JPH10500101A

JPH10500101A - インフルエンザ菌のヒト細胞への付着の阻害

Info

Publication number: JPH10500101A
Application number: JP7521459A
Authority: JP
Inventors: ムカージ，プラデイツプ; セオ，アマンダ・ユン−ヨン; アンダースン，ステイーブン・ニール; ハーベイ，リンダ・アン
Original assignee: アボツト・ラボラトリーズ
Priority date: 1994-05-26
Filing date: 1995-04-18
Publication date: 1998-01-06
Also published as: CA2190610A1; NZ283281A; WO1995032728A1; MX9605829A; AU2129395A; AU695101B2; EP0760673A1

Abstract

(57)【要約】中咽頭細胞などのヒト細胞へのインフルエンザ菌の付着は、天然ヒトβ−カゼイン、ヒトβ−カゼインの組換え形態及びそれらの水解物により阻害し得る。ヒトβ−カゼイン又は水解物は、人工栄養乳のような液体経腸栄養製品に含ませ得る。該経腸栄養製品は、例えば、乳幼児の中耳炎の予防及び治療に用い得る。ヒトβ−カゼイン又は水解物は、滴剤又はスプレーを用い、のどスプレーとして又は経鼻的にも投与し得る。

Description

【発明の詳細な説明】インフルエンザ菌のヒト細胞への付着の阻害本発明は概して、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）のヒト細胞への付着（ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）の阻害、より具体的には、インフルエンザ菌のヒト細胞への付着を阻害するための天然又は組換えヒト β−カゼイン及びその水解物の使用に関する。ヘモフィルスは、複合増殖要件を有する、非運動性（ｎｏｎ−ｍｏｌｏｔｉｌｅ）のグラム陰性、胞子非形成性の小さい桿菌である。通常、インフルエンザ菌により引き起こされる疾患は、上気道のウイルス感染により急発し得る鼻咽頭炎として発症する。Ｊ．Ｂ．ＬｉｐｉｎｃｏｔｔＣｏｍｐａｎｙから出版された、Ｍｏｒｓｅら，“Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ”，ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ，第４版，６１５−６１８ページ（１９９０）。インフルエンザ菌は、空気で運ばれる呼吸飛沫又は分泌物との直接接触によりヒトからヒトへ伝播される。インフルエンザ菌は、コロニーをつくるためには、鼻咽頭粘膜表面の繊毛のクリアランス機構及び粘液のバリヤーと戦わなければならない。インフルエンザ菌は、粘液のバリヤー及び繊毛のエスカレーターを通過すると粘膜上皮細胞に付着する。粘膜表面への侵入は病原性細菌の重要な特性のようである。Ｓｔｅｐｈｅｎｓら，“ＰａｔｈｏｇｅｎｉｃＥｖｅｎｔｓＤｕｒｉｎｇＩｎｆｅｃｔｉｏｎｏｆｔｈｅＨｕｍａｎＮａｓｏｐｈａｒｙｎｘｗｉｔｈＮｅｉｓｓｅｒｉａｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓａｎｄＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ” ，ＲＥＶＩＥＷＳＯＦＩＮＦＥＣＴＩＯＵＳＤＩＳＥＡＳＥＳ，１３：２２−２３（１９９１）。さらに、鼻咽頭に存在するインフルエンザ菌は中耳感染症（中耳炎）の発症の主要因子であり、分類不能なインフルエンザ菌が鼻咽頭粘膜及び鼻粘膜細胞に付着すると報告されている。Ｈａｒａｄａら，“ＡｄｈｅｒｅｎｃｅｏｆＨｅａｍｏｐｈｉｌｕｓｉｎｆｌｕｅｎｚａｅｔｏｎａｓａｌ，ｎａｓｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌａｎｄｂｕｃａｌｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓｆｒｏｍｐａｔｉｅｎｓｗｉｔｈｏｔｉｔｉｓｍｅｄｉａ”，ＥＵＲＯＰＥＡＮＡＲＣＨＴＶＥＳＯＦＯＴＯ−ＲＨＩＮＯ −ＬＡＲＹＮＧＯＬＯＧＹ，２４７：１２２−１２４（１９９０）。Ｓｔｅｎｆｏｒｓら，“ＡｂｕｎｄａｎｔＡｔｔａｃｈｍｅｎｔｏｆＢａｃｔｅｒｉａｔｏＮａｓｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌＥｐｉｔｈｅｌｉｕｍｉｎＯｔｉｔｉｓ−ＰｒｏｎｅＣｈｉｌｄｒｅｎ”，ＴＨＥＪＯＵＲＮＡＬＯＦＩＮＦＥＣＴＩＯＵＳＤＩＳＥＡＳＥＳ，１６５：１１４８−１１５０（１９９２）。