenido en E. coli . Sin embargo, Hansson y colaboradores encontraron que S. cerivisiae parecía expresar la ß-caseína de la leche humana fosforizada. Hidrolisatos de ß-caseína La ß-caseína humana (tanto la nativa como la recombinante) se digirió usando la endoproteinasa específica GLU-C (Sigma, grado de sec?enciamiento) que cataliza la hidrólisis de enlaces péptidos en la C-terminal del residuo del ácido glutámico. Después de monitorear la digestión usando cromatografía en líquido a alta presión, se eligió una relación de enzima contra proteína 1:100 (peso/peso) para una digestión de 30 horas a 37°C en 0.1 M de NH4HC03, pH 7.8.

Estos digestos se secaron y se volvieron a suspender en los reguladores apropiados antes de usarse en los ensayos que se describen más adelante. INHIBICIÓN DE LA INFECCIÓN POR RSV HUMANO DE LAS CÉLULAS HEp-2 La cepa larga de virus sincicial respiratorio se cultivó en células HEp-2 bajo un medio esencial Eagle mínimo (MEM) con 2 por ciento de suero de bovino fetal (FBS) . El virus se cosechó en un efecto citopático (CPE) de 3 a 4+, se sonificó durante 10 segundos al 50 por ciento de potencia con un disruptor de campana ultrasónica Microson (Heat Systems Ultrasonics, Inc.. Farmingdale, N.Y.) dividido en porciones y almacenado a -70°C. Se usó la misma preparación de virus para una serie de pruebas, pero se usó una muestra fresca para cada corrida de prueba.

Las pruebas de neutralización se realizaron en placas de microtitulación, de cultivo de tejido, de fondo plano, de 96 pozos (catálogo no. 3596: Costar, Cambridge, Mass.) . Se agregó suero o un anticuerpo monoclonal (MAb) en la forma de fluido ascites, que se había inactivado por calor a 56°C para duplicar los pozos y se realizaron series de diluciones cuatro veces en las placas de microtitulación. Todas las diluciones fueron en el medio esencial Eagle mínimo con el 2 por ciento de suero bovino fetal, y el volumen final fue de 75 µl por pozo. Aproximadamente del 60 al 50 por ciento de dosis infectiva de cultivo de tejido de virus en 25 µl de medio esencial Eagle mínimo con el 2 por ciento de suero bovino fetal, se agregó a cada pozo, y la mezcla se incubó durante 2 horas a 4°C. Aproximadamente 15,000 células HEp-2 en 100 µl de medio esencial Eagle mínimo con el 5 por ciento de suero bovino fetal, se agregaron a cada pozo, y las placas se envolvieron con celofán y se incubaron a 35°C en un incubador humidificado con C02 durante 3 días. Las placas se fijaron aspirando el contenido de los pozos, lavando tres veces con solución salina regulada con fosfato a un pH de 7.2 con 0.5 por ciento de Tween 20, añadiendo 75 µl de una solución al 80° (volumen/volumen) de acetona - solución salina regulada con fosfato, y se incubaron durante 15 minutos a 4°C. Después del período de incubación, el contenido se aspiró, y los pozos se secaron al aire. El Ensayo Inmuno Sorbente Enlazado con Enzimas (ELISA) se realizó en el mismo día de la fijación, o las placas se guardaron durante la noche a 4°C y el ELISA se realizó al día siguiente. Para el ELISA los pozos se recubrieron previamente con 200 µl de solución salina regulada con fosfato con el 0.5 por ciento de gelatina durante 30 minutos a 35°C, el contenido se aspiró, los pozos se lavaron con solución salina regulada con fosfato (pH 7.2) 0.5 por ciento de Tween 20 y 75µl de suero anti-RSV de bovino (BaRSV) Burroughs Wellcome Co.. Research Triangle Park, N.C.) diluido en solución . salina regulada con fosfato 0.5 por ciento de gelatina más 0.5 por ciento de Tween 20 y se agregó 2 por ciento de suero de cabra normal y se incubó durante 1 hora a 35.5°C. El contenido se aspiró, los pozos se lavaron, y 75 µl de peroxidasa conjugada, inmunoglobulina G de cabra antibovino G (IgG) (Kirkegaard y Perry Laboratories, Inc.. Gaithersburg, MD) diluida en solución salina regulada con fosfato 0.5 por ciento de gelatina más 0.5 por ciento de Tween 20 y se agregó 2 por ciento de suero de cabra normal y se incubó durante 1 hora a 35.5°C. El contenido se aspiró de nuevo, los pozos se lavaron, y se agregaron 125 µl de sustrato (0.4 miligramos de dihidroclor ro de o-fenilendiamina por mililitro de 0.015 por ciento de H202) en 0.15 M de regulador de citrato de fosfato (pH 5.5) y se incubó a temperatura ambiente durante 40 a 45 minutos. La reacción se detuvo con 3.5 M de HCl, y se leyó el A490 con un lector de microplacas. Cada dilución de anticuerpo se corrió por duplicado, y cada charola incluyó pozos de control con pozos sin infecta, una titulación de fondo, o sea, la titulación del virus inoculado en MEM-2 por ciento de FBS, y una titulación de un anticuerpo preinmune o no neutralizador. Una lectura de absorbencia de desviaciones estándar mayor o igual a 3 por encima de la media de 15 pozos de control se consideró ser evidencia de replicación de virus. Las diluciones de BaRSV (1:1,000) y la inmunoglobulina de cabra anti-bovino (1:5,000) usadas durante el estudio se determinaron inicialmente mediante tablas de verificación de titulaciones. Este ensayo se basó en la descripción de Andersson y colaboradores .. "Microneutralización Test for Respiratory Syncytial Virus Based on an Enzyme Immunoassay. JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY. Diciembre 1985, páginas 1050-1052.

RESULTADOS DEL ENSAYO DE LAS CÉLULAS HEp-2 Las soluciones de ß-caseína humana y bovina se prepararon rimero en 20 mM de etanolamina, 6 M de urea, pH 9.5 y luego se lavaron dos veces en PBS mediante ultrafiltración usando filtros de membrana Centricon (A icon, MA) con una abertura de 3,000 daltons. Después de volver a suspender en el regulador apropiado para el ensayo de células HEp-2 descrito antes, estas muestras se probaron en el ensayo. Se realizaron experimentos con diferentes números designados en diferentes días. Como se muestra en la Tabla 1, la ß-caseína humana causó una inhibición de la infección/réplica de virus del 50 por ciento o más a concentraciones de 0.4 miligramos/mililitro o mayores . Se debe notar que cuando se hace referencia a la Tabla 1, un porcentaje de inhibición más alto indica un nivel más alto de bioactividad del "AGENTE" y un porcentaje de inhibición inferior indica un nivel inferior de actividad del "AGENTE". La ß-caseína bovina no fue significativamente activa ni aún a 1.6 miligramos/mililitro. Estos resultados indicaron que la ß-caseína de la leche humana tiene una bioactividad diferente comparada con la ß-caseína de la leche de bovino.

TABLA 1 INHIBICIÓN DE LA INFECCIÓN POR RSV EN HUMANOS DE LAS CÉLULAS HEp-2 s datos mostrados son un promedio de tres réplicas.

