KR100213896B1 - 인삼으로부터 아실-코에이:콜레스테롤 아실트랜스퍼라제(acat) 활성저해제의 제조방법 및 이를 함유하는 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 인삼(Panax ginseng C. A. Myers)으로부터 아실-코에이:콜레스테롤 아실트랜스퍼라제(Acyl-CoA:Cholesterol Acyltransferase: ACAT)의 활성을 특이적으로 저해하는 폴리아세틸렌 화합물의 제조방법 및 이를 함유하는 조성물에 관한 것으로, 인삼으로부터 추출분리하여 얻은 하기 화학식 1, 2 또는 3을 갖는 폴리아세틸렌 화합물은 고콜레스테롤 혈증에 기인한 심혈관 질환의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다:
또는
(여기에서, R, R1및 R2는 각각 OH 또는 0이고, 같거나 다를 수 있으며, R3은 OH 또는 OOH이다. 단, R1및 R2가 모두 0일 때는 함께 에폭시기를 형성한다).
Description
본 발명은 한국 인삼(Panax ginseng C. A. Myers)으로부터 아실-코에이:콜레스테롤 아실트랜스퍼라제(Acyl-CoA:Cholesterol Acyltransferase: 이하, ACAT라함) 활성 저해제의 제조방법 및 이를 함유하는 조성물에 관한 것이다. 보다 상세하게는 각종 성인병 치료 및 예방제로 사용되고 있는 인삼의 실뿌리로부터 ACAT 저해활성을 갖는 폴리아세틸렌 화합물을 추출하고 이의 유도체를 합성하는 방법, 그리고 이들 폴리아세틸렌 화합물을 포함하는 혈중 콜레스테롤 저하 및 콜레스테롤 흡수 저해를 위한 조성물에 관한 것이다.
관상동맥성 심장병(coronary artery heart disease)은 현재 전체 사망원인의 1/3을 차지하는 심장 순환기 질병으로서 미국, 유럽 등 대다수 선진국에서는 이로 인한 사망율이 1위를 차지하고 있으며, 우리나라도 그 발병율이 늘어나고 있는 추세인 반면, 중국, 동남아 등의 아시아 지역에서는 발병율이 매우 낮다. 이는 식생활과 생활방식의 차이에 기인한 것으로, 우리나라도 점차 식생활 문화가 서구화되어 감에 따라 관상동맥성 심장병의 주원인인 동맥경화증에 대한 연구가 중요한 의미를 갖게 되었다(Brown Goldstein,Ann. Rev. Biochem., 52, 223-261(1983)).
동맥경화증(atherosclerosis)이란 동맥의 내막벽에 콜레스테롤이 침착되고 굳어져서 동맥벽이 비후, 경화되어 혈관이 좁아지는 비가역적 변성현상으로, 주로 관상동맥에서 발병되어 혈류장애를 일으키므로 심근으로 가는 혈액공급이 부족하게 되어 협심증, 심근 경색증 등의 관상동맥성 심장병을 일으키는 원인이 된다. 동맥 경화증의 발병인자로는 혈중의 콜레스테롤 농도 상승으로 인한 고콜레스테롤 혈증(hypercholesterolemia), 흡연, 고혈압, 당뇨병 및 비만증 등이 알려져 있다. 이중에서 특히 고콜레스테롤 혈증은 동맥경화증을 심화시키는 주요 요인이 되는데, 이는 콜레스테롤이 저밀도 지단백질(low-density lipoprotein: LDL)로 전환하여 혈관벽에 침착하기 때문인 것으로 사료된다.
