KR100561188B1

KR100561188B1 - 아폽토시스 저해 활성을 가지는 톨루퀴놀

Info

Publication number: KR100561188B1
Application number: KR1020040018334A
Authority: KR
Inventors: 이충환; 고영희; 김진희
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2004-03-18
Filing date: 2004-03-18
Publication date: 2006-03-15
Also published as: KR20050093092A

Abstract

본 발명은 아폽토시스 저해 활성을 가지는 톨루퀴놀에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 다음 화학식 1의 톨루퀴놀(toluquinol)이 아폽토시스 저해 활성을 가짐을 확인함으로써 톨루퀴놀 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 아폽토시스 증가로 인한 염증질환, 신경퇴행성 질환 또는 독성물질에 의한 간질환 치료제 조성물 및 건강식품에 관한 것이다.

아폽토시스, 톨루퀴놀(toluquinol)

Description

아폽토시스 저해 활성을 가지는 톨루퀴놀{Toluquinol showing apoptosis-inhibitive effect}

본 발명은 아폽토시스 저해 활성을 가지는 톨루퀴놀에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 화학식 1의 톨루퀴놀(toluquinol)이 아폽토시스 저해 활성을 가짐을 확인함으로써 톨루퀴놀 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 아폽토시스 증가로 인한 염증질환, 신경퇴행성 질환 또는 독성물질에 의한 간질환 치료제 조성물 및 건강식품에 관한 것이다.

아폽토시스(apoptosis) 또는 프로그램화 세포 사멸(programmed cell death, PCD)은 광범위한 생물학적 체계에서 손상되었거나 원치 않는 세포를 자발적으로 자기-제거(self-elimination)하기 위한 기본적인 세포 내 과정이다. 아폽토시스의 과정을 통하여 사멸한 세포의 내용물은 세포 외로 유리되지 않아 다른 세포들에 손상을 주지 않기 때문에 아폽토시스는 기관 발달, 조직 재형성, 세포내 항상성 유지 및 비정상적이고 손상된 세포의 제거에 필수적인 기작이다.

상기와 같이, 생물체내에서 중요한 역할을 담당하는 아폽토시스 과정은 반드 시 정해진 프로그램에 따라 정교하게 조절되어야 하는데, 만약 아폽토시스가 저해되면 암, 자가면역질환(autoimmune disease) 및 바이러스 감염질환과 같은 질병이 유도되며[Kerr et al., Br. J. Cancer, 26, 239-257, 1972], 아폽토시스가 부적절하게 증가되면, 후천성 면역결핍증, 다양한 신경퇴행성 질환, 허혈성 질환(뇌졸증) 및 알콜 등 독성물질에 의한 간질환과 같은 질병이 유도된다.

아폽토시스가 진행되는 초기의 세포는 세포 연합(cell junctions)의 손상, 세포막의 물집형성(blebbing) 및 세포 수축(shrinkage) 등과 같은 현상이 유도되고 후기로 진행되면서 크로마틴 응집(chromatin aggregation), 세포질 및 핵 농축(cytoplasm and nuclei condensation), 마이토콘드리아 막 전위(mitochondrial membrane potential)의 손실, 원형질막 조성의 변화 및 아폽토시스 체(apoptotic body) 형성 등이 유도되어 전체적으로 형태학적 및 생화학적 변화를 거친다. 아폽토시스의 최종 결과로서 나타나는 올리고뉴클레오좀(oligonucleosome) 형태의 DNA 절편화(DNA fragmentation)는 아폽토시스를 겪는 세포의 전형적인 생화학적 특징이다[Green D. R., and Reed, J. C., Science, 281, 1309-1312, 1998].

현재 많은 아폽토시스 관련 연구 결과, 아폽토시스에 관여하는 주요한 역할자(key players)와 기작이 다양한 생물체에서 밝혀지고 있다. 대표적으로, 포유동물 세포에서는 세포성 시스테인 프로테아제(cystein protease)의 일종인 캐스페이즈(caspase)가 아폽토시스 기작을 조절하는데 중요한 역할을 담당하는 것으로 알려져 있는데, 상기 캐스페이즈는 아미노산 배열의 상동성에 따라 추정된 진화 계통수에 의하여 ICE(interleukin 1 converting enzyme), CPP32 및 ICH-1, 세 가지 형태로 구분될 수 있다.