INHIBICIÓN DE LA INFECCIÓN POR RSV HUMANO DE LAS CÉLULAS LLC-MK2 El ensayo de la inhibición de virus sincicial respiratorio determina cuantitativamente la capacidad de un reactivo de prueba (anticuerpo u otro compuesto bioactivo) para inhibir la infección de células renales de mono (LLC-MK2) (ATCC CCL 7) en placas de microtitulación. Las células infectadas se identificaron usando un método de inmunoperoxidasa . El método se describe brevemente más adelante. Las células LLC-MK2 se sembraron en placas de microtitulación Costar tratadas con fibronectina (5.0 X 103 células por pozo) y se incubaron durante 3-4 días antes de usarlas en el ensayo de reducción de infectividad. El día del ensayo, la cepa larga de virus sincicial respiratorio se diluyó en MEM a 10-20,000 unidades de células infectadas (ICU/mililitro) , y se añadieron a un volumen igual (200 µl) de preparaciones de muestra diluidas en serie a una concentración adecuada (por ejemplo 0.5 1.0 y 2.0 miligramos de caseína/mililitro) . Las mezclas de las muestras de prueba diluidas y los virus se incubaron entonces durante 2 horas a 4°C antes de añadir a las células LLC-MK2. Antes de la adición de las mezclas de muestra-virus a las placas de microtitulación, el medio de cultivo se removió y las monocapas se enjuagaron una vez con MEM. Todas las mezclas de muestra-virus diluidas se probaron en pozos triplicados. Las mezclas de muestra-virus diluidas se dejaron absorber a las capa de LLC-MK2 durante 2 horas a 37°C en una incubadora de C02 humidificada . Después de la incubación, se agregaron 150 µl de MEM a todos los pozos y las placas s incubaron a 37°C durante 16 horas en la incubadora de C02. Después de la incubación durante la noche, el medio de cultivo se removió y las monocapas se fijaron con etanol frío. Después de la fijación, las placas de microtitulación se enjuagaron una vez con 200 µl de PBS Dulbecco por pozo, y se añadió el anticuerpo anti-RSV de bovino (200µl) a todos los pozos. Después de una incubación de 30 minutos a temperatura ambiente y tres enjuagues con PBS/0.5 por ciento de albúmina de pollo (PBS/CEA) se añadió inmunoglobulina antibovina de conejo etiquetada con peroxidasa a todos los pozos y se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos. Las placas d microtitulación se enjuagaron entonces 3 veces con PBS/CEA y se añadió un sustrato de diaminobenzadina y se incubaron durante 20 minutos Las placas se enjuagaron entonces como antes con PBS/CEA, y se determinó el número de células infectadas por virus sincicial respiratorio marcadas usando un microscopio invertido.

RESULTADOS DEL ENSAYO DE LAS CÉLULAS LLC-MK2 Las proteínas descritas en la Tabla I también se probaron en este ensayo para ver la inhibición de la infección del virus sincicial respiratorio. Los resultados de este ensayo se muestran en la Tabla 2. Una vez más, se encontró que la ß-caseína de la leche humana es activa a concentraciones de 1 miligramo/mililitro o mayor, mientras que la ß-caseína bovina no fue significativamente activa. Los hidrolisatos GLU- C de la ß-caseína humana tanto nativa como recombinante j.ó fueron activos a concentraciones de 0.75 miligramos/mililitro y mayores. Por lo tanto estos resultados indicaron que la ß- caseína humana recombinante, la ß-caseína humana nativa y sus hidrolisatos inhiben la infección del virus sincicial respiratorio tanto de las células de mamíferos HEp-2 como de las célula de mamífero LLC-MK2.

TABLA 2 INHIBICIÓN DE LA INFECCIÓN POR RSV HUMANO DE LAS CÉLULAS LLC-MK2 s datos mostrados son el promedio de cuatro réplicas.

