KR20150005852A - 잣나무 잎 추출물을 함유하는 헬리코박터 파일로리 억제용 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 잣나무(Pinus koraiensis Siebold et Zucc) 잎 추출물을 함유하는 헬리코박터 파일로리 억제용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 잣나무(Pinus Koraiensis Siebold et Zucc)잎 추출물 또는 이 추출물로부터 분리 정제한 시링산(syringic acid) 및 쿠마린산(p-coumaric acid)을 함유하는 헬리코박터 파일로리 억제용 조성물의 경우, 헬리코박터 파일로리에 대한 항균 활성를 나타내어 헬리코박터 파일로리를 효과적으로 억제할 수 있다.
본 발명에 따르면, 잣나무(Pinus Koraiensis Siebold et Zucc)잎 추출물 또는 이 추출물로부터 분리 정제한 시링산(syringic acid) 및 쿠마린산(p-coumaric acid)을 함유하는 헬리코박터 파일로리 억제용 조성물의 경우, 헬리코박터 파일로리에 대한 항균 활성를 나타내어 헬리코박터 파일로리를 효과적으로 억제할 수 있다.
Description
본 발명은 헬리코박터 파일로리 억제용 조성물에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 잣나무(Pinus koraiensis Siebold et Zucc) 잎 추출물을 함유하는 헬리코박터 파일로리 억제용 조성물에 관한 것이다.
잣나무(Pinus koraiensis Siebold et Zucc)는 소나무과에 속하는 상록교목으로 해발고도 1,000m 이상에서 자라며 높이 30m, 지름 1m 정도까지 자라는 나무로 수피는 회갈색이고 얇은 조각이 떨어진다. 잎은 짧은 가지 끝에 3 ~ 5개씩 달리며, 뒷면에는 하얀 기공선이 있어 연한 초록색을 띠고, 가장자리에 잔 톱니가 있다. 우리나라에서 자생하는 잣나무의 대한 연구를 보면, Lee 등(Lee HJ, Choi YJ, Choi DH and Hong IP. (2003) Extractives of Pinus koraiensis wood. Mokchae Konghak. 31(5): 49∼56.)은 잣나무 목부의 성분으로는 5-hydroxy-7-methoxyflavone, chrysin, pinocembrin, galangin, 3-hydroxy-5-methoxystilbene, pinosylvin 등의 물질이 함유된 것으로 보고하였다. You(You DY. (2010) A study of anti-oxidation effect and anti-bacterial activation of Pinus koraiensis extract. Thesis Submitted for the Degree of Master of Science in Kyonggi Univ.)은 잣나무 구과 정유 추출물의 항산화효과 및 항균효과에 대한 연구에서 Escherichia coli , Staphylococcus aureus , Candida albicans등에 대해서 모두 99.9% 이상의 항균효과를 나타난다고 보고하였다. Bea 등(Bae BH and Kim YO. (2003) Effect of leaf aqueous extracts from some gymnosperm plant on the seed germination, seedling growth and transplant of Hibiscus syriacus varieties. Korean J. Ecol. 26(1): 37∼47.)은 잣나무 잎의 성분으로는 gallic acid, protocatechuic acid, vanillic acid, syringic acid, p-coumaric acid, scopoletin, (+)-catechin 등의 물질을 분리 동정하였고, Kim 등(Kim JE, Kim WY, Kim JW, Park HS, Lee SH, Lee SY, Kim MJ, Kim AR and Park SN. (2010) Antibacterial, atioxidative activity and component analysis of Pinus koraiensis leaf extracts. J. Soc. Cosmet. Scientists Korea. 36(4): 303∼314.)은 잣나무 잎의 추출물에서 Propionibacterium acnes , Staphylococcus aureus, Pityrosporum ovale , Escherichia coli에 대한 ethyl acetate 분획의 Minimum Inhibitory Cencentrationi(MIC)는 각각 0.06%, 0.25%, 0.13%, 0.50%의 항균활성을 나타냈으며, kaempferol-3-O-glucoside (astragalin), kaempferol-3-O-arabinoside (juglanin) 물질을 분리 동정하였다.
19세기부터 사람의 위에는 구부러진 나선형의 세균이 존재하는 것으로 알려져 왔지만 배양이 불가능하여 오랫동안 무시되어 왔는데, 1983년에 처음으로 순수배양에 성공하여 Campylobacter로 명명되었다. 그 후 Campylobacter와의 차이점이 발견되면서 Helicobacter pylori로 분류되었으며(Goodwin, C. S., Armstrong, J. A., Chilvers, T., Peters, M., Collins, M. D., Sly, L, MacConnell, W. and Harper, W. E. S. (1989) Transfer of Campylobacter pylori and Campylobacter mustelae to Helicobacter gen. nov. as Helicobacter pylori comb. nov. and Helicobacter mustelue comb. nov. respectively. Int. J. Syst. Bacteriol. 39, 397-402.), 현재까지 사람과 동물에서 분리되는 H. pylori와 유사한 14종류가 보고되어 있다. 우리나라 성인의 80% 정도가 이 균에 감염되었으나(Jones, D. M. and Curry, A. (1990) The genesis of coccal forms of Helicobacter pylori, in Helicobacter pylori gastritis and peptic ulcer. Malfertheiner, P and Ditschumeit, H. (Eds.), Springer-Verlh, Berlin, pp. 29, Rhee, K. H., Youn, H. S., Baik, S. C., Lee, W. K. Cho, M. J., Choi, H. J., Maeng, K. Y. and Ko, K. W. (1990) Prevalence of Helicobacter pylori infection in Korea (in Korean). J. Korean Soc. Microbiol. 25, 475-490, teer, H. W. (1975) Ultraststructure of cell migration through the gastric epithelium and its relationship to bacteria. J. Clin. Path. 28, 639-646.) 임상증상을 나타내지 않고 있다가, 어떠한 발병 촉진 인자에 의하여 만성적 위십이지장 궤양을 유발한다는 보고가 있어(Park, C. K., Choi, H. J., Youn, H. S., Lee, W. K., Cho, M. J., Kang, K. H., Baik, S. C. and Rhee, K. H. (1994) Chemotherapy of Helicobacter pylori infection (in korean). J. Korean Soc. Microbiol. 80, 667-672, Rauws, E. A., Langenberg, W., Houthoff, J. and Moore-jones, D. (1990) Is doxycycline more effective than tetracycline HCI in triple therapy of Helicobacter pylori, Gastroenterol. 98, 24-27, Suerbaum, S. and P. Michetri. 2002. Helicobacter pylori infection. N. Engl. J. Med. 347, 1175-1186), H. pylori 자체에 대한 연구와 병행하여 H. pylori에 대한 예방이나 치료를 위한 새로운 방법이 시도될 필요가 있으며, 본 연구에 이용된 잣나무 잎의 항균효과를 활용한 방안도 대안이 될 수가 있을 것이다.
