KR20040085980A - 인터루킨－１ 베타 전환효소 생성 저해활성을 갖는 우방자추출물 - Google Patents

인터루킨－１ 베타 전환효소 생성 저해활성을 갖는 우방자추출물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 인터루킨-1 베타 전환효소 생성 저해활성을 갖는 우방자 추출물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 우방자(Arctii Fructus)로부터 인터루킨-1 베타 전환효소(Interleukin-1β converting enzyme) 생성 저해활성을 나타내며, 인터루킨-1 베타 전환효소의 증가로 인한 염증 질환을 치료하거나 예방하는데 유용하게 이용될 수 있는 유효활성물질을 분리하고, 이를 함유하는 의약물 및 우방자로부터 유효활성물질을 분리하는 방법에 관한 것이다.

Description

인터루킨－１ 베타 전환효소 생성 저해활성을 갖는 우방자 추출물{Arctii Fructus extract with inhibition activity producing Interleukin-1β converting enzyme}
본 발명은 인터루킨-1 베타 전환효소 생성 저해활성을 갖는 우방자 추출물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 우방자(Arctii Fructus)로부터 인터루킨-1 베타 전환효소(Interleukin-1β converting enzyme) 생성 저해활성을 나타내며, 인터루킨-1 베타 전환효소의 증가로 인한 염증 질환을 치료하거나 예방하는데 유용하게 이용될 수 있는 유효활성물질을 분리하고, 이를 함유하는 의약물 및 우방자로부터 유효활성물질을 분리하는 방법에 관한 것이다.
캐스페이즈-1(Caspase-1)로도 불리워지는 인터루킨-1 베타 전환효소(Interleukin-1β converting enzyme)는 염증유발을 일으키는 사이토카인 중의 하나인 인터루킨-1 베타 전구체를 특이부위(Aspartic-acid-alanin position; amino acid 116-117)에서 절단하여 활성형의 인터루킨-1 베타로 전환시키는 시스테인 프로테아제(Cystein protease)이다. 인터루킨-1 베타 전환효소는 크게 두 가지 생물학적 역할을 수행하는데 비활성형인 인터루킨-1 베타를 활성형인 사이토카인으로 전환해주며, 세포 내 중요한 조절단백질의 절단과 다른 캐스페이즈들의활성을 촉매시킴으로써 아폽토시스를 유도한다. 인터루킨-1 베타 전환효소는 또한 인터루킨-1 베타를 매개로 다양한 염증질환과 알츠하이머병, 파키슨병, 다발성 경화증과 같은 퇴행성 뇌질환에 관련이 있다[Livingston DJ.,J. Cell. Biochem,64, 19-26, 1997]. 그 예로 헌팅턴 질병의 마우스 모델에서 인터루킨-1 베타 전환효소의 저해는 병을 더디게 한다고 보고하고 있다[Minghua Chenet al.,Nature Med,6, 797-801, 2000]. 또한, 알츠하이머병에서 인터루킨-1 베타 전환효소의 활성과 단백질이 증가한다고 보고되었다[Zhu SGet al.,J. Neuropathol. Exp. Neurol, 58, 582-587, 1999].
현재 인터루킨-1 베타 전환효소의 저해제들은 활성형의 인터루킨-1 베타의 분비를 막음으로써 각 염증질환과 퇴행성 뇌질환의 치료제 개발을 위한 연구가 진행되고 있다.
우방은 국화과(Compositae)에 속하는 식물로서 한국, 일본과 중국 등지에서 자생하고 있으며, 우방자(Arctii Fructus, 牛蒡子)는 우방의 열매로서 그 성분은 리그난(lignan)으로서 악티게닌(arctigenin), 리그난배당체로서 악틴(arctiin) 등이 알려져 있으며[T. Namba, The encyclopedia of Wakan-Yaku with Color Pictures, Vol I, pp208, Hoikusha, Tokyo, 1993], 한방에서는 풍습은진, 인후풍열(咽喉風熱)을 치료하며, 여러 종(腫)과 창양독(瘡瘍毒)에 사용되고 있으나, 우방자를 이용한 인터루킨-1 베타 전환효소를 조절에 대한 연구는 아직 보고된 바 없다.