De los experimentos anteriores se concluye que la ß-caseína aislada de la leche materna, una forma recombinante de la ß-caseína contenida en la leche humana, y los hidrolisatos de ambas, inhiben la infección del virus sincicial respiratorio a las células de mamíferos. Además, hasta donde el virus sincicial respiratorio se ha identificado en la literatura como asociado con la infección del tracto respiratorio, se ha concluido que las formas identificadas de la ß-caseína pueden emplearse en la prevención y el tratamiento de la infección del tracto respiratorio en humanos, especialmente en lactantes humanos. En vista del efecto terapéutico de la leche humana ingerida enteralmente, que contiene ß-caseína sobre la infección del tracto respiratorio, se concluye que las formas identificadas anteriormente de la ß-caseína humana tiene un beneficio terapéutico cuando se ingiere enteralmente (oralmente) . Los efectos terapéuticos descritos en el párrafo precedente se pueden suministrar mediante un producto nutritivo líquido enteral, tal como una fórmula de lactantes, que comprenda una o más proteínas no contenidas en la leche humana en combinación con una cantidad terapéuticamente efectiva de cuando menos una de las formas de la ß-caseína descrita en el párrafo precedente. También se concluye que la unión del virus sincicial respiratorio a las células de mamíferos se puede inhibir administrándolo vía un pasaje nasal, o como un pulverizador para la garganta, una formulación que contiene una cantidad efectiva terapéuticamente de cuando menos una de las formas de la ß-caseína humana identificada en el párrafo precedente. Una formulación administrada nasalmente puede estar en la forma ya sea de gotas o un pulverizador. Los productos y métodos entérales, en pulverizador para la garganta y nasales se cree que son efectivos para inhibir la infección del virus sincicial respiratorio a las células de mamíferos debido a que la interacción de la ß-caseína y del virus sincicial respiratorio se cree que ocurre vía el contacto directo en lugar de después de la digestión y absorción de la ß-caseína. Se cree que las formas identificadas anteriormente de la ß-caseína se pueden incorporar a cualquier producto nutritivo líquido enteral especializado o estándar que contenga cuando menos una proteína no encontrada en la leche humana, tal como las fórmulas infantiles basadas en leche de bovino o basadas en soya y otras bebidas consumidas por niños pequeños. En una modalidad preferida en el producto nutritivo enteral líquido no se encuentran proteínas ni hidrolisatos de las mismas de la leche materna, distintas de ß-caseína. Un producto así tiene utilidad en el tratamiento y la prevención de la infección del tracto respiratorio en lactantes humanos.

Aunque se han descrito las modalidades preferidas de la invención, para los expertos en la técnica será aparente que se pueden hacer en la misma diversos cambios y modificaciones sin desviarse del espíritu o el alcance de esta invención.

LISTADO DE SECUENCIAS (1) INFORMACIÓN GENERAL (i) SOLICITANTE: Abbott Laboratories (ii) TITULO DE LA INVENCIÓN: Inhibición de la Infección de las Células de Mamíferos por el Virus Sincicial Respiratorio (iii) NUMERO DE SECUENCIAS: 5 (iv) DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA: (A) DESTINATARIO: Lonnie R. Drayer ROSS Products División Abbott Laboratories (B) CALLE: 625 Cleveland Avenue (C) CIUDAD: Columbus (D) ESTADO: Ohio (E) PAÍS: Estados Unidos de América (F) ZIP: 43215 (v) FORMA LEGIBLE EN COMPUTADORA: (A) TIPO