현재 여러 종류의 위궤양 치료제가 시판되고 있으나, 이들은 위산 분비를 억제하거나 위점막을 보호하여 세포가 손상되는 것을 막아주는 기능에 머무르고 있어 궤양 재발에 문제점으로 대두 되고 있다. 이러한 위궤양의 원인에 대하여 Helicobacter pylori가 궤양관련 질병(위염, 위궤양, 십이지장 등)에 깊게 관여한다고 알려졌으며 최근에는 이 균에 의한 위암과의 연관성이 보고되고 있다(Fridovich I (1989) Superoxide dismutase an adaption to paramagnetic gas. J Biol Chem 264, 7761－7762, Halliwell B and Aruoma OJ (1991) DNA damage by oxygen-derived species. FEBS Lett 281, 9－19.). 나선형 몸통과 편모를 가지고 있는 그람음성 세균인 H. pylori는 방어인자를 변경시켜 산을 생성함으로 위염과 위궤양을 발생시킨다고 알려져 이 균의 박멸이 임상에서 다양하게 시도되어 왔으며(Iwuoha CI and Aina JO (1997) Effects of steeping condition and germination time on the alpha-amylase activity, phenolics content and malting loss of Nigerian local red and hybrid short kaura sorghum malt. Food Chem 58, 289－295, Jennings PE and Barnett AH (1998) New approaches to the pathogenesis and treatment of diabetic microangiopathy. Diabetic Med 5, 111－117.), 세계 각국의 이 균에 대한 보균율 조사 결과에 의하면 유럽인의 60%, 아시아인의 90% 이상이 감염되어 있고, 특히 위암 사망률이 높은 한국, 일본 그리고 저개발국가 등이 큰 문제점으로 지적되고 있다. H. pylori 감염으로 유발되는 임상 표현형은 경미한 부증상과 위염에서 위암에 이르기까지 다양하며, H. pylori는 인위적으로 제균을 시도하지 않는 한 대부분 평생 감염이 지속된다(Hubue G, Wray V, and Nahrstedt A (1999) Flavonol Oligosaccharides from the Seeds of Aesculus Hippocastanum, Planta Med 65, 638－640, Higasi GS (2000) Appraisement of antioxidative activity from vegetables. Jpn J Food Ind 57, 56－64.). 현재 치료 요법으로는 항생제와 기존 약물과의 복합 투여에 의한 방법이 제시되고 있으며 bismuth (BIS) 제제, proton pump inhibitor (PPi), ranitidine bismuth citrate (RBC) 등을 근간으로 하는 3중 요법과 BIS를 근간으로 하는 3제 요법에 PPi를 추가하는 4중 요법 등이 사용되고 있으나(Jorge M, Ricardo DS, Jacques R, Vemonique C, Anni C, and Michel M (1991) Procyanidin dimers and trimers from grape seeds. Phytochemistry 30, 1259－1264, Diker KS and Hascelik G (1994) The bactericidal activity of tea against Helicobacter pylori. Lett App Microbiol 19, 299－300.), 치료가 어렵고 항생제의 내성출현, 화학요법제의 약효 한계성이 대두되어 H. pylori 사멸을 위한 예방과 치료를 목적으로 새로운 약물 개발이 절대적으로 필요하다. 최근 이러한 연구 필요성의 대두에 따라 여러 연구자들이 부작용이 없는 천연물에 의한 H. pylori 예방과 치료에 대한 연구가 진행되고 있다( Cho YJ, Chun SS, Lee KH, Kim JH, Kwon HJ, An BJ, and Kim MU (2006) Screening of the antimicrobial activity against Helicobacter pylori and antioxidant by extracts from mulberry fruits. J Korean Soc Food Sci Nutr 35, 15－20, Cho YJ, Ju IS, Kim BO, Kim JH, Lee BG, An BJ, and Choo JW (2007) The antimicrobial activity against Helicobacter pylori and antioxidant effect from the extracts of mulberry leaves. J Korean Soc Appl Biol Chem 50, 334－343, Cho YJ, Lee KH, Cha WS, Ju IS, Yun DH, An BJ, Lee SH, Kim MU, and Chun SS (2009) Purification and Identification of inhibitory compounds from Cheongmoknosang mulberry leaves on Helicobacter pylori. J Appl Biol Chem 52, 65－69, Ju IS and Cho YJ (2009) Purification and Identification of phenol compounds with inhibitory activity on Helicobacter pylori from Rhododendron mucronulatum Flos. extracts. J Life Sci 19, 1125－1131, Kim BO and Cho YJ (2011) Evaluation of in vivo safety on inhibitory compounds agianst Helicobacter pylori from Cheongmoknosang mulberry leaves, Korean J Food Preserv 18, in press, Park KT, Kim JS, Jo BS, An BJ, Chun SS, Kim JH, and Cho YJ (2010) Isolation and identification of inhibitory compounds on Helicobacter pylori from Rosa multiflora Thunberg fruit extracts. J Life Sci 20, 1511－1518, Yun DH, Cha WS, Lee SH, An BJ, Kim JH, Chun SS, Bae JH, and Cho YJ (2010) Purification and Identification of inhibitory compounds on Helicobacter pylori from Cheongmiknosang callus for biomass. J Life Sci 20, 374－380.).
따라서 본 연구에서는 임산자원 부산물 중에서 항균력이 우수한 잣나무 잎을 이용하여 위염과 위궤양의 원인 인자로 작용하는 H. pylori의 억제물질을 분리, 정제 및 구조 동정하고 정제 compound에 의한 H. pylori에 대한 억제효과를 살펴봄으로서 H. pylori 에 대한 예방이나 치료를 위한 천연물을 활용한 기능성 식품을 산업화하기 위한 소재 및 제품 개발에 적용이 가능할 것이다.
이에, 본 발명자들은 상기 종래기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 예의 연구노력한 결과, 잣나무(Pinus Koraiensis Siebold et Zucc)잎 추출물 또는 이 추출물로부터 분리 정제한 시링산(syringic acid) 및 쿠마린산(p-coumaric acid)을 함유하는 헬리코박터 파일로리 억제용 조성물의 경우, 헬리코박터 파일로리에 대한 항균 활성을 나타내어 헬리코박터 파일로리를 효과적으로 억제할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 주된 목적은 헬리코박터 파일로리에 대한 항균 활성를 나타내어 헬리코박터 파일로리를 효과적으로 억제할 수 있는 잣나무(Pinus Koraiensis Siebold et Zucc)잎 추출물을 함유하는 헬리코박터 파일로리 억제용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 잣나무(Pinus Koraiensis Siebold et Zucc)잎 추출물을 함유하는 헬리코박터 파일로리 억제용 조성물을 이용한 위염 또는 위궤양 치료 또는 예방용 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 잣나무(Pinus Koraiensis Siebold et Zucc)잎 추출물을 함유하는 헬리코박터 파일로리 억제용 조성물을 제공한다.
상기 잣나무(Pinus koraiensis Siebold et Zucc)는 소나무과에 속하는 상록교목으로 잣나무 잎은 시중 한약방에서 구입하여 50℃ dry oven에서 건조한 후 40 mesh로 분쇄하여 4℃에서 저온 저장하며 시료로 사용하였다(실시예 1).
본 발명에 있어서, 상기 잣나무 잎 추출물은 종래 알려진 어떠한 추출용매로도 추출될 수 있으며, 바람직하게는 물, 에탄올 또는 이들을 혼합한 용매로 추출하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서는 식품의약품안전청에서 식물을 추출할 때 사용해야하는 용매로 지정한 에탄올로 추출하였다.