이에, 본 발명자들은 인터루킨-1 베타 전환효소를 조절할 수 있는 화합물을 탐색하고자 노력한 결과, 우방자로부터 유효활성물질을 분리하여 이들의 이화학적 특성을 규명하고 상기 유효활성물질이 우수한 인터루킨-1 베타 전환효소 생성 저해효과를 나타냄을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명은 인터루킨-1 베타 전환 효소 생성 저해활성을 나타내는 우방자 추출물 및 이로부터 분리된 유효활성물질을 제공하는데 그 목적이 있다.
또한, 본 발명은 우방자를 메탄올 추출 및 에틸아세테이트(ethylacetate) 추출과 크로마토그래피(chromatography)를 이용하여 인터루킨-1 베타 전환 효소 생성 저해활성을 가지는 유효활성물질을 분리하는 방법을 제공하는데 다른 목적이 있다.
도 1은 화학식 1로 표시되는 화합물의 수소 핵자기공명(1H-NMR) 스펙트럼(spectrum)을 나타낸 것이고,
도 2는 화학식 1로 표시되는 화합물의 탄소 핵자기공명(13C-NMR) 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 3은 화학식 2로 표시되는 화합물의 수소 핵자기공명(1H-NMR) 스펙트럼(spectrum)을 나타낸 것이고,
도 4는 화학식 2로 표시되는 화합물의 탄소 핵자기공명(13C-NMR) 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 5는 화학식 3으로 표시되는 화합물의 수소 핵자기공명(1H-NMR) 스펙트럼(spectrum)을 나타낸 것이고,
도 6은 화학식 3으로 표시되는 화합물의 탄소 핵자기공명(13C-NMR) 스펙트럼을 나타낸 것이다.
본 발명은 인터루킨-1 베타 전환효소(Interleukin-1β converting enzyme) 생성 저해활성을 갖는 우방자(Arctii Fructus) 추출물 및 이를 함유하는 염증질환 치료제를 그 특징으로 한다.
특히, 상기 우방자 추출물의 유효성분은 다음 화학식 1로 표시되는 화합물, 다음 화학식 2로 표시되는 화합물, 다음 화학식 3으로 표시되는 화합물 및 이들의 염 중에서 선택된 1종 또는 2종 이상인 것을 포함한다.
또한, 우방자로부터 유효활성물질을 분리하는 방법을 또 다른 특징으로 한다.
이와 같은 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명은 우방자(Arctii Fructus) 추출물로부터 인터루킨-1 베타 전환효소 생성 저해활성을 나타내며, 인터루킨-1 베타 전환효소의 증가로 인한 염증 질환, 후천성 면역결핍증, 다양한 신경퇴행성 질환, 허혈성 질환(뇌졸증) 등을 저해하거나 예방하는데 유용하게 이용될 수 있는 유효활성물질을 분리하고, 이를 함유하는 의약물 및 우방자로부터 유효활성물질을 분리하는 방법에 관한 것이다.
상기 화학식 1,화학식 2 및 화학식 3으로 나타내는 화합물에 대하여 ESI-MS(electron spray ionization mass spectrometer), 핵자기 공명 스펙트럼 등의 방법을 이용하여 이화학적 특성을 분석한 결과, 다음과 같은 이화학적 특성을 갖는 것으로 확인되었다.