DE MEDIO: Disquete, 3.5 pulgadas, 1.44 Mb de memoria (B) COMPUTADORA: IBM Compatible (C) SISTEMA OPERATIVO: MS-DOS Versión 6.21 (D) SOFTWARE: WordPerfect Versión 6.0a (vi) DATOS DE LA PRESENTE SOLICITUD: (A) NUMERO DE SOLICITUD: (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: (C) CLASIFICACIÓN: (vii) DATOS DE SOLICITUDES ANTERIORES: (A) NUMERO DE SOLICITUD: US 08/249,554 (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: 26- MAYO-1994 (A) NUMERO DE SOLICITUD: US 08/249,555 (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: 26- MAYO-1994 (ix) INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES: (A) TELEFONO: (614)624-3774 (B) TELEFAX: (614)624-3074 (C) TELEX: Ninguno (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO : 1 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA. (A) LONGITUD: 1065 pares de bases (B) TIPO: Acido nucleico (C) TIPO DE CADENA: Simple (D) TOPOLOGÍA: Desconocida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc clonado que representa el producto de un segmento de ADN genómico humano (A) DESCRIPCIÓN: ß-caseína de leche humana (iii) HIPOTÉTICA: (iv) SIN SENTIDO: (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) FUENTE ORIGINAL: Humana (A) ORGANISMO: Homo sapiens (B) CEPA: (C) INDIVIDUAL AISLADA: (D) ESTADO DE DESARROLLO: Adulto (E) HAPLOTIPO: (F) TIPO DE TEJIDO: Glándula mamaria (G) TIPO DE CÉLULA: (H) LINEA CELULAR: ( I ) ORGANELO : (vii) FUENTE INMEDIATA: Glándula mamaria humana (A) BIBLIOTECA: (B) CLONA: (viii) POSICIÓN EN EL GENOMA: (A) CROMOSOMA/SEGMENTO : (B) POSICIÓN EN EL MAPA: (C) UNIDADES: (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE : (B) LOCALIZACION: (C) MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: análisis de secuenciamiento y restricción de ADN. (D) OTRA INFORMACIÓN: El producto codificado del nucleotido de la SEQ ID NO: 1 es la proteína de la leche humana, ß-caseína. (x) INFORMACIÓN DE LA PUBLICACIÓN: (A) AUTORES: B. Lonnerdal, y colaboradores (B) TITULO: Cloning and sequencing of a cDNA encoding human milk beta-casein. (C) REVISTA: Federation European Biochemical Society Letters (D) VOLUMEN: 269 (E) EMISIÓN: (F) PAGINAS: 153-156 (G) FECHA: 1990 (H) NUMERO DE DOCUMENTO: (I) FECHA DE PRESENTACIÓN: (J) FECHA DE PUBLICACIÓN: (K) RESIDUOS RELEVANTES: (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 1 CGG ATG AAG GTC CTC ATC CTC GCC TGC CTG GTG GCT CTT GCT CTT GCA AGG GAG ACC ATA GAA AGC CTT TCA .AGC AGT GAG GAA TCT ATT ACA GAA TAC AAG AAA GTT GAG AAG GTT AAA CAT GAG GAC CAG CAG 1 CAÁ GGA GAG GAT GAA CAC CAG GAT AAA ATC TAC CCC TCT TTC CAG 1 CCA CAG CCT CTG ATC TAT CCA TTC GTT GAA CCT ATC CCC TAT GGT 2 TTT CTT CCA CAÁ AAC ATT CTG CCT CTT GCT CAG CCT GCT GTG GTG 2 CTG CCT GTC CCT CAG CCT GAA ATA ATG GAA GTC CCT AAA GCT AAA GAC ACT GTC TAC ACT AAG GGC AGA GTG ATG' CCT GTC CTT AAA TCT 3 CCA ACG ATA CCC TTT TTT GAC CCT CA ATC CCA AAA CTC ACT GAT 4 CTT GAA AAT CTG CAT CTT CCT CTG CCT CTG CTC CAG CCC TTG ATG 4 CAG CAG GTC CCT CAG CCT ATT CCT CAG ACT CTT GCA CTT CCC CCT 4 CAG CCC CTG TGG TCT GTT CCT CAG CCC AAA GTC CTG CCT ATC CCC 5 CAG CAÁ GTG GTG CCC TAC CCT CAG AGA GCT GTG CCT GTT CAÁ GCC 5 CTT CTG CTC AAC CAÁ GAA CTT CTA CTT AAC CCC ACC CAC CAG ATC 6 TAC CCT GTG ACT CAG CCA CTT GCC CCA GTT CAT AAC CCC ATT AGT 6 GTC TAA GAA GAT TTC AAA GTT AAT TTT CCC TCC TTA TTT TTG AAT 7 TGA CTG AGA CTG GAA ATA TGA TGC CTT TTC CGT CTT TGT ATC ACG 7 TTA CCC CAÁ ATT AAG TAT GTT TGA ATG AGT TTA TAT GGA AAA AAT 8 GAA CTT TGT CCC TTT ATT TAT TTT ATA TAT TAT GTC ATT CAT TTA 8 ATT TGA AAT TTG ACT CAT GAA CTA