LDL의 생성원으로는 외인성 및 내인성 콜레스테롤을 들 수 있는데, 음식물 섭취에 기인하는 외인성 콜레스테롤은 소장에서 ACAT에 의해 콜레스테롤 에스테르(cholesterol ester: CE) 형태로 흡수되어, 이와 함께 흡수된 트리그리세라이드(triglyceride) 및 소장내 존재하는 아포단백질(apoprotein)과 결합하여 지단백질(lipoprotein)의 일종인 카일로마이크론(chylomicron)을 생성한 후, 림프선으로 분비되고 혈액으로 이동하여 혈류를 따라 지방조직 및 근육조직의 모세혈관 내피세포벽에 결합한다. 이러한 카일로마이크론은 각 조직의 내피세포벽에 존재하는 지단백질 리파제(lipoprotein lipase)에 의해 트리글리세라이드가 분해되어 잔여 트리글리세라이드, 아포단백질 및 CE로 이루어진 잔여 카일로마이크론(chylomicron remnant)이라는 작은 크기의 입자가 생성되고, 트리글리세라이드 분해로 생성된 지방산은 지방 및 근육 조직세포에서 에너지원으로 사용되거나 저장된다. 잔여 카일로마이크론의 아포단백질 부분은 간세포의 수용체에 결합되어 세포 안으로 들어가 리소좀내에서 분해되어 CE로 유리된 후, 콜레스테롤 에스테르 가수분해효소 (cholesterol ester hydrolase: CEH)에 의해 콜레스테롤로 변하게 된다. 유리된 콜레스테롤 중 일부는 담즙산 합성에 사용되어 담즙산으로 장내에 분비되거나 세포막 생성에 사용되며, 남은 콜레스테롤은 다시 ACAT에 의해 CE 형태로 간세포내에 저장되거나 혈중에 초저밀도 지단백질(very low-density lipoprotein: VLDL)의 형태로 다시 분비되어 중간 밀도 지단백질(intermediate-density lipoprotein: IDL) 형태를 거쳐 LDL이 된다.
또한, 간에서 생체내 합성에 의해 생성되는 내인성 콜레스테롤은 간세포내의 ACAT 효소에 의해 CE로 전환되고, 중심부에 CE, 고농도의 트리글리세라이드를 지니며 아포단백질로 둘러싸인 VLDL 입자형태로 분비되어, 카일로마이크론과 같은 기전으로 내피 혈관벽에서 지단백질 리파아제의 작용을 받아 트리글리세라이드가 제거되고 중심부에 CE가 많은 IDL로 변하게 된다. 이어서 IDL은 두가지 형태의 대사경로를 겪게 되는데, 잔여 카일로마이크론 처럼 간세포내로 섭취되는 경로와 간에 의해 전체 IDL의 약 50%가 제거되고 나머지 50%는 혈중에서 내부의 잔여 트리글리세라이드가 제거되어 콜레스테롤이 고농도로 존재하는 LDL로 변하게 되는 경로가 있다. 즉, LDL은 콜레스테롤을 고농도로 함유하는 반감기는 1.5일 정도로 장기간 혈액내에 체류하므로, 인체 혈중의 콜레스테롤의 대부분(60 내지 70%)이 LDL의 형태로 있게 된다. 간 및 기타 여러조직내에서 혈중 LDL은 아포단백질 B-100을 매개로 하여 수용체에 결합하여 섭취되는데, 정상적으로 특정 세포에 특정 물질의 생성을 위해서 콜레스테롤이 필요한 경우에는 LDL 수용체의 합성이 증가되어 수용체를 매개로한 세포내 이입이 증가되고, 세포내로 이동된 콜레스테롤은 세포막 형성, 담즙산 생성 또는 스테로이드 호르몬 생성 등에 이용된다(Brown Goldstein,Scientific American, 251,52-60(1984)). 한편, 콜레스테롤이 과잉으로 존재하는 상태에서는 LDL 수용체 합성을 저해하여 혈관내에는 다량의 CE를 함유한 LDL이 증가하게 된다. 혈중에 LDL이 증가하게 되면 LDL은 동맥혈관의 내피세포에 흡수되고, 그 안에서 LDL의 인지질이 중금속 매개로 산화되는데, 산화된 인지질은 아포단백질 B-100 단백질의 리신(lysine)을 산화시켜 단백질의 극성을 변화시킨다. 이렇게 산화된 아포단백질 B-100 단백질은 마크로파지의 포집체(scavenger) 수용체와 결합하여 포말세포(foam cell)를 형성한다. 한편 산화된 LDL은 세포독성은 가지므로 동맥혈관의 내피세포에 손상을 주며, 손상된 내피세포에는 혈소판이 침착된다. 침착된 혈소판에는 PDGF(platelet-derived growth factor)를 비롯한 성장 인자가 분비되어 세포분열을 촉진시키므로 혈관내벽을 증식시키는 결과를 초래하게 되고 결과적으로 동맥 경화증이 야기된다. 이로써, LDL은 혈중의 콜레스테롤 농도와 직접 관련되며 고농도의 LDL이 동맥경화증을 일으키는 결정적인 요인임을 알 수 있다.
