KR100443268B1 - Ａｃａｔ의 활성을 저해하는 순비기나무 열매로부터추출한 퓨란성 랍단 디테르펜 화합물 및 이의 조성물 - Google Patents

Ａｃａｔ의 활성을 저해하는 순비기나무 열매로부터추출한 퓨란성 랍단 디테르펜 화합물 및 이의 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 ACAT의 활성을 저해하는 퓨란성 랍단 디테르펜 화합물 및 이의 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 특이적으로 아실-코에이:콜레스테롤 아실트랜스퍼라제(Acyl-CoA:Cholesterol Acyltransferase, ACAT)를 저해하여 고콜레스테롤혈증에 기인하는 고지혈증, 동맥경화 등의 심혈관 질환 예방과 치료에 유용하게 사용할 수 있는 퓨란성 랍단 디테르펜(furanic labdane diterpene) 계열의 화합물인 로텐디퓨란(Rotundifuran)과 6-에피-로텐디퓨란(6-epi-rotundifuran), 이를 함유하는 조성물 및 순비기나무(Vitex rotundifoliaL.)의 열매인 만형자(蔓荊子)로부터 퓨란성 랍단 디테르펜 화합물을 분리하는 방법에 관한 것이다.

Description

ＡＣＡＴ의 활성을 저해하는 순비기나무 열매로부터 추출한 퓨란성 랍단 디테르펜 화합물 및 이의 조성물{Novel furanic labdane diterpene compounds from Vitex rotundifolia L. fruit, process for extraction and Acyl-CoA cholesterol acyltransferase inhibitors including thereof}
본 발명은 ACAT의 활성을 저해하는 퓨란성 랍단 디테르펜 화합물 및 이의 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 특이적으로 아실-코에이:콜레스테롤 아실트랜스퍼라제(Acyl-CoA:Cholesterol Acyltransferase, ACAT)을 저해하여 고콜레스테롤혈증에 기인하는 고지혈증, 동맥경화 등의 심혈관 질환 예방과 치료에 유용하게 사용할 수 있는 퓨란성 랍단 디테르펜(furanic labdane diterpene) 계열의 화합물인 로텐디퓨란(Rotundifuran)과 6-에피-로텐디퓨란(6-epi-rotundifuran), 이를 함유하는 조성물 및 순비기나무(Vitex rotundifoliaL.)의 열매인 만형자(蔓荊子)로부터 퓨란성 랍단 디테르펜 화합물을 분리하는 방법에 관한 것이다.
보건위생의 여건이 좋아지면서 전염성 질환이 줄어들었으나, 심혈관 질환과 암의 발병률은 계속 증가추세에 있고, 심혈관 질환은 주로 고지혈증에 의하여 발병되며 이 질환의 사망률은 전체 사망률 중에서 상위를 차지하고 있으며, 그에 따른 의약품의 개발이 요구되고 있다.
Heider의 연구에 의하면 생체가 필요로 하는 콜레스테롤은 음식물의 섭취에의한 외인성 콜레스테롤과 생체내 간장에서 합성에 의한 내인성 콜레스테롤이 있다고 알려져 있다[Heider J.G. 1986. Agent which inhibit cholesterol esterification in the intestine and their potential value in the treatment of hypercholesterolaemia, J.R. Prous Science Publishers,423-438]. 그러나, 중성지방과 콜레스테롤의 체내유입이 지나쳐 고지혈증이 되면 혈중에 콜레스테롤이나 트리글리세라이드가 과다하게 높은 증상이 되며 동맥경화증을 일으키는 주 요인으로도 알려져 있다. 이런 증상들은 지단백질(lipoprotein)의 형성, 운반, 분해 과정 중에 이상이 생겨 지단백질의 대사가 비정상적으로 이루어지기 때문이다. 역학적 조사에 의하면 허혈성 심장질환의 대부분은 관상동맥의 아테로마성 동맥경화증이 주된 원인이고, 혈청 콜레스테롤의 상승이 병의 발생과 진전에 중요한 인자라고 알려져 있다. Goldstein 등과 Komai의 보고에 의하면 혈청 콜레스테롤을 저하시키기 위해서는 소장에서 콜레스테롤의 흡수 저해, 간에서 콜레스테롤의 생합성 저해, 담즙산의 배설을 촉진시키는 방법들이 제시되고 있다[Goldstein J.L. and S.M. Brown 1990. Regulation of the mevalonate pathway :Nature33 425-430, Komai T. and Y. Tsujita 1994. Hepatocyte selectivity of HMG-CoA reductase inhibitors;DN & P, 7: 279-288]. 현재 혈청 콜레스테롤 농도를 낮추기 위하여 현재 사용되고 있는 의약품으로는 간장에서 생합성되는 콜레스테롤의 합성을 저해하는 의약품으로 일본의 산쿄, 미국의 Merck사의 제품으로 콤팩틴(compactin)의 생물학적 변형 유도체인 프라바스타틴(pravastatin)과 심바스타틴(simvastatin)이 가장 높은 점유율과 신장률을 보이고 있다. 이들 의약품의 작용 기작은 간장에서 콜레스테롤의 생합성 과정 중 합성중간단계에 관여하는 3-히드록시-3-메틸 글루타릴 Co-A 환원효소를 저해하는 것이다. 