본 발명에 있어서, 상기 잣나무 잎 추출물은 페놀성 물질을 다량 함유하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 실시예에 따르면, 추출용매에 따른 페놀성 물질의 용출량을 측정하였을 때 본 발명에서 사용한 용매 중 메탄올(metanol)로 추출하였을 경우 가장 높은 함량의 페놀성 화합물이 용출되었으며, 아세톤(aceton), 부탄올(buthanol), 에탄올(ethanol) 및 물로 추출하였을 경우에도 높은 함량의 페놀성 화합물이 추출되었다(실시예 2 및 도 2).
또한 에탄올 농도에 따른 페놀성 물질의 용출량을 측정하기 위해 상기 페놀성 물질의 용출에 사용된 추출용매에서 식용이 가능 한 유기용매 중 에탄올(ethnol)을 선정하여 다양한 농도로 잣나무 잎의 페놀성 화합물 용출량을 측정하였다. 그 결과, 모든 농도에서 용출되는 페놀성 화합물의 함량이 높았으나, 80% 에탄올로 추출하였을 때 가장 높은 함량을 나타내었다. 또한 추출 시간에 따른 페놀성 물질의 용출량을 측정하기 위해 에탄올을 이용하여 시간별로 페놀성 물질의 용출량을 측정한 결과 12시간까지 용출량이 증가하다가 12시간 이후부터 용출량의 변화가 거의 없음을 확인하였다. 상기와 같은 결과로 잣나무 잎을 물과 80% 에탄올을 이용하여 12시간 추출하는 추출조건을 확립하였다(실시예 2).
본 발명에 있어서, 상기 잣나무 잎 추출물은 시링산(syringic acid) 또는 쿠마린산(p-coumaric acid)을 함유하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 실시예에 따르면, 잣나무 잎으로부터 분리한 헬리코박터 파일로리 억제물질의 분리 및 정제를 한 결과, 정제된 화합물질은 시링산(syringic acid) 또는 쿠마린산(p-coumaric acid)임을 확인하였다(실시예 4 및 5).
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 헬리코박터 파일로리 억제활성을 갖는 잣나무 잎 추출물의 추출방법:
a) 잣나무 잎을 에탄올추출로 에탄올 추출물을 얻는 단계:
b) 상기 a) 단계에서 추출한 에탄올 추출물을 용매 추출법으로 ethyl-acetate(CH3COOC2H5) 용매로 분획 후 얻은 H2O층을 n-buthanol/H2O로 다시 분획하여 n-butanol 층을 얻는 단계:
c) 상기 b) 단계를 통해 얻은 n-butanol 층을 세파덱스 LH-20 open column을 이용한 크로마토그래피를 통해 분획을 얻는 단계:
d) 상기 c)단계를 통해 얻은 분획물을 세파덱스 LH-20 open column을 이용한 크로마토그래피를 통해 분획을 얻는 단계;
e) 상기 d) 단계를 통해 항균활성이 가장 높은 분획물을 MCl-gel CHP 20 open cloumn을 이용한 크로마토그래피를 통해 분획은 얻는 단계로 추출하는 방법을 제공한다.
본 발명에서 사용한 세파덱스 LH-20 open column은 흡착성의 성질로 주로 저분자의 물질의 분리에 이용되고, MCl-gel CHP 20 open cloumn은 다공성 polystylen gel로서 흡착성의 성질을 가지며 구조적 이성질체의 분리에 주로 사용된다.
본 발명에 있어서, 상기 c) 단계에서 얻은 항균활성을 갖는 분획물은 Fr.C(retention time(RT):5~6시간) 및 Fr.D(RT:8~9시간)이고, 상기 d) 단계에서 얻은 항균활성을 갖는 분획물은 Fr.C3(RT:6~7시간), Fr.D-1(RT:6~7시간) 및 Fr.D-2(RT:9~10시간)이고, 상기 e) 단계에서 얻은 항균활성을 갖는 분획물은 Fr.C3-2(RT:7.5~8.5시간)인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 c) 단계에서 얻은 두 가지 분획물의 항균활성을 측정한 결과 clear zone이 확인되어 헬리코박터 파일로리에 대한 항균활성이 있음을 확인하였다(표 4 및 도 9). 또한 상기 c) 단계의 두 가지 분획물을 gadient elution한 결과 4개의 물질로 분리되었으며 4개의 물질로 항균활성을 측정한 결과 d)단계의 세 가지 분획물에서 clear zone이 확인되어 헬리코박터 파일로리에 대한 항균활성이 있음을 확인하였다(표 5, 6 및 도 10, 11). 또한 상기 d) 단계의 세 가지 분획물을 구조적 이성질체인 페놀류의 분리가 용이한 MCl-gel CHP-20 column을 이용하여 용출한 결과 e) 단계의 분획물에서 clear zone이 확인되어 헬리코박터 파일로리에 대한 항균활성이 있음을 확인하였다(표 7 및 도 12).
발명에 있어서, 상기 Fr.C3-2(RT:7.5~8.5시간) 및 Fr.D-1(RT:6~7시간)은 시링산(syringic acid)이고, Fr.D-2(RT:9~10시간)은 쿠마린산(p-coumaric acid)인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 실시예에 따르면, 헬리코박터 피로리에 대한 항균활성이 있는 Fr.C3-2(RT:7.5~8.5시간), Fr.D-1(RT:6~7시간) 및 Fr.D-2(RT:9~10시간)를 대상으로 구조 동정하였으며 그 결과, Fr.C3-2(RT:7.5~8.5시간) 및 Fr.D-1(RT:6~7시간)는 시링산(syringic acid)으로 동일물질이었으며 Fr.D-2(RT:9~10시간)은 쿠마린산(p-coumaric acid)으로 확인되었다(표 8, 9 및 도 14 내지 19).
본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 시링산(syringic acid) 또는 쿠마린산(p-coumaric acid)을 함유하는 헬리코박터 파일로리 억제용 조성물을 제공한다.
본 발명의 실시예에 따르면, 잣나무 잎 추출물에서 구조 동정한 정제 화합물인 시링산(syringic acid) 및 쿠마린산(p-coumaric acid)을 사용하여 헬리코박터 파일로리에 대한 항균효과를 측정한 결과 각각 clear zone을 나타내었다. 이러한 결과로 볼 때, 두 물질이 단독으로도 헬리코박터 파일로리를 억제할 수 있음을 알 수 있다(표 10 및 도 20).
본 발명에 있어서, 상기 억제용 조성물은 시링산(syringic acid) 및 쿠마린산(p-coumaric acid) 둘 다 함유하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 실시예에 따르면, 잣나무 잎 추출물에서 구조 동정한 정제 화합물인 시링산(syringic acid) 및 쿠마린산(p-coumaric acid)을 혼합하여 항균효과를 측정한 결과 항균효과가 더 높아지는 것을 확인하였다. 이러한 결과로 볼 때, 두 물질을 혼합하여 사용하는 경우 두 물질의 시너지 효과로 헬리코박터 파일로리를 억제하는데 더 효과적일 수 있다는 것을 알 수 있다(표 10 및 도 20).
본 발명에 있어서, 상기 조성물은 위염 또는 위궤양 치료 또는 예방용도로 사용되는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따르면, 본 발명의 잣나무 잎 추출물을 함유하는 조성물이 위염과 위궤양의 원인인자로 작용하는 헬리코박터 파일로리(H. pylori)에 대한 억제효과를 확인하였다. 이러한 결과로 볼 때, 본 발명의 조성물이 헬리코박터 파일로리에 의한 위염 또는 위궤양의 치료 또는 예방을 위해 사용될 수 있음을 알 수 있다.
