KR100559488B1

KR100559488B1 - 오미자로부터 분리한 ｎｆａｔ 전사 저해제

Info

Publication number: KR100559488B1
Application number: KR1020020043034A
Authority: KR
Inventors: 나도선; 김영호; 고제상; 이임선; 이형규; 서영거; 김정우
Original assignee: 고제상; 김영호
Priority date: 2002-07-22
Filing date: 2002-07-22
Publication date: 2006-03-10
Also published as: KR20040009188A

Abstract

본 발명은 오미자 추출물 또는 오미자로부터 분리한 리그난 유도체를 유효성분으로 함유하는 NFAT(nuclear factor of activated T cells)에 의해 야기되는 질병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 기능성 식품에 관한 것으로, 상기 오미자 추출물 또는 리그난 유도체는 NFAT 전사를 저해하여 NFAT에 의해 야기되는 천식, 류마치성 관절염, 심근비대, 알러지, 아토피성 피부염 및 전신 홍반성 낭창 등의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

오미자로부터 분리한 ＮＦＡＴ 전사 저해제{Inhibitor for transcription of NFAT isolated from Schisandra chinensis}

NFAT(nuclear factor of activated T cells)은 세포질에 존재하는 단백질로서 Ca²⁺ 이동(mobilization)과 커플된 세포 표면의 수용체의 자극에 의해서 활성화 된다. NFAT 단백질은 Ca²⁺ 에 의해 활성화되는 포스파타제(phosphatase) 즉, 칼시네우린(calcineurin)에 의해서 탈인산화되며, 탈인산화된 NFAT는 핵으로 이동하여 T 세포의 활성화에 필요한 IL-2 유전자를 포함한 여러 사이토카인(cytokine)유전자의 전사를 유도한다(Winter G, Harris WJ. Humanized antibodies. Immunology Today 1993; 14: 243-6; Abbas AK, et al., Cellular and molecular immunology. W.B. Saunders Company, Philadelphia, 1997:315-38).

일반적으로, NFAT의 활성화는 면역 반응의 유도에 중요한 역할을 수행한다. 그러나, 과도한 활성화는 자가면역, 이식의 거부(transplant rejection) 및 염증반응(inflammation)을 포함하는 면역병리학적(immunopathological) 반응을 야기시킨다(Abbas AK, et al., Cellular and molecular immunology. W.B. Saunders Company, Philadelphia, 1997:315-38). 따라서, NFAT 전사의 조절은 면역과 관련된 질환의 치료에 유용하게 사용될 수 있다. 합성화합물의 경우 고친화성(high-affinity)의 칼시네우린 결합 펩타이드 및 3,5-비스(트리플루오로메틸)피라졸(3,5-bis(trifluoromethyl)pyrazole)은 NFAT 전사인자의 조절자로 보고되고 있다(Aramburu J, et al., Science 1999; 285: 2129-33; Djuric SW, et al., Journal of Medicinal Chemistry 2000; 43: 2975-81). 그러나, 지금까지 천연 물질(natural product)로부터 분리된 NFAT 전사인자 조절자에 대한 보고는 없다.

낮은 분자량의 천연 물질은 약재의 개발에 있어서의 선도적인 화합물의 훨씬 더 유용한 후보군일 수 있다. 최근, 오미자(Schisandra chinensis; Schizandraceae)의 열매로부터 7가지의 리그난 유도체가 분리되었으며, 이들이 혈소판 활성 인자의 길항제(antagonist)로 작용하여 항-염증 활성을 보인다는 것이 보고되었다(Lee IS, et al., Biological and Pharmaceutical Bulletin 1999; 22; 265-7). 오미자는 한방에서 진해제(antitussive), 진정제(sedative) 및 강장제(tonic) 목적으로 사용되어 왔다(Hikino H, et al., Planta Medica 1984; 50: 213-8).

현재까지 NFAT 전사 활성을 조절하는 천연 물질에 대해서는 보고된 바가 없고, 상기 오미자로부터 분리한 리그난 유도체와 NFAT 전사 조절과의 관련성에 대한 연구도 없는 실정이다.

