KR102421305B1 - 단백질 티로신 포스파타제 1b 억제 활성을 보유한 화합물, 및 상기 화합물을 이용한 당뇨병을 예방, 개선 또는 치료하기 위한 조성물 - Google Patents

단백질 티로신 포스파타제 1b 억제 활성을 보유한 화합물, 및 상기 화합물을 이용한 당뇨병을 예방, 개선 또는 치료하기 위한 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 단백질 티로신 포스파타제 1B 억제 활성을 보유한 화합물, 및 상기 화합물을 이용한 당뇨병을 예방, 개선 또는 치료하기 위한 조성물에 관한 것이다.
특히, 차(Camellia sinensis) 의 종자 껍질에서 유래한 화합물을 특정하고, 이 화합물의 단백질 티로신 포스파타제 1B 억제 활성을 입증하고, 이 화합물을 당뇨병 예방, 개선 또는 치료 조성물에 활용하고자는 것이다.

Description

단백질 티로신 포스파타제 1B 억제 활성을 보유한 화합물, 및 상기 화합물을 이용한 당뇨병을 예방, 개선 또는 치료하기 위한 조성물{Compounds for inhibiting protein tyrosine phosphatase 1B activity, and composition compring the compounds for treating diabetes}
본 발명은 단백질 티로신 포스파타제 1B 억제 활성을 보유한 화합물, 및 상기 화합물을 이용한 당뇨병을 예방, 개선 또는 치료하기 위한 조성물에 관한 것이다.
특히, 차(Camellia sinensis) 의 종자 껍질에서 유래한 화합물을 특정하고, 이 화합물의 단백질 티로신 포스파타제 1B 억제 활성을 입증하고, 이 화합물을 당뇨병 예방, 개선 또는 치료 조성물에 활용하고자는 것이다.
단백질 티로신 포스파타제 1B(PTP1B, protein tyrosine phosphatase 1B)는 멤브레인 비통과 포스파타제이며 인슐린 유도 신호 전달의 중요한 음성 조절인자이다(Byon et al. 1998; Bakke and Haj 2015). PTP1B 과발현은 인슐린 저항성을 유도하여, 결국 고혈당증 및 대사 장애를 유발하는데, 이 증상들은 진성 당뇨병 및 비만의 중요한 병원성 원인이 된다(Lam et al. 2006; Zhang et al. 2015). 이러한 질병에 대해 PTP1B는 억제의 중요한 표적이며 제2형 당뇨병을 치료하고 비만을 예방하기 위한 유망한 전략으로 제안되고 있다(Koren and Fantus 2007; He et al. 2014).
많은 연구들이 차(Camellia sinensis) 잎과 꽃의 화학 및 약리학을 분석했지만 종자 껍질을 조사한 연구는 거의 없었다(Sharma et al. 2020). 본 발명자는 C. sinensis 종자 껍질의 생리 활성 성분과 약리학적 효과를 확인하면 당뇨병에 대한 잠재적 치료법을 밝힐 수 있다는 점에 주목하였다.
선행기술문헌을 살펴보면, 대한민국 공개특허공보 10-2013-0055395에는 '하고초, 애엽 추출물을 유효성분으로 포함하는 단백질 타이로신 탈인산화 효소 저해용 조성물'이 기재되어 있다.
또한, 대한민국 등록특허공보 10-1365017에는 '단백질 타이로신 탈인산화효소 1B 저해 조성물'이 기재되어 있다. 청구항 1을 보면, 타이로신 탈인산화효소 1B 저해제의 제조 공정 중 꾸지뽕 나무 잎 분말의 추출 단계가 기재되어 있는 것을 알 수 있다.
또한, 대한민국 공개특허공보 10-2021-0074865에는 '발효 찻잎의 추출물을 포함하는 당뇨병 예방 또는 치료용 약학적 조성물'이 기재되어 있다.
대한민국 공개특허공보 10-2013-0055395 (2013.05.28 공개) 대한민국 등록특허공보 10-1365017 (2014.02.13 등록) 대한민국 공개특허공보 10-2021-0074865 (2021.06.22 공개)
해결과제는, 차 나무(Camellia sinensis) 종자 껍질의 생리 활성 성분을 특정하고, 이 성분의 약리학적 효과를 확인하여, 당뇨병 예방 또는 치료에 이용될 수 있는 가능성을 밝히는 것이다.
해결수단은,
화학식 1의 카페인(caffeine) 및 화학식 2의 테아플라바노사이드 IV (theaflavanoside IV) 중 1개 이상을 포함하는 단백질 티로신 포스파타제 1B (PTP1B, protein tyrosine phosphatase 1B) 억제용 조성물이다.
