KR100202399B1

KR100202399B1 - 오미자로부터 아실-코에이:콜레스테롤 아실트랜스퍼라제 활성 저해제의 제조방법 및 이를 함유하는 조성물

Info

Publication number: KR100202399B1
Application number: KR1019960031440A
Authority: KR
Inventors: 권병목; 복성해; 김영국; 김미경; 현병화; 배기환; 정현주
Original assignee: 박원훈; 한국과학기술연구원
Priority date: 1996-07-30
Filing date: 1996-07-30
Publication date: 1999-06-15
Also published as: KR980008237A

Abstract

본 발명은 오미자(Schizandra chinensis Baillon)로부터 아실-코에이:콜레스테롤 아실트랜스퍼라제(Acyl-CoA:Cholesterol Acyltransferase: ACAT)의 활성을 특이적으로 저해하는 리그난계 화합물의 제조방법 및 이를 함유하는 조성물에 관한 것으로, 오미자를 유기용매로 추출하고, 정제하여 얻은 하기 화학식 1을 갖는 리그난계 화합물은 고콜레스테롤 혈증에 기인한 심혈관 질환의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다:

(여기서, R는 수소, 히드록실, 알킬 또는 아릴기이고, R₁은 수소 또는 히드록실기이다.)

Description

오미자로부터 아실-코에이:콜레스테롤 아실트랜스퍼라제(ACAT) 활성저해제의 제조 방법 및 이를 함유하는 조성물

본 발명은 한국에서 자생하는 오미자(Schizandra chinensis Baillon)로부터 아실-코에이:콜레스테롤 아실트랜스퍼라제(Acyl-CoA: Cholesterol Acyltransferase : 이하, ACAT라 함) 활성 저해제의 제조방법 및 이를 함유하는 조성물에 관한 것이다. 보다 상세하게는 생약 및 식용으로 사용되고 있는 오미자로부터 ACAT 저해활성을 갖는 리그난계 화합물의 제조방법 및 이들 리그난계 화합물을 포함하는 혈중 콜레스테롤 저하 및 콜레스테롤 흡수 저해를 위한 조성물에 관한 것이다.

혈중 콜레스테롤의 증가에 따라 발생되는 고지혈증은 동맥경화, 심장마비, 협심증 및 여러 유형의 뇌일혈 등의 발병요인이 되어 선진국가에서는 가장 중요한 사망요인의 하나로 부각되고 있다(W. B. Kannel, et al., N. Engl. J. Med, 311, 1144(1984)). 이에 따라 혈중 콜레스테롤의 양을 감소시키기 위한 여러가지 연구가 진행되어 왔으며, 특히 과다한 고지방 식이와 관련하여 음식물로부터 섭취되는 콜레스테롤의 흡수를 억제하려는 노력이 계속되고 있다.

선진 문명국에서는 주요 사망원인으로 심장순환계 질병(고혈압, 동맥경화증, 혈중 콜레스테롤 과다 및 고지혈증 등) 및 암을 손꼽고 있기 때문에, 이 분야의 치료제 개발에 주력하고 있다. 예를 들어, 미국 메르크사(Merck Co., Inc)는 콜레스테롤 생합성 대사과정에서 필요한 효소인 3-히드록시-3-메틸 글루타릴-코에이(3-hydroxy-3-methyl glutaryl-CoA) 환원효소 저해제를 혈중 콜레스테롤 저하제로 개발한 바 있다.