이에 본 발명자들은 NFAT 전사 활성을 조절하는 물질에 대해서 예의 연구한 결과, 오미자로부터 분리한 디벤조사이클로옥텐 구조를 갖는 리그난 유도체가 NFAT 전사를 억제하는 것을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 오미자 추출물 또는 오미자로부터 분리한 디벤조사이클로옥텐 구조를 갖는 리그난 유도체를 유효성분으로 함유하는 NFAT에 의해 야기되는 질병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 기능성 식품을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 오미자 추출물을 유효성분으로 함유하는 NFAT에 의해 야기되는 질병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 오미자로부터 분리한 디벤조사이클로옥텐 구조를 갖는 리그난 유도체 또는 그들의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 NFAT에 의해 야기되는 질병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 오미자 추출물 또는 오미자로부터 분리한 리그난 유도체를 유효성분으로 함유하는 기능성 식품을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 오미자 추출물을 유효성분으로 함유하는 NFAT에 의해 야기되는 질병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에서 오미자 추출물은 오미자의 열매를 알콜 수용액으로 추출하여 농축한 후, 알콜 농축물을 물에 현탁시킨 후 헥산, 에틸초산 및 부탄올의 순으로 순차분배하여 추출한 분획이다. 상기에서 알콜 수용액은 5 내지 100%의 에틸알콜 및 5 내지 100%의 메틸알콜로 구성된 군으로부터 선택되어 사용될 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시예에서는 다음과 같은 방법으로 오미자 추출물을 분리하였다. 오미자 열매를 실온에서 메탄올로 추출하고 감압농축하여, 상기 농축물을 물에 현탁시킨 후 헥산, 초산에틸 및 부탄올로 순차 분배하였고, 헥산엑스는 실리카겔 크로마토그라피(헥산-에틸초산; 100:0 → 0:100, 구배)에 의하여 7개 분획으로 나누었다. 두 번째 분획을 다시 감압증류하여 증류분획과 잔류분획으로 나누었다. 시잔드린 A는 증류분획을 역상 칼럼 크로마토그라피(메탄올-물, 7-3)하여 얻었다. 잔류분획은 실리카겔 칼럼 크로마토그라피(헥산-아세톤-크로로포름, 25- 1-2)와 역상 고속액체 칼럼크로마토그라피(메탄올-아세토니트닐-물, 1-1-1)에 의해 시잔드린 C와 고미신 N을 분리하였다. 네 번째 분획을 실리카겔 칼럼 크로마토그라피(헥산-에틸초산, 12-1)하여 고미신 E와 벤조일이소고미신 O를 분리하였다. 시잔드롤 A와 시잔드롤 B는 실리카겔 칼럼크로마토크라피(헥산-에틸초산, 3-1)에 의해 여섯번째 분획으로 부터 단리되었다.

본 발명의 NFAT 전사 활성을 저해하는 오미자 추출물은 헥산엑스, 메탄올엑스, 초산에틸엑스 또는 부탄올엑스인 것이 바람직하고, 헥산엑스인 것이 더욱 바람직하다.

상기 방법에 의해 제조된 오미자 분획물의 NFAT 전사 억제활성 및 세포 생존률을 살펴보면 다음과 같다. 물엑스 분획은 NFAT 전사 저해 활성이 없고 세포 생존률도 영향을 주지 않았으나, 헥산엑스, 메탄올엑스, 초산에틸엑스 및 부탄올엑스는 처리하는 농도에 따라 NFAT 전사를 억제하는 활성을 보였고, 헥산엑스, 메탄올엑스, 초산에틸엑스 및 부탄올엑스의 순으로 NFAT 전사 저해 활성이 나타났다(표 1 참조).

외부로부터 감염되는 병원체의 제거를 위하여 NFAT를 포함한 면역반응의 활성화가 필요하다. 그러나 활성화된 면역세포들에서 면역반응의 유도와 조절에 필수적인 여러 사이토카인(IL-2, -3, -4, -5, GMCSF, TNF-α) 및 세포표면인자 (CD40L, FasL, IL-2Rα)등의 발현에 중요한 역할을 하는 전사인자 NFAT가 과도하게 활성화되면 자가면역, 이식거부(transplant rejection) 및 염증반응(inflammation)을 포함하는 면역병리학적(immunopathological) 반응을 일으킴으로서(Abbas AK, et al., Cellular and molecular immunology. W.B. Saunders Company, Philadelphia, 1997:315-38), 천식, 류마치성 관절염, 심근비대, 알러지, 아토피성 피부염 및 전신 홍반성 낭창 등과 같은 질병을 야기시킨다(Aramburu J, et al., Science 1999; 285: 2129-33; Djuric SW, et al., Journal of Medicinal Chemistry 2000; 43: 2975-81). 따라서 과도한 NFAT의 활성을 억제하여 NFAT의 전사를 조절하면 NFAT에 의해 야기되는 질병을 예방 또는 치료할 수 있다.