[화학식]
Figure 112022004398349-pat00001
해결수단은, 상기 카페인 및 테아플라바노사이드 IV는 차 나무(Camellia sinensis) 종자 씨앗에서 유래한 것을 특징으로 하는 단백질 티로신 포스파타제 1B 억제용 조성물이다.
해결수단은, 단백질 티로신 포스파타제 1B 억제 IC50 으로서,
상기 카페인은 34.4~41.4 uM이고, 테아플라바노사이드 IV는 7.6~9.8 uM 인 것을 특징으로 하는 단백질 티로신 포스파타제 1B 억제용 조성물이다.
해결수단은, 상기 조성물을 포함하는 당뇨병 예방 또는 개선을 위한 조성물이다.
해결수단은, 상기 조성물을 포함하는 당뇨병 예방 또는 치료를 위한 조성물이다.
해결수단은,
차 나무 종자의 껍질을 분쇄하여 분말화하는 단계;
차 나무 종자 껍질 분말을 메탄올로 추출하는 단계;
메탄올 추출물을 n-헥산, EtOAc, n-부탄올 및 H2O로 분획하는 단계;
n-부탄올 분획층을 분리하는 단계; 및
n-부탄올 분획층으로 단백질 티로신 포스파타제 1B 억제제를 제조하는 단계;를 포함하는 단백질 티로신 포스파타제 1B 억제제 제조방법이다.
해결수단은,
상기 마지막 단계는, n-부탄올 분획층에서 카페인(caffeine) 및 테아플라바노사이드 IV (theaflavanoside IV)를 분리하고 이 물질들을 이용하여 단백질 티로신 포스파타제 1B 억제제를 제조하는 단계;인 것을 특징으로 하는, 단백질 티로신 포스파타제 1B 억제제 제조방법이다.
해결수단은, 상기 방법으로 제조된 억제제를 이용한 당뇨병 예방 또는 개선을 위한 조성물이다.
해결수단은, 상기 방법으로 제조된 억제제를 이용한 당뇨병 예방 또는 치료를 위한 조성물이다.
본 발명에 따르는 화합물은 단백질 티로신 포스파타제 1B(PTP1B)에 대한 강력한 억제 활성을 보유하고 있다. 본 발명에 따르는 화합물을 포함하는 조성물은 당뇨병 예방, 개선 또는 치료에 활용될 수 있다.
도 1 내지 도 5는 본 발명에 따르는 화합물의 화학적 구조 및 이 화합물의 단백질 티로신 포스파타제 억제 활성을 나타내는 도면이다.
본 명세서 및 청구 범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 안되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.
따라서 본 명세서에 기재된 실시예, 참조예 및 도면에 기술된 사항은 본 발명의 가장 바람직한 일 예에 불과할뿐이고 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다.
본 발명은 한국연구재단 지원사업(번호 2019061270), 산림과학기술연구개발사업(과제번호 2018121A00-2020- AB01) 및 국립백두대간수목원의 지원으로 이루어졌다.
실험예 1. 차 종자 껍질에 포함된 카페인(caffeine)과 테아플라바노사이드 IV(theaflavanoside IV)의 PTP1B 억제 효능
1. 실험과정
본 발명에서는 차 나무(C. sinensis) 종자 껍질의 메탄올 추출물의 특이성을 결정하기 위해 예비 억제 스크리닝을 수행했다. 조추출물(crude extract)은 용량 의존적으로 PTP1B의 가수분해 활성을 억제하였다.
이에 따라 추출물의 두 가지 주요 컴포넌트인 카페인(caffeine)과 테아플라바노사이드 IV(theaflavanoside IV)를 분취 컬럼 크로마토그래피(preparative column chromatography)를 사용하여 분리 및 정제하였다. 이들 화합물들의 구조는 핵자기 공명, 및 플라잇 고해상도 질량 분석기와 결합된 초고성능 액체 크로마토그래피를 사용하여 확인되었다. 나아가, 이들 성분들의 효소 억제 가능성을 평가하고, 억제 메커니즘 및 억제 상수에 대한 상세한 동역학 분석을 평가했다.