잣나무(Pinus Koraiensis Siebold et Zucc)잎 추출물 또는 이 추출물로부터 분리 정제한 시링산(syringic acid) 및 쿠마린산(p-coumaric acid)을 함유하는 헬리코박터 파일로리 억제용 조성물의 경우, 헬리코박터 파일로리에 대한 항균 활성를 나타내어 헬리코박터 파일로리를 효과적으로 억제할 수 있다.
이러한 효과로 볼 때, 본 발명의 조성물이 헬리코박터 파일로리에 의한 위염 또는 위궤양의 치료 또는 예방을 위해 사용될 수 있다.
도 1은 잣나무 잎의 형태를 나타낸 것이다.
도 2는 잣나무 잎으로부터 추출용매에 따라 추출된 페놀성 물질의 용출량을 나타낸 것이다.
도 3은 잣나무 잎으로부터 에탄올 농도에 따라 추출된 페놀성 물질의 용출량을 나타낸 것이다.
도 4는 잣나무 잎으로부터 추출시간에 따라 추출된 페놀성 물질의 용출량을 나타낸 것이다.
도 5는 헬리코박터 파일로리균에 대한 잣나무 잎 추출물의 항균활성을 측정한 결과를 나타낸 것이다(①물 추출물 ②80% 에탄올 추출물. A:50μg/0.1mL, B:100μg/0.1, C: 150μg/0.1mL, D: 200μg/0.1mL, E : Control).
도 6은 80% 에탄올로 추출한 잣나무 잎 추출물을 정제하는 하는 과정을 나타낸 모식도이다.
도 7은 헬리코박터 파일로리에 대한 잣 나뭇잎 추출물의 여러 분획물의 억제 활성을 나타낸 것이다(A:Buthanol layer, B:Aqueous layer, C:Ethylacetate layer, D:Control).
도 8은 80% 에탄올로 추출한 잣나무 잎 추출물을 세파덱스 LH-20을 이용하여 얻은 분획물을 나타낸 것이다.
도 9는 80% 에탄올로 추출한 잣나무 잎 추출물을 세파덱스 LH-20을 이용하여 얻은 분획물의 헬리코박터 파이로리 억제활성을 나타낸 것이다(A:fraction A(200μg/0.1mL phenolic), B:fraction B(200μg/0.1mL phenolic), C:fraction C (200μg/0.1mL phenolic), D:fraction D (200μg/0.1mL phenolic), E:control).
도 10은 fraction C를 세파덱스 LH-20을 이용하여 얻은 분획물의 헬리코박터 파이로리 억제활성을 나타낸 것이다(A:fraction C-1, B:fraction C-2, C:fraction C-3, D:control).
도 11은 fraction D를 세파덱스 LH-20을 이용하여 얻은 분획물의 헬리코박터 파이로리 억제활성을 나타낸 것이다(A:fraction D-1, B:fraction D-2, C:fraction D-3, D:fraction D-4, E:control).
도 12는 fraction C-3을 세파덱스 LH-20을 이용하여 얻은 분획물의 헬리코박터 파이로리 억제활성을 나타낸 것이다(A:fraction C-3-1, B:fraction C-3-2, C:control).
도 13은 잣 나뭇잎 추출물로부터 정제한 화합물의 thin layer chromatography 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 화합물 A 및 B의 1H-NMR 스펙트럼 결과를 나타낸 것이다.
도 15는 화합물 A 및 B의 13C-NMR 스펙트럼 결과를 나타낸 것이다.
도 16은 시링산(syringic acid)의 분자구조를 나타낸 것이다.
도 17은 화합물 C의 1H-NMR 스펙트럼 결과를 나타낸 것이다.
도 18은 화?물 C의 13C-NMR 스펙트럼 결과를 나타낸 것이다.
도 19는 쿠마린산(p-coumaric acid)의 분자구조를 나타낸 것이다.
도 20은 잣나무 잎으로부터 분리한 화합물의 억제 활성을 나타낸 것이다( ①:Syringic acid, ②:p-coumaric acid, ③:Syringic acid + p-coumaric acid (1:1 w/v). A: 50μg/0.1mL, B: 100μg/0.1mL, C: 150μg/0.1mL, D: 200μg/0.1mL, E: Control).
도 2는 잣나무 잎으로부터 추출용매에 따라 추출된 페놀성 물질의 용출량을 나타낸 것이다.
도 3은 잣나무 잎으로부터 에탄올 농도에 따라 추출된 페놀성 물질의 용출량을 나타낸 것이다.
도 4는 잣나무 잎으로부터 추출시간에 따라 추출된 페놀성 물질의 용출량을 나타낸 것이다.
도 5는 헬리코박터 파일로리균에 대한 잣나무 잎 추출물의 항균활성을 측정한 결과를 나타낸 것이다(①물 추출물 ②80% 에탄올 추출물. A:50μg/0.1mL, B:100μg/0.1, C: 150μg/0.1mL, D: 200μg/0.1mL, E : Control).
도 6은 80% 에탄올로 추출한 잣나무 잎 추출물을 정제하는 하는 과정을 나타낸 모식도이다.
도 7은 헬리코박터 파일로리에 대한 잣 나뭇잎 추출물의 여러 분획물의 억제 활성을 나타낸 것이다(A:Buthanol layer, B:Aqueous layer, C:Ethylacetate layer, D:Control).
도 8은 80% 에탄올로 추출한 잣나무 잎 추출물을 세파덱스 LH-20을 이용하여 얻은 분획물을 나타낸 것이다.
도 9는 80% 에탄올로 추출한 잣나무 잎 추출물을 세파덱스 LH-20을 이용하여 얻은 분획물의 헬리코박터 파이로리 억제활성을 나타낸 것이다(A:fraction A(200μg/0.1mL phenolic), B:fraction B(200μg/0.1mL phenolic), C:fraction C (200μg/0.1mL phenolic), D:fraction D (200μg/0.1mL phenolic), E:control).
도 10은 fraction C를 세파덱스 LH-20을 이용하여 얻은 분획물의 헬리코박터 파이로리 억제활성을 나타낸 것이다(A:fraction C-1, B:fraction C-2, C:fraction C-3, D:control).
도 11은 fraction D를 세파덱스 LH-20을 이용하여 얻은 분획물의 헬리코박터 파이로리 억제활성을 나타낸 것이다(A:fraction D-1, B:fraction D-2, C:fraction D-3, D:fraction D-4, E:control).
도 12는 fraction C-3을 세파덱스 LH-20을 이용하여 얻은 분획물의 헬리코박터 파이로리 억제활성을 나타낸 것이다(A:fraction C-3-1, B:fraction C-3-2, C:control).
도 13은 잣 나뭇잎 추출물로부터 정제한 화합물의 thin layer chromatography 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 화합물 A 및 B의 1H-NMR 스펙트럼 결과를 나타낸 것이다.
도 15는 화합물 A 및 B의 13C-NMR 스펙트럼 결과를 나타낸 것이다.
도 16은 시링산(syringic acid)의 분자구조를 나타낸 것이다.
도 17은 화합물 C의 1H-NMR 스펙트럼 결과를 나타낸 것이다.
도 18은 화?물 C의 13C-NMR 스펙트럼 결과를 나타낸 것이다.
도 19는 쿠마린산(p-coumaric acid)의 분자구조를 나타낸 것이다.
