KR100570496B1 - 아실―코에이ː콜레스테롤 전이효소 저해활성을 갖는비환식 트리테르페노이드계 화합물 및 이를 함유하는 약제조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 아실-코에이:콜레스테롤 전이효소 저해활성을 갖는 비환식 트리테르페노이드계 화합물 및 이를 함유하는 약제 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 다음 화학식 1의 비환식(acyclic) 트리테르페노이드계 화합물인 2,3,22,23-테트라하이드록시-2,6,10,15,19,23-헥사메틸-6,10,14,18-테트라코사테트라엔(2,3,22,23-tertrahydroxy-2,6,10,15,19,23-hexamethyl-6,10,14,18-tetracosatetraene)이 아실-코에이:콜레스테롤 전이효소에 대한 활성을 효과적으로 억제함을 확인함으로써 상기 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 고콜레스테롤혈증에 기인하는 고지혈증, 동맥경화 등의 각종 심혈관계 질환 예방 및 치료용 조성물 또는 식품에 관한 것이다.

아실-코에이:콜레스테롤 전이효소, 2,3,22,23-테트라하이드록시-2,6,10,15,19,23-헥사메틸-6,10,14,18-테트라코사테트라엔, 심혈관계 질환

Description

아실―코에이ː콜레스테롤 전이효소 저해활성을 갖는 비환식 트리테르페노이드계 화합물 및 이를 함유하는 약제 조성물{Composition comprising acyclic triterpenoid compounds with acyl-CoAːcholesterol acyltransferase inhibitory activity}

도 1은 본 발명에 따른 화학식 1로 표시되는 화합물의 수소-핵자기공명 스펙트럼(CDCl₃, 500.13 ㎒)을 나타낸 것이다.

도 2는 본 발명에 따른 화학식 1로 표시되는 화합물의 탄소-핵자기공명 스펙트럼(CDCl₃, 125.75 ㎒)을 나타낸 것이다.

도 3은 본 발명에 따른 화학식 1로 표시되는 화합물의 질량분석 스펙트럼(ESI-Mass)을 나타낸 것이다.

도 4는 본 발명에 따른 화학식 1로 표시되는 화합물의 ACAT(acyl-CoA: cholesterol acyltransferase) 저해활성을 나타낸 도이다.

본 발명은 아실-코에이:콜레스테롤 전이효소 저해활성을 갖는 비환식 트리테르페노이드계 화합물 및 이를 함유하는 약제 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 2,3,22,23-테트라하이드록시-2,6,10,15,19,23-헥사메틸-6,10,14,18-테트라코사테트라엔(2,3,22,23-tertrahydroxy-2,6,10,15,19,23-hexamethyl- 6,10,14,18-tetracosatetraene)이 아실-코에이:콜레스테롤 전이효소에 대한 활성을 효과적으로 억제함을 확인함으로써 상기 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 고콜레스테롤혈증에 기인하는 고지혈증, 동맥경화 등의 각종 심혈관계 질환 예방 및 치료용 조성물 또는 식품에 관한 것이다.

심혈관 질환은 주로 고지혈증에 의하여 발병되며 이 질환의 사망률은 전체 사망률 중에서 상위를 차지하고 있다.

인체가 필요로 하는 콜레스테롤은 음식물의 섭취에 의한 외인성 콜레스테롤과 생체내 간장에서 합성에 의한 내인성 콜레스테롤이 있다고 알려져 있다. 그러나, 중성지방과 콜레스테롤의 체내유입이 지나쳐 고지혈증이 되면 혈중에 콜레스테롤이나 트리글리세라이드가 과다하게 높게 되며 동맥경화증을 일으키는 주 요인이 된다. 이런 증상들은 지단백질(lipoprotein)의 형성, 운반 및 분해 과정 중에 이상이 생겨 지단백질의 대사가 비정상적으로 이루어지기 때문이다.

역학적 조사에 의하면, 허혈성 심장질환의 대부분은 관상동맥의 아테로마성 동맥경화증이 주류를 이루고 있고, 혈중 콜레스테롤의 상승이 병의 발생과 진전에 중요한 인자라고 알려져 있다. 따라서, 혈중 콜레스테롤을 저하시키기 위해서 소장에서 콜레스테롤의 흡수 저해, 간에서 콜레스테롤의 생합성 저해, 담즙산의 배설을 촉진시키는 방법들이 제시되고 있다.