그러나, Grunler의 연구에 의하면 작용 기작 상 HMG Co-A 환원효소 저해제를 장기간 사용하면 메바로네이트(mevalonate) 이후의 콜레스테롤 합성 중간단계의 부경로에서 생성되어야 할 인체가 필요한 유비퀴논(ubiquinone), 돌리콜(dolichol), 헴 에이(haem A), 파네실화된 단백질(farnesylated protein) 및 콜레스테롤에서 생성되는 스테로이드 호르몬, 비타민 D, 담즙산, 지단백질의 생산에 영향을 주는 것으로 보고하였다[Grunler J., J. Ericsson and G. Dalloner 1994. Branch-point reactions in the biosynthesis of cholesterol, dolichol, ubiquinone and prenylated proteins :Biochim. Biophys, Acta1212, 259-277]. Willis의 연구에 의하면 HMG Co-A 환원효소 저해제를 지속적으로 사용시 심장기능과 면역기능에 중요한 역할을 하는 코엔자임 큐의 합성을 감소시키는 것으로 나타나, 동맥경화증 환자나 심장질환 환자에게는 악영향을 줄 수 있는 것으로 보고되었다[Willis R.A., K., Folkers. J.L. Tucker, C.Q. Ye, , L.J. Xia, and H Tamagawa. 1990. Lovastatin decreases coenzyme Q levels in rats :Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 87, 8928-8930]. 현재 고지혈증 치료제로는 간장에서 합성되는 콜레스테롤의 생합성을 저해하는 저해제와, 간장에서 분비되어 음식물을 소화시키고 대장에서 재흡수되는 담즙산에 결합하는 음이온 교환체가 콜레스테롤 재흡수 저해제로 임상적으로 사용되고 있으나, 보다 사용에 제한사항이 없고 작용기작이 확실하며 부작용이 적은 새로운 고지혈증 치료제의 개발이 요구되고 있다. Sliskovic의 보고에 의하면 그 중에서 고지혈증 예방과 치료에 ACAT 활성 저해제가 효과가 있는 것으로 보고되었고[Sliskovic D. R. and A. D. White 1991. Therapeutic potential of ACAT inhibitors as lipid lowering and antiatherosclerotic agents. Trends in Pharmacol. Sci. 12:194-199], 특히 동맥경화 발생 기작에 직접적으로 관련되어 있는 새로운 작용기작을 갖는 고지혈증 치료제 개발의 일환으로 ACAT 저해제의 개발이 추천되고 있다. ACAT는 콜레스테롤의 아실화에 관여하여 소장에서 콜레스테롤의 흡수, 간장에서 VLDL(very low density lipoprotein)의 합성, 지방세포와 혈관내벽에 저장형 콜레스테롤의 축적에 관여하는 효소로 알려져 있다.
외국의 경우 연구소, 대학, 제약업체에서 고지혈증 치료제를 개발하기 위하여 수종의 탐색체계가 개발, 운용되고 있으며 그 중에 몇몇은 개발에 성공하여 큰 성과를 올리고 있는 것도 있으나, 보다 안전하고 확실한 작용기작을 갖는 고지혈증 예방 치료제로 차세대약품을 개발하기 위하여 ACAT 저해제가 탐색되고 있다. 지금까지 연구되어진 ACAT 저해제들은 화학합성품이 주로 연구대상이었으며 Warner Lambert, Pfizer, Yamanouchi 등에서 우레아, 아미드, 페놀계의 합성화합물이 주종을 이루고 있다[Matsuda K. 1994. ACAT inhibitors as antiatherosclerosis agent: compounds and mechanisms.14,John Wiley & Son,Inc.,271-305]. 그 중에서는in vivo활성시험을 마치고 전임상단계 시험중인 의약품 후보물질도 있으나, 아직까지 ACAT 저해제로 임상에 사용되고 있는 것은 없으므로, 새로운 구조를 갖는 선도물질을 개발하기 위하여 미생물 자원을 대상으로 탐색연구가 진행되고 있고 일본 키타사토(Kitasato) 연구소의 퍼팩틴(purpactin)[Tomoda H., H. Nishida, R.Masuma, J. Cao, S. Okuda and S. Omura 1991. Purpactins, new inhibitor of acyl-CoA: cholesterol acyltransferase produced byPenicillium purpurogenumI. Production, isolation and physico-chemical and biological properties. J. Antibiotics 44:136-143]의 구조가 밝혀진 것을 시작으로 일본 산쿄사의 에피-콜리퀴논 에이(epi-cohliquinone A)[일본 공개특허공보 특개평 4-334383, 1992], 동경 농공대의 아카테린(acatelin)[Naganuma S., K Sakai, K. Hasumi and A. Endo 1992. Acaterin, a novel inhibitor of aycl-CoA: cholesterol acyltransferase produced byPseudomonassp. A92. J.Antibiotics45:1216-1221], 헬민토스포롤(helmintosporol)[Park J.K., K. Hasumi and A Endo 1993. Inhibitors of acyl-CoA:cholesterol acyltransferase byHelminthosporoland its related compounds. J. Antibiotics 46:1303-1305], 라테리틴(lateritin)[Hasumi K., C. Shinohara, T. Iwanaga and A. Endo 1993. Lateritin, A new inhibitors of acyl-CoA:cholesterol acyltransferase produced byGibberella lateritiumIFO 