외인성 또는 내인성 콜레스테롤로 인해 유리되는 VLDL이나 LDL과는 달리 세포의 괴사나 세포막의 전환(turnover)에 의해 유리되는 콜레스테롤은 고밀도 지단백질(high-density lipoprotein: HDL)로 흡수되는데, 이것은 총 혈장 콜레스테롤의 20 내지 25%를 차지한다. HDL 입자안의 콜레스테롤은 레시틴(lecithin):콜레스테롤 아실트랜스퍼라제(LCAT)의 작용으로 CE로 변환된다. HDL은 IDL을 거쳐 LDL로 변하며, 말초 조직세포의 콜레스테롤을 간세포로 이동시켜 제거시키는 기능을 하는데, 그 혈장농도의 관상동맥성 심장병 또는 동맥경화증과 반비례 관계를 갖는다.
이처럼 외인성 및 내인성 콜레스테롤의 이동경로를 살펴본 결과, 내인성 콜레스테롤과 같이 체내에서 콜레스테롤이 생합성되는 경우에는 그 농도가 매우 정확하게 조절되어 균형을 이루고 있는 반면, 외인성 콜레스테롤의 경우에는 혈중농도에 대한 조절기전이 없으므로 LDL의 농도변화는 흡수되는 외인성 콜레스테롤의 양에 의존한다고 할 수 있다.
고콜레스테롤 혈증의 유발을 막는 기전으로는, 과량의 외인성 콜레스테롤 흡수로 인한 전체 콜레스테롤 양의 증가를 억제하기 위해 콜레스테롤의 생합성 과정을 저해하거나, 콜레스테롤이 CE로 흡수되는 것을 억제하는 방법이 있다. 현재 알려져 있는 고콜레스테롤 혈증의 치료제로는 콜레스테롤 생합성 경로중에서 HMG CoA가 메발론산염(mevalonate)으로 되는 단계를 조절하는 효소인 HMG-CoA 환원효소(3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase)에 대한 저해제, VLDL의 합성 및 분비를 억제시키는 피브린산(fibric acids), LDL의 농도를 저하시키는 콜레스티라민 수지(cholestyramine resin) 및 콜레스티폴(colestipol), 니코틴산(nicotinic acids), 프로부콜(probucol), 네오마이신(neomycin), 덱스트로티록신 (dextrothyroxine), 콜레스테롤과 그 구조가 유사하여 소장, 간에서 콜레스테롤이 흡수되는 것을 상경적으로 방해하는 β-시토스테롤(β-sitosterol) 등이 있다. 이중 HMG-CoA 환원효소에 대한 저해제 이외의 치료제들은 그 작용 부위가 정확하게 알려져 있지 않다. HMG-CoA 환원효소 저해제로는 사상균의 대사산물인 메바스타틴(mevastatin;Penicilliumsp.; 원래 컴팩틴(compactin)으로 명명함), 로바스타틴(lovastatin;Aspergillus및Mona-scussp.; 원래 모나콜린 케이, 메비놀린(monacolin K, mevinolin)으로 불리었음), 반합성 화합물인 심바스타틴(simvastatin) 및 프라바스타틴(pravastatin) 등이 상품화되어 임상에서 쓰이고 있다. 그러나 이들은 장기간 사용할 때 콜레스테롤 생합성 중간 단계에서 부경로로 생성되는 코엔자임 큐(coenzyme Q; ubiquinone), 돌리콜(dolichol), 햄 에이(haem A), 파네실화된 단백질(farnesylated proteins: Ras, lamin B) 및 콜레스테롤에서 생성되는 스테로이드 호르몬, 비타민 D, 담즙산 및 지단백질의 생산에 영향을 끼치므로 부적절한 것으로 보고되고 있다. 특히 지속적인 사용으로 심장기능과 면역기능에 중요한 역할을 수행하는 코엔자임 큐의 합성이 감소됨으로써 동맥경화 및 심장질환자에게 역효과를 줄 수 있다는 연구결과가 보고되고 있다(Willis,et al., PNAS, 87,8928-8930(1990)).