상기 오미자 분획물의 제조방법에 의해 오미자의 열매에서 디벤조사이클로옥텐(dibenzocyclooctene) 구조를 갖는 리그난 유도체를 분리할 수 있고, 분리된 리그난 유도체는 코튼효과(cotton effect)에 따라 R-형(시잔드린(Schisandrin) A, 고미신(Gomisin) N)과 S-형 바이페닐 구조(biphenyl configuration)(시잔드롤(Schisandrol) A, 고미신(Gomisin) E, 시잔드린(Schisandrin) C, 시잔드롤(Schisandrol) B, 벤조일이소고미신(Benzoylisogomisin) O)로 분류된다(Chen Y-Y, et al., Baill. Sci. Sin 1976; 19: 276-90).

본 발명은 상기 오미자에서 분리한 디벤조사이클로옥텐 구조를 갖는 리그난 유도체 또는 그들의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 함유하는 NFAT에 의해 야기되는 질병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 오미자에서 분리한 리그난 유도체는 시잔드린 A(화학식 1), 시잔드린 C(화학식 2), 고미신 N(화학식 3), 고미신 E(화학식 4), 벤조일이소고미신 O( 화학식 5), 시잔드롤 A(화학식 6) 또는 시잔드롤 B(화학식 7)인 것이 바람직하고, 시잔드린 A(화학식 1), 고미신 N(화학식 3), 고미신 E(화학식 4) 또는 시잔드롤 B(화학식 7)인 것이 더욱 바람직하고, 고미신 N(화학식 3) 또는 시잔드롤 A(화학식 6)인 것이 더욱 바람직하다.

상기 화학식 1 내지 화학식 7로 표시되는 디벤조사이클로옥텐 구조를 갖는 리그난 유도체는 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용될 수 있으며, 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산부가염이 유용하다. 유리산으로는 무기산과 유기산을 사용할 수 있다. 무기산으로는 염산, 브롬산, 황산, 인산 등을 사용할 수 있고, 유기산으로는 구연산, 초산, 젖산, 주석산, 말레인산, 푸마린산, 글루콘산, 메탄술폰산, 글리콘산, 숙신산, 4-톨루엔술폰산, 글루투론산, 엠본산, 글루탐산, 또는 아스파르트산 등이 사용될 수 있다. 또한 화학식 1 내지 화학식 7의 리그난 유도체는 염기로 인해 형성된 약학적으로 허용가능한 금속염 특히 알칼리 금속염일 수도 있다. 이들의 예로는 나트륨염 및 칼륨염이 있다.