7188 J. Antibiotics 46:1782-1787], 짚세틴(gypsetin)[Shinohara C., K. Hasumi , Y. Takei and A. Endo 1994. Gypsetin, a new inhibitor of acyl-CoA: cholesterol acyltransferase produced byNanniizzia gypseavar. incurvata IFO 9228: I. Fermentation, isolation physico-chemical properties and biological activity.J.Antibiotics47:163-167], 일본 키타사토 연구소의 엔니아틴(enniatins)[Nishida H., X.H Huang, R. Masuma, Y.K. Kim and S. Omura 1992. New cyclodepsipeptides, enniatins D. E. and F produced byFusariumsp. FO-1305.J.Antibiotics45:1207-1214], 글리소프레닌(glisoprenins)[Tomoda, H. X.H, Huang, H. Nishida, R Masuma, Y.K. Kim and S. Omura 1992. Glisoprenins, new inhibitors of acyl-CoA: cholesterol acyltransferase produced byGliocladiumsp I. Production. Isolation and physico-chemical and biological properties.J. Antibiotics, 45:1202-1206], 피리피로펜(pyripyropenes)[Omura S., H. Tomoda, Y.K. Kim and H. Nishida 1993. Pyripyropenes, highly potent inhibitors of acyl-CoA: cholesterol acyltransferase produced byAspergillus fumigatus. J. Antibiotics46:1168-1169; Kim Y.K, H Tomoda, H. Nishida, T. Sunazuka, R. Obata, S. Omura 1994. Pyripyropenes, novel inhibitors of acyl-CoA:cholesterol acyltransferase produced byAspergillus fumigatusII. Structure elucidation of pyripyropenes A, B, C and D.J. Antibiotics47:154-162], 테르펜돌(terpendols)[Huang X.H, H. Tomoda, H. Nishida, R, Masuma and S. Omura 1995. Novel ACAT inhibitors produced byAlbophoma yamanashiensis J. Antibiotics48:1-4], 일본 교와 하꼬(Kyowa Hakko) 사의 AS-183[Kuroda K., M. Yoshida, Y. Uosaki, K. Ando, I. Kawamoto, E. Oishi, H. Onuma, K. Yamada and Y. Matsuda 1993. AS-183, a novel inhibitor of aycl-CoA: cholesterol acyltransferaseproduced byScedosporiumsp. SPC-15549.J. Antibiotics46:1196-1202], AS-186[Kuroda K., Y. Morishita, Y. Saito, Y. Ikuina, K. Ando, I. Kawamoto and Y. Matsuda 1994. AS-186, New inhibitor of aycl-CoA: cholesterol acyltransferase fromPenicillium asperosporiumKY1635.J. Antibiotics47:16-22], 한국생명공학연구원의 GERI-BP-001[ Jeong T. S., S. U. Kim, K. H Son , B. M Kwon, Y. K. Kim ,M. U. Choi and S. H. Bok 1995. GERI-BP001 compounds, New inhibitors of acyl-CoA: cholesterol acyltransferase produced byAspergillus fumigatusF37, J. Antibiotics 48:751-756], GERI-BP-002[Kim Y. K, H. W.Lee, K. H Son, B. M Kwon, T. S Jeong, D. H Lee, J H Shin, Y W. Seo , S. U. Kim, S. H. Bok 1996. GERI-BP002-A, Novel inhibitors of acyl-CoA:cholesterol acyltransferase produced byAspergillus fumigatusF93.J. Antibiotics49:31-36] 등이 보고되었다.
이에, 본 발명자들은 오랫동안 사용되어 안전성이 확보된 천연 생약제로부터 새로운 콜레스테롤 대사 억제물질을 탐색한 결과, 순비기나무의 열매인 만형자로부터 퓨란성 렙단 디테르펜 계열의 화합물인 로텐디퓨란과 6-에피-로텐디퓨란이 ACAT의 활성을 특이적으로 저해하는 효과를 규명함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명은 순비기나무의 열매인 만형자로부터 ACAT의 활성 저해작용이 있는 퓨란성 렙단 디테르펜 화합물인 로텐디퓨란과 6-에피-로텐디퓨란을 제공하는데 그 목적이 있다.