ACAT는 세포내 콜레스테롤의 에스테르화를 촉진하는 효소로 밝혀졌다.(J. C. Goldstein, et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 3178(1978)). 장에서 흡수되었거나 간에서 생합성된 콜레스테롤은 에스테르화된 후에 지단백에 의해서 혈관을 통하여 각 조직으로 운반된다. 이때 콜레스테롤 에스테르가 필요 이상으로 존재하게 되면 혈관벽 등에 축적되거나 혈액의 점도를 증가시켜서 각종 심혈관 질환의원인이 되는 것으로 알려지고 있다(D. STeinburg, N. Engl. J. Med., 320, 915(1989)). 따라서, ACAT의 활성을 저해할 경우, 동물의 혈중 콜레스테롤 에스테르의 양이 저하되어 혈액의 점도가 낮아지고, 간에서는 콜레스테롤의 양이 증가되어 이의 합성이 감소되며 장에서 흡수되는 콜레스테롤의 양 또한 줄일 수 있어서, 궁극적으로는 각종 심혈관 질환의 치료 내지는 예방이 가능할 것으로 보기 때문에 ACAT 활성 저해제를 합성하거나 천연물로부터 추출하려는 시도가 계속되어 왔다(K. Matsuda, Med. Res. Rev., 14, 271(1994)). 예를 들어, 합성 ACAT 저해제로는 우레아 유도체(D. R. Sliskovic, et al., J. Med. Chem, 37, 560(1994)) 또는 이미다졸 유도체(R. G. Wilde, et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 5, 167(1995))가 있고, 미생물 대사산물로 부터 분리된 것으로는 아스페르질러스 푸미가루스(Aspergillus fumigatus)로부터 생산된 피리로펜(Pyripyropenes)(S. Omura, et al., J. Antibiotics, 46, 116-119(1993); Kwon, et al., Tetrahedron Lett., (1994); J. Antibiotics, 48, (1995)), 스케도스포리움 속(Scedosporium sp.)으로부터 생산된 AS-183(K. Kuroda et al., J. Antibiotics, 46, 1196-1202(1993)), 또는 천연 생약제로부터 분리된 것으로는 후박잎으로부터 분리된 오보바톨(Obovatol), 매그놀올(Magnolol) 및 호노키올(Honokiol)(대한민국 특허출원 제95-41207 호) 등이 개발된 바 있다.

이에 본 발명자들은 오랜 동안 사용되어 안정성이 확보된 천연 생약재로부터 혈중 콜레스테롤을 저하시킬 수 있는 ACAT 저해제를 개발하기 위해 연구를 계속 진행한 결과, 간독성을 억제하는 효과가 있는 오미자로부터 ACAT 활성을 저해할 수 있는 리그난계 화합물을 분리해 냄으로써 본 발명의 완성에 이르게 되었다.

본 발명의 목적은 오미자로부터 ACAT 활성 저해제를 제조하는 방법 및 이를 포함하는 혈중 콜레스테롤 저하용 조성물을 제공하는 것이다.

제1도는 고미신 N의 수소 핵자기 공명(NMR) 스펙트럼을 나타낸 것이다.

제2도는 고미신 N의 탄소 NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.

제3도는 고미신 N의 자외선 흡광도 스펙트럼을 나타낸 것이다.

제4도는 고미신 A의 수소 NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.

제5도는 고미신 K3의 수소 NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.

제6도는 고미신 J의 수소 NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.

상기 목적에 따라, 본 발명에서는 오미자(Schizandra chinensis Baillon)를 유기용매로 추출하고, 정제하는 단계를 포함하는 하기 화학식 1을 갖는 리그난계 화합물의 제조방법 및 하기 화학식 1의 리그난계 화합물을 포함하는, 고콜레스테롤 혈중에 기인한 심혈관 질환 예방 및 치료용 조성물을 제공한다:

본 발명에 따른 ACAT 저해활성을 갖는 리그난계 화합물은 오미자를 메탄올로 추출한 후 농축하고, 농축물에 헥산과 물을 가하여 수층과 유기용매층으로 분리시킨 다음, 활성성분이 포함되어 있는 유기층을 분리하여 농축하고 농축액을 실리카겔 크로마토그래피 및 HPLC를 이용하여 분리정제하여 얻을 수 잇다.

본 발명에 따라 얻어지는 리그난계 화합물로는 특히 하기 화학식 2, 3, 4 또는 5의 화합물들이 바람직하다:

또는

상기 화학식 2의 화합물은 고미신 N(Gomisin N), 화학식 3의 화합물은 고미신 A, 화학식 4의 화합물은 고미신 K3, 그리고 화학식 5의 화합물은 고미신 J인 것으로 확인되었다(Y. Ikeya, et al., Chem. Pharm. Bull., 27, 2695(1979)).

본 발명에 따라 오미자로부터 분리정제된 리그난계 화합물은 ACAT 저해활성 측정 결과 IC₅₀가 10 내지 50/으로, 특히 고미신 N이 10/으로 높으며, 고미신 A는 50/, 고미신 K3은 15/그리고 고미신 J는 20/의 값을 갖는다. 이들 화합물은 생약 및 식용으로 쓰여 왔던 약재로부터 분리된 것이므로 독성 등의 문제가 없을 뿐만 아니라, 리그난계 화합물은 간독성을 막아주는 역할을 하므로(H. Hikino, et al., Planta Medica, 213(1984)) 대부분의 약재가 가지고 있는 간독성의 문제는 없을 것으로 사료된다. 따라서 본 발명에서 분리한 화합물은 ACAT 활성 저해를 통해 혈중 콜레스테롤 양을 감소시켜 고콜레스테롤 혈증에 기인한 각종 심혈관계 질환의 예방 및 치료에 사용할 수 있다.