도 20은 잣나무 잎으로부터 분리한 화합물의 억제 활성을 나타낸 것이다( ①:Syringic acid, ②:p-coumaric acid, ③:Syringic acid + p-coumaric acid (1:1 w/v). A: 50μg/0.1mL, B: 100μg/0.1mL, C: 150μg/0.1mL, D: 200μg/0.1mL, E: Control).
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예
1 : 잣나무 잎 추출물의 제조
본 실험에 사용한 잣나무 잎은 시중 한약방에서 구입하여 50℃ dry oven에서 건조한 후 40 mesh로 분쇄하여 4℃에서 저온저장하며 시료로 사용하였다(도 1). 항균활성 측정을 위한 잣나무 잎 추출물 제조는 물(열수) 추출물의 경우 건조 잣나무 잎 1g에 증류수 200mL를 가하고 액이 100mL가 될 때까지 가열한 후 냉각하고 교반 추출하였으며, 에탄올 추출물은 시료에 각 농도별 에탄올을 100mL 가하여 24시간 동안 상온 교반 추출하였으며, 추출액은 Whatman No.1 filter paper로 여과한 후 필요에 따라 rotary vacuum evaporator(Eyela NE, Japan)에서 농축하여 시료로 사용하였다.
실시예
2 : 페놀성(
Phenolic
) 화합물 정량
총 페놀 화합물은 Folin-Denis 방법(Folin O and Denis W. (1912) On phosphotungastic-phosphomolybdic compounds as color reagents. J. Biol. Chem. 12: 239-249)으로 측정하였으며, 시료 1mL에 95% ethanol 1mL와 증류수 5 mL를 첨가하고 1 N Folin-ciocalteu reagent 0.5 mL를 넣어 잘 섞어주고, 5분간 방치한 후, 5% Na2CO3 1mL를 가한 후, 흡광도 725nm에서 1시간 이내에 측정하여 갈산(gallic acid)를 이용한 표준곡선으로부터 양을 환산하였다.
1)추출 용매에 따른 페놀성 물질의 용출량 측정
잣나무 잎으로부터 페놀성 화합물(phenolic compounds)을 추출하기 위하여 추출용매를 달리하여 페놀성 화합물의 용출량을 알아보았다. 그 결과 도 2에서와 같이 메탄올(methanol)을 이용하여 추출하였을 때 28.1mg/g으로 본 실험에 사용한 용매 중 가장 높은 함량의 페놀성 화합물이 용출되는 것을 알 수 있었으며, 아세톤(aceton)과 부탄올(buthanol)을 용매로 하였을 때 각각 22.6mg/g, 19.9mg/g의 함량을 나타내었다. 에탄올(Ethanol)과 물 추출물은 각각 12.8mg/g, 12.4mg/g으로 비슷하였다. 유기용매로 추출하는 것이 물을 용매로 하여 추출하였을 때보다 높은 추출물을 나타내어 잣나무 잎의 페놀성 화합물가 극성용매에서 용해도가 높은 것으로 확인되었다.
2)에탄올 농도에 따른 페놀성 물질의 용출량 측정
잣나무 잎 추출물의 추출 조건을 확립하기 위하여 식용이 가능 한 유기용매 중 에탄올(ethanol)을 선정하여 다양한 농도의 에탄올을 추출용매로 하여 잣나무 잎의 페놀성 화합물(phenolic compounds)의 용출량을 측정하였다. 그 결과 도 3에서와 같이 잣나무 잎의 물 추출물의 페놀성 화합물 함량보다 에탄올 70 ∼ 100% 추출물의 함량이 높았으며, 80% 에탄올 추출물에서 13.5 mg/g으로 가장 높은 함량을 나타내었다. 이는 에탄올 농도에 따라 용출되어 나오는 페놀성 물질의 종류가 극성의 차이에 의해 다양한 용출양상을 나타내기 때문인 것으로 판단된다.
3) 추출 시간에 따른 페놀성 물질의 용출량 측정
잣나무 잎 추출물을 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori) 억제활성을 위한 용도로 적용하고자 추출 용매를 물과 인체에 유해하지 않으며 페놀성 물질의 용해도가 높은 에탄올을 이용하여 33시간 동안 3시간 간격으로 페놀성 물질의 용출량을 측정하였다. 그 결과 도 4와 같이 6시간에서 12시간까지 용출량이 서서히 증가하다가 12시간 이후 용출량의 변화가 거의 없음을 알 수 있었다.
이상의 결과를 분석한 결과 물 추출물보다 80% ethanol 추출물이 높은 용출량을 나타내었고 12시간 추출하였을 때 용출량이 가장 높은 것으로 나타나 생리기능성 탐색을 위하여 잣나무 잎을 물과 80% ethanol을 이용하여 12시간 추출하여 시료로 사용하기로 하였다.
실시예
3 : 헬리코박터
파일로리
(
Helicobacter
pylori
) 항균 활성 효과 측정
1) 균의 배양
실험에 사용한 균주는 위, 십이지장궤양 원인균인 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori)로서 표준균주인 ATCC 43504를 사용하여 실험하였다. H. pylori의 배양에는 최적배지(special pepton 0.5 g, agar 0.75 g, NaCl 0.25 g, yeast extract 0.25 g, beef extract 0.2 g 및 pyruvic acid 0.025 g)를 사용하였으며 H. pylori 배양은 미호기성 조건을 유지시켜주기 위해서 10% CO2 incubator를 이용하였고, incubator의 습도는 항상 95% 이상으로 유지하였으며, agar plate상에서 배양은 37℃로 48 ~ 72시간 동안 실시하였다(Gavidson PH and Parish ME. (1989) Methods for testing the efficacy of food antimicrobals. J. Food Technol. 43: 148-154).
2) 디스크 법(
Disc
method
)을 이용한 항균활성 검색
디스크 법(Disc method)에 의한 항균활성 검색은 최적배지 plate에 준비한 균 배양액 100μL를 분주하여 멸균 유리봉으로 도말한 다음, 멸균된 지름 8mm 크기의 disc paper를 올려놓고 0.45μm membrane filter로 제균한 잣나무 잎 추출물 0.1mL에 phenol함량이 50μg/0.1mL, 100μg/0.1mL, 150μg/0.1mL, 200μg/0.1mL가 되도록 분주하였다. 대조구로는 멸균 수 0.1mL를 흡수시켜 24시간 동안 배양시켰으며, disc 주위의 clear zone 생성 유무와 직경을 측정함으로써 항균활성을 계산하여 표 1에 나타내었다. 하기 데이터는 mean ± SD (n = 3)로 나타내었다.
|
Helicobacter pylori |
Clear zone (mm) | |||||||||
| Phenolic contents (μg/0.1 mL) | ||||||||||
| Water extracts | 80% EtOH extracts | |||||||||
| 01) | 502) | 1003) | 1504) | 2005) | 01) | 502) | 1003) | 1504) | 2005) | |
| -6) | 8.3 | 8.3 | 9.5 | 12 | - | 8.3 | 8.4 | 9.4 | 13 | |
1)0μg/0.1mL(phenolic 함량/잣나무 잎 추출물), 2)50μg/0.1mL(phenolic 함량/잣나무 잎 추출물), 3)100μg/0.1mL(phenolic 함량/잣나무 잎 추출물), 4)150μg/0.1mL(phenolic 함량/잣나무 잎 추출물), 5)200μg/0.1mL(phenolic 함량/잣나무 잎 추출물), 6)측정되지 않음.
