KR100207958B1 - 후박 나뭇잎으로부터 아실-코에이:콜레스테롤 아실트랜스퍼라제(acat) 활성 저해제를 제조하는 방법 및 이를 함유하는 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 후박 나뭇잎(Machilus thunbergii Sieb et Zucc)으로부터 아실-코에이:콜레스테롤 아실트랜스퍼라제(Acyl-CoA:Cholesterol Acyltransferase: ACAT)의 활성을 특이적으로 저해하는 리카린계(Licarin) 화합물의 제조 방법 및 이를 함유하는 조성물에 관한 것으로, 후박 나뭇잎으로부터 추출한 하기 화학식 1의 화합물 및 화학식 1의 화합물을 메틸화 반응시켜 얻은 하기 화학식 2의 화합물은 다량의 콜레스테롤 섭취와 고콜레스테롤 혈증에 기인한 심혈관 질환의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

후박 나뭇잎으로부터 아실-코에이:콜레스테롤 아실트랜스퍼라제(ACAT) 활성 저해제를 제조하는 방법 및 이를 함유하는 조성물

본 발명은 후박 나뭇잎(Machilus thunbergii Sieb et Zucc)으로부터 아실-코에이:콜레스테롤 아실트랜스퍼라제(Acyl-CoA:Cholesterol Acyltransferase: 이하, ACAT라 함) 활성 저해제를 제조하는 방법 및 이를 함유하는 조성물에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 각종 성인병 치료 및 예방제로 사용되고 있는 후박 나뭇잎으로부터 ACAT 저해 활성을 갖는 리카린계 화합물을 추출하고 이의 유도체를 합성하는 방법, 그리고 이들 리카린계 화합물을 포함하는 혈중 콜레스테롤 저하 및 콜레스테롤 흡수 저해를 위한 조성물에 관한 것이다.

관상동맥성 심장병(coronary artery heart disease)은 현재 전체 사망 원인의 1/3을 차지하는 심장 순환기 질병으로서 미국, 유럽 등 대다수 선진국에서는 이로 인한 사망율이 1위를 차지하고 있으며, 우리나라도 그 발병율이 매우 높다. 이는 식생활과 생활 방식의 차이에 기인한 것으로, 우리나라도 점차 식생활 문화가 서구화되어 감에 따라 관상 동맥성 심장병의 주원인인 동맥경화증에 대한 연구가 중요한 의미를 갖게 되었다(Brown Goldstein, Ann. Rev. Biochem., 52, 223-261(1983) 참조).

동맥경화증(atheroscleroses)이란 동맥의 내막벽에 콜레스테롤이 침착되고 굳어져서 동맥벽이 비후, 경화되어 혈관이 좁아지는 비가역적 변성현상으로, 주로 관상동맥에서 발병되어 혈류장애를 일으키므로 심근으로 가는 혈액 공급이 부족하게 되어 협심증, 심근경색증 등의 관상동맥성 심장병을 일으키는 원인이 된다.

동맥경화증의 발병인자로는 혈중의 콜레스테롤 농도 상승으로 인한 고콜레스테롤혈증(hypercholesterolemia), 흡연, 고혈압, 당뇨병 빛 비만증 등이 알려져 있다. 이중에서 특히 고콜레스테롤혈증은 동맥경화증을 심화시키는 주요 요인이 되는데, 이는 콜레스테롤이 저밀도 지단백질(low-density lipoprotein: LDL)로 전환하여 혈관벽에 침착하기 때문인 것으로 사료된다.

LDL의 생성원으로는 외인성 및 내인성 콜레스테롤로 나눌 수 있는데, 음식물 섭취에 기인하는 외인성 콜레스테롤은 소장에서 ACAT에 의해 콜레스테롤 에스테르(cholesterol ester: CE) 형태로 흡수되어, 이와 함께 흡수된 트리글리세라이드(triglyseride) 및 소장내 존재하는 아포단백질(apoprotein)과 결합하여 지단백질(lipoprotein)의 일종인 카일로마이크론(chylomicron)을 생성한 후, 림프선으로 분비되고 혈액으로 이동하여 혈류를 따라 지방 조직 및 근육 조직의 모세혈관 내피세포벽에 결합한다. 이러한 카일로마이크론은 각 조직의 내피 세포벽에 존재하는 지단백질 리파제(lipoprotein lipase)에 의해 트리글리세라이드가 분해되어 잔여 트리글리세라이드, 아포단백질 및 CE로 이루어진 잔여 카일로마이크론(chylomicronremnant)이라는 작은 크기의 입자가 생성되고, 트리글리세라이드 분해로 생성된 지방산은 지방 및 근육 조직세포에서 에너지원으로 사용되거나 저장된다. 잔여 카일로마이크론의 아포단백질 부분은 간세포의 수용체에 결합되어 세포 안으로 들어가 리소좀 내에서 분해되어 CE로 유리된 후, 콜레스테롤 에스테르 가수분해효소(cholesterol ester hydrolase: CEH)에 의해 콜레스테롤로 변하게 된다. 유리된 콜레스테롤 중 일부는 담즙산 합성에 사용되어 담즙산으로 장 내에 분비되거나 세포막 생성에 사용되며, 남은 콜레스테롤은 다시 ACAT에 의해 CE 형태로 간세포 내에 저장되거나 혈중에 초저밀도 지단백질(very low-density lipoprotein: VLDL)의 형태로 다시 분비되어 중간 밀도 지단백질(intermediate-density lipoprotein: IDL) 형태를 거쳐 LDL이 된다.

