KR100420664B1

KR100420664B1 - 배초향에서 분리한 아폽토시스 저해 효과를 나타내는신규한 화합물, 그의 제조방법, 그를 포함하는 약학적조성물 및 용도

Info

Publication number: KR100420664B1
Application number: KR10-2001-0001180A
Authority: KR
Inventors: 고영희; 이충환; 이호재; 이상명; 김현아
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2001-01-09
Filing date: 2001-01-09
Publication date: 2004-03-02
Also published as: KR20020059986A

Abstract

본 발명은 아폽토시스를 억제하는 신규한 화합물, 그의 제조방법, 그를 포함하는 약학적 조성물 및 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 메탄올(methanol) 및 에틸아세테이트 추출과 크로마토그래피(chromatography)를 이용하여 배초향(Agastache rugosa)으로부터 분리한 아폽토시스 저해 활성을 가지는 하기화학식 1및화학식 2로 표시되는 화합물, 그를 포함하는 약학적 조성물 및 이를 아폽토시스 저해제로 사용하는 용도에 관한 것이다. 본 발명의 화합물은 우수한 아폽토시스 저해 효과를 나타내므로 아폽토시스 저해제로서 유용하게 사용될 수 있다.

<화학식 1>

<화학식 2>

상기 식에서 R₁, R₂, R₃, R₄및 R₅는 명세서에 기재된 바와 같다.

Description

배초향에서 분리한 아폽토시스 저해 효과를 나타내는 신규한 화합물, 그의 제조방법, 그를 포함하는 약학적 조성물 및 용도{Novel compounds showing apoptosis-inhibitive effect purified from Agastache rugosa, a preparing method, pharmaceutical compositions the same and use thereof}

본 발명은 아폽토시스를 억제하는 신규한 화합물, 그의 제조방법, 그를 포함하는 약학적 조성물 및 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 배초향(Agastache rugosa)으로부터 분리한 아폽토시스 저해 활성을 가지는 하기화학식 1및화학식 2로 표시되는 화합물, 그의 제조 방법, 그를 포함하는 약학적 조성물 및 용도에 관한 것이다.

<화학식 1>

<화학식 2>

상기화학식 1및화학식 2에서

R₁은 C1∼C4인 알킬알콕시기; 수소; C1∼C6인 직쇄 또는 분쇄상 알킬기; 하이드록시기; C2∼C6인 디알킬아미노기; C1∼C6인 직쇄 또는 분쇄상 하이드록시알킬기; C3∼C6인 직쇄 또는 분쇄상 디하이드록시알킬기; C3∼C6인 알콕시알킬기; 치환되지 않거나 C1∼C3인 알킬기로 치환된 N, O, S 중에서 선택된 1∼3개의 헤테로원자를 포함하는, 포화 또는 불포화된 5원자 또는 6원자의 헤테로고리 화합물이고,

R₂는 C1∼C4인 알킬알콕시기; 수소; C1∼C6인 직쇄 또는 분쇄상 알킬기; 하이드록시기; C2∼C6인 디알킬아미노기; C1∼C6인 직쇄 또는 분쇄상 하이드록시알킬기; C3∼C6인 직쇄 또는 분쇄상 디하이드록시알킬기; C3∼C6인 알콕시알킬기; 치환되지 않거나 C1∼C3인 알킬기로 치환된 N, O, S 중에서 선택된 1∼3개의 헤테로원자를 포함하는, 포화 또는 불포화된 5원자 또는 6원자의 헤테로고리 화합물이고,

R₃는 하이드록시기; C1∼C4인 알킬알콕시기; 수소; C1∼C6인 직쇄 또는 분쇄상 알킬기; C2∼C6인 디알킬아미노기; C1∼C6인 직쇄 또는 분쇄상 하이드록시알킬기; C3∼C6인 직쇄 또는 분쇄상 디하이드록시알킬기; C3∼C6인 알콕시알킬기; 치환되지 않거나 C1∼C3인 알킬기로 치환된 N, O, S 중에서 선택된 1∼3개의 헤테로원자를 포함하는, 포화 또는 불포화된 5원자 또는 6원자의 헤테로고리 화합물이고,

R₄는 하이드록시기; C1∼C4인 알킬알콕시기; 수소; C1∼C6인 직쇄 또는 분쇄상 알킬기; C2∼C6인 디알킬아미노기; C1∼C6인 직쇄 또는 분쇄상 하이드록시알킬기; C3∼C6인 직쇄 또는 분쇄상 디하이드록시알킬기; C3∼C6인 알콕시알킬기; 치환되지 않거나 C1∼C3인 알킬기로 치환된 N, O, S 중에서 선택된 1∼3개의 헤테로원자를 포함하는, 포화 또는 불포화된 5원자 또는 6원자의 헤테로고리 화합물이고,

R₅는 하이드록시기; C1∼C4인 알킬알콕시기; 수소; C1∼C6인 직쇄 또는 분쇄상 알킬기; C2∼C6인 디알킬아미노기; C1∼C6인 직쇄 또는 분쇄상 하이드록시알킬기; C3∼C6인 직쇄 또는 분쇄상 디하이드록시알킬기; C3∼C6인 알콕시알킬기; 치환되지 않거나 C1∼C3인 알킬기로 치환된 N, O, S 중에서 선택된 1∼3개의 헤테로원자를 포함하는, 포화 또는 불포화된 5원자 또는 6원자의 헤테로고리 화합물인 것이 바람직하다.