本発明により、ヒト乳から分離したβ−カゼイン若しくはその組換え形態又はそのいずれかの水解物を用いてインフルエンザ菌のヒト細胞への付着が阻害される。ヒト乳幼児に生後４ヶ月間母乳栄養のみを与えると、急性及び反復性中耳炎の発症率が減少する。しかし、保護作用を及ぼすのが母乳自体なのか、又は母乳栄養機構なのかという疑問が残る。Ｓｈｅａｒｄ，“Ｂｒｅａｓｔ−ＦｅｅｄｉｎｇＰｒｏｔｅｃｔｓＡｇａｉｎｓｔＯｔｉｔｉｓＭｅｄｉａ”，ＮＵＴＲＩＴＩＯＮＲＥＶＩＥＷＳ，第５１巻、第９号，２７５−２７７ページ（１９９３）。１，０１３人の乳幼児を生後１年間追跡したある研究によれば、該乳幼児の４７％は、少なくとも１回は中耳炎を発症し、１７％は反復性中耳炎を有していた。生後４ヶ月以上母乳のみで育てられた乳幼児における急性中耳炎の平均発症数は、母乳で全く育てられなかった乳幼児の半分であり、生後４ヶ月以前に他の食品を補った食事を与えられた乳幼児より４０％も低かった。６ヶ月以上母乳栄養のみで育てられた乳幼児の反復性中耳炎発症率は１０％であり、４ヶ月未満しか母乳栄養を与えられなかった乳幼児では２０．５％であった。これらの研究者らは、母乳中のＩｇＡ、微量栄養素又はプロスタグランジンＥが保護作用をし得るとの見解を示したが、中耳炎に対する母乳栄養の保護作用機構は明らかではないとの結論が下された。Ｄｕｎｃａｎら，“ＥｘｃｌｕｓｉｖｅＢｒｅａｓｔ−ＦｅｅｄｉｎｇｆｏｒａｔＬｅａｓｔ４ＭｏｎｔｈｓＰｒｏｔｅｃｔｓＡｇａｉｎｓｔＯｔｉｔｉｓＭｅｄｉａ”，ＰＥＤＩＡＴＲＩＣＳ，第９１巻，第５号，８６７− ８７２ページ（１９９３）。Ａｎｄｅｒｓｓｏｎらにより出願された“ＡＮＴＩＢＡＣＴＥＲＩＡＬＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮ”と題するＷＯ９１／０６３０８号及び同著者らによる刊行物（Ａｎｉａｎｓｓｏｎら，“Ａｎｔｉ−ａｄｈｅｓｉｖｅＡｃｔｉｖｉｔｙｏｆｈｕｍａｎｃａｓｅｉｎａｇａｉｎｓｔＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａａｎｄＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ”，ＭＩＣＲＯＢＩＡＬＰＡＴＨＯＧＥＮＥＳＩＳ，８：３１５−３２３（１９９０）は、「肺炎レンサ球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎａｅ）及び／又はインフルエンザ菌により引き起こされる感染症の治療、予防及び／又は診断用」に、少なくとも５，０００ダルトンの分子量を有する乳画分の使用を開示しているが、これらの刊行物には、その有益作用はκ−カゼインにより得られると示唆されている。しかし、本発明は、インフルエンザ菌感染を阻害するための天然又は組換えヒトβ−カゼイン及びそれらの水解物の使用に関する。ＷＯ９３／０４１７２号は、ヒトβ−カゼインをコードするＤＮＡ配列に関するが、インフルエンザ菌のヒト細胞への付着を阻害する天然又は組換えヒトβ− カゼインの能力は開示していない。ＷＯ９１／０８６７５号は、ヒトα−ラクトアルブミン及びヒトβ−カゼインの両方の組換え形態を含む人工栄養乳（ｉｎｆａｎｔｆｏｒｍｕｌａ）を開示している。しかし、該刊行物は、これらのヒト乳タンパク質により、「ウシ又は他の異種タンパク質をベースとする人工栄養乳（ｆｏｒｍｕｌａ）に係わるアレルギー特性を示さない疑似ヒト母乳の人工栄養乳が得られる」（３ページ，２０ −２２行）ことを開示しているに過ぎない。該刊行物には、インフルエンザ菌のヒト細胞への付着を阻害するためのヒトβ−カゼインの使用は教示も示唆もされていない。 β−カゼインの生物に対する活性の測定に用いた２種のアッセイ（放射能標識アッセイ及びＥＬＩＳＡアッセイ）を以下に説明する。これらのアッセイはこれまで公表されていないが、ＥＬＩＳＡアッセイは確立された方法に基づいている。両アッセイに用いた材料インフルエンザ菌中耳炎に係わるインフルエンザ菌培養株（フィンブリエ有、分類不能）は、米国オハイオ州コロンバスにあるオハイオ州立大学のＬａｕｒｅｎＢａｋｅｌｅｔｚ博士から得た。アッセイにおけるこれらの微生物の使用は、Ｂａｋａｌｅｔｚら，“ＦｒｅｑｕｅｎｃｙｏｆＦｍｂｒｉａｔｉｏｎｏｆＮｏｎｔｙｐａｂｌｅＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｉｎｆｌｕｅｎｚａｅａｎｄｉｔｓＡｂｉｌｉｔｙｔｏＡｄｈｅｒｅｔｏＣｈｉｎｃｈｉｌｌａａｎｄＨｕｍａｎＲｅｓｐｉｒａｔｏｒｙＥｐｉｔｈｅｌｉｕｍ”，ＩｎｆｅｃｔｉｏｎａｎｄＩｍｍｕｎｉｔｙ，５６：３３１−３３５（１９８８）に記載されている。該インフルエンザ菌を、低継代数の冷凍アリコートからチョコレート寒天プレート（ＢＢＬ−ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ＆Ｃｏ．，Ｃｏｃｋｅｙｓｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）上に画線接種し、５％ＣＯ₂インキュベーター中３７℃で約１８時間インキュベートして、対数関数的に増殖する培養株を得た。該インフルエンザ菌を以下に記載の酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）アッセイにも放射能標識アッセイにも用いた。天然ヒトβ−カゼインヒト乳から分離したβ−カゼインは、ＳｙｍｂｉｃｏｍＡＢ，Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ１４５１，Ｓ−９０１２４Ｕｍｅａ，Ｓｗｅｄｅｎから購入した。組換えヒトβ−カゼイン本出願人は、β−カゼインｃＤＮＡ及びその発現系を、ＳｙｍｂｉｃｏｍＡＢ（前出）から得た。用いたヒトβ−カゼインｃＤＮＡは、Ｌｏｎｎｅｒｄａｌら，ＣｌｏｎｉｎｇａｎｄｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｏｆａｃＤＮＡｅｎｃｏｄｉｎｇｈｕｍａｎｍｉｌｋ β−ｃａｓｅｉｎ（配列番号１）ＦｅｄｅｒａｔｉｏｎｏｆＥｕｒｏｐｅａｎＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＳｏｃｉｅｔｉｅｓＬｅｔｔｅｒｓ２６９，１５３−１５６（１９９０）により既にクローン化・配列決定されている。Ｈａｎｓｓｏｎら，ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＨｕｍａｎＭｉｌｋ β−ＣａｓｅｉｎｉｎＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ：ＣｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＰｒｏｔｅｉｎｗｉｔｈＮａｔｉｖｅＩｓｏｆｏｒｍｓ，ＰｒｏｔｅｉｎＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ４，３７３−３８１（１９９３）の方法に従い、Ｅ．ｃｏｌｉから組換えヒトβ−カゼインを得、精製した。ヒトβ−カゼインをＥ．ｃｏｌｉ中で発現させるために、β−カゼインｃＤＮＡをＴ７プロモーターの調節下に２種の異なる発現ベクター中でクローン化した。一方のベクター、ｐＳ２６は、細胞内発現させるように設計し、他方のベクター、ｐＳ２８は、細胞外発現させるためのシグナル配列を有する。用いた方法は、Ｈａｎｓｓｏｎらが記載したものと実質的に同じである。Ｈａｎｓｓｏｎらに従って、ヒトλｇｔ乳腺ライブラリーから１．１−ｋｂのＥｃｏＲＩフラグメントとしてヒトβ−カゼインｃＤＮＡを分離し、ｐＵＣ１９にサブクローン化し、これをｐＳ２１と称した。５′及び３′末端に合成オリゴヌクレオチドを導入して該ｃＤＮＡを修飾した。５′末端に適当なクローニング部位を導入するために、翻訳開始部位、ＮｄｅＩを成熟ヒトβ−カゼインをコードする配列の前に挿入した。翻訳配列の最初の部分をＥ．ｃｏｌｉコドンの使用に適合させるために、６個の合成オリゴヌクレオチドを構築して連結した。さらに、ＰｓｔＩ及びＥｃｏＲＩ部位をＮｄｅＩ部位の前に挿入した。該合成フラグメントの配列は、5′-CTGCAGAATTCATATGCGTGAAACCATCGAATCCCTGAGCTCGAGCGAAGAATCGATCACCGAA TACAAAAAAGTTGAAAAAGTTAAACACGAGGACCAG GATCC-3′（配列番号２）であった（タンパク質コード配列には下線を付した）。該合成フラグメントをＰｓｔＩ／ＢａｍＨＩ消化ｐＵＣ１９にクローン化し、プラスミドｐＳ２４を得た。β−カゼインコード化配列の残りの部分を挿入するために、３０３ｂｐのＡｃｃＩ／Ｂｇｌ IIフラグメントを分離し、ｐＵＣ１８誘導体にクローン化し、これをプラスミドｐＳ２２と称した。カルボキシ末端及び翻訳停止部位とそれに続くＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩ部位をコードする配列を含む４個の合成オリゴヌクレオチドを構築して、配列5′-AGATCTAC CCTG TGACTCAGCCACTTGCCCCAGTTCATAACCCCATTAGTGTCTAATAAGGATCCGAATTC-3′（配列番号３）（タンパク質コード配列には下線を付した）を得た。該合成フラグメントをＢｇｌII／ＥｃｏＲＩ消化ｐＳ２２にクローン化して、プラスミドｐＳ２３を得た。組換え修飾β−カゼインコード化フラグメントを得るために、３つのフラグメント：ｐＳ２４からの８９ｂｐのＰｓｔＩ／ＡｖａIIフラグメント；ｐＳ２１からの１９７ｂｐのＡｖａII／ＡｃｃＩフラグメント；及びＰｓｔＩ／ＡｃｃＩ消化ｐＳ２３を連結した。