본 발명에 따라 분리정제된 리그난계 화합물은 통상적인 방법에 의해 정제, 캅셀제, 산제, 과립제, 현탁제, 유제 또는 비경구용 제제와 같은 단위 투여형 또는 수회 투여형 제제로 제형화하여 콜레스테롤 흡수 저해, 고지혈증 예방 및 치료, 그리고 고콜레스테롤 혈증에 기인한 각종 심혈관계 질환 예방 및 치료용 제제로 사용할 수 잇다.

본 발명에서 분리한 유도체들을 유효성분으로 함유하는 약학 조성물은 목적하는 바에 따라 비경구 투여하거나 경구 투여할 수 있으며, 고미신 N은 하루에 체중 1kg당 5 내지 10mg, 고미신 A는 25 내지 50mg, 고미신 K3은 8 내지 15mg, 그리고 고미신 J는 10 내지 20mg의 양을 1 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다. 특정 환자에 대한 투여용량 수준은 사용될 특정 화합물의 종류, 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법 및 배설, 그리고 약제 혼합 및 질환의 중증도에 따라 변화시킬 수 있다.

이하 본 발명을 하기 실시예에 의거하여 좀더 상세히 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 만으로 제한되는 것은 아니다.

[실시예 1]

[리그난계 화합물의 분리 및 정제]

본 발명에 사용한 오미자는 대한민국에서 자생하는 오미자(Schizandra chinensis Baillon)를 구입한 것이다. 완전히 건조한 1kg의 오미자에 2의 메탄올을 가하여 상온에서 3일간 방치한 후 여과지를 사용하여 액상과 고체부분으로 분리하였다. 액상을 모아서 감압하에서 농축한 후 1의 헥산과 1의 물을 가하여 물층과 유기 용매층으로 분리하고, 물층을 1의 헥산으로 3번 추출하여 유기용매에 녹는 부분을 모았다.

유기용매층과 물층을 분리하여 효소활성 저해도를 측정한 결과 유기용매층에 활성 물질이 함유되어 있음을 확인하였다. 유기용매층을 감압하에서 농축 건조하여 얻은 액체물질을 200의 메탄올에 녹이고 500의 C18에 흡착시킨 후 메탄올/물(80/20)으로부터 메탄올/물(95/5)까지 용리하여 활성물질 분획을 얻었다. 용리액을 감압하에서 농축하여 황갈색의 액체 물질을 얻었다. 실리카겔(Merck사, 상품명: 9385)을 충전한 칼럼(4.5x40cm)을 통하여 활성성분 분획을 실리카겔에 흡착시키고, 헥산:에틸 아세테이트의 빙율을 9.5 : 0.5 부터 7 : 3으로 변화시키면서 2회의 시릴카겔 칼럼 크로마토그래피를 수행하여 활성분획을 분리하였다. 최종적으로 HPLC를 이용하여 순수한 4가지의 리그난계 화합물을 정제하였는데, HPLC 칼럼으로는 YMC사의 YMC-PackC8 SH-243-5(250x21.2mm)를 사용하였다. 고미신 N 및 A는 메탄올/물(85/15)을 용매로 하여 용출시켰을 때 각각 30분 및 20분에 단일성분으로 분리되었으며, 고미신 K3는 메탄올/물(80/20)로 용출시켜 순수정제하였고, 가장 극성이 높은 고미신 J는 메탄올/물(70/30)로 용출시켜 정제하였다. 최종적으로 분리된 순수한 화합물중 고미신 N은 0.1%, 고미신 A, K3 및 J는 0.03 내지 0.5%의 수율로 얻을 수 있었다.

[실시에 2]

[기기분석 및 구조결정]

실시예 1에서 분리정제한 ACAT 저해 활성물질의 구조 결정을 위해 하기와 같은 기기분석을 행하였다.

자외선(UV)-가시광선(Visible) 흡광도 분석: HPLC에 의해 최종적으로 분리 정제된 활성물질을 100% 메탄올에 녹여서 자외선-가시광선 분광기(Shimazu사, UV-265)를 이용하여 흡수파장을 분석하였으며, 그 결과는 표 1에 요약하였다. 적외선(IR) 흡광도 분석: 활성물질 시료 1mg을 클로로포름에 녹여 AgBr 창에 바른후 건조하여 비율 기록 적외선 분광기(Bio-Rad Digilab Division, FTS-80)로 분석하엿다. 상기 물질은 1605cm^-1에서 방향족 화합물의 특성 흡수피크를 보였고, 고미신A, K3 및 J는 3500cm^-1에서 OH 그룹의 존재를 나타내는 흡수피크를 보였다.