아폽토시스 또는 프로그램화 세포 사멸(programmed cell death, PCD)은 광범위한 생물학적 체계에서 손상되었거나 원치않는 세포를 자발적으로 자기-제거(self-elimination)하기 위한 기본적인 세포내 과정이다. 아폽토시스 과정을 통하여 사멸한 세포의 내용물은 세포외로 유리되지 않아 다른 세포들에 손상을 주지 않기 때문에 아폽토시스는 기관 발달, 조직 재형성, 세포내 항상성 유지 및 비정상적이고 손상된 세포의 제거에 필수적인 기작이다.

상기와 같이, 생물체내에서 중요한 역할을 담당하는 아폽토시스 과정은 반드시 정해진 프로그램에 따라 정교하게 조절되어야 하는데, 만약 아폽토시스가 저해되면 암, 자가면역질환(autoimmune disease) 및 바이러스 감염질환과 같은 질병이유도되며(Kerret al.,Br. J. Cancer, 26, 239-257, 1972), 아폽토시스가 부적절하게 증가되면 후천성 면역결핍증, 다양한 신경퇴행성 질환, 허혈성 질환(뇌졸증) 및 알콜 등의 독성물질에 의한 간질환과 같은 질병이 유도된다.

아폽토시스가 진행되는 초기의 세포는 세포 연합(cell junctions)의 손상, 세포막의 물집형성(blebbing) 및 세포 수축(shrinkage) 등과 같은 현상이 유도되고 후기로 진행되면서 크로마틴 응집(chromatin aggregation), 세포질 및 핵 농축(cytoplasm and nuclei condensation), 미토콘드리아 막 전위(mitochondrial membrane potential)의 손실, 원형질막 조성의 변화 및 아폽토시스 체(apoptotic body) 형성 등이 유도되어 전체적으로 형태학적 및 생화학적 변화를 거친다. 아폽토시스의 최종 결과로서 나타나는 올리고뉴클레오좀(oligonucleosome) 형태의 DNA 단편화(DNA fragmentation)는 아폽토시스를 겪는 세포의 전형적인 생화학적 특징이다(Green D. R. and Reed J. C.,Science, 281, 1309-1312, 1998).

현재까지 많은 아폽토시스 관련 연구결과, 아폽토시스에 관여하는 주요한 역할자(key players)와 기작이 다양한 생물체에서 밝혀지고 있다. 대표적으로, 포유동물 세포에서는 세포성 시스테인 프로테아제(cystein protease)의 일종인 캐스페이즈(caspase)가 아폽토시스 기작을 조절하는데 중요한 역할을 담당하는 것으로 알려져 있는데, 상기 캐스페이즈는 아미노산 배열의 상동성에 따라 추정된 진화 계통수에 의하여 ICE(interlukin 1 converting enzyme), CPP32, ICH-1을 중심으로 하는 세 가지 형태로 구분될 수 있다.

캐스페이즈는 수용체-매개성 신호 전달기작(receptor-mediated signal transduction), 성장인자의 결핍(depletion of growth factors), 산화적 스트레스(oxidative stress), DNA 손상 및 세포-세포(cell-cell) 또는 세포-기질 결합(cell-matrix interaction)의 붕괴 등을 포함하는 다양한 자극에 의해 활성화되어 폴리(ADP-라이보스)중합효소(poly(ADP-ribose) polymerase, PARP), 라민(lamine), 사이토케라틴(cytokeratins) 및 캐스페이즈-활성화 DNA 분해효소(DNase) 억제제(ICAD) 등과 같은 세포성 단백질들을 분해함으로써 아폽토시스 형성을 유도한다(Cryns V. and Yuan J.,Genes Dev., 12, 1551-1570, 1998). 지금까지 최소한 14개의 서로 다른 부류에 속하는 케스페이즈가 포유동물에서 밝혀졌으며, 이들이 모두 아폽토시스의 개시와 실행에 중추적인 역할을 하는 아스파르트산(aspartic acid) 잔기 이후의 펩타이드 기질을 절단함으로써 아폽토시스를 유발함이 보고되었다(Nunezet al.,Oncogene,17, 3237-3245, 1998).