得られたプラスミドｐＳ２５をＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩで消化し、６４１ｂｐのフラグメントを分離し、ベクターｐＥＴ−３ａにクローン化した。得られた発現ベクターをｐＳ２６と称した。細胞外発現を媒介するベクターを構築するために、エンテロトキシンＳＴII遺伝子のＥ．ｃｏｌｉシグナル配列をβ−カゼインコード化配列の前に導入した。合成オリゴヌクレオチド、5′-CATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTGCATCGATGTTCGTTT TTTCTATTGCTACAAATGCATATG-3′（配列番号４）を用い、ＮｃｏＩ−及びＮｄｅＩ −適合性末端及び内部ＣｌａＩ部位を含む修飾ＳＴII配列を得た。該シグナル配列をβ−カゼインコード化配列の前に挿入するために、ｐＳ２５をＡｖａＩ／ＥｃｏＲＩで消化し、６１９ｂｐのフラグメントを分離した。該フラグメントを、合成オリゴヌクレオチドフラグメント、5′-CATATGCACGTGAAACCATCGAATCCCTGA GCTCGAG-3′（配列番号５）及びＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩ消化ｐＵＣ１９と連結した。得られたプラスミドをｐＳ２７と称した。３つのフラグメント：ｐＳ２７から分離した７００ｂｐのＮｄｅＩ／ＨｉｎｄIIIβ−カゼインフラグメント；ＳＴIIシグナル配列；及びＮｃｏＩ／ＨｉｎｄIII消化ｐＡＣＡＴ７ベクターを連結して、最終発現ベクター、ｐＳ２８を構築した。発現ベクター、ｐＳ２６及びｐＳ２８を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ及びＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＥを形質転換した。該細菌を、５０μｇ／ｍｌのカルベニシリンを含むルリアブロス培地中で増殖させ、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ及びＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＥを用いた場合には、該培地を２５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールで補足した。発現を誘発させるために、光学濃度（ＯＤ）として、波長６００ｎｍでの光学濃度（ＯＤ₆₀₀）が０．６となる密度まで培養株を増殖させ、次いで、０．４ｍＭＩＰＴＧを加えてＴ７系を誘発させた。誘発後約９０分して細胞を収穫した。標準法を用いて組み換えβ−カゼインを分離した。誘導Ｔ７ベース発現系により、組換えβ−カゼインの高レベル発現を得た。細菌を収穫し、細胞を遠心してペレット化した。上清は周辺細胞質タンパク質を含み、ペレットは細胞質画分を含んでいた。得られた組換えタンパク質を、イオン交換クロマトグラフィー及びその後の逆相ＨＰＬＣか、又はゲル濾過を含む標準法を用いて精製しておいた天然β−カゼインと比較した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウエスターンブロット法、アミノ酸分析、ペプチドマッピング、リン酸基分析及び質量分析法を含む標準生化学技術を用いて組換えβ−カゼインと天然β−カゼインとを比較した。Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現させた組換えβ−カゼインは、７種の天然イソ型の１つである全長の非リン酸化天然ヒトβ−カゼインと同時移動することが知見された。ｐＹＥＳ２．０ベクター（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＣｏｒｐ．，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）を用い、組換えヒトβ−カゼインをＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中でも発現させたが、発現レベルは、Ｅ．ｃｏｌｉの約１０％であった。しかし、Ｈａｎｓｓｏｎらは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅがリン酸化ヒト乳β−カゼインを発現するらしいことを知見した。β−カゼイン水解物グルタミン酸残基のＣ末端でペプチド結合の加水分解を触媒する特異的エンドプロテイナーゼＧＬＵ−Ｃ（Ｓｉｇｍａ，配列決定グレード）を用い、ヒトβ− カゼイン（天然及び組換え）を消化した。