상기 화학식 1 내지 화학식 7로 표시되는 유도체의 구조와 NFAT 활성 및 세포 생존의 관계는 다음과 같다. 고미신 N(C₂₃H₂₈O₆, 화학식 3) 및 시잔드롤 A(C₂₄H₃₂O₇, 화학식 6)는 세포의 생존력에는 영향을 미치지 않으면서 NFAT의 전사에 대하여 강력한 억제 효과(IC₅₀ : 1.3×10^-6 M)를 보인다(표 2 참조). 시잔드린 A(C₂₄H₃₂O₆, 화학식 1)의 구조는 시잔드롤 A(화학식 6)의 구조와 비교하였을 때 C-7 위치에 하이드록실(OH) 그룹이 없는 것만 차이가 있다. 그러나, 시잔드린 A(화학식 1)의 억제 활성(IC₅₀ : 7.2×10^-6 M)은 시잔드롤 A(화학식 6)의 억제 활성보다 5.5배 더 약하였다. 또한, A 고리(ring)에 추가적으로 메틸렌 디옥시 구조를 가지는 시잔드린 C(C₂₂H₂₄O₆, 화학식 2)는 고미신 N(화학식3)의 경우보다 더 낮은 억제 활성을 보였다(IC₅₀ : 7.5×10^-6 M). 시잔드롤 B(C₂₃H₂₈O₇, 화학식 7)는 A 고리에 메틸렌 디옥시 구조 뿐만 아니라 C-7에 하이드록실 그룹도 가지고 있으며, 시잔드롤 A(화학식 6)의 경우보다 훨씬 더 낮은 활성을 보였다(IC₅₀ : 1.6×10^-5 M). 또한, A 고리에 메틸렌 디옥시 구조를 가지는 벤조일이소고미신 O(C₃₀H₃₂O₈, 화학식 5)는 약한 활성을 보인 반면에(IC₅₀ : 1.1×10^-5 M), A 고리에 메틸렌 디옥시 그룹이 존재하지 않는 고미신 E(C₂₈H₃₄O₉, 화학식 4)는 C-6에 위치하는 에스테르 그룹과는 관계없이 높은 활성을 보였다(IC₅₀ : 4.7×10^-6 M).

상기와 같은 결과로부터, NFAT에 대한 리그닌의 활성은 C-7위치에 하이드록실 그룹을 도입함으로써 증가될 수 있으며, A 고리에 존재하는 메틸렌 디옥시 구조 에 의해서 감소될 수 있음을 확인하였다. 이들 화합물에 있어서의 구조와 활성과의 상관관계가 결론적으로 밝혀지지는 않았지만, C-7 위치의 하이드록시 그룹과 B 고리에 존재하는 메틸렌 디옥시 구조가 NFAT 전사에 대한 억제 활성에 기여하는 것으로 보인다. 오미자의 열매는 약 2% 중량부의 리그난을 포함하고 있다(Hikino H. et al., Antihepatotoxic actions of lignoids from Schisandra chinensis fruits. Planta Medica 1984; 50: 213-8). 이들 중에서, 주된 리그난들인 시잔드린 A(화학식 1), 시잔드린 C(화학식 2), 고미신 N(화학식 3), 시잔드롤 A(화학식 6) 및 시잔드롤 B(화학식 7)는 NFAT 전사에 대한 강한 억제 활성을 보였다.

따라서 오미자 추출물 또는 오미자에서 분리한 리그난 유도체는 NFAT에 의해 야기되는 질병 즉, 천식, 류마치성 관절염, 심근비대, 알러지, 아토피성 피부염 및 전신 홍반성 낭창 등과 같은 질병의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 오미자 추출물 또는 화학식 1 내지 화학식 7의 유도체 등을 유효성분으로 하고 이를 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하면 NFAT에 의해 야기되는 질병의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제조할 수 있다.

본 발명의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 통상적으로 사용되는 부형제, 붕해제, 감미제, 활택제, 향미제 등을 추가로 포함할 수 있으며, 통상적인 방법에 의해 정제, 캅셀제, 산제, 과립제, 현탁제, 유제, 시럽제, 기타 액제로 제형화될 수 있다. 구체적으로 본 발명의 약학적 조성물은 경구 투여용 제형, 예를 들면 정 제, 트로치제(troches), 로젠지(lozenge), 수용성 또는 유성현탁액, 조제분말 또는 과립, 에멀젼, 하드 또는 소프트 캡슐, 시럽 또는 엘릭시르제(elixirs)로 제제화된다. 정제 및 캡슐 등의 제형으로 제제하기 위해 락토오스, 사카로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴과 같은 결합제; 디칼슘 포스페이트와 같은 부형제; 옥수수 전분 또는 고구마 전분과 같은 붕해제; 스테아르산 마그네슘, 스테아르산 칼슘, 스테아릴푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌글리콜 왁스와 같은 윤활유가 함유된다. 캡슐제형의 경우는 상기에서 언급한 물질 이외에도 지방유와 같은 액체 담체를 함유한다.

또한, 본 발명의 약학적 조성물은 비경구로 투여할 수 있으며, 비경구 투여는 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사 또는 흉부내 주사 주입방식에 의한다. 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위해서는 상기 오미자 추출물 또는 화학식 1 내지 화학식 7의 유도체를 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여형으로 제제한다.