한편, 악티노마이신 D(RNA 합성 억제제), 시클로헥시미드(단백질 합성 억제제) 및 칼슘이온(Ca²⁺) 킬레이트제 등이 아폽토시스를 억제할 수 있는 것으로 보고되어 있으며, 또한 시클로스포린 A(면역 억압제), 헤마토포이에트계 사이토카인[IL-3, GM-CSF(과립세포 대식세포 군체 자극제), G-CSF(과립세포 군체 자극제)], IL-2 및 bcl-2 등과 같은 단백질들도 아폽토시스를 억제한다고 보고되어 있다(Cohen JJ.,J. Immunol., 132, 38, 1984; Wyllie AH. et al.,J. Pathol.,142, 67, 1984; Shi Y. et al.,Nature, 339, 625, 1989). 반면에, 시클로헥시미드 및 악티노마이신 D의 경우에는 시클로헥시미드에 의한 급성 백혈병 세포와 악티노마이신 D에 의한 소정 소여포 세포 및 이들 두 가지에 의한 HL-60 세포에서 아폽토시스 유발을 기술한 보고가 있다(Martin, S. J., et al.,J. Immunol., 145, 1859∼1867, 1990). 그 외에도, 시클로헥시미드는 X-선 조사에 의하여 증가되는 림포시트 종양 세포의 아폽토시스를 오히려 억압하는 반면 악티노마이신 D는 오히려 아폽토시스를 촉진시킨다고 보고되었다. 따라서, 세포의 종류, 상태, 분화, 성장 및 성숙에 따라 아폽토시스의 작용기전이 다르고 이러한 세포의 분화, 성장 등에 어느 정도 영향을 미칠 수 있는 물질도 또한 아폽토시스와 연관되어 있을 수 있으며, 아폽토시스를 조정하거나 억제함으로써 항암제, 안티레트로 바이러스제 및 자가면역 질환, 혈소판 감소증, 알츠하이머 질환 및 다양한 형태의 간장염, 종양 병소 전이 억제용의 의약분야에 유용하게 적용될 수 있다(Igarashi T. et al.,Acta Hematol. Jpn., 51, 144, 1988).

이에, 본 발명자들은 아폽토시스를 조절할 수 있는 화합물을 탐색하고자 노력한 결과, 방아풀로부터 아폽토시스 저해 효과를 나타내는 신규한 화합물을 분리하여 이들의 이화학적 특성을 규명하고 상기 화합물이 아폽토시스가 유도된 세포주에서 우수한 아폽토시스 저해 효과를 나타냄을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 아폽토시스 저해제로서 우수한 아폽토시스 저해 효과를 나타내는 신규한 화합물 및 그의 유도체, 이를 포함하는 약학적 조성물 및 그의 용도를 제공하는 것이다.

도 1은 본 발명의화학식 3으로 표시되는 신규한 화합물의 수소 핵자기공명(¹H-NMR) 스펙트럼(spectrum)을 나타낸 것이고,

도 2는 본 발명의화학식 3으로 표시되는 신규한 화합물의 탄소 핵자기공명(¹³C-NMR) 스펙트럼을 나타낸 것이고,

도 3은 본 발명의화학식 4로 표시되는 신규한 화합물의 수소 핵자기공명 스펙트럼을 나타낸 것이고,

도 4는 본 발명의화학식 4로 표시되는 신규한 화합물의 탄소 핵자기공명 스펙트럼을 나타낸 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 우수한 아폽토시스 억제 효과를 나타내는 신규한 화합물 및 그의 유도체와 약학적으로 허용 가능한 그의 염을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 화합물 및 그의 유도체와 약학적으로 허용 가능한 그의 염의 제조 방법을 제공한다.

아울러, 본 발명은 상기 화합물 및 그의 유도체와 약학적으로 허용 가능한 그의 염을 아폽토시스 억제에 사용하는 용도를 제공한다.

마지막으로, 본 발명은 상기 화합물 및 그의 유도체와 약학적으로 허용 가능한 그의 염을 유효 성분으로 함유하는 아폽토시스 억제용 약학적 조성물을 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 우수한 아폽토시스 억제 효과를 나타내는 하기화학식 1및화학식 2로 표시되는 신규한 화합물 및 그의 유도체와 약학적으로 허용 가능한 그의 염을 제공한다.

상기화학식 1및화학식 2에서

상기화학식 1및화학식 2로 표시되는 본 발명의 화합물에서, R₁및 R₂가 메톡시기이고 R₃내지 R₅가 하이드록시기인 하기화학식 3및화학식 4로 표시되는 화합물에 대하여 ESI-MS(electron spray ionization mass spectrometer), HRESI-MS(high resolution electron spray ionization mass spectrometer), 핵자기 공명 스펙트럼 등의 방법을 이용하여 이화학적 특성을 분석한 결과, 본 발명의 화합물은 하기와 같은 이화학적 특성을 갖는 것으로 확인되었다.