위염의 직·간접적 원인균인 Helicobacter pylori균에 대한 잣나무 잎 추출물의 항균활성을 phenolic 함량을 50 ~ 200μg/0.1mL로 첨가하여 항균효과를 살펴본 결과 표 1 및 도 5와 같이 물 추출물과 80% ethanol 추출물을 200μg/0.1mL phenolic의 농도에서 각각 12, 13 mm의 clear zone이 나타나 비교적 Helicobacter pylori에 대한 항균효과는 우수하였다.
실시예
4 : 잣나무 잎으로부터 분리한
Helicobacter
pylori
억제 물질의 분리 및 정제
1) 정제를 위한 잣나무 잎 추출물의 제조
건조된 잣나무 잎 5 kg에 시료의 10배 volume의 80% ethanol을 가하고 실온(25℃)에서 24시간 추출한 후 원심분리(10,000 ppm, 15 min)하여 상징액과 침전물을 얻었고 이 침전물은 다시 80% ethanol을 가하여 위와 같은 추출과정을 4회 반복하였다. 각각의 상징액을 모아 Whatman No. 1 filter paper로 여과하고 rotary evaporator로 농축한 후 ethanol 추출물로써 분획을 위한 시료로 사용하였다.
2) 용매에 의한 잣나무 잎 추출물의 분획
농축한 ethanol 추출액에 초산에틸(ethyl-acetate)을 동량 첨가하여 용매 분획하고, 분획물들에 대한 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori) 억제활성을 측정하였다. 항균활성을 나타내는 분획에 n-butanol을 동량 첨가하여 용매 분획하고, 항균활성을 측정하여 Helicobacter pylori에 대해 항균활성을 가지는 n-butanol층을 얻었다. 향후 정제는 n-butanol층을 대상으로 실시하였다. 그 결과는 표 2에 나타내었다. 하기 데이터는 mean ± SD (n = 3)로 나타내었다.
| Type of solvent | Clear zone (mm) |
| Control | -1) |
| Buthanol layer | 12.5 |
| Aqueous layer | 8.3 |
| Ethylacetate layer | 8.9 |
1)나타나지 않음.
페놀성 물질의 함량(200 μg/0.1 mL)
그 결과, 표 2 및 도 7과 같이 butanol layer, aqueous layer, ethyl acetate layer 에서 각각 12.5, 8.9, 8.3bmm의 저해환을 나타내었다. butanol layer의 항균활성이 가장 높아 butanol 층 분획물을 Sephadex LH-20 open column(4.5×50cm)을 이용하여 정제하였다.
3)
Helicobacter
pylori
억제 물질의 정제
(1) Sephadex LH-20 open column에 의한 정제
잣나무 잎으로부터 용매 분획하여 얻은 활성분획인 n-butanol층을 동결 건조하여 얻은 고형분 3 g을 흡착성 성질로 주로 저분자의 물질분리에 이용되는 Sephadex LH-20 column(4.5x50cm)을 이용하여 흡착성의 성질에 의해 분리하였다. 용출액은 80% ethanol을 사용하였고, 용출속도는 1.0mL/min tube당 15mL을 취하여 분획한 후 각 분획물을 Folin-Denis 방법을 사용하여 페놀성 함량을 측정하였고, 각 분획물로 disc method 방법으로 Helicobacter pylori의 저해활성을 실험하였다.
(2) MCI-gel CHP 20P open column에 의한 정제
다공성 polystyrene gel로서 흡착성 성질로 주로 구조적 이성질체의 분리에 주로 이용되는 MCI-gel을 이용하였으며, 용출용매는 일반적인 reverse phase type인 H2O→EtOH로 용출하여 분획물을 Helicobacter pylori에 대한 저해활성을 확인하였다.
(3) Thin layer chromatography
Open column에 의해 분리된 용출액을 silica gel plate(5.0 × 5.0 cm)에 spot한 다음 toluene : ethyle acetate : formate acid (5:4:1, v/ v/ v)의 용매를 사용하여 전개하여 건조시키고, FeCl3/K3Fe(CN)6을 분무하여 70℃부근에서 발색시켜 band를 확인하였다.
표 2 및 도 7에서 나타나는 바와 같이 부탄올(butanol) 층의 항균활성이 가장 높아 butanol 층을 농축한 후 Sephadex LH 20 column(5 x 50cm)을 이용하여 80% ethanol을 이동상으로 하여 용출하였다. 그 결과 도 8과 같이 Fraction A ~ D의 4가지 분획물을 얻을 수 있었다.
각 분획물을 농축하여 100 mL로 맞추고, 각각의 페놀성 화합물의 ?량을 측정하였고 그 결과를 표 3에 나타내었다. 하기 데이터는 mean ± SD (n = 3)로 나타내었다.
| Fraction Number | Phenolic contents (μg/mL) |
| Fraction A | 921.44±0.1 |
| Fraction B | 851.17±0.2 |
| Fraction C | 1959.27±0.5 |
| Fraction D | 1285.40±0.4 |
상기 표 3과 같이 fraction C(RT: 5.9시간)가 1959.3±0.5 μg/ mL, fraction D(RT: 8.3시간)가 1285.4±0.4 μg/mL의 순으로 높게 나타났다.
또한 각 분획물의 항균활성을 측정한 결과를 표 4 및 도 9에 나타내었다. 하기 데이터는 mean ± SD (n = 3)로 나타내었다.
| Fraction | Diameter of clear zone (mm) |
| Control | -1) |
| Fraction A | - |
| Fraction B | - |
| Fraction C | 10.1 |
| Fraction D | 12.3 |
1)나타나지 않음.
페놀성 물질의 함량 : 200 μg/0.1mL
표 4 및 도 9와 같이 fraction C와 D에서 10.1과 12.3mm의 clear zone이 확인되어 H. pylori에 대한 항균활성을 나타내었다.
또한, Fraction C와 D를 Sephadex LH-20 column(4.5×50cm)으로 H20→EtOH (0~100%)로 gadient elution한 결과 fraction C는 C-1(RT: 3.8시간), C-2(RT: 4.9시간), C-3(RT: 6.6시간)등 3개의 물질로 분리되었고, fraction D는 D-1(RT: 6.8시간), D-2(RT: 9.6시간), D-3(RT: 11.5시간) 및 D-4(RT: 12.9시간) 등 4개의 물질로 분리되었다. 각각의 분획물로 Helicobacter pylori에 대한 항균활성을 확인하였으며 그 결과는 표 5 및 도 10에 나타내었다. 하기 데이터는 mean ± SD (n = 3)로 나타내었다.
| Fraction | Diameter of clear zone (mm) |
| Control | -1) |
| Fraction C-1 | - |
| Fraction C-2 | - |
| Fraction C-3 | 10.7 |
1)나타나지 않음.
페놀성 물질의 함량 : 200 μg/0.1mL
그 결과, fraction C에서는 표 5 및 도 10에서와 같이 fr. C-1, C-2에서는 항균활성이 검출되지 않았으며, fr. C-3에서 10.7mm의 clear zone이 확인되었다.
| Fraction | Diameter of clear zone (mm) |
| Control | -1) |
| Fraction D-1 | 11.2 |
| Fraction D-2 | 9.8 |
| Fraction D-3 | - |
| Fraction D-4 | - |
1)나타나지 않음.