2. Chemicals and reagents
컬럼 크로마토그래피는 실리카겔(230-400 mesh; Merck Co., Darmstadt, Germany), Sfar C18 D 컬럼(Å 30 mm, Biotage, Uppsala, Sweden) 및 Sephadex LH-20(GE Healthcare Bioscience AB, Uppsala, 스웨덴)을 이용하여 수행되었다. 효소 분석은 SpectraMax ID3 Multi-Mode Microplate Reader(Molecular Devices, San Jose, CA, USA)에서 모니터링되었다. 인간 재조합 PTP1B 및 p-니트로페닐 포스페이트(pNPP)는 Enzo Life Sciences(Farmingdale, NY, USA)에서 구입했다. Merck(Merck Co., Darmstadt, Germany)에서 실리카 F254 및 RP-18 F254 크로마토그래피(TLC) 박층 플레이트, 분석 등급 H2O, 아세토니트릴(ACN) 및 메탄올을 구입했다. n-Hexane, 클로로포름, 에틸 아세테이트 및 메탄올은 Duksan Co.(경기, 한국)에서 구입했다. 사용된 모든 시약은 사용 가능한 최고 순도였다.
3. Plant materials
C. sinensis 종자(원산지: 대한민국 하동, 북위 35°, 북위 127°)는 2018년 10월 하동녹차연구소(하동, 대한민국)에서 채집되었다. 물질은 국립백두대간수목원에서 분류되었다(BDNA-2018100869). 추후 연구를 위해 표본을 백두대간 표본관에 보관하였다. 물질은 약 25℃ 실온에서 어둡고 밀폐된 캐빈에서 건조시켰다.
4. Purification of the target compounds
C. sinensis 종자(500g)의 단단한 껍질을 분쇄(약 20메쉬)하고 실온에서 24시간 동안 95% 메탄올(10L)로 2회 추출하였다. 여과된 용액을 농축하여 조추출물의 검(gum) 농축물(13.2g)을 얻었다.
그런 다음 이것을 H2O (2.0 L)에 현탁시키고, n-헥산( 3L x 2, 1.7 g), EtOAc(3 L x 2, 1.4 g), n-부탄올(BuOH)(3 L x 2, 3.7g), 및 H2O (2.4g)으로 연속적으로 분획하였다.
효소 테스트를 사용하여 4개 층의 PTP1B 억제 기능을 조사했다. n-BuOH 분획은 가장 강력한 활성을 나타냈다(50 μg/mL에서 87% 억제).
따라서 이 분획층에 대해 35분에 걸쳐 60개의 분획을(V1-V60)를 생성하기 위하여, H2O 에서 다른 비율의 ACN(10%, 30%, 50%, 70% 및 90%)을 사용하여 역상 실리카겔에서 중압 액체 크로마토그래피(MPLC, Biotage, Uppsala, Sweden)를 수행했다.
유사한 분획(TLC에 의해 결정됨)을 모았다. 분획 V17은, 9:1 H2O:ACN에서 카페인(화합물 1; 45.8 mg)을 분리하기 위하여, 역상 실리카겔(3.0 Х 500 mm, 15 um, Japan Analytical Industry)을 사용하여 분취용 고성능 액체 크로마토그래피(prep-HPLC, JAI, Japan Analytical Industry Co., Ltd., Tokyo, Japan)를 사용했다.
분획 V21 및 V22를 5:1 H2O:ACN을 포함하는 역상 분취 HPLC를 사용하여 정제하여 4개의 하위 분획(V212.1-V212.4)을 얻었다. V212.3 분획(33 mg)을 Sephadex LH-20 컬럼에서 80% 메탄올 중 크로마토그래피를 사용하여 테아플라바노사이드 IV(화합물 2; 15.7 mg)를 분리했다.
화합물의 화학 구조는 분광 데이터에 대한 포괄적인 연구와 발표된 보고서(Yoshikawa et al. 2007)와의 비교를 통해 해명되었다.
5. Identification of isolated compounds
1차원 및 2차원(1D 및 2D) NMR 스펙트럼은 Bruker Avance II 800 및 Avance 700 분광기(Bruker Biospin, Rheinstetten, Germany)를 사용하여 실온(25 ℃) 에서 용매로서 화학적 이동 MeOD 또는 D2O에 대한 내부 대한 내부 표준으로서 테트라메틸실란을 사용하여 기록되었다.
분리된 화합물의 UHPLC-TOF-HRMS(Waters, Milford, MA, USA) 분석은 표준 절차에 따라 수행되었다(Yoshikawa et al. 2007).
Compound 1 : 1H-NMR (800 MHz, methanol-d 4+D2O) δ 3.29 (3H, s, H-1), 3.48 (3H, s, H-3), 3.95 (3H, s, H-7), 7.89 (1H, s, H-8). 13C-NMR (200 MHz, methanol-d 4+D2O) δ 27.44 (C-1), 29.36 (C-3), 33.10 (C-7), 107.35 (C-5), 143.08 (C-8), 148.27 (C-4), 151.92 (C-2), 155.47 (C-6).