또한, 본 발명은 상기 퓨란성 렙단 디테르펜 화합물을 함유하는 고콜레스테롤혈증에 기인하는 심혈관 질환의 예방 및 치료용 조성물을 제공하는데 또 다른 목적이 있다.
도 1은 본 발명에 따른 화학식 1로 표시되는 화합물인 로텐디퓨란의 수소핵자기공명 스펙트럼(CDCl3, 500.13 MHz)을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에 따른 화학식 1로 표시되는 화합물인 로텐디퓨란의 탄소핵자기공명 스펙트럼(CDCl3, 125.75 MHz)을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명에 따른 화학식 1로 표시되는 화합물인 로텐디퓨란의 DEPT 스펙트럼(CDCl3, 125.75 MHz)을 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명에 따른 화학식 1로 표시되는 화합물인 로텐디퓨란의 수소-수소핵자기공명 스펙트럼(CDCl3, 500.13 MHz)을 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명에 따른 화학식 1로 표시되는 화합물인 로텐디퓨란의 HMBC 관련 그림을 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명에 따른 화학식 1로 표시되는 화합물인 로텐디퓨란의 NOE 관련 그림을 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명에 따른 화학식 2로 표시되는 화합물인 6-에피로텐디퓨란의 NOE 관련 그림을 나타낸 것이다.
본 발명은 아실-코에이:콜레스테롤 아실트랜스퍼라제(ACAT)의 활성을 저해하는 퓨란성 랍단 디테르펜 화합물인 다음 화학식 1로 표시되는 로텐디퓨란(Rotundifuran) 또는 다음 화학식 2로 표시되는 6-에피-로텐디퓨란(6-epi-rotundifuran) 및 이를 만형자로부터 분리하는 방법을 그 특징으로 한다.
또한, 퓨란성 랍단 테르펜 화합물을 유효성분으로 함유하는 고콜레스테롤증에 기인하는 고지혈증 및 동맥경화 등의 심혈관 질환의 예방 및 치료용 조성물을포함한다.
이와 같은 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.
만형자를 MeOH로 3일간 실온에서 냉침시킨 후 감압 농축하여 조추출물을 얻었다. 이 조추출물을 n-헥산, 클로로포름, 에틸 아세테이트, 물로 분획하여 n-헥산층을 감압 농축시킨다. n-헥산층을 실리카 겔 컬럼 그로마토그래피를 실시한다(Hexane / EtOAc : 100/0 ∼ 0/100). 이 분획들 중에서 가장 저해활성이 높은 분획들을 모아 C18 컬럼 크로마토그래피(MeOH / H2O : 50 / 50 ∼ 0 / 100)를 실시한 후 세파덱스 LH - 20(MeOH)을 행하여 TLC로 물질을 확인 후 ACAT에 저해활성을 보여주는 분획들을 모아 최종적으로 HPLC을 실시하여 순수 화합물들을 각각 얻는다. 위에서 분리 동정한 화합물들을 가지고 ACAT 저해활성을 측정한 결과 상기 화학식 1로 표시되는 화합물, 상기 화학식 2로 표시되는 화합물의 IC50값은 각각 35, 55μM로 나타났다. 그 중 상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 저해활성이 상기 화학식 2로 표시되는 화합물에 비하여 우수하였고, 화합물들 모두 농도 의존적인 저해활성을 보여 주었다. 그리고, 만형자는 오랫동안 사용되던 생약으로 이들로부터 추출, 분리된 본 발명의 화합물들 역시 독성 및 부작용 등의 문제가 없을 것임을 예상할 수 있다.
본 발명에 따라 분리 정제된 테르펜계 화합물들은 통상적인 방법에 의하여 정제, 캅셀제, 과립제, 현탁제, 유제와 같은 단위투여형 또는 수회투여형 제제로 제형화하여 고콜레스테롤혈증에 기인하는 순환기질환 예방 및 치료용 제제로 사용할 수 있다.