TTT ACA TTT TCC AAA TCT TAA 9 TTC AAC TAG TAC CAC AGA AGT TCA ATA CTC ATT TGG AAA TGC TAC 9 AAA CAT ATC AAA CAT ATG TAT ACA AAT TGT TTC TGG AAT TGT GCT 9 TAT TTT TAT TTC TTT AAG AAT CTA TTT CCT TTC CAG TCA TTT CAÁ 10 TAA ATT ATT CTT AAG CAT AAA AAA. AAA AAA 10 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO : 2: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (Á) LONGITUD: 105 pares de bases (B) TIPO: Acido nucleico 5 (C) TIPO DE CADENA: Simple (D) TOPOLOGÍA: Desconocida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: oligonucleótido sintético (A) DESCRIPCIÓN: (iii) HIPOTÉTICA: :_.<_> (iv) SIN SENTIDO: (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) FUENTE ORIGINAL: Secuencia de oligonucleótido sintético (A) ORGANISMO : 15 (B) CEPA: (C) INDIVIDUAL AISLADA: (D) ESTADO DE DESARROLLO: (E) HAPLOTIPO: (F) TIPO DE TEJIDO: 20 (G) TIPO DE CÉLULA: (H) LINEA CELULAR: (I) ORGANELO: (vii) FUENTE INMEDIATA: (A) BIBLIOTECA: 5 (B) CLONA: (viii) POSICIÓN EN EL GENOMA: (A) CROMOSOMA/SEGMENTO: (B) POSICIÓN EN EL MAPA: (C) UNIDADES: (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE : (B) LOCALIZACION: (C) MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: análisis de secuenciamiento y restricción de ADN. (D) OTRA INFORMACIÓN: El oligonucleótido sintético asegura la adaptación de la secuencia de traducción a la usanza del codón de E. coli. (x) INFORMACIÓN DE LA PUBLICACIÓN: (A) AUTORES: L. Hansson, y colaboradores (B) TITULO: Expression of Human Milk ß-casein in Escherichia coli: Comparison of Recombinant Protein with Native Isoforms. (C) REVISTA: Protein Expression and Purification (D) VOLUMEN: 4 (E) EMISIÓN: (F) PAGINAS: 373-381 (G) FECHA: 1993 (H) NUMERO DE DOCUMENTO: (I) FECHA DE PRESENTACIÓN: (J) FECHA DE PUBLICACIÓN: (K) RESIDUOS RELEVANTES: (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2 CTG CAG AAT TCA TAT GCG TGA AAC CAT CGA ATC CCT GAG CTC GAG 45 CGA AGA ATC GAT CAC CGA ATA CAÁ AAA AGT TGA AAA AGT TAA ACA 90 CGA GGA CCA GGA TCC 105 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 3: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA. (A) LONGITUD: 71 pares de bases (B) TIPO: Acido nucleico (C) TIPO DE CADENA: Simple (D) TOPOLOGÍA: Desconocida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: oligonucleótido sintético (A) DESCRIPCIÓN: (Üi) HIPOTÉTICA: (iv) SIN SENTIDO: (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) FUENTE ORIGINAL: Secuencia de oligonucleótido sintético (A) ORGANISMO: (B) CEPA: (C) INDIVIDUAL AISLADA: (D) ESTADO DE DESARROLLO: (E) HAPLOTIPO: (F) TIPO DE TEJIDO: (G) TIPO DE CÉLULA: (H) LINEA CELULAR: ( I ) ORGANELO : (vii) FUENTE INMEDIATA: (A) BIBLIOTECA: (B) CLONA: (viii) POSICIÓN EN EL GENOMA: (A) CROMOSOMA/SEGMENTO: (B) POSICIÓN EN EL MAPA: (C) UNIDADES: (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE: (B) LOCALIZACION: (C) MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: análisis de secuenciamiento y restricción de ADN. (D) OTRA INFORMACIÓN: (x) INFORMACIÓN DE LA PUBLICACIÓN: (A) AUTORES: L. Hanssson, y colaboradores (B) TITULO: Expression of Human Milk ß-casein in Escherichia coli: Comparison of Recombinant Protein with Native Isoforms. (C) REVISTA: Protein Expression and Purification (D) VOLUMEN: 4 (E) EMISIÓN: (F) PAGINAS: 373-381 (G) FECHA: 1993 (H) NUMERO DE DOCUMENTO: (I) FECHA DE PRESENTACIÓN: (J) FECHA DE PUBLICACIÓN: (K) RESIDUOS RELEVANTES: (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 3 AGA TCT ACC CTG TGA CTC AGC CAC TTG CCC CAG TTC ATA ACC CCA 45 TTA GTG TCT AAT AAG GAT