독성실험 결과 본 발명의 오미자 추출물 또는 화학식 1 내지 화학식 7의 유도체는 160 ㎎/㎏의 용량으로 쥐에게 경구 투여하였을 때 독성이 거의 없는 것으로 밝혀졌고 간을 비롯한 장기의 기능에 어떠한 부작용도 나타내지 않음을 확인하였다(Zhu et al., J. ethnopharmacology 1999; 50: 61-8). 또한, 리그난 유도체 함유 오미자 추출물은 랫트에서 2 g/㎏까지 독성 변화를 나타내지 않으며 경구 투여 최소 치사량(LD₅₀)은 2 g/㎏ 이상인 안전한 물질로 확인되었다.

본 발명에 따른 유효성분의 투여량은 체내에서 활성성분의 흡수도, 불활성화율 및 배설속도, 환자의 연령, 성별 및 상태, 치료할 질병의 중증 정도에 따라 적절히 선택되나, 일반적으로 성인에게 1일에 체중 1 ㎏ 당 오미자 추출물 또는 화학식 1 내지 화학식 7의 유도체를 1∼500 ㎎의 양으로 1회 내지 수회 나누어 투여할 수 있으며 바람직하기로는 5∼100 ㎎이다.

또한, 본 발명은 오미자 추출물 또는 화학식 1 내지 화학식 7의 유도체를 유효성분으로 함유하는 기능성 식품을 제공한다.

본 발명의 오미자 추출물 또는 화학식 1 내지 화학식 7의 유도체를 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 오미자 추출물 또는 화학식 1 내지 화학식 7의 유도체를 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용되고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 오미자 추출물 또는 화학식 1 내지 화학식 7의 유도체를 식품 또는 음료의 제조시에 원료에 대하여 0.01 내지 100 중량%, 바람직하게는 20 내지 95 중량%의 양으로 첨가될 수 있다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있음은 확실하다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식 품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 오미자 분획물의 제조

본 발명자들은 오미자(S. chinensis) 열매로부터 오미자 분획물을 제조하였다. 구체적으로, 오미자 열매(6 ㎏)는 실온에서 메탄올로 세 번 추출하여 감압농축하였다. 농축물(1,485 g)을 물에 현탁시킨 후 헥산, 초산에틸 및 부탄올로 순차 분배하였고, 헥산엑스(200 g)는 실리카겔 크로마토그라피(헥산-에틸초산; 100:0 → 0:100, 구배)에 의하여 7개 분획으로 나누었다. 두 번째 분획(50 g)을 다시 150℃에서 감압증류하여 증류분획과 잔류분획으로 나누었다. 시잔드린 A(448 ㎎)는 증류분획(33 g)을 역상 칼럼 크로마토그라피(메탄올-물, 7-3)하여 얻었다. 잔류분획(17 g)은 실리카겔 칼럼 크로마토그라피(헥산-아세톤-크로로포름, 25-1-2)와 역상 고속액체 칼럼 크로마토그라피(메탄올-아세토니트닐-물, 1-1-1)에 의해 시잔드린 C(143 ㎎)와 고미신 N(30 ㎎)을 분리하였다. 네 번째 분획(3.7 g)을 실리카겔 칼럼 크로마토그라피(헥산-에틸초산, 12-1)하여 고미신 E(168 ㎎)와 벤조일이 소고미신 O(11 ㎎)를 분리하였다. 시잔드롤 A(2.85 g)와 시잔드롤 B(1.3 g)는 실리카겔 칼럼크로마토크라피(헥산-에틸초산, 3-1)에 의해 여섯번째 분획(16.6 g)으로 부터 단리되었다.

<실시예 2> 오미자 분획물의 NFAT 전사 저해활성 분석

버퍼 및 시료의 제조

페놀 레드가 포함되지 않은 RPMI 1640(11835-030, Gibco. BRL)을 0.5% FBS(fetal bovine serum) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신과 혼합시켰다. 자극제(stimulator)로 사용한 25 ng/㎖의 PMA 및 0.5 mM의 이오노마이신(ionomycin)을 DMSO에 용해시켜 사용하였다. 기질로 사용한 120 mM의 p-니트로-페닐포스페이트는 1 M 디에탄올아민과 0.5 mM MgCl₂ 및 10 mM 호모아르기닌(homoarginine)으로 구성되는 SEAP 완충용액에 용해시켜 사용하였다.