페놀성 물질의 함량 : 200 μg/0.1mL
상기 Fraction D에서는 표 6과 도 11에서와 같이 fr. D-1와 D-2에서 각각 11.2와 9.8mm의 clear zone이 확인되었으며 fr. D-3와 D-4에서는 clear zone이 검출되지 않았다. 따라서 fr. C-3, fr. D-1과 D-2 이 세 가지 분획물을 선택하여 구조적 이성질체인 페놀류의 분리가 용이한 MCI-gel CHP-20 column을 이용하여 reverse phase type인 H2O→EtOH(0→100%)로 농도를 증가시키며 용출한 결과 도 6과 같이 fraction C-3에서는 C-3-1(RT: 4.2시간)과 C-3-2(RT: 8.0시간) 등 2종의 물질이 분리되었고, fraction D-1, fraction D-2는 단일 물질로 확인되었다. 상기 데이터는 mean ± SD (n = 3)로 나타내었다.
분리된 fraction C-3-1과 fraction C-3-2에 대한 Helicobacter pylori의 저해효과를 측정하였고 그 결과는 표 7및 도 12에 나타내었다. 하기 데이터는 mean ± SD (n = 3)로 나타내었다.
| Fraction | Diameter of clear zone (mm) |
| Control | -1) |
| Fraction C-3-1 | - |
| Fraction C-3-2 | 10.4 |
1)나타나지 않음.
페놀성 물질의 함량 : 200 μg/0.1mL
그 결과, 표 7과 도 12에서와 같이 fraction C-3-2에서의 10.4 mm의 clear zone을 얻고, fraction D-1와 fraction D-2에서 각각 11.2와 9.8 mm의 clear znoe을 확인할 수 있었다.
실시예
5 : 정제 활성 물질의 구조 동정
(1) Melting point 및 〔α〕D 측정
융해점은 시료 1 mg을 취하여 미량융점 측정 장치를 이용하여 측정하였으며,〔α〕D는 시료 5mg을 Me2O 및 MeOH에 용해하여 polarimeter에 의해 측정하였다.
(2) Infrared Spectrum (IR) 측정
IR spectrum은 할로겐화 알칼리 정제법을 이용하였다. 순수 분리된 시료 1 mg을 KBr 100 mg 분말과 잘 섞어 배합한 후 압력을 가해 가압 정제를 만들어 측정하였다.
3) 핵자기공명분광기(Nuclear Magnetic Resonance ; NMR) spectrum의 측정
NMR spectrum은 FT 방법(Pulse Fourier Transform method)을 이용하여 순수정제물 10mg을 측정 용매 DMSO에 용해시키고 TMS[Tetramethylsilane ;(CH3)4Si]를 기준 물질로 하여 PMR(400 MHz)로 측정하였다.
그 결과는 하기에 나타내었다.
1) Compound A
mp : 206～209℃
FAB-MS m/z = 198 [M-H]-
1H-NMR : δ: 7.32(1H, s), 3.87(3H, s)
13C-NMR: δ: 150.41, 115.36, 120.86, 145.10, 120.86, 115.36, 165.77, 60.12
Compoud A는 흰색 분말상이였으며, melting point는 205 ~ 209℃였고, FAB-MS spectrim 상에서 분자량 198을 나타내었다. 1H-NMR spectrum은 7.32ppm(1H, s)의 benzene ring를 갖는 구조로 예측되었고, 3.87ppm(3H, s)의 methoxy기가 2개 있는 것으로 확인되었다(도. 14). 13C-NMR spectrum에서 δ 165.77의 carboxyl기의 탄소 signal이 관찰되었으며, methoxy기의 탄소signal인 δ 60.12가 관찰되었다(도. 15). 또한, methine 탄소인 δ 115.36이 관찰되어, 표 8에서와 같이 확인되었다. 이러한 결과로 Compoud A는 syringic aicd로 동정하였다(도 16).
| Carbon NO. | δC | δH |
| 1 | 150.41 | - |
| 2 | 115.36 | 7.32 (1H, s) |
| 3 | 120.86 | - |
| 4 | 145.10 | - |
| 5 | 120.86 | - |
| 6 | 115.36 | 7.32 (1H, s) |
| 7 | 165.77 | - |
| OCH3 | 60.12 | 3.87 (3H, s) |
δ units in ppm downfield from internal TMS in DMSO
2) Compoud B
Compoud B는 흰색 분말상이였으며, melting point는 205 ~ 209℃였고, FAB-MS spectrim 상에서 분자량 198을 나타내었다. 1H-NMR spectrum은 7.32ppm(1H, s), 3.87ppm(3H, s)의 methoxy기가 2개 있는 것으로 확인되어 Compound A와 동일한 것으로 추측되었다. 13C-NMR spectrum에서도 δ 165.77의 carboxyl기의 탄소 signal과 methoxy기의 탄소signal인 δ 60.12, methine 탄소인 δ 115.36이 관찰되어, Compound A의 분석결과와 동일하여 Compoud B는 Compound A와 동일물질로 syringic aicd임이 확인되었다(도 16).
3) Compound C
mp : 210～213℃
FAB-MS m/z = 164 [M-H]-
1H-NMR : δ: 7.45 (2H, d, J=8.6 Hz), 6.81 (2H, d, J=8.6 Hz), 7.53 (1H, d, J=16.0 Hz), 6.29 (1H, d, J=16.0 Hz)
13C-NMR: δ: 127.2, 131.0, 116.7, 161.1, 146.6, 115.5, 171.0
Compoud C는 황색 분말상이였으며, melting point는 210 ~ 123℃였고, FAB-MS spectrim 상에서 분자량 164를 나타내었다. 1H-NMR spectrum 분석 결과 7.45(2H, d, J=8.6 Hz), 6.81(2H, d, J=8.6 Hz)에서 두개의 ortho coupling doublets의 aromatic 링을 가지는 구조로 관찰되었고(도 17), 13C-NMR spectrum에서는 δ 116.71과 146.66는 carboxyl기의 탄소 signal이 관찰되어, 표 9와 도. 18과 같이 확인 되었다. 이러한 결과로 Compoud C는 p - coumaric acid로 동정하였다(도 19).