高圧液体クロマトグラフィーを用いて消化産物をモニターした後、０．１ＭＮＨ₄ＨＣＯ₃，ｐＨ７．８中３７℃で３０時間の消化に、１：１００（重量／重量）の酵素対タンパク質比を選択した。これらの消化産物を乾燥し、上記アッセイに用いる前に適切な緩衝液に再懸濁した。放射能標識アッセイＤｅｔｒｏｉｔ５６２細胞ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，Ｕ．Ｓ．Ａ）からＤｅｔｒｏｉｔ５６２咽頭癌細胞を得た。アッセイにおける該細胞型の使用は、Ｔａｋａｈａｓｈｉら， “ＰｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎＯｆＡＳｕｒｆａｃｅＲｅｃｅｐｔｏｒＢｏｕｎｄＵｒｏｋｉｎａｓｅ−ＴｙｐｅＰｌａｓｍｉｎｏｇｅｎＡｃｔｉｖａｔｏｒＩｎａＨｕｍａｎＭｅｔａｓｔａｔｉｃＣａｒｃｉｎｏｍａｔｏｕｓＣｅｌｌＬｉｎｅ”，ＢＩＯＣＨＥＭＩＣＡＬＡＮＤＢＩＯＰＨＹＳＩＣＡＬＲＥＳＥＡＲＡＣＨＣＯＭＭＵＮＩＣＡＴＩＯＮＳ，１８２：１４６６−７２に記載されている。１０％ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，Ｕｔａｈ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）を補足したダルベッコの修飾イーグル培地（ＧＴＢＣＯ，ＧｒａｎｄＩｓｌａｎｄ，ＮｅｗＹｏｒｋ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）中でＤｅｔｒｏｉｔ５６２細胞を培養した。トリプシン−ＥＤＴＡ〔０．２５％トリプシン、１ｍＭＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）〕（ＧＩＢＣＯ）を用い、７５ｃｍ²フラスコ（Ｃｏｓｔａｒ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）中で細胞を慣用的に継代培養して、細胞を分離した。継代培養継代数４８〜７５の細胞を付着（ａｄｈｅｓｉｏｎ）実験に用いた。細胞を９６ウエルプレート（Ｃｏｓｔａｒ）に、１ウエル当たり２０，０００細胞の密度で接種し、５％ＣＯ₂インキュベーター中に３７℃で８〜１０日間維持して、付着実験用の集密的細胞単層を得た。３０ｍＭＮ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ ′−２−エタンスルホン酸（ＨＢＳ）（ＧＩＢＣＯ）を補足したハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳ）（ＧＩＢＣＯ）２００μｌでプレートを３回洗浄して、付着アッセイで細菌を添加する前に、血清タンパク質を取り出した。細菌の放射能標識０．０５％ウシ血清アルブミンを補足したリン酸緩衝塩水（ＰＢＳ−ＢＳＡ）中の収穫細菌を遠心して、光学濃度（ＯＤ）として、波長６００ｎｍでの光学濃度（ＯＤ₆₀₀）２．４を得る量のＰＢＳ−ＢＳＡに再懸濁した。細菌の放射能標識には、¹¹¹−インジウム−オキシン（¹¹¹−Ｉｎ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ，ＡｒｌｉｎｇｔｏｎＨｅｉｇｈｔｓ，Ｔｌｌｉｎｏｉｓ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）の高エネルギー短寿命トレーサーを用いた。（¹¹¹−Ｉｎは細胞膜を貫入し、一旦細胞内に入ると、解離して、¹¹¹−インジウムイオンと細胞質成分が結合する。）他のアッセイに¹¹¹−Ｉｎ標識を用いることは、Ａｒｄｅｈａｌｉら，“¹¹¹−ＩｎｄｉｕｍＬａｂｅｌｉｎｇｏｆＭｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓｔｏＦａｃｉｌｉｔａｔｅｔｈｅＩｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｏｆＢａｃｔｅｒｉａｌＡｄｈｅｓｉｏｎ”，ＪＯＵＲＮＡＬＯＦＢＩＯＭＥＤＩＣＡＬＭＡＴＥＲＩＡＬＳＲＥＳＥＡＲＣＨ，２７：２６９−２７５（１９９３）に記載されている。２．５ｍｌの細菌懸濁液に¹¹¹ −Ｉｎ溶液５０μＣｉを３７℃で加え、２０分間インキュベートした。次いで、放射能標識細菌を２回洗浄し、３０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液を補足した５ｍｌＨＢＳに再懸濁した。２５μｌの¹¹¹−Ｉｎ標識細菌懸濁液を２５μｌのβ −カゼインと共に、ポリプロピレン９６ウエルプレート中３７℃で１５分間子備インキュベートし、β−カゼインと細菌を結合させた。