기존의 고콜레스테롤 혈증 및 동맥경화증 치료제의 문제점을 보완할 수 있는 새로운 형태의 치료제로서 현재 ACAT가 유망한 것으로 기대되고 있다. ACAT는 콜레스테롤을 CE 형태로 변화시켜 소장내로 콜레스테롤의 흡수를 촉진시키며, 간에서 VLDL을 형성함으로써 LDL을 형성하는데 관여하고 혈관내벽 상처의 주변세포에 CE가 축적되는데 관여한다(J. C. Goldstein,et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 3178(1978)). 또한 필요이상의 CE가 존재할 경우 혈관벽 등에 축적되거나 혈중의 점도를 증가시켜서 각종 심혈관 질환을 일으킨다는 것이 밝혀졌는데(D. Steinburg,N. Engl. J. Med. 320,915(1989)), ACAT의 활성을 저해할 경우, 혈중 CE의 양을 저하시켜서 혈액의 점도를 낮추고 간에서는 콜레스테롤 양이 증가되어 그 합성을 감소시키고 장에서 흡수되는 콜레스테롤의 양 또한 줄일 수 있어서 궁극적으로 각종 심혈관 질환의 치료 뿐만 아니라 예방도 가능하리라 사료된다.
이에 따라 많은 연구자들에 의해서 ACAT 활성 저해제를 합성하거나 천연자원으로부터 추출하려는 시도가 계속되어 왔다(K. Matsuda,Med. Res. Rev., 14,271(1994)). 예를 들어, 합성 ACAT 저해제로는 우레아 유도체(D. R. Sliskovic,et al., J. Med. Chem., 37,560(1994)) 또는 이미다졸 유도체(R. G. Wilde,et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 5,167(1995))가 있으며, 미생물 대사산물로부터 분리된 것으로는아스페르질러스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus)로부터 생산된 피리피로펜(Pyripyropenes) 유도체(S. Omura,et al., J. Antibiotics, 46,116-119(1993); Kwon,et al., Tetrahedron Lett., 35,3567(1994);J. Antibiotics, 48,751(1995)),스케도스포리움속(Scedospriumsp.)으로부터 생산된 AS-183(K. Kurodaet al., J. Antibiotics, 46,1196-1202(1993))가 있고, 또한 천연 생약재로부터 분리된 것으로는 후박잎으로부터 분리된 오보바톨(Obovatol), 매그놀올(Magnolol) 및 호노키올(Honokiol)(대한민국 특허출원 제 95-41207 호), 오미자로부터 분리된 리그난계 화합물(대한민국 특허출원 제 95-41207 호) 등이 개발된 바 있다.
이에 본 발명자들은 오랜 동안 사용되어 안정성이 확보된 천연 생약재로부터 혈중 콜레스테롤 농도를 저하시킬 수 있는 ACAT 저해제를 개발하기 위해 연구를 계속 진행할 결과, 각종 성인병 치료 및 예방제로 사용되고 있는 한국 인삼내에 함유되어 있는 저극성 지질 화합물들이 혈액의 전체 콜레스테롤의 양을 저하시킨다(A. A. Qureshi, Z. Z. Din,et al., Atherosclerosis, 48,81-94(1983))는 동물 실험 결과 보고에 착안하여 인삼 추출물로부터 ACAT 활성을 저해할 수 있는 폴리아세틸렌 화합물을 분리해 냄으로써 본 발명의 완성에 이르게 되었다.
본 발명의 목적은 인삼으로부터 신규의 ACAT 활성 저해제를 제조하는 방법 및 이를 포함하는 혈중 콜레스테롤 저하용 조성물을 제공하는 것이다.
도 1은 파녹시놀의 수소 핵자기 공명(NMR) 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 2는 파낙시돌의 수소 NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 3은 파낙시디올의 수소 NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 4는 파낙시퍼옥시드의 수소 NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 5는 파낙시트리올의 수소 NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 6는 파낙시옥사이드의 수소 NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
상기 목적에 따라, 본 발명에서는 인삼을 유기용매로 추출하고 정제하는 단계를 포함하는 하기 화학식 1, 2 또는 3을 갖는 폴리아세틸렌 화합물의 제조방법 및 하기 화학식 1, 2 또는 3을 갖는 폴리아세틸렌 화합물을 포함하는, 고콜레스테롤 혈증에 기인한 심혈관 질환 예방 및 치료용 조성물을 제공한다:
화학식 1
화학식 2
또는
화학식 3
(여기에서, R, R1및 R2는 각각 OH 또는 0이고, 같거나 다를 수 있으며, R3은 OH 또는 OOH이다. 단, R1및 R2가 모두 0일 때는 함께 에폭시기를 형성한다).