현재 혈중 콜레스테롤 농도를 낮추기 위하여 사용되고 있는 의약품으로는 간장에서 생합성되는 콜레스테롤의 합성을 저해하는 것으로, 일본의 산쿄, 미국의 머크사의 제품으로 콤팩틴(compactin)의 생물학적 변형 유도체인 프라바스타틴 (pravastatin)과 심바스타틴(simvastatin)이 가장 높은 점유율과 신장률을 보이고 있다. 이들 의약품의 작용 기작은 간장에서 콜레스테롤의 생합성 과정 중 합성중간단계에 관여하는 3-히드록시-3-메틸 글루타릴 Co-A 환원효소(이하 "HMG Co-A"라 한다)를 저해하는 것이다. 그러나, 작용 기작 상 HMG Co-A 환원효소 저해제를 장기간 사용하면 메바로네이트(mevalonate) 이후의 콜레스테롤 합성 중간단계의 부경로에서 생성되어야할 인체가 필요한 우비퀴논(ubiquinone), 돌리콜(dolichol), 헴 에이(haem A), 파네실화된 단백질(farnesylated protein) 및 콜레스테롤에서 생성되는 스테로이드 호르몬, 비타민 D, 담즙산, 지단백질의 생산에 영향을 주는 것으로 보고되어 있다[Grunler J., J. Ericsson and G. Dalloner 1994. Branch-point reactions in the biosynthesis of cholesterol, dolichol, ubiquinone and prenylated proteins: Biochim. Biophys, Acta 1212, 259-277]. 실제로, HMG Co-A 환원효소 저해제를 지속적으로 사용 시 심장기능과 면역기능에 중요한 역할을 하는 코엔자임 큐의 합성을 감소시키는 것으로 나타나, 동맥경화증 환자나 심장질 환 환자에게는 악영향을 줄 수 있는 것으로 보고되고 있다[Willis R.A., K., Folkers. J.L. Tucker, C.Q. Ye, , L.J. Xia, and H Tamagawa. 1990. Lovastatin decreases coenzyme Q levels in rats: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 8928-8930].

현재 사용되고 있는 고지혈증 치료제로는 간장에서 합성되는 콜레스테롤의 생합성을 저해하는 저해제와, 간장에서 분비되어 음식물을 소화시키고 대장에서 재흡수되는 담즙산에 결합하는 음이온 교환체가 콜레스테롤 재흡수 저해제로 임상적으로 사용되고 있으나, 보다 사용에 제한사항이 없고 작용기작이 확실하며 부작용이 적은 새로운 고지혈증 치료제의 개발이 요구되고 있다. 슬리스코빅의 연구에 의하면 고지혈증의 예방과 치료에 ACAT(acyl-CoA: cholesterol acyltransferase) 활성 저해제가 효과가 있는 것으로 보고되었고[Sliskovic D. R. and A. D. White 1991. Therapeutic potential of ACAT inhibitors as lipid lowering and antiatherosclerotic agents: Trends in Pharmacol. Sci. 12:194-199], 특히 동맥경화 발생 기작에 직접적으로 관련되어 있는 새로운 작용기작을 갖는 고지혈증 치료제 개발의 일환으로 ACAT 저해제의 개발이 주목되고 있다.

ACAT는 콜레스테롤의 아실화에 관여하여 소장에서 콜레스테롤의 흡수, 간장에서 VLDL(very low density lipoprotein)의 합성, 지방세포와 혈관내벽에 저장형 콜레스테롤의 축적에 관여하는 효소로 알려져 있다.

지금까지 연구되어진 ACAT 저해제들은 화학 합성품이 주로 연구대상이었으며, 워너람베르트, 화이자, 야마노우치 등에서 우레아계, 아미드계, 페놀계의 합성 화합물이 주종을 이루고 있다[Matsuda K. 1994. ACAT inhibitors as antiatherosclerosis agent:compounds and mechanisms. 14, John Wiley & Son, Inc., 271-305]. 또한, 새로운 구조를 갖는 ACAT 저해 선도물질을 개발하기 위하여 미생물 자원을 대상으로 탐색연구가 진행되고 있으며, 일본 키타사토(Kitasato) 연구소의 퍼팩틴(purpactin)의 구조가 밝혀진 것을 시작으로 일본 산쿄사의 에피-콜리퀴논 에이(epi-cohliquinone A)[일본 특허공개공보 특개평 4-334383, 1992], 동경 농공대의 아카테린(acatelin), 헬민토스포롤(helmintosporol), 라테리틴 (lateritin), 짚세틴(gypsetin), 일본 키타사토 연구소의 엔니아틴(enniatins), 글리소프레닌(glisoprenins), 피리피로펜(pyripyropenes), 테르펜돌(terpendols), 일본 교와하꼬(Kyowa Hakko)사의 AS-183, AS-186, 한국생명공학연구원의 GERI-BP-001, GERI-BP-002 등이 보고되어 있다. 특히, 최근 화이자가 개발 중인 ACAT 저해제 아바시미베(avasimibe)는 제 3상 임상실험에 들어가 고지혈증 치료의 새로운 의약품으로 관심을 모으고 있다[Heinonen TM., 2002. Acyl coenzyme A:cholesterol acyltransferase inhibition: potential atherosclerosis therapy or springboard for other discoveries: Expert Opin Investig Drugs. 11:1519-1527].