放射能標識細菌の付着測定放射能標識細菌及びβ−カゼインを含む予備インキュベーション混合物２５μ ｌを、Ｄｅｔｒｏｉｔ５６２細胞を含むアッセイプレートの各ウエルにピペット秤量した。アッセイプレートを３７℃で２０分間インキュベートして、細胞単層に細菌が付着できる状態とした。次いで、プレートをＨＢＳで３回洗浄して、付着していない細菌をＤｅｔｒｏｉｔ５６２細胞から除去した。１００μｌの１Ｎ水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）を加えてアッセイを停止し、細胞単層を破壊した。各ウエルの全内容物をＣｏｂｒａポリプロピレン管（直径１２ｍｍ、高さ７５ｍｍ）（Ｐａｃｋａｒｄ，Ｍｅｒｉｄｅｎ，Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）に装入し、Ｃｏｂｒａガンマ計数管（これもＰａｃｋａｒｄ製）で計数した。バックグラウンド放射線を差し引いた後で、４回の実験の結果を平均して結果を計算した。薬剤を含まない対照ウエルにおける細菌付着の阻害％として結果を示す。放射能標識アッセイの結果先ず、２０ｍＭエタノールアミン、６Ｍ尿素，ｐＨ９．５中のヒト及びウシβ −カゼインの各溶液を調製し、次いで、３，０００ダルトンのカットオフを有するＣｅｎｔｒｉｃｏｎメンブランフィルター（Ａｍｉｃｏｎ，ＭＡ）を用い限外濾過によりＰＢＳ中で２回洗浄した。上記放射能アッセイに適した緩衝液に再懸濁した後、これらの試料を該アッセイでテストした。異なる番号のついた実験は異なる日に実施した。表１に示すように、ヒトβ−カゼインは０．７５ｍｇ／ｍｌ以上の濃度で５０％以上の阻害率を示した。表１を参照する場合、高阻害％が「作用物質（ａｇｅｎｔ）」の高レベルの対生物活性を示し、低阻害％が「作用物質」の低レベル活性を示すことに留意されたい。ウシβ−カゼインは１．５ｍｇ／ｍｌの濃度でさえ有意な活性を示さなかった。これらの結果は、ヒト乳由来のβ−カゼインが牛乳由来のβ−カゼインとは異なる対生物活性を有することを示した。ＧＬＵ−Ｃ酵素を用いて（上記のように調製して）得られたヒトβ−カゼインの水解物も０．７５ｍｇ／ｍｌ以上の濃度で活性（＞５０％の阻害率）であった。精製組換えβ−カゼインのＧＬＵ−Ｃ水解物を３．０ｍｇ／ｍｌでテストすると、該水解物は、ヒト乳β−カゼイン水解物と類似の活性を示した。従って、この組換えタンパク質を細菌から大量に製造して、インフルエンザ菌に対する天然ヒト乳β−カゼインの抗付着活性を保持するタンパク質を大量に得ることができる。ＥＬＩＳＡアッセイインフルエンザ菌の調製チョコレート寒天プレートから収穫したインフルエンザ菌を７ｍｌのＰＢＳ− ＢＳＡに懸濁し、３５０μｌのビオチン−カプロン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（０．０１ｇビオチン／１ｍｌジメチルスルホキシド；Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）と共に室温で１５分間インキュベートしてビオチン化した。ビオチン化細菌をそれぞれ２，７００ｒｐｍで３０分間３回洗浄して過剰なビオチンを除去した。次いで、ＰＢＳ−ＢＳＡを用い、標識細菌を２．４のＯＤ₆₀₀で再懸濁した。中咽頭細胞ドナーから中咽頭（ＯＰ）細胞を捕集し、リン酸緩衝塩水（ＰＢＳ）中にプールした。ＰＢＳ中で一回洗浄した細胞懸濁液を再懸濁し、血球計数器を用いて計数した。細胞をＰＢＳ中１ｍｌ当たり２．５×１０⁵細胞の密度に調整した。ＯＰ細胞の付着を促進するために、９６ウエルプレート（Ｌｉｎｂｒ−ｏ−ＩＣＮ，ＣｏｓｔａＭｅｓａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）をＬ−リシンでコーティングし、次いで１．２５％グルタルアルデヒドに暴露した（架橋の形成）。プレートを十分に洗浄して残留グルタルアルデヒドを除去した。９６ウエルプレートの各ウエルに５０μｌのＯＰ細胞調製物を接種して、１ウエル当たり１．２５×１０⁴細胞の最終濃度を得た。指定ウエルをＰＢＳのみ（ＯＰ細胞を含まない）と共にインキュベートしてプラスチックに結合する非特異的細菌を測定するためのバックグラウンド対照ウエルとして供した。接種したプレートを２，７００〜３，０００ｒｐｍで１０分間遠心して懸濁細胞調製物を沈殿させ、吸引し、湿潤チャンバー内で一晩３７℃でインキュベートした。翌朝、ＣＰ細胞を含むプレートを５％ＢＳＡを含むＰＢＳで４時間処理して、非特異的細菌の付着を防止した。付着アッセイに用いる前に、プレートを２００μｌのＰＢＳ−ＢＳＡで３回洗浄した。付着の測定ビオチン化インフルエンザ菌をβ−カゼイン又は対照緩衝液（ＰＢＳ−ＢＳＡ）に１：１希釈し、振盪水浴中３７℃で３０分間インキュベートした。５０μｌの予備インキュベーション混合物をＯＰ細胞アッセイプレートの適切なウエルに装入し、３７℃で６０分間インキュベートした。