상기 화학식 1, 2 또는 3의 폴리아세틸렌 화합물은 인삼을 메탄올로 추출한 후 농축하고, 농축물에 에틸아세테이트와 물을 가하여 층분리시키고, 유기층을 분리하여 농축하고, 농축액을 실리카겔 크로마토그래피하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조할 수 있다.
본 발명에 따라 얻어지는 폴리아세틸렌 화합물로는 특히 하기 화학식 1, 4, 5, 6, 7 또는 8의 화합물들이 바람직하다:
화학식 1
또는
상기 화학식 1의 화합물은 파녹시돌(panoxydol), 화학식 4의 화합물은 파낙시돌(panaxydol), 화학식 5의 화합물은 파낙시디올(panaxydiol), 화학식 6의 화합물은 파낙시퍼옥시드(panaxyperoxid), 화학식 7의 화합물은 파낙시트리올 (panaxytriol) 그리고 화학식 8의 화합물은 파낙시옥사이드(panaxyoxide)인 것으로 확인되었다(K. Hirakura,et al., Phytochemisty, 31,899-903(1992); K. Hirakura,et al., Phytochemisty, 30,3327-3333(1991); B. M. Kwon,et al., Chem. Pharm. Bull., 44,444-445(1996)).
본 발명에 따라 인삼으로부터 분리정제된 폴리아세틸렌 화합물은 ACAT 저해활성 측정 결과 IC50는 16 내지 50㎍/㎖이다. ACAT의 작용을 저해하는 이 화합물들은 장내에서 콜레스테롤의 흡수를 저해하는 기능과 콜레스테롤의 축적을 감소시키는 작용을 하기 때문에, 혈중 콜레스테롤치를 감소시켜 고지혈증으로부터 유발되는 각종 심혈관 질환의 치료 및 예방에 사용될 수 있다. 더우기 인삼은 오랫동안 생약 및 식용으로 쓰여 왔던 약재로서 이들로부터 추출분리된 본 발명의 화합물들 역시 독성 및 부작용 등의 문제가 없을 것으로 사료된다.
본 발명에 따라 분리정제된 폴리아세틸렌 화합물은 통상적인 방법에 의해 정제, 캅셀제, 산제, 과립제, 현탁제, 유제 또는 비경구용 제제와 같은 단위 투여형 또는 수회 투여형 제제로 제형화하여 콜레스테롤 흡수 저해, 고지혈증 예방 및 치료, 그리고 고콜레스테롤 혈증에 기인한 각종 심혈관계 질환 예방 및 치료용 제제로 사용할 수 있다.
본 발명에서 분리한 유도체들을 유효성분으로 함유하는 약학 조성물은 목적하는 바에 따라 비경구 투여하거나 경구 투여할 수 있으며, 화학식 1의 파녹시놀은 하루에 체중 1kg당 15 내지 20mg, 화학식 5의 파낙시디올은 8 내지 15mg의 양을 1 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다. 특정 환자에 대한 투여용량 수준은 사용될 특정 화합물의 종류, 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법 및 배설, 그리고 약제 혼합 및 질환의 중증도에 따라 변화시킬 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의거하여 좀더 상세히 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 만으로 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: 폴리아세틸렌 화합물의 분리 및 정제
본 발명에 사용한 인삼은 대한민국 충청남도 금산에서 재배한 미삼을 구입한 것이다. 완전히 건조한 1kg의 인삼 실뿌리를 잘게 분쇄하여 2ℓ의 메탄올을 가하여 상온에서 3일간 방치한 후 교반하고 여과지를 사용하여 분리하였다. 여액을 모아서 감압하에서 농축한 후 1ℓ의 에틸아세테이트와 1ℓ의 물을 가하여 물층과 유기용매층으로 분리하고, 물층을 1ℓ의 에틸아세테이트로 3번 추출하여 유기용매에 녹는 부분을 모았다.