캐스페이즈(caspase)는 수용체-매개성 신호 전달기작(receptor-mediated signal transduction), 성장인자의 결핍(depletion of growth factors), 산화적 스트레스(oxidative stress), DNA 손상 및 세포-세포(cell-cell) 또는 세포-기질 결합(cell-matrix interaction)의 붕괴 등을 포함하는 다양한 자극에 의해 활성화되어 폴리(ADP-라이보스)중합효소[poly(ADP-ribose) polymerase, RARP], 라민(lamine), 사이토케라틴(cytokeratins) 및 캐스페이즈-활성화 DNase 억제제(ICAD) 등과 같은 세포성 단백질들을 분해함으로써 아폽토시스 형성을 유도한다[Cryns, V., and Yuan, J., Genes Dev., 12, 1551-1570, 1998].

아폽토시스에 관한 활발한 연구 결과로서, 지금까지 최소한 14개의 서로 다른 부류에 속하는 캐스페이즈가 포유동물에서 밝혀졌으며, 이들이 모두 아폽토시스의 개시와 실행에 중추적인 역할을 하는 아스파라긴산(aspartic acid) 잔기 이후의 펩타이드 기질을 절단함으로써 아폽토시스를 유발함이 보고되었다[Nunez et al., Oncogene, 17, 3237-3245, 1998].

톨루퀴놀은 미생물이 생산하는 2차대사산물로서 이미 알려져 있으나, 아폽토시스 저해 활성을 가진다는 사실은 본 발명자들에 의해 최초로 확인되었다.

이에, 본 발명자들은 과도한 아폽토시스로 인한 질병을 효과적으로 치료하기 위해 아폽토시스 억제 물질을 탐색하고자 노력한 결과, 톨루퀴놀이 아폽토시스가 유도된 세포주에서 우수한 아폽토시스 저해효과를 나타냄을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명은 다음 화학식 1로 표시되는 톨루퀴놀 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 아폽토시스 증가로 인한 염증질환, 신경퇴행성 질환 및 독성물질에 의한 간질환 치료제 조성물을 제공하는데 그 목적이 있다.

또한, 본 발명은 상기 톨루퀴놀 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 함유하는 건강식품을 제공하는데 또 다른 목적이 있다.

[화학식 1]

본 발명은 다음 화학식 1로 표시되는 톨루퀴놀 또는 약학적으로 허용가능한 이의 염을 유효성분으로 함유하는 염증질환, 신경퇴행성 질환 및 독성물질에 의한 간질환 치료제 조성물을 그 특징으로 한다.

[화학식 1]

또한, 상기 톨루퀴놀 또는 약학적으로 허용가능한 이의 염을 함유하는 건강식품을 포함한다:

이와 같은 본 발명을 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 상기 화학식 1의 톨루퀴놀(toluquinol)이 아폽토시스 저해 활성을 가짐을 확인함으로써 톨루퀴놀을 유효성분으로 함유하는 아폽토시스 증가로 인한 염증질환, 신경퇴행성 질환 및 독성물질에 의한 간질환 치료제 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서 다음과 같은 이화학적 특성을 갖는톨루퀴놀의 혈액암세포주로 아폽토시스 저해 효과를 실험한 결과, 기준 물질 보다 우수한 아폽토시스 저해활성을 가짐을 확인하였다.

i) 물질 성상: 분말 ii) 분자량: 124

iii) 분자식: C₇H₈O₂iv) 질량분석치(M-H)^-: 123(m/ z)

한편, 본 발명의 유효성분인 톨루퀴놀은 약학적으로 허용가능한 염의 형태로 사용할 수 있으며, 염으로는 약학적으로 허용가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 유용하다. 화학식 1의 화합물은 당해 기술 분야에서 통상적인 방법에 따라 약제학적으로 허용되는 산 부가염을 형성할 수 있다. 유리산으로는 유리산과 무기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 브롬산, 황산, 인산 등을 사용할 수 있고 유기산으로는 구연산(citric acid), 초산, 젖산, 주석산(tartaric acid), 말레인산, 푸마르산(fumaric acid), 포름산, 프로피온산(propionic acid), 옥살산, 트리플루오로아세트산, 벤조산, 글루콘산, 메탄술폰산, 글리콜산, 숙신산, 4-톨루엔술폰산, 갈룩투론산, 엠본산, 글루탐산 또는 아스파라긴산 등을 사용할 수 있다.