1)화학식 3으로 표시되는 화합물

i) 물질 성상: 분말 ii) 분자량: 480

iii) 분자식: C₂₇H₂₈O₈iv) 질량분석치(M-H): 479(m/z)

2)화학식 4로 표시되는 화합물

i) 물질 성상: 분말 ii) 분자량: 478

iii) 분자식: C₂₇H₂₆NO₈iv) 질량분석치(M-H): 477(m/z)

또한, 듀트로 아세톤을 용매로 이용하여 측정한 수소 핵자기공명 스펙트럼 및 탄소 핵자기공명 스펙트럼 분석결과, 상기화학식 3및화학식 4로 표시되는 화합물은 현재까지 보고되지 않은 신규 화합물로 판명되었다(도 1,도 2,도 3및도 4참조).

화학식 1및화학식 2로 표시되는 본 발명의 화합물 및 그의 유도체는 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용할 수 있으며, 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 유용하다.화학식 1및화학식 2로 표시되는 본 발명의 화합물 및 그의 유도체는 당해 기술 분야에서 통상적인 방법에 따라 약제학적으로 형용되는 산 부가염을 형성할 수 있다. 유리산으로는 유리산과 무기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 브롬산, 황산, 인산 등을 사용할 수 있고 유기산으로는 구연산(citric acid), 초산, 젖산, 주석산(tartaric acid), 말레인산, 푸마르산(fumaric acid), 포름산, 프로피온산(propionic acid), 옥살산, 트리플루오로아세트산, 벤조산, 글루콘산, 메탄술폰산, 글리콜산, 숙신산, 4-톨루엔술폰산, 갈룩투론산, 엠본산, 글루탐산 또는 아스파르트산 등을 사용할 수 있다.

본 발명의 화합물 및 그의 약학적으로 허용 가능한 염의 제조방법은

1) 배초향을 유기용매 1로 추출하고 감압농축한 후 유기용매 2로 추출하여 추출물을 얻는 단계(단계 1);

2) 상기 추출물을 농축하고 소량의 혼합용매에 용해시킨 후 크로마토그래피를 수행하여 활성분획의 농축액을 얻는 단계(단계 2);

3) 상기 농축액을 유기용매 3에 용해시킨 후 크로마토그래피를 수행하여 활성분획을 모으는 단계(단계 3); 및

4) 상기 활성분획을 크로마토그래피로 분리하고 용매를 감압건조기로 제거한 후 냉동건조하는 단계(단계 4)로 구성된다.

상기 단계 1은 배초향으로부터 본 발명의화학식 1및화학식 2로 표시되는 화합물을 추출하는 단계로서, 유기용매 1은 메탄올, 에탄올, 아세톤 및 증류수로 구성된 군으로부터 선택되어 사용될 수 있으며 유기용매 2는 에틸아세테이트, 헥산 및 부탄올로 구성된 군으로부터 선택되어 사용될 수 있다. 본 발명에서는 바람직한 실시예를 통하여 배초향을 절단하여 100% 메탄올로 48시간 추출하여 얻은 메탄올 추출물을 감압농축한 후 에틸아세테이트를 사용하여 재추출하였다.

상기 단계 2는 추출물을 농축하는 단계로서, 농축된 에틸아세테이트 추출물을 클로로포름과 메탄올 또는 헥산과 에틸아세테이트의 혼합용매에 용해시킨 후 상기 혼합용매를 용출용매로 이용하여 실리카 겔 칼럼 흡착 크로마토그래피(silica gel column adsorption chromatography) 및 엠씨아이 겔 칼럼 크로마토그라피(MCI gel column chromatography)로 구성된 군으로부터 선택된 칼럼 크로마토그래피를 수행하여 활성분획을 농축한다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 단계 1의 에틸아세테이트 추출물을 혼합용매로 클로로포름 : 메탄올 = 100 : 1을 사용하여 용해시킨 후 실리카 겔 칼럼 흡특 크로마토그래피를 실시하였다.

상기 단계 3은 활성분획을 모으는 단계로서, 상기 농축된 활성분획을 메탄올, 에탄올, 아세톤 및 증류수로 구성된 군으로부터 선택된 유기용매 3에 용해시킨 후 세파덱스 LH-20 겔(sephadex LH-20 gel) 칼럼 크로마토그래피, 실리카 겔 칼럼 흡착 크로마토그래피(silica gel column adsorption chromatography) 및 엠씨아이 겔 칼럼 크로마토그라피로 구성된 군으로부터 선택된 칼럼 크로마토그래피를 수행하여 활성분획을 모은다.

상기 단계 4는 화합물을 분리·정제하는 단계로서, C18 칼럼, NH₂칼럼 및 CN 칼럼으로 구성된 군으로부터 선택되는 칼럼 크로마토그래피와 물-아세토니트릴(acetonitrile)(20 내지 100%의 아세토나이트릴) 용출용매를 이용하는 고압액체 크로마토그래피(high pressure liquid chromatography)로 활성분획을 분리하였다. 상기 분리 과정을 통하여 유지시간 25분대의 활성분획으로부터화학식 1의 화합물을 얻고 유지시간 27분대의 활성분획으로부터화학식 2의 화합물을 얻었다.