アッセイプレートをＰＢＳ−ＢＳＡで３回洗浄してアッセイを停止し、プレートを６５℃で１０分間熱固定した。プレートを室温に冷却した後、ＰＢＳ−ＢＳＡ中で１００倍希釈したＥｘｔｒａｖｉｄｉｎ−ペルオキシダーゼ複合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）（Ｓｉｇｍａ）１００μｌを各ウエルに加え、プレートを３７℃で４０分間インキュベートした。この複合体はビオチン標識細菌に結合する。ＰＢＳ−ＢＳＡでアッセイプレートを３回洗浄して結合していない過剰な複合体を除去し、ペルオキシダーゼの基質、２，２′−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）１００μｌを各ウエルに加えた。プレートを１０分間インキュベートし、次いで、Ｔｈｅｒｍｏｍａｘ９６ウエルプレート読み取り装置（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ，ＭｅｎｌｏＰａｒｋ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）上で、ＯＰ細胞及びビオチン化細菌を含む陽性対照ウエル（β−カゼインを含まない）が２．５〜３．０のＯＤ₆₀₀に達するまで発色をモニターした。３回の実験の結果を平均して結合結果を計算した。ＥＬＩＳＡアッセイの結果Ｄｅｔｒｏｉｔ５６２細胞は咽頭癌由来であるため、表１に記載のタンパク質を、ボランティアからの正常なヒト中咽頭細胞を用いた抗付着アッセイでもテストした。このＥＬＩＳＡアッセイの結果を表２に示す。この場合もまた、天然ヒト乳β−カゼイン及び組換えヒトβ−カゼインは０．５ｍｇ／ｍｌの濃度でも活性であることが検出されたのに対し、ウシβ−カゼインはＳＥＴＩに記載の実験では不活性であった。該アッセイの最大感度を得るように読み取り値の分析を調整した後でも、ヒトβ−カゼイン及びそのＧＬＵ−Ｃ水解物は０．５ｍｇ／ｍｌ以上の濃度で活性であった（ＳＥＴ II）。従って、これらの結果は、組換えヒトβ−カゼイン、ヒト乳β−カゼイン及びその水解物がインフルエンザ菌のヒト腫瘍細胞への付着同様、正常なヒト中咽頭細胞への付着をも阻害することを示した。上記の実験から、ヒト乳から分離したβ−カゼイン、ヒト乳に含まれているβ −カゼインの組換え形態及びそれらの水解物は、インフルエンザ菌のヒト細胞への付着を阻害するという結論を得た。さらに、インフルエンザ菌が中耳炎に係わりがあることが文献で確認されているので、上記同定形態のヒトβ−カゼインは、ヒト、特にヒト乳幼児の中耳炎の予防及び治療に用い得るとの結論を得た。ヒトβ−カゼインを含むヒト乳の経腸摂取における中耳炎に対する治療効果を考えれば、上記同定形態のヒトβ−カゼインは経腸（経口）摂取すると治療効果があると推断される。上節に記載の治療効果は、治療上有効量の上節記載の少なくとも１種の形態のヒトβ−カゼインと組合わせた、ヒト乳には含まれていない１種以上のタンパク質を含む、例えば人工栄養乳のような経腸液体栄養製品によって得ることができる。さらに、インフルエンザ菌のヒト中咽頭細胞への付着は、経鼻経路を介して又はのどスプレーとして、上節で同定された少なくとも１種の形態のヒトβ−カゼインを治療上有効量含む組成物（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）を投与することにより阻害し得ると結論される。そのような経鼻投与組成物は、滴剤又はスプレーの形態であってよい。ヒトβ−カゼインとインフルエンザ菌との相互作用がβ−カゼインの消化・吸収後よりもむしろ鼻咽頭における直接接触により生じると考えられるので、経腸、のどスプレー及び経鼻製品並びにそれらを用いた方法はヒト細胞へのインフルエンザ菌の付着の阻害に有効であると確信する。上記同定形態のヒトβ−カゼインは、ヒト乳には含まれていない少なくとも１種のタンパク質を含む標準的又は特殊化経腸液体栄養製品、例えば牛乳ベース又は大豆ベースの人工栄養乳及び幼児が消費する他の飲料に配合し得る。好ましい実施態様においては、ヒト乳に含まれている、β−カゼイン以外のいずれのタンパク質又はその水解物も該液体経腸栄養製品には含まれない。そのような製品は、ヒト乳幼児の中耳炎の治療及び予防に有効である。本発明の好ましい実施態様を開示したが、当業者には、本発明の精神又は範囲を逸脱せずに、種々の変更及び改変が可能であることが明らかであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＪＰ，ＭＸ，ＮＺ (72)発明者アンダースン，ステイーブン・ニールアメリカ合衆国、オハイオ・43147、ピカーリントン、ストーンミル・ロード・401 (72)発明者ハーベイ，リンダ・アンアメリカ合衆国、オハイオ・43146、オリエント、ハイナー・ロード・1275