따라서, 본 발명은 톨루퀴놀 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염을 유효성분으로 함유하는 약제 조성물은 비정상적으로 유발하는 아폽토시스 기작을 저해함으로써 아폽토시스 증가로 인한 염증 질환, 후천성 면역결핍증, 다양한 신경퇴행성 질환, 허혈성 질환(뇌졸증) 및 알콜 등 독성물질에 의한 간질환 등을 치료하거나 예방하는데 유용하게 이용될 수 있다.

본 발명의 약제 조성물은 임상 투여시에 경구 또는 비경구로 투여, 예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소 적용할 수 있으며, 일반적인 의약품 및 건강식품의 형태로 사용될 수 있다.

본 발명의 약제 조성물은 경구 투여용 제형, 예를 들면 정제, 트로키제(troches), 로렌지(lozenge), 수용성 또는 유성현탁액, 조제분말 또는 과립, 에멀젼, 하드 또는 소프트 캡슐, 시럽 또는 엘릭실제(elixirs)로 제제화된다. 정제 및 캡슐 등의 제형으로 제제하기 위해 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니 톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴과 같은 결합제; 디칼슘 포스페이트와 같은 부형제; 옥수수 전분 또는 고구마 전분과 같은 붕괴제; 스테아린산 마그네슘, 스테아린산 칼슘, 스테아릴푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌글리콜 왁스와 같은 윤활유가 함유된다. 캡슐제형의 경우는 상기에서 언급한 물질 이외에도 지방유와 같은 액체 담체를 함유한다.

또한, 본 발명의 약제 조성물은 비경구로 투여할 수 있으며, 비경구 투여는 피하주사, 정맥주사, 근육 내 주사 또는 흉부 내 주사 주입방식에 의한다. 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위해서는 톨루퀴놀을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여형으로 제제한다.

또한, 상기 유효성분의 투여 용량은 일반적으로 성인 환자 체중 1 kg 당 1 ∼ 50 mg/일이고, 바람직하기로는 5 ∼ 20 mg/일이며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정 시간 간격으로 1 ∼ 수회, 바람직하기로는 하루 2 ∼ 3 회 분할 투여할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 조성물은 톨루퀴놀 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 하는 건강식품을 포함한다.

건강식품이란, 톨루퀴놀 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 음료, 차류, 향신료, 껌, 과자류 등의 식품소재에 첨가하거나, 캡슐화, 분말화, 현탁액 등으로 제조한 식품으로, 이를 섭취할 경우 건강상 특정한 효과를 가져오는 것을 의미하나, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기복용시 발생할 수 있는 부 작용 등이 없는 장점이 있다.

이하, 본 발명은 다음 실시예에 의거하여 더욱 상세히 설명하겠는바, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 톨루퀴놀의 이화학적 특성 분석

화학식 1로 표시되는 화합물의 이화학적인 특성을 분석하기 위하여, 본 발명자들은 ESI-MS(electrospray ionization mass spectrometry, Fisons VG Quattro 400 mass spectrometer, USA), 수소 및 탄소 핵자기 공명 스펙트럼 등의 방법을 이용하였다. NMR 실험은 각 시료를 듀트로 메탄올(CD₃CD) 용매로 녹여 5 ㎜ NMR tube에서 측정하였으며, 각 용매의 피이크를 내부 표준물질로 하거나 TMS(tetramethylsilane)의 피이크를 기준으로 하여 화학이동을 측정하였다. 상기 화합물에 대하여 물질의 성상, 분자량, 분자식 및 질량을 분석한 결과, 본 발명의 화합물은 하기와 같은 이화학적인 특성을 갖는 것으로 확인되었다.

그 결과, 화학식 1의 화합물의 물질 성상은 분말이고, 분자량은 124이며 분자식은 C₇H₈O₂로 확인되었고, 상기 화합물의 질량분석치(M-H)^-는 123(m/z)이었다. 상기 이화학적 특성과 함께 듀트로 메탄올(CD₃CD)을 용매로 측정한 수소 핵자기공명 스펙트럼 및 탄소 핵자기공명 스펙트럼 분석결과, 화학식 1로 표시되는 본 발명의 화합물은 현재까지 보고되지 않은 아폽토시스 저해효과를 나타내는 화합물로 판명 되었다.