Compound 2 : 1H-NMR (700 MHz, methanol-d 4) δ 5.36 (1H, m, H-2) 3.15 (1H, m, H-3), 2.76 (1H, t, J = 13.99, 14.44 Hz, H-3), 6.26 (1H, d, J = 1.85 Hz, H-6), 6.20 (1H, d, J = 1.88 Hz, H-8), 7.34 (2H, d, J = 8.61 Hz, H-2′, 6′), 6.86 (2H, dd, J = 4.01, 8.21 Hz, H-3′, 5′), 5.07 (1H, t, J = 8.15 7.19 Hz, H-1″), 5.32 (1H, d, J = 5.30 Hz, H-1m), 4.31 (1H, dd, J = 5.92, 7.27 Hz, H-1m), 4.53 (1H, dd, J = 5.14, 7.58 Hz, H-1'm). 13C-NMR (175 MHz, methanol-d 4) δ 80.54, 80.49 (C-2), 43.92, 43.72 (C-3), 198.55, 198.48 (C-4), 164.80 (C-5), 97.89 (C-6), 166.23, 166.17 (C-7), 96.83, 96.88 (C-8), 164.48, 164.41 (C-9), 104.95, 104.41 (C-10), 130.60, 130.74 (C-1′), 129.28, 129.18 (C-2′, 6′), 116.41, 116.37 (C-3′, 5′), 158.85, 158.88 (C-4′), 99.20 (C-1″), 78.57 (C-2″), 78.63 (C-3″), 71.18 (C-4″), 76.81 (C-5″), 69.81, 69.76 (C-6″), 102.01, 101.97 (C-1m), 71.29 (C-2m), 82.59 (C-3m), 72.52 (C-4m), 69.64 (C-5m), 18.27 (C-6m), 105.27, 105.31 (C-1m), 74.69 (C-2m), 77.50 (C-3m), 70.90 (C-4m), 66.66 (C-5m), 105.44 (C-1m'), 77.50 (C-2m'), 75.21 (C-3m'), 70.90 (C-4m'), 77.50 (C-5m'), 62.14 (C-6m').
6. Extract analysis using HPLC
추출물은 1260 Infinity Quaternary LC 시스템(Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)이 있는 HPLC를 사용하여 분석되었다.
메탄올 추출물을 100% 메탄올에 용해시켜 1 mg/mL 농도를 얻은 다음 주입하기 전에 0.45 μm 필터를 통과시켰다. 역상 컬럼(Zorbax Eclipse C18, 5mm, 4.6 Х 150 mm i.d., Agilent Technologies)을 사용하여 컬럼 온도 30℃에서 분리했다.
용출에 사용된 용매는 0.1%(v/v) 포름산(A) 또는 ACN(B)을 포함하는 H2O 이고, 기울기는 5% B에서 시작하여 10분에 15%, 38분에 100%, 45분에 100%에 도달했으며, 유속 및 주입 부피는 각각 1.0 mL/min 및 10 μL였다. 검출 파장은 카페인과 테아플라바노사이드 IV를 동시에 모니터링하기 위해 280nm로 설정되었습니다. 각 실행 전에 컬럼을 5% ACN으로 10분 동안 재평형화했다.
7. PTP1B inhibition assays
PTP1B의 효소 활성은 이전에 보고된 방법을 약간 변형하여 측정하였다(Li et al. 2018). 먼저, 화합물을 디메틸 설폭사이드에 용해시키고 필요한 농도로 희석하였다. 효소 반응은 10μL 억제제 또는 비히클을 20μL의 효소(1mg/mL), 40μL의 pNPP(4mM) 및 130μL의 완충액[25mM Tris-HCl(pH 7.5), 1 mM 에틸렌디아민테트라아세트산, 1mM 디티오트레이톨 및 2mM β--머캅토에탄올]을 96웰 플레이트로 하여 수행되었다.
반응 혼합물을 37℃ 에서 30분 동안 인큐베이션하고 SpectraMax M3 다중 모드 마이크로플레이트 판독기에서 모니터링했다. pNPP의 가수분해는 405 nm에서 흡수를 측정하여 검출할 수 있는 p-니트로페놀을 생성했다.
테스트된 화합물의 억제 효과는 최대 억제 농도의 절반(IC50)으로 표시하였다. 억제율(%)은 다음 방정식을 사용하여 구했다.