Claims

【特許請求の範囲】１．ヒト乳から分離されたβ−カゼイン、ヒト乳に含まれているβ−カゼインの組換え形態及びそれらの水解物からなる群から選択された治療上有効量の、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのヒト細胞への付着を阻害する少なくとも１種の物質と組み合わせて、ヒト乳には含まれていない少なくとも１種のタンパク質を含む液体経腸栄養製品。２．前記製品が人工栄養乳である、請求項１に記載の液体経腸栄養製品。３．ヒト細胞が中咽頭細胞である、請求項１に記載の液体経腸栄養製品。４．ヒト細胞が中咽頭細胞である、請求項２に記載の液体経腸栄養製品。５．ヒト乳から分離されたβ−カゼイン、ヒト乳に含まれているβ−カゼインの組換え形態及びそれらの水解物からなる群から選択された治療上有効量の、ヒト細胞への付着を阻害する少なくとも１種の物質と組み合わせて、ヒト乳には含まれていない少なくとも１種のタンパク質を含み、ヒト乳に含まれている他のタンパタ質を含まない、液体経腸人工栄養乳。６．ヒト細胞が中咽頭細胞である、請求項５に記載の液体経腸人工栄養乳。７．ヒト乳から分離されたβ−カゼイン、ヒト乳に含まれているβ−カゼインの組換え形態及びそれらの水解物からなる群から選択された、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのヒト中咽頭細胞への付着を阻害する少なくとも１種の物質を治療上有効量含む経鼻投与性組成物。８．ヒト乳から分離されたβ−カゼイン、ヒト乳に含まれているβ−カゼインの組換え形態及びそれらの水解物からなる群から選択された、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのヒト中咽頭細胞への付着を阻害する少なくとも１種の物質を治療上有効量含むのどスプレー組成物。９．ヒト乳から分離されたβ−カゼイン、ヒト乳に含まれているβ−カゼインの組換え形態及びそれらの水解物からなる群から選択された治療上有効量の少なくとも１種の物質と組み合わせて、ヒト乳には含まれていない少なくとも１種のタンパク質を含む液体栄養製品を経腸摂取させることによる、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのヒト細胞への付着を阻害する方法。１０．ヒト乳から分離されたβ−カゼイン、ヒト乳に含まれているβ−カゼインの組換え形態及びそれらの水解物からなる群から選択された治療上有効量の少なくとも１種の物質と組み合わせて、ヒト乳には含まれていない少なくとも１種のタンパク質を含む人工栄養乳をヒト乳幼児に経腸摂食させることによる、ヒト乳幼児におけるＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのヒト細胞への付着を阻害する方法。１１．ヒト乳から分離されたβ−カゼイン、ヒト乳に含まれているβ−カゼインの組換え形態及びそれらの水解物からなる群から選択された治療上有効量の少なくとも１種の物質と組み合わせて、ヒト乳には含まれていない少なくとも１種のタンパク質を含む経腸栄養製品をヒトに摂食させてＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのヒト細胞への付着を阻害することによる、ヒトの中耳炎を治療及び予防する方法。１２．ヒト乳から分離されたβ−カゼイン、ヒト乳に含まれているβ−カゼインの組換え形態及びそれらの水解物からなる群から選択された治療上有効量の少なくとも１種の物質と組み合わせて、ヒト乳には含まれていない少なくとも１種のタンパク質を含む経腸人工栄養乳をヒト乳幼児に摂食させてＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのヒト細胞への付着を阻害することによる、ヒト乳幼児の中耳炎を治療及び予防する方法。１３．ヒト乳から分離されたβ−カゼイン、ヒト乳に含まれているβ−カゼインの組換え形態及びそれらの水解物からなる群から選択された少なくとも１種の物質を治療上有効量含む組成物を経鼻経路を介して投与することによる、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのヒト中咽頭細胞への付着を阻害する方法。１４．ヒト乳から分離されたβ−カゼイン、ヒト乳に含まれているβ−カゼインの組換え形態及びそれらの水解物からなる群から選択された少なくとも１種の物質を治療上有効量含むのどスプレー組成物を投与することによる、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのヒト中咽頭細胞への付着を阻害する方法。