본 발명에 사용한 초두구(Alpinia katsumadai)는 생강과(Zingiberaceae)에 속하는 생약으로, 건위, 진토 등의 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 초두구는 중국남부, 대만 홍콩 등에 분포하며, 열대각지에서 재배되고 있으며 해독과 체질개선, 구강위생증진, 항염증 등의 효과도 알려져 있다.

최근에 초두구 추출물이 췌장 콜레스테롤 에스터레이즈(pancreatic cholesterol esterase; pancreatic cholesteryl ester hydrolase: pCEH)의 활성을 저해하여 초두구 추출물이 동맥경화증 예방 및 치료용도로 특허 등록 받은 바 있다[국내 특허 등록 제307667호]. 하지만 초두구의 활성분획물만 수득하였을 뿐, 구체적인 물질의 구조는 밝히지 못하였다. 또한, 분획물로 의약품을 제조할 경우에는 분획물 내에 여러 가지 화합물이 함께 함유되어 있어 원하는 약효활성과 상관없는 활성을 나타낼 수 있어 부작용이 우려되며, 약물로서 안전하지 않은 물질들이 포함되어 있는 단점이 있다.

한편, 비환식 트리테르페노이드계 화합물인 2,3,22,23-테트라하이드록시-2,6,10,15,19,23-헥사메틸-6,10,14,18-테트라코사테트라엔(2,3,22,23-tertrahydroxy-2,6,10,15,19,23-hexamethyl- 6,10,14,18-tetracosatetraene)의 약리활성에 대해서는 전혀 보고된 바 없다.

이에, 본 발명자들은 천연물로부터 콜레스테롤 대사억제물질을 연구하던 중, 초두구로부터 유효활성성분이 다음 화학식 1의 비환식(acyclic) 트리테르페노이드계 화합물임을 밝히고 이 화합물이 ACAT 활성을 특이적으로 저해하는 작용이 있음을 최초로 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명은 다음 화학식 1의 비환식(acyclic) 트리테르페노이드계 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 하는 심혈관계 질환의 예방 및 치료용 조성물을 제공하는데 그 목적이 있다.

또한, 본 발명은 다음 화학식 1의 비환식(acyclic) 트리테르페노이드계 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 하는 식품을 제공하는데 그 목적이 있다.

[화학식 1]

본 발명은 다음 화학식 1의 비환식(acyclic) 트리테르페노이드계 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 하는 심혈관계 질환의 예방 및 치료용 조성물을 그 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 다음 화학식 1의 비환식(acyclic) 트리테르페노이드계 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 하는 식품을 포함한다.

[화학식 1]

이와 같은 본 발명을 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 화학식 1의 비환식(acyclic) 트리테르페노이드계 화합물인 2,3,22,23-테트라하이드록시-2,6,10,15,19,23-헥사메틸-6,10,14,18-테트라코사테트라엔(2,3,22,23-tertrahydroxy-2,6,10,15,19,23-hexamethyl- 6,10,14,18-tetracosatetraene)이 아실-코에이:콜레스테롤 전이효소에 대한 활성을 효과적으로 억제함을 확인함으로써 상기 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 고콜레스테롤혈증에 기인하는 고지혈증, 동맥경화 등의 각종 심혈관계 질환 예방 및 치료용 조성물 또는 식품에 관한 것이다.

먼저, 본 발명에 따른 초두구로부터 상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 분리방법은 다음과 같다.

초두구는 물로 깨끗이 세척한 후 그늘에서 건조한 후, 분쇄기로 분말화 시킨다. 분말화된 초두구에 3배의 에탄올(건조된 초두구 중량에 대해)을 가하여 7일간 실온에서 추출한 후 여과하고, 여과액을 감압 농축하여 조추출물을 얻는다.

상기 조추출물을 클로로포름, 에틸아세테이트 및 물을 이용하여 분리하고, 얻어진 클로로포름층, 에틸아세테이트층 및 물층에 대하여 ACAT 활성을 측정한 결과, 클로로포름층에서 ACAT 활성이 강하게 억제된다.

상기 클로로포름층을 클로로포름과 메탄올의 혼합용매를 사용하여 실리카겔 칼럼 크로마토그래피로 분리한다. 이때, 클로로포름과 메탄올은 100 ∼ 0 : 0 ∼ 100 (v/v)인 용매를 사용하는 것이 바람직하다.