CCG AAT TC I (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO : 4: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 68 pares de bases (B) TIPO: Acido nucleico (C) TIPO DE CADENA: Simple (D) TOPOLOGÍA: Desconocida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: oligonucleótido sintético (A) DESCRIPCIÓN: (iii) HIPOTÉTICA: (iv) SIN SENTIDO: (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) FUENTE ORIGINAL: Secuencia de oligonucleótido sintético (A) ORGANISMO: (B) CEPA: (C) INDIVIDUAL AISLADA: (D) ESTADO DE DESARROLLO: (E) HAPLOTIPO: (F) TIPO DE TEJIDO: (G) TIPO DE CÉLULA: (H) LINEA CELULAR: ( I ) ORGANELO : (vii) FUENTE INMEDIATA: (A) BIBLIOTECA: (B) CLONA: (viii) POSICIÓN EN EL GENOMA: (A) CROMOSOMA/SEGMENTO: (B) POSICIÓN EN EL MAPA: (C) UNIDADES: (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE : (B) LOCALIZACION: (C) MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: análisis de secuenciamiento y restricción de ADN. (D) OTRA INFORMACIÓN: (x) INFORMACIÓN DE LA PUBLICACIÓN: (A) AUTORES: L. Hanssson, y colaboradores (B) TITULO: Expression of Human Milk ß-casein in Escherichia coli: Comparison of Recombinant Protein with Native Isoforms. (C) REVISTA: Protein Expression and Purification (D) VOLUMEN: 4 (E) EMISIÓN: (F) PAGINAS: 373-381 (G) FECHA: 1993 (H) NUMERO DE DOCUMENTO: (I) FECHA DE PRESENTACIÓN: (J) FECHA DE PUBLICACIÓN: (K) RESIDUOS RELEVANTES: (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 4 CAT GAA AAA GAA TAT CGC ATT TCT TCT TGC ATC GAT GTT CGT TTT 45 TTC TAT TGC TAC AAA TGC ATA TG 8 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO : 5: (i) CARACTERÍSTICAS DE LAS SECUENCIAS. (A) LONGITUD: 37 pares de bases (B) TIPO: Acido nucleico (C) TIPO DE CADENA: Simple (D) TOPOLOGÍA: Desconocida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: oligonucleótido sintético (A) DESCRIPCIÓN: (iii) HIPOTÉTICA: (iv) SIN SENTIDO: (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) FUENTE ORIGINAL: Secuencia de oligonucleótido sintético (A) ORGANISMO: (B) CEPA: (C) INDIVIDUAL AISLADA: (D) ESTADO DE DESARROLLO: (E) HAPLOTIPO: (F) TIPO DE TEJIDO: (G) TIPO DE CÉLULA: (H) LINEA CELULAR: ( I ) ORGANELO : (vii) FUENTE INMEDIATA: (A) BIBLIOTECA: (B) CLONA: (viii) POSICIÓN EN EL GENOMA: (A) CROMOSOMA/SEGMENTO: (B) POSICIÓN EN EL MAPA: (C) UNIDADES: (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE : (B) LOCALIZACION: (C) MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: análisis de secuenciamiento y restricción de ADN. (D) OTRA INFORMACIÓN: (x) INFORMACIÓN DE LA PUBLICACIÓN: (A) AUTORES: L. Hanssson, y colaboradores (B) TITULO: Expression of Human Milk ß-casein in Escherichia coli: Comparison of Recombinant Protein with Native Isoforms. (C) REVISTA: Protein Expression and Purification (D) VOLUMEN: 4 (E) EMISIÓN: (F) PAGINAS: 373-381 (G) FECHA: 1993 (H) NUMERO DE DOCUMENTO: (I) FECHA DE PRESENTACIÓN: (J) FECHA DE PUBLICACIÓN: (K) RESIDUOS RELEVANTES: (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5 CAT ATG CAC GTG AAA CCA TCG AAT CCC TGA GCT CGA G 37

Claims (11)

1. REIVINDICACIONES 1. Un producto nutritivo enteral líquido que comprende cuando menos una proteína no contenida en la leche humana en combinación con cuando menos un material seleccionado del grupo que consiste en ß-caseína aislada de la leche humana, una forma recombinante de la ß-caseína contenida en la leche humana e hidrolisatos de ambas en una cantidad terapéuticamente efectiva que inhibe la infección de las células de mamíferos por el virus sincicial respiratorio.