본 발명의 화합물의 아폽토시스 저해 효과를 측정하기 위하여, 본 발명자들은 인간 혈액암 세포주를 이용하여 생체외 실험을 수행하였다.

인간 혈액암 세포주를 마이크로플레이트(microplate)에서 배양한 후 아폽토시스 유도물질인 에토포사이드와 본 발명의 화합물을 처리하여 본 발명의 화합물의세포에 대한 아폽토시스 저해 효과를 확인하였다. 현미경으로 세포의 모양을 관찰하여 아폽토시스 여부를 1차 판정하였으며, 원심분리하여 얻은 세포를 이용하여 케스페이즈-3의 활성을 측정함으로써 세포의 아폽토시스 여부를 확인하였다. 양성대조군(에토포사이드만 처리한 경우)의 케스페이즈-3 활성과 음성대조군(에토포사이드 및 화합물을 처리하지 않은 경우)의 케스페이즈-3 활성을 기준으로 본 발명의 화합물의 아폽토시스 저해 효과를 확인한 결과, 본 발명의화학식 3으로 기재되는 화합물은 표준 비교물질인 PDTC와 거의 동일한 아폽토시스 저해 효과를 나타내고화학식 4로 기재되는 화합물은 RDTC보다 우수한 아폽토시스 저해 효과를 나타냄으로써 상기 화합물들을 아폽토시스 억제용으로 사용할 수 있음을 확인하였다.

상기의 약학적 조성물은 아폽토시스 저해 효과를 나타내는화학식 1및화학식 2로 표시되는 화합물 및 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하므로 비정상적으로 유발되는 아폽토시스를 저해함으로써 아폽토시스 증가로 인한 후천성 면역결핍증, 다양한 신경퇴행성 질환, 허혈성 질환(뇌졸증) 및 알콜 등 독성물질에 의한 간질환 등을 저해하거나 예방하는데 유용하게 이용될 수 있다.

화학식 1및화학식 2로 표시되는 화합물 및 그의 약학적으로 허용 가능한 염은 임상 투여시에 경구 또는 비경구로 투여되어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소 적용할 수 있으며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 경구 투여용 제형, 예를 들면 정제, 트로치제(troches), 로렌지(lozenge), 수용성 또는 유성현탁액, 조제분말 또는 과립, 에멀젼, 하드 또는 소프트 캡슐, 시럽 또는 엘릭시르제(elixirs)로 제제화될 수 있다. 정제 및 캡슐 등의 제형으로 제제화하기 위해 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴과 같은 결합제; 디칼슘 포스페이트와 같은 부형제; 옥수수 전분 또는 고구마 전분과 같은 붕괴제; 스테아르산 마그네슘, 스테아르산 칼슘, 스테아릴푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌글리콜 왁스와 같은 윤활유가 함유된다. 캡슐제형의 경우는 상기에서 언급한 물질 이외에도 지방유와 같은 액체 담체를 함유한다.

또한, 본 발명의 약학적 조성물은 비경구로 투여할 수 있으며, 비경구 투여는 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사 또는 흉부내 주사 주입방식에 의한다. 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위해서는 상기화학식 1및화학식 2의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여형으로 제제한다.

상기화학식 1및화학식 2로 표시되는 본 발명의 화합물의 유효 용량은 일반적으로 성인 환자 체중 1 kg 당 1 내지 50 mg/일이고 바람직하기로는 5 내지 20 mg/일이며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정 시간 간격으로 1 일 수회, 바람직하기로는 하루 2 회 내지 3 회 분할 투여될 수 있다.

화학식 1및화학식 3으로 표시되는 화합물에 대하여 급성독성 실험을 한 결과, 본 발명의 신규한 화합물들은 MLD(mouse lethal dosage) 값이 500 ㎎/㎏ 이상으로 매우 안정함을 확인하였다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 아폽토시스 저해물질의 분리 및 정제

본 발명자들은 아폽토시스 기작을 조절할 수 있는 신규한 화합물을 탐색하기 위하여, 배초향으로부터 추출 및 크로마토그래피를 실시하여 신규 화합물을 분리·정제하였다.