1) 화학식 1로 표시되는 화합물
i) 물질 성상: 분말 ii) 분자량: 358
iii) 분자식: C20H22O5iv) 질량분석치(M-H)-: 357(m/z)
2) 화학식 2로 표시되는 화합물
i) 물질 성상: 분말 ii) 분자량: 536
iii) 분자식: C30H32O9iv) 질량분석치(M-H)-: 535(m/z)
3) 화학식 3으로 표시되는 화합물
i) 물질 성상: 분말 ii) 분자량: 372
iii) 분자식: C21H24O5iv) 질량분석치(M-H)-: 371(m/z)
또한, 듀트로 메탄올(CD3OD)을 용매로 이용하여 측정한 수소 핵자기공명 스펙트럼 및 탄소 핵자기공명 스펙트럼 분석결과, 상기 화학식 1, 화학식 2 및 화학식 3으로 표시되는 화합물로 판명되었다.
상기 화학식 1, 화학식 2 및 화학식 3으로 표시되는 화합물은 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용할 수 있으며, 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 유용하다. 상기 화학식 1, 화학식 2 및 화학식 3으로 표시되는 화합물은 당해 기술 분야에서 통상적인 방법에 따라 약제학적으로 허용되는 산 부가염을 형성할 수 있다. 유리산으로는 유리산과 무기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 브롬산, 황산, 인산 등을 사용할 수 있고 유기산으로는 구연산(citric acid), 초산, 젖산, 주석산(tartaric acid), 말레인산, 푸마르산(fumaric acid), 포름산, 프로피온산(propionic acid), 옥살산, 트리플루오로아세트산, 벤조산, 글루콘산, 메탄술폰산, 글리콜산, 숙신산, 4-톨루엔술폰산, 갈룩투론산, 엠본산, 글루탐산 또는 아스파르트산 등을 사용할 수 있다.
한편, 본 발명은 우방자로부터 우수한 인터루킨-1 베타 전환 효소 생성 저해 활성성분으로서의 상기 화학식 1, 화학식 2 및 화학식 3으로 표시되는 화합물을 추출 분리하는 방법에 또 다른 특징이 있다. 상기한 바대로, 본 발명에 따른 상기 화학식 1, 화학식 2 및 화학식 3으로 표시되는 화합물은 유기 합성방법으로 합성할 수 있고, 또는 본 발명의 방법에 따라 우방자로부터 추출 분리할 수도 있다.
우방자로부터 상기 화학식 1, 화학식 2 및 화학식 3으로 표시되는 화합물을추출 분리하는 방법은 다음 단계를 포함한다:
1) 우방자(Arctii Fructus)를 메탄올로 추출하고 감압농축한 후 에틸아세테이트로 추출하여 에틸아세테이트 추출물을 얻는 단계;
2) 상기 에틸아세테이트 추출물을 농축하고 소량의 혼합용매에 용해시킨 후 크로마토그래픽를 수행하여 활성분획을 농축하여 농축액을 얻는 단계;
3) 상기 농축액을 메탄올에 용해시킨 후 크로마토그래피를 수행하여 활성분획을 모으는 단계; 및
4) 상기 활성분획을 크로마토그래피로 분리하고 용매를 감압건조기로 제거한 후 냉동건조하여 목적화합물을 얻는 단계로 이루어진다.
상기 1) 단계를 구체적으로 설명하면, 우방자를 채취하여 100% 메탄올로 48 시간 환류추출하고 감압여과한 후, 에틸아세테이트를 사용하여 추출한다.
상기 2) 단계를 구체적으로 설명하면, 농축된 에틸아세테이트 추출물을 클로로포름과 메탄올(100:1)의 혼합용매에 용해시킨 후 클로로포름과 메탄올(100:1, 50:1 및 10:1)의 혼합용매를 용출용매로 이용하는 실리카 젤 칼럼 흡착 크로마토그래피(silica gel column adsorption chromatography)를 수행하여 활성분획을 농축한다.
상기 3) 단계를 구체적으로 설명하면, 상기 농축된 활성분획을 메탄올에 용해시킨 후 세파덱스 LH-20 젤 칼럼 크로마토그래피(sephadex LH-20 gel column chromatography)를 수행하여 활성분획을 모은다.