% inhibition = [(Ac - As) / Ac] Х 100 (1)
기질 및 억제제 농도를 증가시키면서 Lineweaver-Burk 이중 역수 플롯 방법을 사용하여 운동 매개변수를 결정했습니다. 억제 상수(K i) 값은 Dixon 플롯을 해석하고 유효 친화도 상수를 계산하여 추정했다.
모든 실험은 삼중으로 수행되었다. 데이터는 비선형 회귀 프로그램인 Sigma Plot 14.0(SPCC Inc., Chicago, IL, USA)을 사용하여 분석되었다.
8. Slow-binding measurements
PTP1B는 0.2U/mL의 IC50을 갖는 10μL의 경쟁적 억제제와 함께 사전 인큐베이션되었다. 그 다음, 억제제를 Tris-HCl 완충액(pH 7.5)에 각각의 농도로 첨가하고, 혼합물을 37℃에서 0, 5, 15, 30, 45, 60 및 75분 동안 인큐베이션하였다.
그런 다음 각 웰에 20 μL의 pNPP를 첨가하고 20분 동안 30초 간격으로 p-니트로페놀 생성을 직접 측정하였다.
고정 기질(1mM)과 효소(0.02U/mL) 농도를 사용하여 여러 억제제 농도에서 진행 곡선을 얻어, 방정식 (2)-(4)[(Kim 외 2018)]을 이용하여 시간 베이스의 PTP1B 억제와 관련된 운동 매개변수를 결정하였다. 매개변수는 Sigma Plot 14.0을 사용하여 계산되었다.
v/v 0 = exp(-k obst) (2)
k obs = k 4(1+[I]/K i app) (3)
K i app = k 4/k 3 (4)
9. 실험결과
(1) 도 1은 차의 종자 껍질에서 유래된 화합물 1 및 화합물 2의 화학구조이다. 화합물 1 및 2의 구조는 1H-NMR, 13C-NMR, 2D-NMR 및 MS 스펙트럼 데이터를 사용하여 설명된다. 또한, 화합물 2는 글리코시드가 2S- 및 2R- 이성질체의 등가 혼합물이라는 문헌과의 비교에 의해 입증되었다(Akiyam et al. 2000).
(2) 도 2는 Chromatogram obtained for caffeine (A), theaflavanoside IV (B), and crude extract (C) detection at 280 nm이다.
C. sinensis 종자 껍질 조 추출물(1 mg/mL, 10 uL 주입)에 대해 280 nm에서 카페인 및 테아플라바노사이드 IV의 존재에 대해 조사했다(도 2C). HPLC-다이오드 어레이 검출기(DAD) 분석은 카페인(피크 1) 및 테아플라바노사이드 IV(피크 2)의 존재를 밝혀냈다. NMR 데이터를 얻기 전에 각 화합물을 정제하고 순도를 테스트했다. 분리된 화합물의 리텐션 시간은 각각 12.2분 및 14.1분이었고 단일 넓은 피크를 생성하여 순도를 확인했다(도 2A 및 B). 또한 UV 스펙트럼에서 가장 강한 광자 흡수 파장은 각각 카페인 및 테아플라바노사이드 IV의 UV 스펙트럼과 유사하게 피크 1의 경우 207 및 273 nm, 피크 2의 경우 211 및 284 nm였다.
(3) PTP1B는 인슐린 신호전달의 음성 조절에 관여하므로 당뇨병 치료의 잠재적 표적이다(Koren and Fantus 2007). 경쟁적인 PTP1B 억제제인 Ursolic acid(IC50 = 22.4 ± 1.9 mM)는 혼합된 억제 효과를 나타낸다(표 1). 따라서 우리는 pNPP를 기질로 사용하여 분리된 카페인(1)과 테아플라바노사이드 IV(2)를 PTP1B의 억제제로 평가할 때 이를 참조 억제제로 사용했다.
Inhibitory effects of compounds on PTP1B activities
Comp. PTP1B
IC50 1 (μM) Kinetic mode (K i 2) K I K IS
1
2
Ursolic acid4 		37.9 ± 3.5
8.7 ± 1.1
22.4 ± 1.9		 Mixed type I (35.0 ± 2.1)
Competitive (3.7 ± 0.2)
NT		 34.4
NT3
NT		 65.2
NT
NT
All compounds were examined by repeating the set of experiments three times. 1 IC50 values of the compounds represent the concentration responsible for 50% loss in enzymatic activity;2 Value of inhibition constant; 3 NT was not tested; 4 Ursolic acid is the positive control.
(4) 도 3은 (A) Effect of compound 1, 2, and ursolic acid on PTP1B activity. (B) Determination of the reversible inhibitory mechanism of compound 2.이다.