유기용매층과 물층을 분리하여 효소활성 저해도를 측정한 결과 유기용매층에 활성물질이 함유되어 있음을 확인하였다. 유기용매층을 감압하에서 농축 건조하여 얻은 액체물질을 50㎖의 메탄올에 녹이고 500㎖의 C18에 흡착시킨 후 메탄올/물(70/30)로부터 메탄올/물(100/0)까지 용리하여 활성물질 분획을 얻었다. 용리액을 감압하에서 농축하여 황갈색의 액체 물질을 얻었다. 실리카겔(Merck사, 상품명: 9385) 650g을 헥산/에틸아세테이트(9/1) 용액을 사용하여 칼럼(4.5x40cm)을 충진한 후, 황갈색의 유성 물질을 메틸렌클로라이드에 용해시켜 실리카겔에 흡착시키고, 헥산:에틸아세테이트의 비율을 9.5 : 0.5 부터 7 : 3으로 변화시키면서 실리카겔 칼럼 크로마토그래피를 2회 수행하여 활성분획을 분리하였다. 최종적으로 예비(preparative) TLC를 이용하여 순수한 4가지의 폴리아세틸렌 화합물을 정제하였다. 인삼 실뿌리 1kg당 최종적으로 분리된 순수한 파녹시놀 80mg, 파낙시돌 210mg, 파낙시디올 40mg 그리고 파낙시퍼옥시드 30mg의 수율로 얻을 수 있었다.
실시예 2: 폴리아세틸렌 유도체 화학식 7을 갖는 파낙시트리올의 제조
파낙시트리올은 화학식 4를 갖는 파낙시돌을 다음과 같은 방법으로 황산 존재하에서 에폭사이드 그룹을 가수분해하여 제조하였다. 즉, 50mg의 파낙시돌을 THF : 물(2%의 황산함유) 2 : 1의 혼합용액 10㎖에 녹이고 상온에서 30 시간 동안 교반한 후 박막크로마토그래피법으로 반응이 50% 정도 진행되었음을 확인하였다. 반응용액을 중조로 포화된 50㎖의 물과 100㎖의 에틸아세테이트 혼합용액에 가하여 반응을 정지시킨 후 유기용매층을 분리하고 예비 TLC로 순수 정제하여 화학식 7을 갖는 순수한 파낙시트리올(11mg)을 얻었다.
실시예 3: 폴리아세틸렌 유도체 화학식 8을 갖는 파낙시옥사이드의 제조
파낙시옥사이드는 화학식 4를 갖는 파낙시돌을 다음과 같은 방법으로 이산화망간과 반응시켜서 제조하였다. 즉, 50㎎의 파낙시돌을 메틸렌 클로라이드 50mg에 녹이고 이산화망간 300mg을 가하여 상온에서 10 시간 동안 교반한 후 박막크로마토그래피법으로 반응이 완결된 것을 확인하였다. 반응 용액을 여과하여 이산화 망간을 제거하고, 유기용매층은 감압하에 건조시키고 여액은 예비 TLC로 순수 정제하여 순수한 파낙시옥사이드(32mg)를 얻었다.
실시예 4: 기기분석 및 구조결정
실시예 1에서 분리정제한 ACAT 저해 활성물질을 하기와 같이 분석하여 구조를 결정하였다.
자외선(UV)-가시광선(Visible) 흡광도 분석: HPLC에 의해 최종적으로 분리 정제된 활성물질을 100% 메탄올에 녹여서 자외선-가시광선 분광기(Shimazu사, UV-265)를 이용하여 흡수파장을 분석하였으며, 그 결과는 표 1에 요약하였다.
적외선(IR) 흡광도 분석: 활성물질 시료 1mg을 클로로포름에 녹여 AgBr 창에 바른 후 건조하여 비율 기록 적외선 분광기(Bio-Rad Digilab Division, FTS-80)로 분석하였다. 이들 화합물의 특징인 삼중결합의 흡수띠를 2240cm-1에서 확인하였고, 3500cm-1에서 OH 그룹의 존재를 나타내는 흡수피크를 보였다. 그리고 파낙시옥사이드의 CO 그룹은 1660cm-1에서 흡수피크를 보였다.
분자량 분석: VG70-VSEQ 질량분석기를 이용하여 HRCI(high-resolution electron chemical ionization)-MS 방법으로 분자량을 측정하여, 결과는 표 1 및 2에 나타내었다.