본 발명에 따라 분리 정제된 테르펜계 화합물들을 함유하는 약학 조성물들은 목적하는 바에 따라 비경구 투여하거나 경구 투여할 수 있으며 로텐디퓨란과 에피 로텐디퓨란은 체중 1 ㎏당 15 ∼ 20 ㎎의 량을 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다. 특정환자에 대한 투여용량수준은 성별, 연령, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 그리고 약제혼합 및 질환의 중증도에 따라 변화될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의거하여 더욱 상세히 설명하겠는바, 본 발명이 다음 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 활성물질의 분리정제
본 실험에 사용된 실험 재료들 중에서 만형자는 대전 유성의 한약 건재상에서 구입하였으며 1차 활성검색을 위한 식물체들은 중부지방의 여러 지역에서 채집하였으며 채집된 식물들은 식물 분류전문가의 검증을 받아 그늘에서 건조 후 잘게 썰어 사용하였다. 만형자 4 kg을 MeOH로 3일간 실온에서 냉침시킨 후 감압 농축하여 조추출물을 얻었고, 이 조추출물을 n-헥산, 클로로포름, 에틸 아세테이트, 물로 분획하여 활성이 있는 n-헥산층을 감압 농축시켰다. 농축된 n-헥산층을 여러 용매조건의 컬럼 크로마토그래피를 행하여 활성 물질들을 분리하였는데 n-헥산 분획의 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피시의 헥산/EtOAc : 100/0 ∼ 0/100를 용출 용매로 사용하였고, 이 분획들을 ACAT 저해활성을 평가하여 그 중에서 가장 저해활성이 높은 분획들을 모아 농축하여 C18 컬럼 크로마토그래피를 행하였는데 용출용매는 MeOH/H2O : 50/50 ∼ 100/0로 흘려주어 분획을 나누어 활성을 검정하여 활성부분을 모아 농축하여 세파덱스 LH - 20에 용출 용매는 MeOH로 행하여 ACAT에 저해활성을 보여주는 분획들을 모아 최종적으로 HPLC을 실시하여 순수화합물들을 얻었다. HPLC 컬럼은 YMC - pack ODS - 180(20 ×250 mm)를 사용하였으며 용출용매는 MeOH / H2O : 88/12로 3 ㎖/min로 흘려주었으며 검출은 UV 230 nm에서 행하였다. 다음 화학식 1로 표시되는 화합물은 46분에, 다음 화학식 2로 표시되는 화합물은 44분에 용출되었다.
화학식 1
화학식 2
실시예 2: 활성물질의 구조결정
활성물질들은 n-헥산 EtOAc(8 : 2) 용매조건으로 실리카 TLC 플레이트 상에서 Rf 값의 약간의 차이와 성상의 차이를 제외하고는 IR 스펙트럼, 질량 스펙트럼 등 화합물들의 물리, 화학적 특성은 거의 유사했다. 화합물들은 IR 스펙트럼에서 3500 cm-1의 히드록실기, 1700 cm-1에서 카보닐기의 존재가 추정되었다. 한편, 화합물들의 분자량을 조사하기 위해 질량 스펙트럼을 조사한 결과, 화합물들 모두 m/z 81에서 강한 퓨란 일부분(furan moiety)의 존재가 추정되었고, 분자 이온 피크(molecular ion peak)는 m/z 362인 것으로 관찰되었다. 이 화합물들의 분자식은 HREI MS로부터 C22H34O4로 추정할 수 있었다. 화합물들은 IR, Mass, NMR 데이타들을 분석한 결과 퓨란의 일부분을 가지고 있는 퓨란성 렙단 디테르펜계 화합물들로 추정되었다. 두 화합물들은 분자량과 기본골격이 모두 같고, 공간상에서의 입체적인 배열이 다른 것으로 추정하고 이미 보고되어있는 문헌들과 NOESY 실험을 통해 확인하였다. 화학식 1로 표시되는은 n-헥산 분획으로부터 무색의 오일상으로 얻어졌으며 EI MS로부터 m/z 362의 분자이온 피크를 확인할 수 있었다. 또한, HREI MS로부터 이 물질의 분자식을 C22H34O4로 결정할 수 있었다.1H-NMR 스펙트럼의 6.29 ppm(1H, bs), 7.22 ppm(1H, bs), 7.34 ppm(1H, t like)의 signal로부터 퓨란 링의 존재를 확인할 수 있었으며, 3개의 3급 메틸(δ 0.93, 0.98,1.23)과 1개의 2급 메틸(δ0.92), 2.0 ppm 에서 단일선(singlet)으로 나타나는 프로톤 3개에 해당하는 피크로부터 1개의 아세틸기을 확인할 수 있었다[도 1].13C-NMR은 총 22개의 탄소를 보여주고 있으며[도 2], DEPT 스펙트럼으로부터 5개의 CH3, 6개의 CH2, 6개의 CH와 5개의 4급 탄소를 확인할 수 있었다[도 3]. 170.45 ppm에서 카보닐 탄소의 시그날(signal), 142.75, 110.70, 125.33, 138.34 ppm에서 퓨란 링에서 기인하는 이중결합의 존재와 70.20 ppm, 76.74 ppm의 피크로부터 산소와 연결된 2개의 탄소를 확인할 수 있었다[도 4]. 이상의1H-NMR,13C-NMR 데이타와1H-1H COSY, HMQC, HMBC의 스펙트럼 데이타의 분석결과, 각 수소와 탄소를 귀속시킬 수 있었다. 