2. 2. Un producto nutritivo enteral líquido de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el producto es una fórmula para lactantes .
3. 3. Una fórmula para lactantes nutritiva enteral líquida que comprende cuando menos una proteína no contenida la leche humana en combinación con cuando menos un material seleccionado del grupo que consiste en ß-caseína aislada de la leche humana, una forma recombinante de la ß-caseína contenida en la leche humana e hidrolisatos de ambas en una cantidad terapéuticamente efectiva que inhibe la infección de las células de mamíferos por virus sincicial respiratorio, no conteniendo dicha fórmula para lactantes otras proteínas encontradas en la leche humana.
4. 4. Una formulación administrable nasalmente que comprende cuando menos un material seleccionado del grupo que consiste en ß-caseína aislada de la leche humana, una forma recombinante de la ß-caseína contenida en la leche humana e hidrolisatos de ambas en una cantidad efectiva terapéuticamente que inhibe la infección de las células de mamíferos por el virus sincicial respiratorio.
5. 5. Una formulación en pulverizador que comprende cuando menos un material seleccionado entre el grupo que consiste en ß-caseína aislada de la leche humana, una forma recombinante de la ß-caseína contenida en la leche humana e hidrolisatos de ambas en una cantidad efectiva terapéuticamente que inhibe la infección de las células de mamíferos por el virus sincicial respiratorio.
6. 6. Un método para inhibir la infección de las células de mamíferos por el virus sincicial respiratorio, mediante la ingestión por vía enteral un producto nutritivo líquido que comprende cuando menos una proteína no contenida en la leche humana en combinación con una cantidad efectiva de cuando menos un material seleccionado entre el grupo que consiste en ß-caseína aislada de la leche humana, una* forma recombinante de la ß-caseína contenida en la leche humana e hidrolisatos de ambas.
7. 7. Un método para inhibir la infección de las células de mamíferos por el virus sincicial respiratorio en un lactante humano, alimentando al lactante humano por vía enteral al lactante humano con una fórmula para lactantes que comprende cuando menos una proteína no contenida en la leche humana en combinación con una cantidad efectiva de cuando menos un material seleccionado entre el grupo que consiste en ß-caseína aislada de la leche humana, una forma recombinante de la ß-caseína contenida en la leche humana e hidrolisatos de ambas .
8. 8. Un método para tratar y prevenir la infección del tracto respiratorio en un humano inhibiendo la infección de las células de mamíferos por el virus sincicial respiratorio, alimentando al humano con un producto nutritivo que comprende cuando menos una proteína no contenida en la leche humana en combinación con una cantidad efectiva de cuando menos un material seleccionado entre el grupo que consiste en ß-caseína aislada de la leche humana, una forma recombinante de la ß-caseína contenida en la leche humana e hidrolisatos de ambas.
9. 9. Un método para tratar y prevenir la otitis media en un lactante humano inhibiendo la infección de las células de mamíferos por virus sincicial respiratorio, alimentando al lactante humano con un producto nutritivo que comprende cuando menos una proteína no contenida en la leche humana en combinación con una cantidad efectiva de cuando menos un material seleccionado entre el grupo que consiste en ß-caseína aislada de la leche humana, una forma recombinante de la ß-caseína contenida en la leche humana e hidrolisatos de ambas.
10. 10. Un método para inhibir la infección de las células de mamíferos administrando vía un pasaje nasal una formulación que contiene una cantidad efectiva terapéuticamente de cuando menos un material seleccionado entre el grupo que consiste en ß-caseína aislada de la leche humana, una forma recombinante de la ß-caseína contenida en la leche humana e hidrolisatos de ambas.
11. 11. Un método para inhibir la infección de las células de mamíferos por virus sincicial respiratorio administrando una formulación en pulverización para la garganta que contiene una cantidad efectiva terapéuticamente de cuando menos un material seleccionado entre el grupo que consiste en ß-caseína aislada de la leche humana, una forma recombinante de la ß-caseína contenida en la leche humana e hidrolisatos de ambas.