상기 분리된 활성분획의 ACAT 저해활성을 측정하여 그 중에서 가장 ACAT 저해활성이 높은 분획들을 모아 70%, 80%, 90%, 100% 메탄올을 용출용매로 사용하여 역상 컬럼 크로마토그래피로 분리한다.

상기 얻어진 최종 분획 중 ACAT 저해활성이 높은 분획들을 모아 90% 메탄올을 사용하여 5 ㎖/분으로 흘려주면서 HPLC로 최종 화합물을 분리한다.

상기 화학식 1의 화합물은 상기한 바대로 초두구로부터 추출 분리하거나 유기합성법으로 합성 제조될 수 있다.

또한, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 약학적으로 허용가능한 염의 형태로 사용할 수 있으며, 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 유용하다. 상기 화학식 1의 화합물은 당해 기술 분야에서 통상적인 방법에 따라 약제학적으로 형용되는 산 부가염을 형성할 수 있다. 유리산으로는 유리산과 무기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 브롬산, 황산, 인산 등을 사용할 수 있고 유기산으로는 구연산(citric acid), 초산, 젖산, 주석산(tartaric acid), 말레인산, 푸마르산(fumaric acid), 포름산, 프로피온산(propionic acid), 옥살산, 트리플루오로아세트산, 벤조산, 글루콘산, 메탄술폰산, 글리콜산, 숙신산, 4-톨루엔술폰산, 갈룩투론산, 엠본산, 글루타민산 또는 아스파라긴산 등을 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 초두구 추출물로부터 분리된 화학식 1의 화합물은 쥐간 ACAT에 대한 IC₅₀치가 24 ㅅg/㎖로 나타나고, 농도 의존적으로 ACAT 활성을 효과적으로 억제함을 확인하였다.

따라서, 본 발명은 상기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능 한 염을 유효성분으로 함유하는 고콜레스테롤혈증에 기인하는 고지혈증, 동맥경화 등의 각종 심혈관계 질환 예방 및 치료용 조성물을 포함한다.

본 발명의 조성물은 상기 화학식 1의 화합물에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.

본 발명의 조성물은 실제 임상투여 시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캅셀제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다.

투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 일일 투여량은 화학식 1의 화합물이 약 10 ∼ 50 ㎎/㎏이고, 바람직하게는 15 ∼ 20 ㎎/㎏ 이며, 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여하는 것이 더욱 바람직하다.

본 발명의 화학식 1로 표시되는 화합물을 랫트에 경구투여하여 독성 실험을 수행한 결과, 화학식 1의 화합물의 50% 치사량(LD₅₀)은 적어도 0.1 g/㎏으로 나타나, 안전한 물질로 판단된다.

본 발명의 조성물은 심장순환계 질환의 예방 및 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 호르몬 치료, 약물 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

본 발명의 조성물은 심장순환계 질환의 개선을 목적으로 건강식품에 첨가될 수 있다. 본 발명의 화학식 1로 표시되는 화합물을 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 화학식 1의 화합물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에는 화학식 1의 화합물은 원료에 대하여 1 ∼ 20 중량%, 바람직하게는 5 ∼ 10 중량%의 양으로 첨가된다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.

본 발명의 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 0.01 ∼ 0.04 g, 바람직하게는 약 0.02 ∼ 0.03 g이다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.01 ∼ 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하, 본 발명은 다음 실시예에 의거하여 더욱 상세히 설명하겠는바, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 초두구로부터 화학식 1로 표시되는 화합물의 분리

1) 초두구로부터 추출

추두구는 물로 깨끗이 세척한 후 그늘에서 건조한 후, 분쇄기로 분말화 시켰다. 분말화된 초두구 100g에 3배의 에탄올(건조된 초두구 중량에 대해)을 가하여 7일간 실온에서 추출한 후 여과하였다. 상기 여과액을 감압 농축하여 조추출물을 얻었다.

상기 조추출물에서 활성물질을 분리, 정제하기 위하여, 클로로포름, 에틸아세테이트 및 물을 이용하여 각각의 분획물로 분리하여 다음 실험예 1의 방법으로 ACAT 저해 활성을 측정하였다. 측정 결과, 클로르포름층에서 가장 우수한 ACAT 저해 활성을 나타내었다.

2) 클로로포름층의 분리 및 정제

상기 1)에서 얻은 클로로포름층을 감압 농축하고(7.35g), 클로르포름:메탄올 = (100/0 ∼ 0/100)로 구성된 단계농도 구배(step gradient) 용매 시스템을 이용하여 실리카겔의 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 활성분획을 분리하였다.