먼저, 본 발명자들은 방아풀 4 ㎏을 5 ㎝ 크기로 절단하고 100% 메탄올로 48 시간 동안 추출한 후 감압농축하고 이를 다시 에틸아세테이트로 추출하였다. 상기 에틸아세테이트 층을 농축하여 클로로포름과 메탄올(100:1)을 혼합한 2 ㎖의 혼합용매에 용해시킨 후 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피(20-230 mes, Merck)를 수행하여 활성분획을 농축하였다. 상기 농축물질을 2 ㎖의 메탄올에 용해시킨 후 세파덱스 LH 겔 칼럼 크로마토그래피를 수행하여 활성분획을 모은 후 상기 활성분획을 물-아세토나이트릴(20% 내지 100% 아세토나이트릴, 30분)을 용출용매로 이용하는 고압액체 크로마토그래피(컬럼: C18, 유속: 1.5 ㎖/분, 220 nm 검출)를 수행하였다. 이로부터 유지시간 25 분대의 활성분획을 분리하고 감압건조기로 용매를 제거한 후 얻은 잔사(residue)를 냉동건조하여화학식 3으로 표시되는 화합물 4 ㎎을 얻었으며, 유지시간 27 분대의 활성분획을 분리하고 감압건조기로 용매를 제거한 후 얻은 잔사를 냉동건조하여화학식 4로 표시되는 화합물 4 ㎎을 얻었다. 상기화학식 3과화학식 4로 표시되는 화합물의 NMR 스펙트럼를도 1내지도 4에 나타내었다.

<실시예 2> 이화학적 특성 분석

상기 실시예 1에서 얻어진화학식 3및화학식 4로 표시되는 화합물의 이화학적인 특성을 분석하기 위하여, 본 발명자들은 ESI-MS(electrospray ionization mass spectrometry, Fisons VG Quattro 400 mass spectrometer, USA), HRESI-MS(high resolution electrospray ionization mass spectrometry, Fisons VG Quattro 400 mass spectrometer, USA), 수소 및 탄소 핵자기 공명 스펙트럼 등의 방법을 이용하였다. NMR 실험은 각 시료를 듀트로 아세톤(acetone-d6) 용매로 녹여 5 ㎜ NMR 튜브에서 측정하였으며, 각 용매의 피크(peak)를 내부 표준물질로 하거나 TMS(tetramethylsilane)의 피크를 기준으로 하여 화학이동을 측정하였다. 상기 화합물에 대하여 물질의 성상, 분자량, 분자식 및 질량을 분석하여 본 발명의 화합물의 이화학적인 특성을 확인하였다.

그 결과,화학식 3으로 표시되는 화합물의 물질 성상은 분말이고, 분자량은480이며 분자식은 C₂₇H₂₈O₈로 확인되었고, 상기 화합물의 질량분석치(M-H)는 479(m/z)이었다. 상기 이화학적 특성과 함께 듀트로 아세톤(acetone-d6)을 용매로 측정한 수소 핵자기공명 스펙트럼 및 탄소 핵자기공명 스펙트럼 분석결과,화학식 3로 표시되는 본 발명의 화합물은 현재까지 보고되지 않은 아폽토시스 저해 효과를 나타내는 신규한 화합물로 판명되었다(도 1및도 2).

1)화학식 3으로 표시되는 화합물의¹³C NMR 결과

¹³C NMR (acetone-d6) δ 33.9, 43.8, 50.6, 56.3, 63.7, 73.3, 84.2, 110.6, 113.2, 115.5, 115.8, 16.1, 19.7, 121.9, 122.5, 132.6, 135.8, 145.8, 146.8, 148.4, 162.8, 166.5

또한,화학식 4로 기재되는 화합물의 물질 성상은 분말이고, 분자량은 478이며 분자식은 C₂₇H₂₆NO₈로 확인되었고, 상기 화합물의 질량분석치(M-H)는 477(m/z)이었다. 상기 이화학적 특성과 함께 듀트로 아세톤(acetone-d6)을 용매로 측정한 수소 핵자기공명 스펙트럼 및 탄소 핵자기공명 스펙트럼 분석결과,화학식 4로 표시되는 본 발명의 화합물 역시 현재까지 보고되지 않은 아폽토시스 저해 효과를 나타내는 신규한 화합물로 판명되었다(도 3및도 4).

2)화학식 4로 표시되는 화합물의¹³C NMR 결과

¹³C NMR (acetone-d6) δ 46.7, 56.2, 56.4, 64.5, 73.5, 85.7, 10.6, 112.5, 15.6, 116.0, 116.1, 119.7, 122.3, 122.5,123.6, 129.4, 132.7, 134.8, 137.9, 146.9, 147.0, 148.3, 148.4, 162.9, 166.6

<실험예 1> 아폽토시스 저해 효과 측정

본 발명의화학식 3및화학식 4로 표시되는 화합물의 아폽토시스 저해 효과를 측정하기 위하여, 본 발명자들은 인간혈액암 세포주인 U937 세포를 이용하여 하기와 같은 생체외(in vitro) 실험을 수행하였다.