세포 및 샘플의 제조

NFAT 의존적 전사 리포터 유전자를 포함하는 쥬캣(Jurkat) T 세포주, pCMV-SEAP은 10% FBS(fetal bovine serum) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신을 포함하는 RPMI 1640 배지에서 배양하였다. 세포를 원심분리로 수확한 후 PBS로 한 번 세척하였고, 페놀 레드를 포함하지 않는 RPMI 1640에서 재부유시켰다. 각각의 시료는 DMSO에 용해시켰으며, 페놀 레드를 포함하지 않는 RPMI 1640에 희석시켰다.

NFAT 전사에 대한 억제 활성 분석

NFAT 전사에 대한 억제 활성은 변형된 SEAP 분석법에 의하여 결정하였다(Yang TT. et al., Biotechniques 1997; 23: 1110-4). 구체적으로, 100 ㎕의 세포 (1×10⁴ 세포/웰)를 50 ㎕의 시료와 50 ㎕의 자극제(stimulator)에서 37℃에서 18시간 동안 배양시켰다. 반응 혼합물을 원심분리한 후, 100 ㎕의 상등액(supernatant)을 새로운 튜브로 옮긴 후 65℃에서 1시간 동안 가열시켰다. 가열된 시료를 바닥이 평평한 마이크로플레이트로 옮긴 후 50 ㎕의 SEAP 완충용액과 50 ㎕의 기질에서 37℃에서 4시간 동안 반응시켰다. 반응 혼합물을 배양한 후, 405 nm에서의 흡광도를 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 측정하였다. NFAT 전사에 대한 억제 활성은 대조군에 대한 억제의 백분율로 표시하였다. IC₅₀ 수치는 50% NFAT 전사를 억제하기 위하여 요구되는 저해제의 최종 농도로 정의하였다. 사이클로스포린 A를 양성 대조군(IC₅₀, 1.2×10^-9 M)으로 사용하였다.

세포의 생존력 분석

MTT 세포 증식 키트(465007, Roche)를 사용하여, 미토콘드리아 의존적으로 MTT가 포르마잔(formazan)으로 환원되는 것을 결정함으로써 세포의 생존력을 결정하였다.

그 결과, 10 ㎍/㎖ 이하의 물엑스 분획은 NFAT 전사 저해 활성이 없고 세포 생존률도 100% 이상으로 나타났으나, 5 ㎍/㎖의 헥산엑스 처리시에는 65.47%의 NFAT 전사 저해 활성을 나타냈고, 이때 세포 생존율은 100% 이었다(표 1). 또한, 5, 10 또는 20 ㎍/㎖ 분획물을 처리시에 헥산엑스, 메탄올엑스, 초산에틸엑스 및 부탄올엑스의 순으로 NFAT 전사 저해 활성이 나타나, 헥산엑스에서 NFAT 저해 활성이 가장 높은 것을 알 수 있었다.

샘플	최종 농도 (㎍/㎖)	O.D.(405nm)		평균	저해(%)	생존률(%)
메탄올 엑스	100	0.626	0.622	0.624	99.67	81
	10	1.576	1.488	1.532	57.1	102.6
	5	1.979	2.005	1.992	35.54	107
헥산엑스	20	0.615	0.626	0.621	99.84	40.6
	10	0.931	0.99	0.961	83.9	98.6
	5	1.32	1.387	1.354	65.47	100.5
초산에틸엑스	20	0.694	0.702	0.698	96.2	98.6
	10	1.802	1.897	1.85	42.22	102.2
	5	0.814	3.117	1.966	36.78	107.7
부탄올엑스	20	1.564	1.866	1.715	48.52	97.8
	10	2.218	1.958	2.088	31.04	100.2
	5	2.223	2.209	2.216	25.04	103.6
물엑스	20	2.382	2.069	2.2255	24.59	116.1
	10	2.79	2.678	2.734	0.75	108.2
	5	2.829	2.885	2.857	-5.02	108.9

<실시예 3> 오미자로부터 리그난의 분리 및 NFAT 전사 저해활성 분석

본 발명자들은 오미자(S. chinensis) 열매의 n-헥산(hexane)으로부터 Lee 등의 공지된 방법으로 실리카겔 칼럼 크로마토그래피 및 HPLC를 이용하여 리그난 유 도체를 분리하였다(Lee IS. et al., Biological and Pharmaceutical Bulletin 1999; 22; 265-7). NFAT 저해활성 분석은 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 수행하였다.