상기 분리된 활성분획의 ACAT 저해활성을 측정하여 그 중에서 가장 ACAT 저해활성이 높은 분획들을 모아, 용출 용매로 70%, 80%, 90%, 100% 메탄올을 사용하여 역상 컬럼 크로마토그래피(reversed-phase column chromatography, ODS gel)로 활성분획을 분리하였다. 이 중 ACAT 저해활성이 높은 분획들을 모아 최종적으로 용출 용매로서 90% 메탄올을 6 ㎖/min로 흘려주면서, 고속액체 크로마토그래피 (high performance liquid chromatography; HPLC, YMC Jsphere ODS H-80 (250 × 20 ㎜))를 실시하여 순수 화합물(50.8 ㎎)을 얻었다. 활성물질의 검출은 UV 210㎚에서 행하였으며, ACAT 저해활성 물질은 25분에 용출되었다.

3)　ACAT 저해활성 물질의 구조 분석

완전히 분리, 정제된 화합물은 짙은 무색의 오일로, 분자량을 측정한 결과 [M+Na]+가 m/z 501이었으며, 고분해 ESI-MS 에서 분자식이 C₃₀H₅₄O₄로 추정되었다. 화합물의 자외선 흡광도를 측정한 결과 최대 흡수치가 210 ㎚에서 나타났다. 화합물의 구조를 결정하기 위한 NMR 시험 중에, ¹³C-NMR에서 질량분석 스펙트럼에서 추정된 탄소 30개의 반에 해당되는 15개의 탄소가 관찰되었는데 이는 이 화합물이 대칭구조(symmetrical structure)를 갖고 있음을 보여주었다. ¹H-NMR 스펙트럼에서는 네개의 올레핀 프로톤(olefinic proton, δ 5.13, 5.18)이 관찰되었으며, 네 개의 메틸 프로톤(methyl protone, δ 1.59, 1.61), 올레핀 그룹에 연결된 6개의 메틸렌 프로톤(methylene proton, δ 1.99, 2.08, 2.01)이 관찰되었다. 또 한 4개의 메틸렌 프로톤(δ 1.40, 1.58, 2.06 과 2.23), 수산기(hydroxyl group)에 결합된 두개의 메틴 프로톤(methin protone, δ 3.36) 및 4개의 말단 메틸 프로톤 (δ1.15, 1.19)이 관찰되었다(도 1, 도 2 및 도 3).

상기 화합물을 발표된 문헌(Nishiyama Y, Moriyasu M, Ichimaru M, Tachibana Y, Kato A, Mathenge SG et al. Acyclic triterpenoids from Ekebergia capensis. Phytochemistry 1996; 42(3): 803-807)의 데이타와 비교 분석한 결과, 2,3,22,23-테트라하이드록시-2,6,10,15,19,23-헥사메틸-6,10,14,18-테트라코사테트라엔(2,3,22,23-tertrahydroxy-2,6,10,15,19,23-hexamethyl-6,10,14,18-tetracosatetraene)으로 판명되었고, 이 화합물의 구조식은 다음 화학식 1과 같다.

[화학식 1]

실험예 1: 화학식 1로 표시되는 화합물의 ACAT 활성 저해 효과 확인

본 발명에 따른 초두구로부터 분리된 화학식 1로 표시되는 화합물의 ACAT 활성에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 다음과 같은 실험을 수행하였다.

1) ACAT 효소원의 제조

ACAT 효소원으로 흰쥐(Male Sprague-Dawley rats, 250 ∼ 300 g)의 간을 분 리하여 마이크로좀 완충용액 A(0.25M 슈크로오스, 1mM EDTA, 0.01M 트리스-염산, pH 7.4)로 세척하고, 가위로 1∼2㎤ 크기로 세절하고 테프론-유리로 이루어진 균질화기 (homogenizer)를 이용하여 균질화하였다. 상기 균질액을 14,000 xg에서 15분 동안 원심분리하여 상등액을 모아 다시 100,000 xg에서 1시간 동안 원심분리하였다.

ACAT가 포함된 마이크로좀(microsome)을 분리하기 위해 원심분리한 침전물을 마이크로좀 완충용액 B(0.25M 슈크로오스, 0.01M 트리스-염산, pH 7.4)에 가하여 100,000 xg에서 1시간 동안 다시 원심분리하였다.

시험시 효소원의 단백질 농도를 균일화하기 위하여, 원심분리된 침전물에 마이크로좀 완충용액 B를 적당히 가하여 용해시키고 단백질 표준물질로 소혈청 알부민(bovine serum albumin)을 사용하여 로우리(Lowry) 방법에 의하여 단백질 농도를 결정한 후, 마이크로좀 완충용액 B로 희석하여 단백질 농도를 10 ㎎/㎖로 조정하여 1 ㎖ 바이알에 분주하고 -70 ℃에서 보관하면서 실험에 사용하였다.