| Carbon NO. | δC | δH |
| 1 | 127.2 | - |
| 2 | 131.0 | 7.45 (2H, d, J=8.6 Hz) |
| 3 | 116.7 | 6.81 (2H, d, J=8.6 Hz) |
| 4 | 161.1 | - |
| 5 | 116.7 | 6.81 (2H, d, J=8.6 Hz) |
| 6 | 131.0 | 7.45 (2H, d, J=8.6 Hz) |
| 7 | 146.6 | 7.53 (1H, d, J=16.0 Hz) |
| 8 | 115.5 | 6.29 (1H, d, J=16.0 Hz) |
| COOH | 171.0 | - |
δ units in ppm downfield from internal TMS in DMSO
실시예 6 : 구조 동정한 정제 화합물의 헬리코박터 파일로리 저해 효과
1H-NMR spectrum과 13C-NMR spectrum 분석으로 구조 동정한 syringic acid와 p-coumaric acid를 사용하여 Helicobacter pylori에 대한 항균효과를 알아보기 위해 disc method로 측정한 결과 표 10 및 도 20과 같았다. 페놀성 물질의 농도를 50μg/0.1mL, 100μg/0.1mL, 150μg/0.1mL, 200μg/0.1mL로 조절하여 syringic acid와 p-coumaric acid를 단일물질로 실험한 결과 syringic acid는 200μg/0.1mL의 농도에서 13mm의 clear zone이 나타났으며, p-coumaric acid는 200μg/0.1mL의 농도에서 12 mm의 clear zone이 나타났다. syringic acid 와 p-coumaric acid 두 가지 물질을 혼합하여 50 ~ 200μg/0.1mL의 농도로 처리하여 syringic effect를 살펴본 결과 disc paper에 150μg/0.1mL의 농도로 첨가하여 항균활성을 측정하였을 때 17mm의 저해 환을 나타내어 200μg/0. mL의 농도에서 15 mm보다 높은 항균활성이 확인되었다. 이는 최적농도가 150μg/0.1mL인 것으로 판단되며, 본 연구의 결과 또한 Syringic acid 와 p-Coumaric acid가 단독으로 Helicobacter pylori에 대해 항균효과를 나타내지만 두 물질의 혼합에서 의한 synersy 효과로 인해 항균효과는 더욱 높아지는 것으로 확인되었다. 이러한 결과로 볼 때 정제한 단일물질의 처리보다 추출물에 의한 항균효과가 보다 효과적일 수 있어서 산업화를 위한 더 좋은 조건을 갖추고 있다고 판단되어진다. 이러한 결과는 rosemary(Yun SJ. (2006) Inhibition activity of extracts from herb plants on Helicobacter pylori. Kyungpook National University), 뽕잎(Yun DH. (2010) Screening and identification of inhibitory compounds on Helicobacter pylori from Chenonhmoknosang callus for biological mass production. Kyungpook National University), 진달래(Ju IS. (2009) Screening of biological activity and purification, identification of inhibitory compounds on Helicobacter pylori from the Rhododendron mucronulatum. Kyungpook National University.)등의 원료에서 분리, 정제하여 Helicobacter pylori에 대한 항균활성 물질을 동정한 연구 결과에서 단일 물질로 분리 하였을 때 Helicobacter pylori에 대한 항균활성이 높지 않고 여러 가지 물질이 혼합되었을 때 synergy effect에 의해 Helicobacter pylori에 대한 항균활성을 나타낸다고 보고 한 결과와 일치하였다.
| Helicobacter pylori | Clear zone (mm) | ||||
| Phenolic content (μg/0.1 mL) | |||||
| 01) | 502) | 1003) | 1504) | 2005) | |
| Syringic acid | -6) | 12 | 11 | 12 | 13 |
| p-coumaric acid | -6) | 9 | 12 | 12 | 12 |
| Syringic acid + p-coumaric acid | -6) | 12 | 13 | 17 | 15 |
1)0μg/0.1mL(phenolic 함량/잣나무 잎 추출물), 2)50μg/0.1mL(phenolic 함량/잣나무 잎 추출물), 3)100μg/0.1mL(phenolic 함량/잣나무 잎 추출물), 4)150μg/0.1mL(phenolic 함량/잣나무 잎 추출물), 5)200μg/0.1mL(phenolic 함량/잣나무 잎 추출물), 6)측정되지 않음. Syringic acid : p-coumaric acid = 1 : 1(w/w)
이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면 잣나무(Pinus Koraiensis Siebold et Zucc)잎 추출물 또는 이 추출물로부터 분리 정제한 시링산(syringic acid) 및 쿠마린산(p-coumaric acid)을 함유하는 헬리코박터 파일로리 억제용 조성물의 경우, 헬리코박터 파일로리에 대한 항균 활성를 나타내어 헬리코박터 파일로리를 효과적으로 억제할 수 있다. 따라서 잣나무 잎 추출물을 이용한 기능성 식품의 소재로서 산업화에 적용할 수 있다.
Claims (10)
- 잣나무(Pinus Koraiensis Siebold et Zucc)잎 추출물을 함유하는 헬리코박터 파일로리 억제용 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 잣나무 잎 추출물은 잣나무 잎의 물, 에탄올 또는 이들을 혼합한 용매로 추출하는 것을 특징으로 하는 헬리코박터 파일로리 억제용 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 잣나무 잎 추출물은 페놀성 물질을 다량 함유하는 것을 특징으로 하는 헬리코박터 파일로리 억제용 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 잣나무 잎 추출물은 시링산(syringic acid) 또는 쿠마린산(p-coumaric acid)을 함유하는 것을 특징으로 하는 헬리코박터 파일로리 억제용 조성물.
- 하기 단계를 포함하는 헬리코박터 파일로리 억제활성을 갖는 잣나무 잎 추출물의 추출방법:
a) 잣나무 잎을 에탄올추출로 에탄올 추출물을 얻는 단계:
b) 상기 a) 단계에서 추출한 에탄올 추출물을 용매 추출법으로 ethyl-acetate(CH3COOC2H5) 용매로 분획 후 얻은 H2O층을 n-buthanol/H2O로 다시 분획하여 n-butanol 층을 얻는 단계:
c) 상기 b) 단계를 통해 얻은 n-butanol 층을 세파덱스 LH-20 open column을 이용한 크로마토그래피를 통해 분획을 얻는 단계:
d) 상기 c)단계를 통해 얻은 분획물을 세파덱스 LH-20 open column을 이용한 크로마토그래피를 통해 분획을 얻는 단계;
e) 상기 d) 단계를 통해 항균활성이 가장 높은 분획물을 MCl-gel CHP 20 open cloumn을 이용한 크로마토그래피를 통해 분획은 얻는 단계.
- 제 5항에 있어서, 상기 c) 단계에서 얻은 항균활성을 갖는 분획물은 Fr.C(retention time(RT):5~6시간) 및 Fr.D(RT:8~9시간)이고, 상기 d) 단계에서 얻은 항균활성을 갖는 분획물은 Fr.C3(RT:6~7시간), Fr.D-1(RT:6~7시간) 및 Fr.D-2(RT:9~10시간)이고, 상기 e) 단계에서 얻은 항균활성을 갖는 분획물은 Fr.C3-2(RT:7.5~8.5시간)인 것을 특징으로 하는 잣나무 잎 추출물의 추출방법.
- 제 6항에 있어서, 상기 Fr.C3-2(RT:7.5~8.5시간) 및 Fr.D-1(RT:6~7시간)은 시링산(syringic acid)이고, Fr.D-2(RT:9~10시간)은 각각 쿠마린산(p-coumaric acid)인 것을 특징으로 하는 잣나무 잎 추출물의 추출방법.
- 시링산(syringic acid) 또는 쿠마린산(p-coumaric acid)를 함유하는 헬리코박터 파일로리 억제용 조성물.
- 제 8항에 있어서, 상기 억제용 조성물은 시링산(syringic acid) 및 쿠마린산(p-coumaric acid) 둘 다 함유하는 것을 특징으로 하는 헬리코박터 파일로리 억제용 조성물.
- 제 1항 내지 4항, 제 8항 및 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 위염 또는 위궤양 치료 또는 예방용도로 사용되는 것을 특징으로 하는 헬리코박터 파일로리 억제용 조성물.
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-
2013
- 2013-08-07 KR KR1020130093485A patent/KR20150005852A/ko not_active Application Discontinuation
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| CN112153975A (zh) * | 2018-05-21 | 2020-12-29 | (株)碧乐施 | 含有红松副产物提取物的具有幽门螺杆菌除菌效果的组合物 |
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