분리된 화합물은 상당한 용량 의존적 PTP1B 억제를 입증했다(도 3A). 화합물 2는 IC50 of 8.7 ± 1.1 uM으로 PTP1B에 대해 높은 활성을 보였고, 화합물 1은 IC50 of 37.9 ± 3.5 uM 으로 중간 정도의 활성을 보였다.
PTP1B에 대한 theaflavanoside IV의 활성은 우르솔산보다 높았다. 이전 보고서에서 수성 차 추출물은 H2O 추출물에 고농도로 존재하는 카페인과 카페인산과 함께 강력한 PTP1B 억제 활성을 나타냈습니다. 또한 홍차가 가장 강한 억제 활성을 보였으며 우롱차와 녹차가 그 뒤를 이었다. 홍차의 활성 성분은 산화된 카테킨에 해당한다(Ma et al. 2011, Sharangi 2009). 우리는 본 발명이 C. sinensis 종자 껍질의 화학에 대한 첫 번째 조사라고 믿는다. 종자 껍질 추출물은 효소 기반 분석에서 높은 PTP1B 억제 활성을 갖는 테아플라바노사이드 IV를 산출했다.
(5) 도 4는 (A) Lineweaver-Burk plots and (B) Dixon plots from the inhibition of 1 on PTP1B activity. (Inset) Represents the secondary plot of the slope and intercept of the straight line versus concentration of compound 1, respectively. (C) Lineweaver-Burk plots and (D) Dixon plots from the inhibition of 2 on PTP1B activity. (Inset) Each curve provides the tendencies for the Michaelis-Menten constant (K m) and maximal velocity (V max).이다.
도 5는 (A) Slow-binding inhibition at different preincubation times for 2 at 7.0 μM. (B) Inhibition as a function of preincubation time for 2. (C) Time course of compound 2-mediated inactivation of PTP1B. (D) k obs on dependence on different concentrations of 2. 이다.
우리는 다음으로 PTP1B에 대한 화합물 1과 2의 기본 억제 메커니즘을 조사했습니다. pNPP가 p-니트로페놀로 가수분해되는 동안 PTP1B의 동역학 거동이 보고되었다(Li et al. 2018, Tan et al. 2017). 이 연구에 사용된 조건에서, 반응은 Michaelis-Menten 역학을 따랐다. 이중-역수 1/V 대 1/[S] 플롯은 다양한 억제제 농도에서 억제제가 없는 경우 여러 직선을 생성했다(1 및 2, 도 4A 및 C).
경쟁적 억제제로서 PTP1B의 운동 활성(V max)은 유지된 반면 Michaelis-Menten 상수(K m)는 화합물 2의 농도에 따라 증가했다. 그러나 화합물 1은 혼합 억제제로 작용하여 V max 를 변화시키면서 K m 을 증가시켰다. 이 행동은 PTP1B가 두 가지 별개의 경로를 통해 화합물 1과 2에 의해 억제된다는 것을 보여준다. 즉 경쟁적 효소 억제제(EI) 복합체와 효소 기질 억제제(ESI) 복합체를 비경쟁적 방식으로 형성한다.
화합물 1과 2의 농도에 대한 기울기의 Dixon 플롯은 각각 Ki = 35.0 ± 2.1 uM 및 3.7 ± 0.2 uM 의 EI 해리 상수를 나타낸다(도 4B 및 D). 더 낮은 K i 는 효소와 억제제 사이의 더 강한 결합을 나타내며, 이는 혼합 억제보다 경쟁적 억제에 대한 선호를 시사한다.
화합물 2는 PTP1B의 활성이 시간이 지남에 따라 감소했기 때문에 PTP1B의 느린 결합 억제제였습니다. 따라서 PTP1B 가수분해 속도는 7 μM의 화합물 2의 존재 하에 시간 경과에 따른 잔류 효소 활성을 측정하여 연구 및 정량화되었다. 느린 결합 매개변수(k 3, k 4, k 5, k 6, and K i app)를 계산하기 위해, 화합물 2의 농도를 증가시키면서 식 (2)를 사용하여 곡선을 분석하였고; K obs 의 리플롯은 [I]로 획득되었습니다(단순한 가역적 느린 결합 효소 이성질체화 또는 메커니즘 기반 억제, 도 3B 및 4). 억제제 2에 대한 K obs 플롯은 선형 모델에 적합했으며, 이는 PTP1B 농도에 대한 선형성 편차가 없음을 시사한다(도 5).