이 물질은 랍단형 디테르펜계 물질로 생각할 수 있었다. 5번 11번, 12번 17번 수소의 근접한 탄소와의 연관관계는 이 물질의 HMBC 스펙트럼에서 주요한 부분의 수소와 탄소간의 상관관계를 나타내고 있다[도 5]. H-11(δ1.91)은 C-13(125.33 ppm), C-9(76.74 ppm), C-8(31.64 ppm), C-10(43.52 ppm)과 long range 커플링을 하고 있으며, H-12(δ2.50)의 경우 C-13(125.33 ppm), C-14(110.70), C-16(138.34 ppm), C-11(34.67 ppm)과 상관 피크를 확인할 수 있었다. 이상으로부터 퓨란 링이 연결된 사이드 체인이 C-9위에 연결됨을 알 수 있었으며, C-9의 화학적 변위(chemical shift) 76.74 ppm와 탄소(4급 탄소)로부터 IR에서 확인된 히드록실기가 C-9위에 결합됨을 알았다. 또한,lH-1H COSY 스펙트럼으로부터 H-6(δ5.39)에서부터 H-5(δ1.65)과 H2-7(δ1.51, 1.34)로 가는 상관 피크와δ5.39의 수소와 70.20 ppm의 탄소의 연결성을 HMQC로 확인할 수 있었으므로 -OCOCH3가 C-6위에 결합하고 있음을 추정하고 보고된 문헌과 비교하여 로텐디퓨란의 구조로 확정할 수 있었다[Asaka, Y., Kamikawa, T., and Kubota, T 1973. Constituents ofVitex rotundifoliaL. FIL.Chemistry Letters.937 - 940]. 그러나, 이 물질의1H-NMR과13C-NMR에 대한 보고가 없어 다른 유사한 랍단형 디테르펜과의 비교와 NOESY 실험을 통해 상대적인 입체배위를 정할 수 있었다[도 6].
상기 화학식 2로 표시되는 화합물도 상기 화학식 1로 표시되는 화합물과 골격이 같은 퓨란성 랍단 디테르펜 화합물로 상기 화학식 1로 표시되는 화합물과 비교시 화학적 변위의 약간의 차이를 볼 수 있었고, 특징적으로 6번 탄소에 결합한 수소의 갈라짐 양식(splitting pattern)과 결합 상수(coupling constant) 값의 차이가 있었다. 상기 화학식 2로 표시되는 화합물은 n-헥산 분획으로부터 미황색의 무정형 분말로 얻어졌으며 EI MS로부터 m/z 362의 분자이온 피크를 확인할 수 있었다. 또한, HREI MS로부터 이 물질의 분자식을 C22H34O4로 결정할 수 있었다. 이 물질은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물과 동일한 분자량과 분자식을 갖는 물질로서 IR,1H-NMR,13C-NMR이 거의 유사하게 나타나고 있어 랍단형 디테르펜계 물질로 추정할 수 있었다.1H-NMR 스펙트럼의 6.26 ppm(1H, bs), 7.21 ppm(1H, bs), 7.34 ppm(1H, bs)은 전형적으로 퓨란 환에서 나타나는 시그날들로, 물질의 구조에 퓨란 링의 존재와 3개의 3급 메틸(δ0.89, 1.01, 1.04)과 1개의 2급메틸(δ0.91), 2.0 ppm(3H, S)에서 1개의 아세틸기를 확인할 수 있었다.13C-NMR은 총 22개의 탄소를 보여주고 있으며, DEPT 스펙트럼으로부터 5개의 CH3, 6개의 CH2, 6개의 CH와 5개의 4급 탄소를 확인할 수 있었다. 170.45 ppm에서 카보닐 탄소의 시그날, 142.87, 110.70, 125.26, 138.47 ppm에서 퓨란 링에 기인한 4개의 탄소와 72.24 ppm, 76.38 ppm의 피크로부터 산소와 연결된 2개의 탄소를 확인할 수 있었다. 이상의1H-NMR,13C-NMR 데이타와1H-1H COSY, HMQC, HMBC의 스펙트럼 데이타 분석 결과, 각 수소와 탄소를 귀속시킬 수 있었다.1H-NMR에서 상기 화학식 2로 표시되는 화합물은 H-5, H-6의 화학적 변위가 δ1.94, δ5.09 이었고, 화학식 1로 표시되는의 경우 δ1.65, δ5.39로 약간의 증감의 차이점을 찾아볼 수 있었다. 또한,13C-NMR의 경우도 C-5(48.16 ppm), C-6(72.24 ppm)의 화학적 변위가 상기 화학식 1로 표시되는 화합물(47.03 ppm과 70.20 ppm)과 차이가 있었다. 이상으로부터 이 물질은 로텐디퓨란의 구조의 골격을 가지고 있으나 5번 탄소에 위치한 수소와 6번 탄소에 위치한 수소의 상대적 입체배위의 차이에 기인된 것으로 생각되어 5번 탄소에 위치한 수소와 6번 탄소에 위치한 수소의 갈라짐 양식과 J 값을 조사하고 공간적 입체배위를 밝히기 위해 NOESY 실험을 행하였다. 상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 경우 H-5와 H-6가 적도(equatorial) 형태의 입체배위로서 H-6은 J = 2.1 Hz의 사중선의 갈라짐 양식을 보여주고 있다. 이 같은 패턴은 기존에 보고된 문헌치와 비교시 H-6이 축(axial) 형태일 때의 패턴과 일치했다[Asaka, Y., Kamikawa, T., and Kubota, T 1973. Constituents ofVitex rotundifoliaL. FIL.Chemistry Letters.937 - 940]. 상기 화학식 2로 표시되는 화합물의 NOESY 실험 결과 20번의 메틸(axial)과의 상관 피크를 확인할 수 있었으나 상기 화학식 1로 표시되는 화합물(로텐디퓨란)의 경우 발견할 수 없었다. 이상의 결과로서 상기 화학식 2로 표시되는 화합물은 로텐디퓨란의 H-6의 입체배위가 축 형태로 반전된 6-에피-로텐디퓨란으로 신규화합물로 구조를 결정하였다[도 7].