5 X 10⁶세포/웰 농도의 U937 세포를 96-웰 마이크로플레이트(96-well microplate)에서 배양한 후 아폽토시스 유도물질인 에토포사이드 10 ㎍/㎖ 및 본 발명의 화합물을 1 내지 100 ㎍/㎖의 농도로 상기 U937 세포에 처리하고 5% CO₂-95% 공기 및 37℃ 온도에서 5 시간 동안 배양하여 아폽토시스 저해 효과를 비교하였다. 이 때, 에토포사이드를 처리한 세포를 양성대조군으로 이용하고, 아무것도 처리하지 않은 세포를 음성대조군으로 사용하였다. 5 시간 후 현미경으로 U937 세포의 모양을 관찰하여 아폽토시스 여부를 1차 판정하였고, 원심분리하여 얻은 세포를 이용하여 DEVD-AFC(Z-Asp-Glu-Val-Asp-7-amino-4-trifluoromethyl coumarin)를 기질로 케스페이즈-3의 활성을 측정하였다. 케스페이즈-3의 저해활성은 시료 1 ㎕, 5mM의 기질(DEVD-AFC)을 100 ㎕의 완충액[100 mM HEPES(N-(2-hydroxyethyl)piperazine-N-2(2-ethanesulfonic acid)), pH 7.5, 10 mM DTT(dithiothreitol), 10% sucrose, 0.1% CHAPS, and 0.1% BSA]과 혼합하여 25℃에서 반응시킨 후 생성된 AFC를 형광계(fluorometer, Perkin-Elmer LS-50B)를 사용하여 측정하였다. 양성대조군(에토포사이드만 처리한 경우)의 케스페이즈-3 활성과 음성대조군(에토포사이드 및 화합물을 처리하지 않은 경우)의 케스페이즈-3 활성을 기준으로 본 발명의 화합물이 나타내는 아폽토시스 저해 효과를 결정하여 하기표 1에 나타내었다.

U937 세포주에서의 아폽토시스 저해 효과 비교

화합물	저해율(IC₅₀, ㎍/㎖)
화학식 3의 화합물	13.0
화학식 4의 화합물	10.0
PDTC(pyrrolidine dithiocarbonate)	15.0

그 결과, 에토포사이드에 의하여 유도된 U937 세포의 아폽토시스에 대한화학식 3로 표시되는 화합물의 저해활성 농도(IC₅₀, 50%의 저해 효과를 나타내는데 요구되는 농도)는 10 ㎍/㎖이었고,화학식 4로 표시되는 화합물의 저해활성 농도는 15 ㎍/㎖이었으며 표준 비교물질인 PDTC(pyrrolidine dithiocarbonate)의 저해활성 농도는 15.0 ㎍/㎖로 나타나, 본 발명의화학식 3로 기재되는 화합물은 표준 비교물질인 PDTC와 거의 동일한 아폽토시스 저해 효과를 나타내고화학식 4로 기재되는화합물은 표준 비교물질보다 우수한 아폽토시스 저해 효과를 나타냄으로써 상기 화합물들을 아폽토시스 억제용으로 사용할 수 있음을 확인하였다.

<실험예 2> 랫트에 대한 경구투여 급성 독성실험

6주령의 특정병원체부재(specific pathogen-free, SPF) SD계 랫트를 사용하여 급성독성실험을 실시하였다. 군당 2 마리씩의 동물에화학식 1및화학식 2로 기재되는 화합물을 각각 0.5% 메틸셀룰로즈 용액에 현탁하여 1 g/㎏/㎖의 용량으로 단회 경구투여하였다. 시험물질 투여 후 동물의 폐사여부, 임상증상, 체중변화를 관찰하고 혈액학적 검사와 혈액생화학적검사를 실시하였으며, 부검하여 육안으로 복강장기와 흉강장기의 이상여부를 관찰하였다.

그 결과, 시험물질을 투여한 모든 동물에서 특기할 만한 임상증상이나 폐사된 동물은 없었으며, 체중변화, 혈액검사, 혈액생화학 검사, 부검소견 등에서도 독성변화는 관찰되지 않았다. 이상의 결과, 실험된 화합물은 모두 랫트에서 500 ㎎/㎏까지 독성변화를 나타내지 않으며 경구 투여 최소치사량(LD₅₀)은 500 ㎎/㎏ 이상인 안전한 물질로 판단되었다.

<제제예 1> 시럽제의 제조방법

본 발명의화학식 1또는화학식 2의 화합물 및 그의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분 2%(중량/부피)로 함유하는 시럽은 다음과 같은 방법으로 제조한다.

화학식 1또는화학식 2의 화합물의 산부가염, 사카린, 당을 온수 80 ㎖에 용해시켰다. 이 용액을 냉각시킨 후, 여기에 글리세린, 사카린, 향미료, 에탄올, 소르브산 및 증류수로 이루어진 용액을 제조하여 혼합하였다. 이 혼합물에 물을 첨가하여 100 ㎖가 되게 하였다. 상기 부가염은 실시예에 의한 다른 염으로 대치시킬 수 있다.

상기 시럽제의 구성성분은 다음과 같다.