따라서, 억제제 2는 PTP1B에 대한 가역적 단순 느린 결합 억제 활성을 갖는 경쟁적 억제제였다. 억제제 2의 운동 매개변수는 k 3 = 0.002 uM-1·min-1, k 4 = 0.0002 min-1, and K i app = 0.1 uM 이다(표 2). 억제제 1의 혼합 억제 모드(혼합 유형 I 및 II)를 확인하기 위해, 억제제 농도 대 절편 및 기울기의 이차 플롯에서 K I 및 K IS 값을 결정했습니다. 저해제 1의 K I 는 34.4 uM, K IS 는 65.2 uM 으로 유형 I 혼합 저해를 나타낸다. 이것은 ES 복합체가 유리 효소보다 억제제 1에 의해 더 효과적으로 억제된다는 것을 보여준다(표 1).
Kinetic parameters for time-dependent inhibition of PTP1B by compound 2
Compound K i app k 3 k 4
2 0.1 0.002 0.0002
(6) 본 발명에서는 용매 추출 및 역상 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 C. sinensis 종자 껍질의 메탄올 추출물에서 카페인과 테아플라바노사이드 IV(각각 화합물 1 및 2)를 분리했다. HPLC-DAD 분석을 통해 순도를 확인하였고, HRMS 및 NMR 분석을 통해 구조를 밝히고 확인하였다. PTP1B 억제 분석에서 두 화합물 모두 우르솔산에 비해 유망한 억제 효과를 나타냈다. 화합물 1 및 2는 각각 혼합형 및 경쟁적 억제를 나타냈다. 이러한 결과는 화합물 1과 2가 2형 당뇨병과 관련된 매우 어려운 건강 문제를 해결하는 데 유용할 수 있음을 나타낸다.
실시예 1. PTP1B 억제 화합물로서의 카페인(caffeine) 또는 테아플라바노사이드 IV(theaflavanoside IV), 이 화합물을 포함하는 PTP1B 억제 조성물, 및 상기 화합물 또는 조성물을 포함하는 당뇨병 예방, 개선 또는 치료용 조성물
Camellia sinensis(차) 씨앗은 기능 식품 화합물의 잠재적인 공급원으로 확인되었다. 본 발명에서 확인된 카페인과 테아플라바노사이드 IV, 두 화합물은 각각 37.9 ± 3.5 및 8.7 ± 1.1 uM 의 IC50값으로 단백질 티로신 포스파타제 1B(PTP1B)에 대한 강력한 억제를 나타냈다.
운동 연구에서 카페인은 자유 효소에 결합하는 것을 선호하는 혼합 유형 I 모드로 PTP1B를 억제했고, 테아플라바노사이드 IV는 경쟁적이고 가역적인 단순 느린 결합 억제를 보였다 [k 3 = 0.1 mM-1·min-1, k 4 = 0.002 min-1, K i app = 0.0002 uM].
따라서 본 발명에 따르는 단백질 티로신 포스파타제 억제 활성을 보유한 화합물은 차 나무에서 유래된 카페인 또는 테아플라바노사이드 IV이다. 또한, 본 발명에 따르는 단백질 티로신 포스파타제 억제 활성을 보유한 조성물은 상기 화합물 중 1 종 이상을 포함하는 조성물이다. 또한, 본 발명에 따르는 당뇨병을 예방, 개선 또는 치료하기 위한 조성물은 상기 단백질 티로신 포스파타제 억제 활성을 보유한 조성물을 포함하는 조성물이다.
실시예 2. PTP1B 억제제 제조방법
본 발명의 실시예 2에 따르는 방법은,
차 나무 종자의 껍질을 분쇄하여 분말화하는 단계; 차 나무 종자 껍질 분말을 메탄올로 추출하는 단계; 메탄올 추출물을 n-헥산, EtOAc, n-부탄올 및 H2O로 분획하는 단계; n-부탄올 분획층을 분리하는 단계; 및 n-부탄올 분획층으로 단백질 티로신 포스파타제 1B 억제제를 제조하는 단계;를 포함한다.
마지막 단계는, n-부탄올 분획층에서 카페인(caffeine) 및 테아플라바노사이드 IV (theaflavanoside IV)를 분리하고 이 물질들을 이용하여 단백질 티로신 포스파타제 1B 억제제를 제조하는 단계로 대신될 수 있다.
지금까지 본 발명에 대하여 바람직한 실시예를 중심으로 살펴보았다.
본 명세서에 기재된 실시예와 도면에 도시된 구성은 본 발명의 가장 바람직한 하나의 실시예에 관련된 것이고, 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형된 예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다.