실시예 3 : ACAT 효소원의 제조
효소원으로는 흰쥐(Male Sprague - Dawley rats 250 ∼ 300 g)의 간을 분리하여 마이크로솜 버퍼(microsome buffer) A(0.25 M sucrose, 1 mM EDTA, 0.01 M Tris - HCl, pH 7.4)로 세척하고 테플론-유리 균질기(teflon-glass homogenizer)[동양과학 제작]로 균질화하였다. 균질액을 14,000 ×g에서 15분 동안 원심분리하여 상등액을 얻었다. 이 상등액을 다시 100,000 ×g에서 1시간동안 원심분리하였다. ACAT이 포함된 마이크로솜 분리를 위해 원심분리한 침전물을 마이크로솜 버퍼 B(0.25 M sucrose, 0.01 M Tris - HCl, pH 7.4)를 가하여 100,000 ×g에서 1시간동안 다시 원심 분리시켰다. 그리고 나서 침전물에 새로운 마이크로솜 버퍼 B 4 ㎖를 가해 용해시키고 표준물질로 소의 혈청 알부민(bovine serum albumin)을 사용하여 Lowry 방법에 의해 단백질 농도를 결정하였다. 용액은 단백질의 농도를 10 ㎎/㎖로 희석 조정하고 -70 ℃에서 보관하였다.
실시예 4 : ACAT 효소활성측정
ACAT 효소활성측정은 [1 -14C]올레오일-코에이를 기질로 하여 Jeong 등의 방법을 일부 수정하여 사용하였다[Jeong T. S., S. U. Kim, K. H Son , B. M Kwon, Y. K. Kim ,M. U. Choi and S. H. Bok 1995. GERI-BP001 compounds, New inhibitors of acyl-CoA: cholesterol acyltransferase produced byAspergillus fumigatusF37, J. Antibiotics 48:751-756]. 반응 용액으로는 10.0 ㎕ 시료액, 4.0 ㎕ 쥐의 간 조직의 마이크로솜 효소(liver microsomal enzyme), 20.0 ㎕ 어세이 버퍼(assay buffer)[0.5 M KH2PO4, 10 mM DTT, pH 7.4], 40 ㎎/㎖ 소 혈청 알부민(essentially fatty acid free) 15.0 ㎕, 20 ㎎/㎖ 콜레스테롤 2.0 ㎕, 증류수 41.0 ㎕ 를 가하여 37 ℃에서 20분간 예비반응 시키고, 이 반응액에 [1 - 14C]올레오일-코에이(0.05 μCi, 최종농도 10 μM) 8.0 ㎕를 첨가하여 다시 37 ℃에서 25 분간 반응시킨 후 이소프로판올-헵탄(4 : 1 ; v / v) 1 ㎖을 가하여 반응을 정지시키고, 헵탄 0.6 ㎖과 5배로 희석한 어세이 버퍼 0.4 ㎖을 첨가한 후 원심분리를 행하였다. 효소 활성의 측정은 원심 분리하여 얻은 상층액 100 ㎕에 신틸레이션 칵테일(scintillation cocktail) 3 ㎖를 첨가한 후 리퀴드 신틸레이션 카운터(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사능(radioactivity)을 측정하였다
ACAT 저해도는 방사능으로 표지한 기질과 효소에 검색시료를 넣어 반응 생성물의 양을 방사능 측정장치를 사용하여 측정하였고, 다음 수학식 1로 활성 저해도를 계산하였다.
CPM (T) : 시료와 효소를 넣었을 때의 CPM
CPM (C1) : 시료는 넣지 않고, 효소는 넣었을 때의 CPM
CPM (C2) : 시료는 넣고, 효소는 넣지 않았을 때의 CPM
CPM (B) : 효소와 시료를 넣지 않았을 때의 CPM
이때 공시험은 0 ℃에서 반응시켰다. 또한, 양성 대조군으로는 obovatol를 사용하였으며, ACAT 저해활성을 측정한 결과 IC50값은 44μM로 나타났다. 상기 분리 동정한 화합물들을 가지고 ACAT 저해활성을 측정한 결과 상기 화학식 1로 표시되는 화합물, 화학식 2로 표시되는 화합물의 IC50값은 각각 35, 55μM로 나타났다. 그 중 화학식 1로 표시되는 화합물의 저해활성이 화학식 2로 표시되는 화합물에 비하여 우수하였고, 화합물들 모두 농도 의존적인 저해활성을 보여 주었다.