핵자기 공명(NMR) 분석: 활성물질을 완전건조하여 CDCl3에 녹인 후 5mm 튜브에 넣어 Varian UNITY 300 기종으로 NMR 분석을 하였으며1H-NMR은 299.949 MHz로,13C-NMR은 75.430 MHz로 측정하였다.
본 발명의 화합물의1H-스펙트럼을 도 1 내지 6에 나타내었다.
이들 화합물의 이화학적 성질을 다음 표 1에 요약하여 나타낸다.
폴리아세틸렌 화합물의 이화학적 성질 | ||||
파녹시놀 | 파낙시돌 | 파낙시디올 | 파낙시퍼옥시드 | |
외형 | 미황색 액체 | 미황색 액체 | 미황색 액체 | 미황색 액체 |
분자식 | C17H24O | C17H24O2 | C17H24O2 | C17H24O3 |
분자량 | 224 | 260 | 260 | 276 |
자외선(UV)nm | 207, 230, 242, 255 | 204, 229,240, 255 | 215, 253,269, 284 | 207, 254,270, 286 |
가용성 | 유기용매 | 유기용매 | 유기용매 | 유기용매 |
불용성 | H2O | H2O | H2O | H2O |
실시예 5: 폴리아세틸렌 화합물의 ACAT 저해활성 검정
ACAT 활성의 측정은 [1-14C] 올레오일-CoA를 기질로 하여 타바스(Tabas) 등의 방법(Tabas,et al., J. Biol. Chem., 261,3147-3154(1986))을 응용하여 실시하였다.
발효 상등액 10㎕, 쥐의 간조직 마이크로좀 효소 4.0㎕, 분석 완충액(0.5M KH2PO4, 10mM DTT, pH 7.4) 20.0㎕, 40mg/㎖ 소 혈청 알부민(지방산 부재) 15.0㎕, 20㎎/㎖의 콜레스테롤 2.0㎕ 및 물 41.0㎕를 혼합하여 37℃에서 15 분간 예비반응시켰다. 이 반응액에 [1-14C] 올레오일-CoA(0.02μCi, 최종농도 10μM) 8㎕를 첨가하여 37℃에서 15 분간 다시 반응시킨 후, 이소프로판올-헵탄(isopropanol-heptane, 4:1, v/v) 1㎖을 가하여 반응을 정지시키고, 헵탄 0.6㎖와 5배로 희석한 분석 완충액 0.4㎖를 첨가하여 원심분리하였다. 원심분리하여 얻은 상층액 100㎕에 칵테일 5㎖를 첨가한 후 액체 신틸레이션 카운터(liquid scintillation counter)를 사용하여 효소활성을 측정하였다. ACAT 저해활성은 다음 수식 1과 같이 계산한다:
이때 공시험은 0℃에서 반응시킨 것이고, 양성 대조구로는 클로르프로마진(chlorpromazine)을 사용하였다.
이들 화합물들의 ACAT 저해도 측정 결과 IC50가 15 내지 50㎍/㎖인 것으로 확인되었다. 다음 표 2는 본 발명의 활성 화합물의 효소 저해 활성도를 측정한 결과를 나타낸다.
폴리아세틸렌 화합물들의 ACAT 저해 활성도(IC50값) | |
화합물 | IC50(㎍/㎖) |
파녹시놀 | 38 |
파낙시돌 | 42 |
파낙시디올 | 15 |
파낙시퍼옥시드 | 25 |
파나시트리올 | 50 |
파낙시옥사이드 | 34 |
장기간에 걸친 사용으로 안정성이 확보된 생약인 인삼으로부터 추출 정제하여 얻은 폴리아세틸렌류 화합물은, ACAT 저해 활성을 가져 혈중 콜레스테롤 농도를 저하시키는데 유효하므로, 고콜레스테롤 혈증에 기인하는 고지혈증, 동맥경화증 등 각종 심혈관계 질환의 예방 및 치료용 제제로 유용하게 사용될 수 있다.
Claims (1)
- 하기 화학식 1, 2 또는 3을 갖는 폴리아세틸렌 화합물을 포함하는,고콜레스테롤 혈증에 기인한 심혈관 질환 예방 및 치료용 조성물:화학식 1화학식 2또는화학식 3(여기에서, R, R1및 R2는 각각 OH 또는 O이고 같거나 다를 수 있으며, R3은 OH 또는 OOH이다. 단 R1및 R2가 모두 O일 때에는 함께 에폭시기를 형성한다).
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