따라서 본 발명은 제시되는 실시예에 한정되지 않으며, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의하여 본 발명의 기술 사상과 아래에 기재될 특허청구범위에 기재된 기술사상의 균등한 범위 내에서 다양한 수정 및 변경이 가능한 실시예가 있을 수 있다.

Claims (9)

  1. 화학식 2의 테아플라바노사이드 IV (theaflavanoside IV)를 포함하는 단백질 티로신 포스파타제 1B (PTP1B, protein tyrosine phosphatase 1B) 억제제를 유효성분으로 포함하는 당뇨병 예방 또는 치료를 위한 약학 조성물.
    [화학식 2]
    Figure 112022032401884-pat00008
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 단백질 티로신 포스파타제 1B 억제제에 화학식 1의 카페인(caffeine)이 추가로 포함되는 것을 특징으로 하는 당뇨병 예방 또는 치료를 위한 약학 조성물.
    [화학식 1]
    Figure 112022032401884-pat00009
  3. 청구항 2에 있어서,
    상기 카페인 및 테아플라바노사이드 IV는 차 나무(Camellia sinensis) 종자 씨앗에서 유래한 것을 특징으로 하는, 당뇨병 예방 또는 치료를 위한 약학 조성물.
  4. 청구항 2에 있어서,
    단백질 티로신 포스파타제 1B 억제 IC50 으로서,
    상기 카페인은 34.4~41.4 uM이고, 테아플라바노사이드 IV는 7.6~9.8 uM 인 것을 특징으로 하는, 당뇨병 예방 또는 치료를 위한 약학 조성물.
  5. 화학식 2의 테아플라바노사이드 IV (theaflavanoside IV)를 포함하는 단백질 티로신 포스파타제 1B (PTP1B, protein tyrosine phosphatase 1B) 억제제를 유효성분으로 포함하는 당뇨병 예방 또는 개선을 위한 식품 조성물.
    [화학식 2]
    Figure 112022032401884-pat00010
  6. 당뇨병 예방 또는 치료를 위한 약학 조성물을 제조하는 방법으로서,
    차 나무 종자의 껍질을 분쇄하여 분말화하는 단계;
    차 나무 종자 껍질 분말을 메탄올로 추출하는 단계;
    메탄올 추출물을 n-헥산, EtOAc, n-부탄올 및 H2O로 분획하는 단계;
    n-부탄올 분획층을 분리하는 단계;
    n-부탄올 분획층으로 단백질 티로신 포스파타제 1B 억제제를 제조하는 단계;및 상기 단백질 티로신 포스파타제 1B 억제제를 유효성분으로 포함하는 조성물을 제조하는 단계; 를 포함하는 당뇨병 예방 또는 치료를 위한 약학 조성물을 제조하는 방법.
  7. 청구항 6에 있어서,
    단백질 티로신 포스파타제 1B 억제제를 제조하는 단계는,
    n-부탄올 분획층에서 카페인(caffeine) 및 테아플라바노사이드 IV (theaflavanoside IV)를 분리하고 이 물질들을 이용하여 단백질 티로신 포스파타제 1B 억제제를 제조하는 단계;인 것을 특징으로 하는,
    당뇨병 예방 또는 치료를 위한 약학 조성물을 제조하는 방법.
  8. 당뇨병 예방 또는 개선을 위한 식품 조성물을 제조하는 방법으로서,
    차 나무 종자의 껍질을 분쇄하여 분말화하는 단계;
    차 나무 종자 껍질 분말을 메탄올로 추출하는 단계;
    메탄올 추출물을 n-헥산, EtOAc, n-부탄올 및 H2O로 분획하는 단계;
    n-부탄올 분획층을 분리하는 단계;
    n-부탄올 분획층으로 단백질 티로신 포스파타제 1B 억제제를 제조하는 단계;및 상기 단백질 티로신 포스파타제 1B 억제제를 유효성분으로 포함하는 조성물을 제조하는 단계;를 포함하는 당뇨병 예방 또는 개선을 위한 식품 조성물을 제조하는 방법.
  9. 청구항 8에 있어서,
    단백질 티로신 포스파타제 1B 억제제를 제조하는 단계는,
    n-부탄올 분획층에서 카페인(caffeine) 및 테아플라바노사이드 IV (theaflavanoside IV)를 분리하고 이 물질들을 이용하여 단백질 티로신 포스파타제 1B 억제제를 제조하는 단계;인 것을 특징으로 하는,
    당뇨병 예방 또는 개선을 위한 식품 조성물을 제조하는 방법.
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