상기 4) 단계를 구체적으로 설명하면, C18 칼럼과물-아세토나이트릴(acetonitrile)(40% 아세토나이트릴) 용출 용매를 이용하는 고압액체 크로마토그래피 high pressure liquid chromatography)로 활성분획을 분리하여 유지시간 22 분대의 활성분획으로부터 화학식 1로 표시되는 화합물을 얻고, 유지시간 27분대의 활성분획으로부터 화학식 2로 표시되는 화합물을 얻고, 마지막으로 유지시간 32분대의 화학식 3으로 표시되는 화합물을 얻는다.
본 발명에 따른 우방자 추출물 또는 유효활성물질이 인터루킨-1 베타 전환효소 생성 저해 활성을 나타내고 있음을 알아보기 위하여 인터루킨-1에 의존적인 Th2 세포주인 D10S 세포로 생체 외 실험을 수행한 결과, 인터루킨-1 베타 전환효소 생성 저해활성을 갖는 것으로 나타났으며, 특별한 부작용이 관찰되지 않아 기존 인터루킨-1 베타 전환효소의 생성 저해 물질보다 더욱 유용할 것으로 사료된다.
이로 인해 상기 화학식 1, 화학식 2, 화학식 3으로 표시되는 화합물 또는 약학적으로 허용되는 이들의 염은 비정상적으로 유발하는 인터루킨-1 베타 전환효소 생성기작을 저해함으로써 인터루킨-1 베타 전환효소의 증가로 인한 염증 질환, 후천성 면역결핍증, 다양한 신경퇴행성 질환, 허혈성 질환(뇌졸증) 등을 저해하거나 예방하는데 유용하게 이용될 수 있다.
따라서, 상기 화학식 1, 화학식 2, 화학식 3으로 표시되는 화합물 또는 약학적으로 허용되는 이들의 염은 임상 투여시에 경구 또는 비경구로 투여, 예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소 적용할 수 있으며, 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다.
상기 의약품 제제 중 경구 투여용 제형으로는 예를 들어 정제,트로키제(troches), 로젠지(lozenge), 수용성 또는 유성현탁액, 조제분말 또는 과립, 에멀젼, 하드 또는 소프트 캡슐, 시럽 또는 엘릭실제(elixirs) 등이 있다. 정제 및 캡슐 등의 제형으로 제제화하기 위해 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴과 같은 결합제; 디칼슘 포스페이트와 같은 부형제; 옥수수 전분 또는 고구마 전분과 같은 붕괴제; 스테아린산 마그네슘, 스테아린산 칼슘, 스테아릴푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌글리콜 왁스와 같은 윤활유가 함유된다. 캡슐제형의 경우는 상기에서 언급한 물질 이외에도 지방유와 같은 액체 담체를 함유한다.
또한, 비경구로 투여할 수 있으며, 비경구 투여는 피하주사, 정맥주사, 근육 내 주사 또는 흉부 내 주사 주입방식에 의한다. 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위해서는 상기 화학식 1, 화학식 2, 화학식 3으로 표시되는 화합물 또는 이의 염을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여형으로 제제화한다.
상기 화학식 1, 화학식 2, 화학식 3으로 표시되는 화합물 또는 이의 염의 유효 용량은 일반적으로 성인 환자 체중 1 kg 당 1 내지 50 mg/일이고, 바람직하기로는 5 내지 20 mg/일이며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정 시간 간격으로 1 일 수회, 바람직하기로는 하루 2 내지 3 회 분할 투여될 수 있다.
한편, 상기 화학식 1, 화학식 2 및 화학식 3으로 표시되는 화합물에 대하여 급성독성 실험을 수행한 결과, MLD(mouse lethal dosage) 값이 500 mg/kg 이상으로 매우 안정하였다.
이하, 본 발명은 다음 실시예에 의거하여 더욱 상세히 설명하겠는바, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 인터루킨-1 베타 전환효소 생성 저해물질의 분리 및 정제
인터루킨-1 베타 전환효소 생성 저해 기작을 조절할 수 있는 화합물을 탐색하기 위하여, 추출 및 크로마토그래피를 이용하여 우방자로부터 화합물을 분리 정제하였다.