2) ACAT 활성 측정

ACAT 활성은 [1-¹⁴C]올레오일-코에이와 콜레스테롤을 기질로 하고, 하기의 공지된 방법을 일부 수정하여 측정하였다[Kim Y. K, H. W. Lee, K. H Son, B. M Kwon, T. S Jeong, D. H Lee, J H Shin, Y W. Seo , S. U. Kim, S. H. Bok 1996. GERI-BP002-A, Novel inhibitors of acyl-CoA:cholesterol acyltransferase produced by Aspergillus fumigatus F93: J. Antibiotics 49:31-36].

반응 용액으로는 메탄올에 녹인 시료액 10.0 ㎕, 쥐에서 채취한 간 조직의 마이크로좀 효소원(liver microsomal enzyme) 4. 0㎕, 표준 완충용액(assay buffer)[0.5 M KH₂PO₄, 10mM DTT(Dithiothreitol), pH 7.4] 20.0 ㎕, 소혈청 알부민(bovine serum albumin)은 검색계에 필요 이상의 지방산이 들어가지 않도록 필수지방산이 특별히 제거된(essentially fatty acid free) 특급으로 제조한 40 ㎎/㎖의 15.0 ㎕, 20 ㎎/㎖의 콜레스테롤 2.0 ㎕, 증류수 41.0 ㎕를 가하여 잘 섞고 37 ℃에서 20분간 흔들어주면서 예비 반응을 실시하였다.

상기 반응액에 8.0 ㎕의 [1-¹⁴C]올레오일-코에이(0.05 μCi, 최종농도 10μM)를 첨가하여 다시 37 ℃에서 25분간 반응시킨 후, 1 ㎖의 이소프로판올-헵탄 (4:1(v/v))을 가하여 효소반응을 정지시켰다. 헵탄 0.6 ㎖와 5배로 희석한 표준 완충용액의 0.4 ㎖를 첨가하여 원심분리하였다.

ACAT 활성의 측정은 원심분리하여 얻은 상층액을 100 ㎕ 취하여 신틸레이션 병에 넣고 신틸레이션 칵테일(scintillation cocktail, Lipoluma, Lumac Co.) 3 ㎖를 첨가한 후, 액체 신틸레이션 카운터(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사능(radioactivity)을 측정하였다

ACAT 활성 저해도는 방사능으로 표지한 기질 및 효소에 검색시료를 넣어 반응량을 방사능 측정장치를 사용하여 측정하였고, 다음 수학식 1을 이용하여 ACAT 활성 저해도를 계산하였다.

CPM(T): 시료 및 효소를 첨가하였을 때의 CPM(counter per minute)

CPM(C1): 시료는 첨가하지 않고, 효소는 첨가하였을 때 CPM

CPM(C2): 시료는 첨가하고, 효소는 첨가하지 않았을 때 CPM

CPM(B): 시료 및 효소를 첨가하지 않았을 때 CPM

이때, 모든 기본 조작은 빙욕 상에서 실시하였고, 양성 대조군으로는 오보바톨(obovatol)을 사용하였다.

상기 수학식 1을 이용하여 ACAT 저해활성을 측정한 결과, 양성 대조군인 오보바톨(obovatol)의 IC₅₀값은 44 μM이고, 본 발명의 화학식 1로 표시되는 화합물의 IC₅₀값은 24 ㎍/㎖로 나타났다.

또한, 도 4에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 화학식 1의 화합물은 농도가 증가할수록 ACAT 활성을 효과적으로 억제하였다.

따라서, 농도의존적으로 활성이 나타난 화학식 1의 화합물은 고콜레스테롤혈증에 기인하는 고지혈증, 동맥경화 등 각종 심혈관계 질환의 예방 및 치료에 유용하게 사용할 수 있다.

실험예 2 : 화학식 1로 표시되는 화합물의 HepGe세포에서의 콜레스테롤 아실화에 미치는 영향

본 발명에 따른 초두구로부터 분리한 화학식 1의 화합물의 콜레스테롤 아실화에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 하기의 공지된 방법을 일부 수정하여 측정하였다[Namatame I, H. Tomoda, H. Arai, K. Inoue, S. Omura 1999. Complete inhibition of mouse macrophage-derived foam cell formation by triacsin C: J Biochem 125: 319-327].

본 실험에 사용된 인간의 간 유래 HepG2 세포주는 10% 소혈청을 첨가한 D-MEM 배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium)를 이용하여 배양하였다.