분자량 분석 : VG70-VSEQ 질량분석기를 이용하여 HRCI(High-Resolution Electron Chemical Ionization)-MS 방법으로 분자량을 측정하여, 결과는 표 1에 나타내었다.

핵자기 공명(NMR) 분석: 활성물질을 완전건조하여 CDCl₃에 녹이 후 5mm 튜브에 넣어 Varian UNITY 300 기종으로 NMR 분석을 하였으며¹H-NMR은 299.949 MH_z로,¹³C-NMR은 75.430 MH_z로 측정하엿다.

본 발명의 화합물의¹H-스펙트럼 및¹³C-스펙트럼을 제1도 내지 제6도에 나타내었다. 제1도, 제2도 및 제3도는 각각 고미신 N의 수소 NMR 스펙트럼, 탄소 NMR 스펙트럼 및 자외선 흡광도 스펙트럼을 나타내고, 제4도, 제5도 및 제6도는 각각 고미신 A, K3 및 J의 수소 NMR 스펙트럼을 나타낸다.

이들 화합물의 이화학적 성질을 다음 표 1에 요약하여 나타낸다.

[실시예 3]

[리그난계 화합물의 ACAT 저해활성 검정]

ACAT 활성의 측정은 [1-¹⁴C] 올레오일-CoA를 기질로 하여 타비스(Tabas) 등의 방법(Tabas, et al., J. Biol. Chem, 261, 3127`3154(1986))을 응용하여 실시하였다.

발효 상등액 10, 쥐의 간조직 마이크로좀 효소 4.0, 분석 완충액(0.5M KH₂PO₄, 10mM DTT, pH 7.4) 20.0, 40mg/소 혈청 알부민(지방산 부재) 15.0, 20mg/의 콜레스테롤 2.0및 물 41.0를 혼합하여 37에서 15분간 예비반응시켰다. 이 반응액에 [1-¹⁴C] 올레오일-CoA(0.02Ci, 최종농도 10M) 8를 첨가하여 37에서 15분간 다시 반응시킨 후, 이소프로판올-헵탄(isopropanol-heptane, 4:1, v/v) 1을 가하여 반응을 정지시키고, 헵탄 0.6와 5배로 희석한 분석 완충액 0.4를 첨가하여 원심분리하엿다. 원심분리하여 얻은 상층액 100에 칵테일 5를 첨가한 후 액체 신틸레이션 카운터(liquid scintillation counter)를 사용하여 효소활성을 측정하였다. ACAT 저해활성은 다음과 같이 계산한다:

이 때 공시험은 0에서 반응시킨 것이고, 대조구로는 클로르프로마진(chlorpromazine)을 사용하였다.

이들 화합물들의 ACAT 저해도 측정 결과 IC₅₀가 10 내지 50/인 것으로 확인되었다.

다음 표 2는 본 발명의 활성 화합물 고미신 N, A, K3 및 J의 효소 저해 활성도를 측정한 결과를 나타낸다.

[실시예 4]

[고미신 N, A, K3 및 J의 급성독성 실험]

고미신 N, A, K3 및 J를 각각 체중 23 내지 25g의 마우스(암컷)에 500mg/kg 용량으로 피하 주사한 결과, 특별한 이상증상은 관찰되지 않았고 투여 4일 후까지 사망하지 않았으므로, 이들 물질에 대한 급성 효과는 나타나지 않은 것으로 판단된다.

본 발명에 따라 장기간에 걸친 사용으로 인해 안정성이 확보된 생약인 오미자로부터 추출 정제하여 얻은 리그난계 화합물은, ACAT 저해 활성을 가지므로 혈중 콜레스테롤 농도를 저하시키는데 유효하여 고콜레스테롤 혈중에 기인하고 고지혈증, 동맥경화증 등 각종 심혈관게 질환의 예방 및 치료용 제제로 유용하게 사용될 수 있다.

Claims

하기 화학식 1의 리그난계 화합물을 포함하는 고콜레스테롤 혈중에 기인한 심혈관 질환 예방 및 치료용 조성물;

(여기에서, R¹은 수소 또는 히드록실이고, R²는 수소, 알킬 또는 아릴기이고, R³은 히드록실 또는 알콕시이고, R⁴와 R⁵는 독립적으로 수소, 알킬 또는 아릴기이거나 함께 메틸렌 브리지로 연결된다).