그 결과, 화학식 3의 구조를 갖는 고미신 N(C₂₃H₂₈O₆) 및 화학식 6의 구조를 갖는 시잔드롤 A(C₂₄H₃₂O₇)는 세포의 생존력에는 영향을 미치지 않으면서 NFAT의 전사에 대하여 가장 강력한 억제 효과(IC₅₀ : 1.3×10^-6 M)를 보였다(표 2). 화학식 1의 구조를 갖는 시잔드린 A의 억제 활성(IC₅₀ : 7.2×10^-6 M)은 화학식 6의 구조를 갖는 시잔드롤 A의 억제 활성보다 5.5배 더 약하였다. 또한, 화학식 2의 구조를 갖는 시잔드린 C(C₂₂H₂₄O₆)은 화학식 3의 구조를 갖는 고미신 N의 경우보다 더 낮은 억제 활성을 보였다(IC₅₀ : 7.5×10^-6 M). 화학식 7의 구조를 갖는 시잔드롤 B(C₂₃H₂₈O₇)는 화학식 6의 구조를 갖는 시잔드롤 A의 경우보다 훨씬 더 낮은 활성을 보였다(IC₅₀ : 1.6×10^-5 M). 또한, 화학식 5의 구조를 갖는 벤조일이소고미신 O(C₃₀H₃₂O₈, 화학식 5)는 약한 활성을 보인 반면에(IC₅₀ : 1.1×10 ^-5 M), 화학식 4의 구조를 갖는 고미신 E(C₂₈H₃₄O₉)는 높은 활성을 보였다(IC₅₀ : 4.7×10^-6 M).

화합물	IC₅₀ 값
시잔드린 A (화학식 1)	7.2 X 10^-6 M
시잔드린 C (화학식 2)	7.5 X 10^-6 M
고미신 N (화학식 3)	1.3 X 10^-6 M
고미신 E (화학식 4)	4.7 X 10^-6 M
벤조일이소고미신 O (화학식 5)	1.1 X 10^-5 M
시잔드롤 A (화학식 6)	1.3 X 10^-6 M
시잔드롤 B (화학식 7)	1.6 X 10^-5 M

<실험예 4> 랫트에 대한 경구투여 급성 독성실험

본 발명의 오미자로부터 분리한 오미자 추출물 또는 리그난 유도체의 급성 독성을 알아보기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

6주령의 특정병원부재 (SPF) SD계 랫트를 사용하여 급성독성실험을 실시하였다. 리그난 유도체 함유 오미자 추출물을 각각 0.5% 메틸셀룰로오스 용액에 현탁하여 2 g/㎏/15 ㎖의 용량으로 단회 경구 투여하였다. 시험물질 투여후 동물의 폐사여부, 임상증상, 체중변화를 관찰하고 혈액학적 검사와 혈액생화학적검사를 실시하였으며, 부검하여 육안으로 복강장기와 흉강장기의 이상 여부를 관찰하였다.

시험 결과, 시험물질을 투여한 모든 동물에서 특기할 만한 임상증상이나 폐사된 동물은 없었으며, 체중변화, 혈액검사, 혈액생화학 검사, 부검소견 등에서도 독성 변화는 관찰되지 않았다. 이상의 결과 리그난 유도체 함유 오미자 추출물은 랫트에서 2 g/㎏까지 독성 변화를 나타내지 않으며 경구 투여 최소 치사량 (LD₅₀)은 2 g/㎏ 이상인 안전한 물질로 판단되었다.

<제제예 1> 주사액제의 제조방법

유효성분 10 ㎎을 함유하는 주사액제는 다음과 같은 방법으로 제조하였다. 오미자 추출물 또는 리그난 유도체 함유물 1 g, 염화나트륨 0.6 g 및 아스코르브산 0.1 g을 증류수에 용해시켜서 100 ㎖를 만들었다. 이 용액을 병에 넣고 20℃에서 30분간 가열하여 멸균시켰다.