먼저, 일신약품에서 구입한 우방자 3 kg을 5 cm 크기로 절단하고 100% 메탄올로 48 시간 동안 추출하여 감압농축한 후 에틸아세테이트로 추출하였다. 상기 에틸아세테이트 층을 농축하여 클로로포름과 메탄올(100:1)을 혼합한 혼합용매에 용해시킨 후 실리카 젤 칼럼 크로마토그래피(20-230 mes, Merck)를 수행하여 활성분획을 농축하였다. 상기 농축물질을 2 ㎖의 메탄올에 용해시킨 후 세파덱스 LH 젤 칼럼 크로마토그래피를 수행하여 활성분획을 모았다. 상기 활성분획을 40% 아세토나이트릴 수용액을 용출용매로 이용하는 고압액체 크로마토그래피(컬럼: C18, 유속: 1.5 ㎖/분, 220 nm 검출)를 수행하여 유지시간 22분대의 활성분획을 분리하고 감압건조기로 용매를 제거한 후 얻은 잔사(residue)를 냉동건조하여 다음 화학식 1로 표시되는 화합물 4 ㎎을 얻었고, 유지시간 27분대의 활성분획을 분리하고 감압건조기로 용매를 제거한 후 얻은 잔사(residue)를 냉동건조하여 다음 화학식 2로 표시되는 화합물 10 mg을 얻었으며, 유지시간 32분대의 활성분획을 분리하고 활성분획을 분리하고 감압건조기로 용매를 제거한 후 얻은 잔사(residue)를 냉동건조하여 다음 화학식 3으로 표시되는 화합물 12 mg을 얻었다.
[화학식 1]
[화학식 2]
[화학식 3]
실시예 2: 유효활성물질의 이화학적 특성 분석
상기 실시예 1에서 얻어진 상기 화학식 1, 화학식 2 및 화학식 3으로 표시되는 화합물의 이화학적인 특성을 분석하기 위하여, ESI-MS(electrospray ionization mass spectrometry, Fisons VG Quattro 400 mass spectrometer, USA), 수소 및 탄소 핵자기 공명 스펙트럼 등의 방법을 이용하였다. NMR 실험은 각 시료를 듀트로 메탄올(CD3OD) 용매로 녹여 5 ㎜ NMR 튜브에서 측정하였으며, 각 용매의 피이크를 내부 표준물질로 하거나 TMS(tetramethylsilane)의 피이크를 기준으로 하여 화학이동을 측정하였다. 상기 화합물에 대하여 물질의 성상, 분자량, 분자식 및 질량을 분석한 결과, 본 발명의 화합물은 다음과 같은 이화학적인 특성을 갖는 것으로 확인되었다.
그 결과, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 물질 성상은 분말이고, 분자량은 358이며 분자식은 C20H22O5로 확인되었고, 상기 화합물의 질량분석치(M-H)-는 357(m/z)이었다. 상기 이화학적 특성과 함께 듀트로 메탄올(CD3OD)을 용매로 측정한 수소 핵자기공명 스펙트럼 및 탄소 핵자기공명 스펙트럼 분석결과, 화학식 1로 표시되는 화합물은 현재까지 보고되지 않은 인터루킨-1 베타 전환효소 생성 저해효과를 나타내는 화합물로 판명되었다[도 1 및 도 2].
또한, 상기 화학식 2로 표시되는 화합물의 물질 성상은 분말이고, 분자량은 536이며 분자식은 C30H32O9로 확인되었고, 상기 화합물의 질량분석치(M-H)-는535(m/z)이었다. 상기 이화학적 특성과 함께 듀트로 메탄올(CD3OD)을 용매로 측정한 수소 핵자기공명 스펙트럼 및 탄소 핵자기공명 스펙트럼 분석결과, 화학식 2로 표시되는 화합물은 현재까지 보고되지 않은 인터루킨-1 베타 전환효소 생성 저해효과를 나타내는 화합물로 판명되었다[도 3 및 도 4].