48 웰 플레이트의 각 웰에 HepG2 세포를 세미포화상태까지 배양한 뒤 2.5 ㎕의 시료와 7 ㎎/㎖의 소혈청 알부민(bovine serum albumin)에 혼합된 [¹⁴C] 올렌산 (0.5 μCi, 33.4 μM)을 첨가하고 37 ℃에서 4시간 반응시켰다.

상기 반응액을 제거하고 표준완충용액(PBS)으로 세포를 3번 세척한 뒤 PBS액에 혼합된 0.1%(wt/vol) SDS(sodium dodecyl sulfate) 용액 0.5 ㎖을 첨가하여 세포를 용해시켰다. 1 ㎖의 이소프로판올-헥산 (2:3(v/v))을 가하여 세포내 지질성분을 추출하였다.

추출된 유기용매 분획을 질소 가스를 이용하여 완전히 농축한 뒤 페트롤레움 에테르(petroleum ether) : 에테르 : 아세트산(90:10:1, v/v/v)을 전개용매로 이용하여 이를 TLC 플레이트로 분리하였다. [¹⁴C] 올렌산으로 아실화된 콜레스테롤의 방사능을 바이오-이미징 분석기(Bio-imaging analyzer, BAS1500, Fuji)로 측정 하였다.

화학식 1의 화합물의 HepG2 세포에서의 콜레스테롤 아실화 저해활성은 그 IC₅₀값은 16.28 ㎍/㎖로 ACAT 효소저해농도의 IC₅₀값보다 낮게 나타났다.

다음 표 1에 나타난 바와 같이, 본 발명의 화학식 1로 표시되는 화합물은 농도가 증가할수록 콜레스테롤 아실화를 효과적으로 억제하였다.

따라서, 화학식 1의 화합물은 고콜레스테롤혈증에 기인하는 고지혈증, 동맥경화 등의 각종 심혈관계 질환의 예방 및 치료에 유용하게 사용할 수 있다.

실험예 3 : 급성 독성실험

본 발명의 화학식 1로 표시되는 화합물의 급성 독성을 알아보기 위하여, 하기와 같은 방법으로 급성독성실험을 하였다.

실험동물로 6주령의 특정병원부재(SPF) SD계 랫트를 사용하였으며, 군당 5마리씩 나누었다. 상기 실시예에서 얻은 화학식 1의 화합물을 0.5% 메틸셀룰로오스 용액에 현탁하여 0.1 g/㎏의 용량으로 단회 경구투여 하였다.

시험물질 투여 후 동물의 폐사여부, 임상증상, 체중변화를 관찰하고 혈액학적 검사와 혈액생화학적 검사를 실시하였으며, 부검하여 육안으로 복강장기와 흉강장기의 이상여부를 관찰하였다.

시험결과, 시험물질을 투여한 모든 동물에서 특기할 만한 임상증상은 없었고 폐사된 동물도 없었으며, 또한 체중변화, 혈액검사, 혈액생화학 검사, 부검소견 등에서도 독성변화는 관찰되지 않았다.

이상의 결과 상기 화합물은 랫트에서 0.1 g/㎏까지 독성변화를 나타내지 않았으며, 경구투여 최소치사량(LD₅₀)은 적어도 0.1 g/㎏ 이상인 안전한 물질로 판단되었다.

제제예 1 : 약제 제조

1) 정제 제조

본 발명의 화학식 1의 화합물의 10 ㎎을 유효성분으로 함유하는 정제는 다음과 같은 방법으로 제조하였다.

화학식 1의 화합물 1.0 g을 락토오스 7.0 g, 결정성 셀룰로오스 1.5 g, 마그네슘 스테아레이트 0.5 g과 혼합한 후 직타법(direct tableting method)에 의하여 정제를 제조하였다.

각 정제의 총량은 100㎎이고, 그 중 유효성분의 함량은 10㎎이다.

2) 캅셀제 제조

본 발명의 화학식 1로 표시되는 화합물의 10 ㎎을 유효성분으로 함유하는 캅셀제는 다음과 같은 방법으로 제조하였다.

화학식 1의 화합물 1.0 g을 옥수수 전분 5.0 g, 카르복스 셀룰로오스 4.0 g과 잘 혼합하여 분말을 제조하였다. 경질 캅셀에 상기 분말 100 ㎎을 넣어 캅셀제를 제조하였다.

제제예 2 : 식품 제조

본 발명의 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 식품들을 다음과 같이 제조하였다.

1) 조리용 양념의 제조

화학식 1의 화합물 20 ∼ 95 중량%을 된장 및 간장과 같은 일반 양념에 첨가하여 건강 증진용 조리용 양념을 제조하였다.