화학식 1또는화학식 2의 화합물·염산염 ······ 2 g

사카린 ······················· 0.8 g

당 ························· 25.4 g

글리세린······················ 8.0 g

향미료 ······················· 0.04 g

에탄올 ······················· 4.0 g

소르브산 ······················ 0.4 g

증류수 ······················· 정량

<제제예 2> 정제의 제조방법

유효성분 15 ㎎이 함유된 정제는 다음과 같은 방법으로 제조한다.

화학식 1또는화화식 2로 기재되는 화합물·염산염 250 g을 락토오스 175.9 g, 감자전분 180 g 및 콜로이드성 규산 32 g과 혼합하였다. 이 혼합물에10% 젤라틴 용액을 첨가시킨 후, 분쇄해서 14 메쉬체를 통과시켰다. 이것을 건조시키고 여기에 감자전분 160 g, 활석 50 g 및 스테아린산 마그네슘 5 g을 첨가해서 얻은 혼합물을 정제로 만들었다.

상기 정제의 구성성분은 다음과 같다.

화학식 1또는화학식 2의 화합물·염산염 ····· 250 g

락토오스 ····················175.9 g

감자전분 ···················· 180 g

콜로이드성 규산 ················· 32 g

10% 젤라틴 용액

감자전분 ···················· 160 g

활석 ······················ 50 g

스테아르산 마그네슘 ·············· 5 g

<제제예 3> 주사액제의 제조방법

유효성분 10 ㎎을 함유하는 주사액제는 다음과 같은 방법으로 제조하였다.

화학식 1또는화학식 2로 기재되는 화합물·염산염 1 g, 염화나트륨 0.6 g 및 아스코르브산 0.1 g을 증류수에 용해시켜서 100 ㎖을 만들었다. 이 용액을 병에 넣고 120℃에서 30 분간 가열하여 멸균시켰다.

상기 주사액제의 구성성분은 다음과 같다.

화학식 1또는화학식 2의 화합물 ·염산염···· 1 g

염화나트륨···················0.6 g

아스코르브산··················0.1 g

증류수····················· 정량

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의화학식 1및화학식 2로 표시되는 방아풀에서 유래한 신규한 화합물은 독성이 없고 우수한 아폽토시스 저해 효과를 나타내므로 아폽토시스 제해제로 유용하게 이용될 수 있다.

Claims

아폽토시스 저해 활성을 가지는, 하기화학식 1로 표시되는 신규한 화합물 및 약학적으로 허용 가능한 그의 염.

<화학식 1>

상기화학식 1에서

R₁및 R₂는 메톡시기이고 R₃내지 R₅는 하이드록시기이다
삭제
아폽토시스 저해활성을 가지는, 하기화학식 2로 표시되는 신규한 화합물 및 약학적으로 허용 가능한 그의 염.

<화학식 2>

상기화학식 2에서

R₁및 R₂는 메톡시기이고 R₃내지 R₅는 하이드록시기이다
삭제
1) 배초향을 유기용매 1로 추출하고 감압농축한 후 유기용매 2로 추출하여 추출물을 얻는 단계(단계 1);

2) 상기 추출물을 농축하고 소량의 혼합용매에 용해시킨 후 크로마토그래피를 수행하여 활성분획의 농축액을 얻는 단계(단계 2);

3) 상기 농축액을 유기용매 3에 용해시킨 후 크로마토그래피를 수행하여 활성분획을 모으는 단계(단계 3); 및

4) 상기 활성분획을 크로마토그래피로 분리하고 용매를 감압건조기로 제거한 후 냉동건조하는 단계(단계 4)로 구성되는 제 1항 또는 제 3항의 화합물 및 약학적으로 허용 가능한 그의 염의 제조 방법.
제 5항에 있어서, 단계 1과 단계 3의 유기용매 1 및 유기용매 3은 메탄올,에탄올, 아세톤 및 증류수로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
제 5항에 있어서, 단계 1의 유기용매 2는 에틸아세테이트, 헥산 및 부탄올로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
제 5항에 있어서, 단계 2의 혼합용매는 클로로포름과 메탄올 또는 헥산과 에틸아세테이트의 혼합용매를 사용하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
제 5항에 있어서, 단계 2의 크로마토그래피는 실리카 겔 칼럼 흡착 크로마토그래피(silica gel column adsorption chromatography), 엠씨아이 겔 칼럼 크로마토그라피(MCI gel column chromatography)로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
제 5항에 있어서, 단계 3의 크로마토그래피는 세파덱스 LH-20 겔(sephadex LH-20 gel) 칼럼 크로마토그래피, 실리카 겔 칼럼 흡착 크로마토그래피(silica gelcolumn adsorption chromatography) 및 엠씨아이 겔 칼럼 크로마토그라피로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
제 5항에 있어서, 단계 4의 크로마토그래피는 C18 고압액체 칼럼 크로마토그래피, NH₂칼럼 및 CN 칼럼으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
삭제
삭제