ACAT 저해활성물질은 소장에서 콜레스테롤의 체내 흡수를 저해하여 혈중 콜레스테롤 농도를 저하시키는데 유효하며, 간장에서 VLDL의 합성을 저해하여 혈중의 LDL 콜레스테롤 저하, 혈관내의 동맥경화 병변에서 동맥경화의 진전에 관여하는 콜레스테롤 아실화를 저해하여, 고콜레스테롤혈증에 기인하는 고지혈증, 동맥경화 등각종 심혈관 질환의 예방 및 치료용 의약품으로 유용하게 사용될 수 있다.
실시예 5: 정제의 제조
유효성분 1 g
락토스 7 g
결정성 셀룰로오스 1.5 g
마그네슘 스테아레이트 0.5 g
총 량 10 g
상기에서 나열된 성분들을 잘게 부숴 혼합한 후 직타법(direct tableting method)에 의해 정제를 제조하였다. 각 정제의 총량은 100 ㎎이고, 그 중 유효성분의 함량은 10 ㎎이다.
실시예 6: 분말제의 제조
유효성분 1 g
옥수수 전분 5 g
카르복시 셀룰로오스 4 g
총 량 10 g
상기에 나열된 성분들을 잘게 부숴 혼합하여 분말을 제조하였다. 경질 캡슐에 분말 100 ㎎을 넣어 캡슐제를 제조하였다.
실시예 7: 활성물질의 급성독성 시험
활성물질을 체중이 25 g 정도의 ddY 마우스의 복강에 200 ㎎/㎏용량으로 주사한 결과, 투여 30분 후 활동량이 조금 줄어들었으나, 투여 2시간 후 이런 증상이 나타나지 않았고, 투여 후 7 일 후까지 사망하지 않았으므로, 이 물질에 대한 급성독성은 200 ㎎/㎏ 용량까지는 없는 것으로 판단되었다.
이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명은 순비기나무의 열매인 만형자로부터 추출하여 얻은 퓨란성 랍단 디테르펜 계열의 화합물인 로텐디퓨란과 6-에피-로텐디퓨란은 특이적으로 ACAT을 저해하여 혈중 콜레스테롤 농도를 저하시키는데 유효하므로, 고콜레스테롤 섭취와 고콜레스테롤혈증에 기인한 심혈관 질환의 예방과 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (7)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 다음 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 퓨란성 랍단 테르펜 화합물을 함유하는 것을 특징으로 하는 고콜레스테롤증에 기인하는 심혈관 질환의 예방 및 치료용 조성물.
    화학식 1
    화학식 2
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 심혈관 질환은 고지혈증 또는 동맥경화인 것을 특징으로 하는 고콜레스테롤증에 기인하는 심혈관 질환의 예방 및 치료용 조성물.
  5. 1) 순비기나무의 열매인 만형자를 MeOH로 3일간 실온에서 냉침시킨 후 감압 농축하여 조추출물을 얻는 단계;
    2) 상기 조추출물을 n-헥산, 클로로포름, 에틸 아세테이트, 물로 분획하여 활성이 있는 n-헥산층을 감압 농축시키는 단계;
    3) 상기 농축된 n-헥산층을 여러 용매조건의 컬럼 크로마토그래피를 행하여 활성 물질들을 분리하는 단계;
    4) 상기 분획들을 ACAT 저해활성을 평가하여 그 중에서 가장 저해활성이 높은 분획들을 모아 C18 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 활성을 검정하는 단계; 및
    5) 상기 활성부분을 모아 세파덱스 LH - 20에 용출 용매는 MeOH로 행하여 ACAT에 저해활성을 보여주는 분획들을 모아 최종적으로 HPLC을 실시하여 순수 화합물을 얻는 단계를
    포함하는 것을 특징으로 하는 만형자로부터 다음 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 퓨란성 랍단 디테르펜 화합물을 분리하는 방법.
    화학식 1
    화학식 2
  6. 제 5 항에 있서서, 상기 3) 컬럼 크로마토그래피시의 용출 용매는 헥산/EtOAc : 100/0 ∼ 0/100인 것을 특징으로 하는 만형자로부터 퓨란성 랍단 디테르펜 화합물을 분리하는 방법.
  7. 제 5 항에 있어서, 상기 4) C18 컬럼 크로마토그래피의 용출용매는 MeOH/H2O : 50/50 ∼ 100/0인 것을 특징으로 하는 만형자로부터 퓨란성 랍단 디테르펜 화합물을 분리하는 방법.
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