또한, 상기 화학식 3으로 표시되는 화합물의 물질 성상은 분말이고, 분자량은 372이며 분자식은 C21H24O5로 확인되었고, 상기 화합물의 질량분석치(M-H)-는 371(m/z)이었다. 상기 이화학적 특성과 함께 듀트로 메탄올(CD3OD)을 용매로 측정한 수소 핵자기공명 스펙트럼 및 탄소 핵자기공명 스펙트럼 분석결과, 화학식 3으로 표시되는 화합물은 현재까지 보고되지 않은 인터루킨-1 베타 전환효소 생성 저해효과를 나타내는 화합물로 판명되었다[도 5 및 도 6].
<NMR 데이타>
1) 화학식 1로 표시되는 화합물
13C NMR (CD3OD) δ 35.3, 38.9, 42.5, 47.7, 56.3, 72.9, 113.2, 113.9, 116.0, 116.1, 122.2, 123.0, 130.7, 131.4, 146.0, 146.3, 149.0, 181.3
2) 화학식 2로 표시되는 화합물
13C NMR (CD3OD) δ 35.5, 39.0, 42.5, 47.7, 55.2, 56.3, 56.7, 61.7, 72.8, 89.0, 110.4, 113.3, 114.0, 114.9, 116.1, 118.2, 130.2, 131.5, 132.6, 133.3, 145.3,146.2, 147.5, 148.1, 148.9, 172.9
3) 화학식 3으로 표시되는 화합물
13C NMR (CD3OD) δ 35.4, 38.8, 42.4, 47.7, 56.3, 56.5, 72.8, 113.1, 113.6, 113.8, 116.0, 122.0, 123.0, 130.7,132.8, 146.4, 149.0, 149.1, 150.1, 181.5
실험예 1: 유효활성물질의 인터루킨-1 베타 전환효소 생성 저해효과 측정
상기 실시예 1에서 얻은 화학식 1, 화학식 2 및 화학식 3으로 표시되는 화합물의 인터루킨-1 베타 전환효소 생성 저해효과를 측정하기 위하여, 본 발명자들은 인터루킨-1에 의존적인 Th2세포주인 D10S세포를 이용하여 다음과 같은 생체 외 실험을 수행하였다.
D10S 세포를 차가운 피비에스로 3회 세척하여 배지 내에 존재하던 인터루킨-1 베타를 완전하게 제거한 후 96-웰 마이크로플레이트(96-well microplate)에서 2.5 ×104세포/웰이 될 때까지 배양한 후 인터루킨-1 베타 2 ng/㎖ 및 본 발명의 화합물을 1 내지 100 ㎍/㎖의 농도로 상기 D10S 세포에 처리하고 5% CO2-95% 공기조건으로 37 ℃에서 36 시간 동안 배양하였다. 이때, 인터루킨-1 베타만 처리한 세포를 양성대조군으로 이용하고, 인터루킨-1 베타 및 본 발명의 화합물 모두를 처리하지 않은 세포를 음성대조군으로 사용하였다. 36 시간 후 현미경으로 D10S세포의 모양을 관찰하여 인터루킨-1 베타 전환효소 생성 저해활성 여부를 1차 판정하고, 원심분리하여 얻은 세포를 이용하여 AC-YVAVD-AFC(Ac-Tyr-Val-Ala-Asp-7-amino-4-trifluoromethyl coumarin)를 기질로 인터루킨-1 베타 전환효소 활성을 측정하였다. 양성대조군(인터루킨-1 베타만 처리한 경우)의 인터루킨-1 베타 전환효소 활성과 음성대조군(인터루킨-1 베타 및 화합물을 처리하지 않은 경우)의 인터루킨-1 베타 전환효소 활성을 기준으로 본 발명의 화합물이 나타내는 인터루킨-1 베타 전환효소 생성 저해효과를 결정하여 다음 표 1에 나타내었다.