¹³C NMR (CD₃CD) δ11.0, 114.1, 117.0, 117.8, 126.3, 149.8, 150.6

실시예 2: 톨루퀴놀의 아폽토시스 저해효과 측정

톨루퀴놀의 아폽토시스 저해효과를 측정하기 위하여, 본 발명자들은 인간혈액암 세포주인 U937 세포를 이용하여 다음과 같은 생체 외 실험을 수행하였다.

U937 세포를 96-웰 마이크로플레이트(96-well microplate)에서 5 ×10⁶ 세포/웰이 될 때까지 배양한 후 아폽토시스 유도물질인 에토포사이드 10 ㎍/㎖ 및 본 발명의 화합물을 1 ∼ 100 ㎍/㎖의 농도로 상기 U937 세포에 처리하고 5% CO₂-95% 공기조건으로 37 ℃에서 5 시간 동안 배양하여 아폽토시스 저해효과를 비교하였다. 이때, 에토포사이드만 처리한 세포를 양성대조군으로 이용하고, 에토포사이드 및 본 발명의 화합물 모두를 처리하지 않은 세포를 음성대조군으로 사용하였다. 5 시간 후 현미경으로 U937 세포의 모양을 관찰하여 아폽토시스 여부를 1차 판정하고, 원심분리하여 얻은 세포를 이용하여 DEVD-AFC(Z-Asp-Glu-Val-Asp-7-amino-4-trifluoromethyl coumarin)를 기질로 케스페이즈-3 활성을 측정하였다. 양성대조군(에토포사이드만 처리한 경우)의 케스페이즈-3 활성과 음성대조군(에토포사이드 및 화합물을 처리하지 않은 경우)의 케스페이즈-3 활성을 기준으로 본 발 명의 화합물이 나타내는 아폽토시스 저해효과를 결정하여 다음 표 1에 나타내었다.

U937 세포주에서의 아폽토시스 저해효과 비교

화합물	저해율(IC₅₀,㎍/㎖)
톨루퀴놀	0.7
PDTC(pyrrolidine dithiocarbonate)	15.0

상기 표 1에 나타나 있듯이, 에토포사이드에 의하여 유도된 U937 세포의 아폽토시스에 대한 화학식 1로 표시되는 화합물의 저해활성 농도(IC₅₀, 50%의 저해효과를 나타내는데 요구되는 농도)는 0.7 ㎍/㎖이며 표준 비교물질인 PDTC(pyrrolidine dithiocarbonate)의 저해활성 농도인 15.0 ㎍/㎖로 나타나, 톨루퀴놀은 표준 비교물질인 PDTC 보다 우수한 아폽토시스 저해효과를 가짐을 알 수 있었다. 상기의 결과로부터, 본 발명의 화학식 1의 화합물은 생체 외에서 아폽토시스를 저해할 수 있는 화합물임을 확인할 수 있었다.

실시예 3: 랫트에 대한 경구투여 급성 독성실험

6주령의 특정병원부재(SPF) SD계 랫트를 사용하여 급성독성실험을 실시하였다. 군당 2 마리씩의 동물에 톨루퀴놀을 각각 0.5% 메틸셀룰로즈 용액에 현탁하여 1 g/kg/1 ㎖의 용량으로 단회 경구투여하였다. 시험물질 투여 후 동물의 폐사여부, 임상증상, 체중변화를 관찰하고 혈액학적 검사와 혈액생화학적검사를 실시하였으며, 부검하여 육안으로 복강장기와 흉강장기의 이상여부를 관찰하였다. 시험결과, 시험물질을 투여한 모든 동물에서 특기할 만한 임상증상이나 폐사된 동 물은 없었으며, 체중변화, 혈액검사, 혈액생화학 검사, 부검소견 등에서도 독성변화는 관찰되지 않았다. 이상의 결과 실험된 화합물은 모두 랫트에서 500 mg/kg까지 독성변화를 나타내지 않으며 경구 투여 최소치사량(LD₅₀)은 500 mg/kg이상인 안전한 물질로 판단되었다.