상기 주사액제의 구성성분은 다음과 같다.

오미자 추출물 또는 리그난 유도체 함유물 1 g

염화나트륨 0.6 g

아스코르브산 0.1 g

증류수 정량

<제제예 2> 시럽제의 제조방법

본 발명의 오미자 추출물 또는 오미자로부터 분리한 리그난 유도체의 산부가염 및 약학적으로 허용되는 그의 염을 유효성분 2% (중량/부피)로 함유하는 시럽은 다음과 같은 방법으로 제조한다.

오미자 추출물 또는 리그난 유도체 함유물의 산부가염, 사카린, 당을 온수 80 g에 용해시켰다. 이 용액을 냉각시킨 후, 여기에 글리세린, 향미료, 에탄올, 소르브산 및 증류수로 이루어진 용액을 제조하여 혼합하였다. 이 혼합물에 물을 첨가하여 100 ㎖가 되게 하였다.

상기 시럽제의 구성성분은 다음과 같다.

오미자 추출물 또는 리그난 유도체 함유물 2 g

사카린 0.8 g

당 25.4 g

글리세린 8.0 g

향미료 0.04 g

에탄올 4.0 g

소르브산 0.4 g

증류수 정량

<제제예 3> 정제의 제조방법

유효성분 15 ㎎이 함유된 정제는 다음과 같은 방법으로 제조한다. 오미자 추출물 또는 리그난 유도체 함유물 250 g, 락토오스 175.9 g, 감자전분 180 g 및 콜로이드성 규산 32 g과 혼합하였다. 이 혼합물에 10% 젤라틴 용액을 첨가시킨 후, 분쇄해서 14 메쉬체를 통과시켰다. 이것을 건조시키고 여기에 감자전분 160 g, 활석 50 g 및 스테아린산 마그네슘 5 g을 첨가해서 얻은 혼합물을 정제로 만들었다.

상기 정제의 구성성분은 다음과 같다.

오미자 추출물 또는 리그난 유도체 함유물 250 g

락토오스 175.9 g

감자전분 180 g

콜로이드성 규산 32 g

10% 젤라틴 용액

감자전분 160 g

활석 50 g

스테아르산 마그네슘 5 g

<제제예 4> 음료의 제조

본 발명자들은 오미자 추출물 또는 오미자로부터 분리한 리그난 유도체를 유효성분으로 함유하는 음료 조성물을 하기와 같이 제조하였다.

하기와 같은 조성으로 음료를 제조하였다.

꿀 522 ㎎

치옥토산아미드 5 ㎎

니코틴산아미드 10 ㎎

염산리보플라빈나트륨 3 ㎎

염산피리독신 2 ㎎

이노시톨 30 ㎎

오르트산 50 ㎎

오미자 추출물 또는 리그난 유도체 함유물 0.48 ∼ 1.28 ㎎

물 200 ㎖

상기 조성 및 함량으로 하여 통상적인 방법을 사용하여 음료를 제조하였다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 오미자 추출물 또는 오미자로부터 분리한 리그난 유도체는 NFAT 전사를 저해하는 활성이 크고, 동시에 세포 생존에는 별다른 영향을 주지 않기 때문에 이를 포함하는 약학적 조성물은 NFAT의 과도한 활성화에 의해 야기되는 자가면역, 이식거부, 염증반응을 포함하는 면역병리학적(immunopathological) 반응 등의 질병의 예방 또는 치료에 안전하고, 유용하게 사용될 수 있다.

Claims

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고미신 N(화학식 3), 고미신 E(화학식 4), 시잔드롤 A(화학식 6) 및 그들의 약학적으로 허용가능한 염으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상의 리그난 유도체를 유효성분으로 함유하는 NFAT(nuclear factor of activated T cells)에 의해 야기되는 자가면역성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.

<화학식 3>

<화학식 4>

<화학식 6>
제 4항에 있어서, 자가면역성 질환은 천식, 류마치성 관절염, 심근비대, 알러지, 아토피성 피부염 또는 전신 홍반성 낭창인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
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