D10S 세포주에서의 인터루킨-1 베타 전환효소 생성 저해효과 비교
구분 저해율(IC50, ㎍/㎖)
화학식 1의 화합물 25.0
화학식 2의 화합물 20.0
화학식 3의 화합물 8.0
상기 표 1에 나타나 있듯이, 인터루킨-1 베타에 의하여 유도된 D10S 세포의 인터루킨-1 베타 전환효소에 대한 화학식 1로 표시되는 화합물의 저해활성 농도(IC50, 50%의 저해효과를 나타내는데 요구되는 농도)는 25.0 ㎍/㎖이고, 화학식 2로 표시되는 화합물의 저해활성 농도는 20 ㎍/㎖, 화학식 3으로 표시되는 화합물의 저해활성 농도는 8 ㎍/㎖로 우수한 인터루킨-1 베타 전환효소 생성 저해효과를 가짐을 알 수 있었다. 상기의 결과로부터, 본 발명의 화학식 1, 화학식 2 및 화학식 3으로 표시되는 화합물은 생체 외에서 인터루킨-1 베타 전환효소의 생성을 저해할 수 있는 천연물 유래의 화합물임을 확인할 수 있었다.
실험예 2: 랫트에 대한 경구투여 급성 독성실험
6주령의 특정병원부재(SPF) SD계 랫트를 사용하여 급성독성실험을 실시하였다. 군당 2 마리씩의 동물에 화학식 1, 화학식 2 및 화학식 3으로 표시되는 화합물을 각각 0.5% 메틸셀룰로즈 용액에 현탁하여 1 g/kg/1 ㎖의 용량으로 단회 경구 투여하였다. 시험물질 투여 후 동물의 폐사여부, 임상증상, 체중변화를 관찰하고 혈액학적 검사와 혈액생화학적검사를 실시하였으며, 부검하여 육안으로 복강장기와 흉강장기의 이상여부를 관찰하였다. 시험결과, 시험물질을 투여한 모든 동물에서 특기할 만한 임상증상이나 폐사된 동물은 없었으며, 체중변화, 혈액검사, 혈액생화학 검사, 부검소견 등에서도 독성변화는 관찰되지 않았다. 이상의 결과 실험된 화합물은 모두 랫트에서 500 mg/kg까지 독성변화를 나타내지 않으며 경구 투여 최소치사량(LD50)은 500 mg/kg이상인 안전한 물질로 판단되었다.
제제예 1: 시럽제의 제조
본 발명의 화학식 1, 화학식 2 또는 화학식 3으로 표시되는 화합물 또는 약학적으로 허용되는 이의 염을 유효성분 2%(중량/부피)로 함유하는 시럽은 다음과 같은 방법으로 제조한다.
화학식 1, 화학식 2 및 화학식 3의 화합물의 산부가염, 사카린, 당을 온수 80 g에 용해시켰다. 이 용액을 냉각시킨 후, 여기에 글리세린, 사카린, 향미료, 에탄올, 소르브산 및 증류수로 이루어진 용액을 제조하여 혼합하였다. 이 혼합물에 물을 첨가하여 100 ㎖가 되게 하였다. 상기 부가염은 실시예에 의한다른 염으로 대치시킬 수 있다.
상기 시럽제의 구성성분은 다음과 같다.
화학식 1, 2 또는 3의 화합물의 염산염 ········2 g
사카린 ······················· 0.8 g
당 ························ 25.4 g
글리세린······················ 8.0 g
향미료 ······················ 0.04 g
에탄올 ·······················4.0 g
소르브산 ······················0.4 g
증류수 ·······················적량
제제예 2: 정제의 제조
유효성분 15 mg이 함유된 정제는 다음과 같은 방법으로 제조한다.