2) 토마토케찹 및 소스의 제조

화학식 1의 화합물 0.2 ∼ 1.0 중량%를 토마토케찹 또는 소스에 첨가하여 건강 증진용 토마토 케찹 또는 소스를 제조하였다.

3) 밀가루 식품의 제조

화학식 1의 화합물 0.5 ∼ 5.0 중량%를 밀가루에 첨가하고, 이 혼합물을 이 용하여 빵, 케이크, 쿠키, 크래커 및 면류를 제조하여 건강 증진용 식품을 제조하였다.

4)　스프 및 육즙(gravies)의 제조

화학식 1의 화합물 0.1 ∼ 5.0 중량%를 스프 및 육즙에 첨가하여 건강 증진용 육가공 제품, 면류의 수프 및 육즙을 제조하였다.

5) 그라운드 비프(ground beef)의 제조

화학식 1의 화합물 10 중량%를 그라운드 비프에 첨가하여 건강 증진용 그라운드 비프를 제조하였다.

6) 유제품(dairy products)의 제조

화학식 1의 화합물 5 ∼ 10 중량%를 우유에 첨가하고, 상기 우유를 이용하여 버터 및 아이스크림과 같은 다양한 유제품을 제조하였다.

7) 선식의 제조

현미, 보리, 찹쌀, 율무를 공지의 방법으로 알파화시켜 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60 메쉬의 분말로 제조하였다.

검정콩, 검정깨, 들깨도 공지의 방법으로 쪄서 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60 메쉬의 분말로 제조하였다.

본 발명의 화학식 1의 화합물을 진공 농축기에서 감압·농축하고, 분무, 열풍건조기로 건조하여 얻은 건조물을 분쇄기로 입도 60 메쉬로 분쇄하여 건조분말을 얻었다.

상기에서 제조한 곡물류, 종실류 및 화학식 1의 화합물의 건조분말을 다음의 비율로 배합하여 제조하였다.

곡물류(현미 30 중량%, 율무 15 중량%, 보리 20 중량%),

종실류(들깨 7 중량%, 검정콩 8 중량%, 검정깨 7 중량%),

화학식 1의 화합물의 건조분말(1 중량%),

영지(0.5 중량%),

지황(0.5 중량%)

8) 다류의 제조

화학식 1의 화합물 0.1 ∼ 10 중량%와 액상과당(0.5%), 올리고당 (2%), 설탕(2%), 식염(0.5%), 물(75%)과 같은 부재료를 섞어 건강 증진용 다류를 제조하였다.

제제예 3 : 음료의 제조

1) 탄산음료의 제조

설탕 5 ∼ 10%, 구연산 0.05 ∼ 0.3%, 카라멜 0.005 ∼ 0.02%, 비타민 C 0.1 ∼ 1%의 첨가물을 혼합하고, 여기에 79 ∼ 94%의 정제수를 섞어서 시럽을 만들고, 상기 시럽을 85 ∼ 98 ℃에서 20 ∼ 180초간 살균하여 냉각수와 1:4의 비율로 혼합 한 다음 탄산가스를 0.5 ∼ 0.82 % 주입하여 화학식 1의 화합물을 함유하는 탄산음료를 제조하였다.

2) 건강음료의 제조

액상과당(0.5%), 올리고당(2%), 설탕(2%), 식염(0.5%), 물(75%)과 같은 부재료와 화학식 1의 화합물을 균질하게 배합하여 순간 살균을 한 후 이를 유리병, 패트병 등 소포장 용기에 포장하여 건강음료를 제조하였다.

3) 야채쥬스의 제조

화학식 1의 화합물 5 g을 토마토 또는 당근 쥬스 1,000 ㎖에 가하여 건강 증진용 야채쥬스를 제조하였다.

4) 과일쥬스의 제조

화학식 1의 화합물 1 g을 사과 또는 포도 쥬스 1,000 ㎖에 가하여 건강 증진용 과일쥬스를 제조하였다.

이상에서 상술한 바와 같이, 본 발명에 따른 화학식 1의 화합물이 아실-코에이:콜레스테롤 전이효소에 대한 활성을 효과적으로 억제하여 고콜레스테롤혈증에 기인하는 고지혈증, 동맥경화 등의 각종 심혈관계 질환 예방 및 치료에 유용하게 사용할 수 있다.

Claims (4)

1. 다음 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 하는 것을 특징으로 하는 고콜레스테롤혈증 예방 및 치료용 조성물.

   [화학식 1]

   
2. 제 1 항에 있어서, 상기 화합물은 초두구(Alpinia katsumadai)로부터 분리된 것임을 특징으로 하는 고콜레스테롤혈증 예방 및 치료용 조성물.
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4. 삭제

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