상기에서 확인된 바와 같이, 톨루퀴놀은 우수한 아폽토시스 저해효과를 나타내어 아폽토시스 증가로 인한 염증 질환, 후천성 면역결핍증, 다양한 신경퇴행성 질환, 허혈성 질환(뇌졸증) 및 알콜 등 독성물질에 의한 간질환 등을 치료하는 약제 조성물로 제제화할 수 있다.

제조예 1: 시럽제의 제조

본 발명의 톨루퀴놀 및 약학적으로 허용되는 그의 염을 유효성분 2%(중량/부피)로 함유하는 시럽은 다음과 같은 방법으로 제조하였다.

톨루퀴놀의 산부가염, 사카린, 당을 온수 80 g에 용해시켰다. 이 용액을 냉각시킨 후, 여기에 글리세린, 사카린, 향미료, 에탄올, 소르빈산 및 증류수로 이루어진 용액을 제조하여 혼합하였다. 이 혼합물에 물을 첨가하여 100 ㎖가 되게 하였다. 상기 부가염은 실시예에 의한 다른 염으로 대치시킬 수 있다.

상기 시럽제의 구성성분은 다음과 같다.

톨루퀴놀ㆍ염산염 ···············2 g

사카린 ······················· 0.8 g

당 ························ 25.4 g

글리세린······················ 8.0 g

향미료 ······················ 0.04 g

에탄올 ·······················4.0 g

소르빈산 ······················0.4 g

증류수 ·······················정량

제조예 2: 정제의 제조

유효성분 15 mg이 함유된 정제는 다음과 같은 방법으로 제조하였다.

톨루퀴놀ㆍ염산염 250 g을 락토오스 175.9 g, 감자전분 180 g 및 콜로이드성 규산 32 g과 혼합하였다. 이 혼합물에 10% 젤라틴 용액을 첨가시킨 후, 분쇄해서 14 메쉬체를 통과시켰다. 이것을 건조시키고 여기에 감자전분 160 g, 활석 50 g 및 스테아린산 마그네슘 5 g을 첨가해서 얻은 혼합물을 정제로 만들었다.

상기 정제의 구성성분은 다음과 같다.

톨루퀴놀·염산염··········· ···· 250 g

락토오스 ··················· 175.9 g

감자전분 ··················· 180 g

콜로이드성 규산 ················ 32 g

10% 젤라틴 용액

감자전분 ··················· 160 g

활석 ····················· 50 g

스테아린산 마그네슘 ·············· 5 g

제조예 3: 주사액제의 제조

유효성분 10 mg을 함유하는 주사액제는 다음과 같은 방법으로 제조하였다.

톨루퀴놀ㆍ염산염 1 g, 염화나트륨 0.6 g 및 아스코르빈산 0.1 g을 증류수에 용해시켜서 100 ㎖을 만들었다. 이 용액을 병에 넣고 20 ℃에서 30 분간 가열하여 멸균시켰다.

상기 주사액제의 구성성분은 다음과 같다.

톨루퀴놀ㆍ염산염 ········· ···· 1 g

염화나트륨··················0.6 g

아스코르빈산·················0.1 g

증류수····················정량

제제예 4: 음료 제조

톨루퀴놀 500 ㎎을 적당량의 물에 용해시킨 후에 보조성분으로서 비타민 C, 교미제로서 구연산, 구연산나트륨, 올리고당을 적당량 가하고, 보존제로서 적당량의 나트륨벤조에이트를 가한 후에 물을 가하여 전량을 100 ㎖로 만들어 음료용 조성물을 제조하였다. 이때 타우린이나 마이오 이노시톨, 엽산, 판토텐산 등을 단독으로 혹은 함께 첨가할 수 있다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따른 톨루퀴놀이 우수한 아폽토시스 저해효과를 나타내므로 아폽토시스 증가로 인한 염증 질환, 후천성 면역결핍증, 다양한 신경퇴행성 질환, 허혈성 질환(뇌졸증) 및 알콜 등 독성물질에 의한 간질환 등을 치료하거나 예방하는데 유용하게 이용될 수 있다.

Claims

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다음 화학식 1로 나타내는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 아폽토시스 증가로 인한 독성물질에 의한 간질환 치료제 조성물.

[화학식 1]
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