화학식 1, 화학식 2 또는 화학식 3으로 표시되는 화합물의 염산염 250 g을 락토오스 175.9 g, 감자전분 180 g 및 콜로이드성 규산 32 g과 혼합하였다. 이 혼합물에 10% 젤라틴 용액을 첨가시킨 후, 분쇄해서 14 메쉬체를 통과시켰다. 이것을 건조시키고 여기에 감자전분 160 g, 활석 50 g 및 스테아린산 마그네슘 5 g을 첨가해서 얻은 혼합물을 정제로 만들었다.
상기 정제의 구성성분은 다음과 같다.
화학식 1, 2 또는 3의 화합물의 염산염 ·····250 g
락토오스 ···················175.9 g
감자전분 ····················180 g
콜로이드성 규산 ················ 32 g
10% 젤라틴 용액 ················ 적량
감자전분 ····················160 g
활석 ······················ 50 g
스테아린산 마그네슘 ··············· 5 g
제제예 3: 주사액제의 제조
유효성분 10 mg을 함유하는 주사액제는 다음과 같은 방법으로 제조하였다.
화학식 1, 화학식 2 또는 화학식 3으로 표시되는 화합물의 염산염 1 g, 염화나트륨 0.6 g 및 아스코르브산 0.1 g을 증류수에 용해시켜서 100 ㎖을 만들었다. 이 용액을 병에 넣고 20 ℃에서 30 분간 가열하여 멸균시켰다.
상기 주사액제의 구성성분은 다음과 같다.
화학식 1, 2 또는 3의 화합물의 염산염 ···· 1 g
염화나트륨···················0.6 g
아스코르브산··················0.1 g
증류수·····················적량
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따른 우방자로부터 얻어진 유효활성물질은 독성이 없고 우수한 인터루킨-1 베타 전환효소의 생성 저해효과를 나타내므로 인터루킨-1 베타 전환효소의 증가로 인한 염증 질환, 후천성 면역결핍증, 다양한 신경퇴행성 질환, 허혈성 질환(뇌졸증) 등을 저해하거나 예방하는데 유용하게 이용될 수 있다.

Claims (4)

  1. 우방자(Arctii Fructus) 추출물이 유효성분으로 함유된 것을 특징으로 하는 염증질환 치료제.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 추출물에는 다음 화학식 1로 표시되는 화합물, 다음 화학식 2로 표시되는 화합물, 다음 화학식 3으로 표시되는 화합물 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염 중에서 선택된 1종 이상이 유효성분으로 함유된 것을 특징으로 하는 염증질환 치료제.
    [화학식 1]
    [화학식 2]
    [화학식 3]
  3. 1) 우방자(Arctii Fructus)를 메탄올로 추출하고 감압농축한 후 에틸아세테이트로 추출하여 에틸아세테이트 추출물을 얻는 단계;
    2) 상기 에틸아세테이트 추출물을 농축하고 소량의 혼합용매에 용해시킨 후 크로마토그래피를 수행하여 활성분획을 농축하여 농축액을 얻는 단계;
    3) 상기 농축액을 메탄올에 용해시킨 후 크로마토그래피를 수행하여 활성분획을 모으는 단계; 및
    4) 상기 활성분획을 크로마토그래피로 분리하고 용매를 감압건조기로 제거한 후 냉동건조하여 다음 화학식 1, 화학식 2 또는 화학식 3으로 표시되는 화합물을 얻는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 우방자로부터 유효활성물질의 분리방법.
    [화학식 1]
    [화학식 2]
    [화학식 3]
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 2) 단계의 크로마토그래피는 실리카 젤 칼럼 흡착 크로마토그래피(silica gel column adsorption chromatography)이고, 3) 단계의 크로마토그래피는 세파덱스 LH-20 젤 칼럼 크로마토그래피(sephadex LH-20 gel column chromatography)이며, 4) 단계의 크로마토그래피는 고압액체 크로마토그래피(high pressure liquid chromatography)인 것을 특징으로 하는 분리방법.
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