또한, 간에서 생체 내 합성에 의해 생성되는 내인성 콜레스테롤은 간세포 내의 ACAT 효소에 의해 CE로 전환되고, 중심부에 CE, 고농도의 트리글리세라이드를 지니며 아포단백질로 둘러싸인 VLDL 입자 형태로 분비되어, 카일로마이크론과 같은 기전으로 내피 혈관벽에서 지단백질 리파아제의 작용을 받아 트리글리세라이드가 제거되고 중심부에 CE가 많은 IDL로변하게 된다. 이어서 IDL은 두가지 형태의 대사 경로를 겪게 되는데, 잔여 카일로마이크론처럼 간세포 내로 섭취되는 경로와 간에 의해 전체 IDL의 약 50%가 제거되고 나머지 50%는 혈중에서 내부의 잔여 트리글리세라이드가 제거되어 콜레스테롤이 고농도로 존재하는 LDL로 변하게 되는 경로가 있다. 즉, LDL은 콜레스테롤을 고농도로 함유하고 반감기는 1.5일 정도로 장기간 혈액내에 체류하므로, 인체 혈중의 콜레스테롤의 대부분(60 내지 70%)이 LDL의 형태로 있게 된다. 간 및 기타 여러 조직 내에서 혈중 LDL은 아포단백질 B-100을 매개로하여 수용체에 결합하여 섭취되는데, 정상적으로 특정 세포에 특정 물질의 생성을 위해서 콜레스테롤이 필요한 경우에는 LDL 수용체의 합성이 증가되어 수용체를 매개로 한 세포내 이입이 증가되고, 세포 내로 이동된 콜레스테롤은 세포막 형성, 담즙산 생성 또는 스테로이드 호르몬 생성 등에 이용된다(Brown Goldstein, Scientific American, 251, 52-60(1984)). 한편, 콜레스테롤이 과잉으로 존재하는 상태에서는 LDL 수용체 합성을 저해하여 혈관 내에는 다량의 CE를 함유한 LDL이 증가하게 된다. 혈중에 LDL이 증가하게 되면 LDL은 동맥혈관의 내피세포에 흡수되고, 그 안에서 LDL의 인지질이 중금속 매개로 산화되는데, 산화된 인지질은 아포단백질 B-100 단백질의 리신(lysine)을 산화시켜 단백질의 극성을 변화시킨다. 이렇게 산화된 아포단백질 B-100 단백질은 마크로파지의 포집체(scavenger) 수용체와 결합하여 포말세포(foam cell)를 형성한다. 한편 산화된 LDL은 세포 독성을 가지므로 동맥혈관의 내피 세포에 손상을 주며, 손상된 내피세포에는 혈소판이 침착된다. 침착된 혈소판에는 PDGF(platelet-derived growth factor)를 비롯한 성장 인자가 분비되어 세포 분열을 촉진시키므로 혈관 내벽을 증식시키는 결과를 초래하게 되고 결과적으로 동맥경화증이 야기된다. 이로써, LDL은 혈중의 콜레스테롤 농도와 직접 관련되며 고농도의 LDL이 동맥 경화증을 일으키는 결정적인 요인임을 알 수 있다.

외인성 또는 내인성 콜레스테롤로 인해 유리되는 VLDL이나 LDL과는 달리 세포의 괴사나 세포막의 전환(turnover)에 의해 유리되는 콜레스테롤은 고밀도 지단백질(high-density lipoprotein: HDL)의 작용으로 CE로 변환된다. HDL은 IDL을 거쳐 LDL로 변하며, 말초 조직 세포의 콜레스테롤을 간세포로 이동시켜 제거시키는 기능을 하는데, 그 혈장 농도는 관상동맥성 심장병 또는 동맥경화증과 반비례 관계를 갖는다.

이처럼 외인성 및 내인성 콜레스테롤의 이동경로를 살펴본 결과, 내인성 콜레스테롤과 같이 체내에서 콜레스테롤이 생합성되는 경우에는 그 농도가 매우 정확하게 조절되어 균형을 이루고 있는 반면, 외인성 콜레스테롤의 경우에는 혈중 농도에 대한 조절기전이 없으므로 LDL의 농도변화는 흡수되는 외인성 콜레스테롤의 양에 의존한다고 할 수 있다.

고콜레스테롤혈증의 유발을 막는 기전으로는, 과량의 외인성 콜레스테롤 흡수로 인한 전체 콜레스테롤 양의 증가를 억제하기 위해 콜레스테롤의 생합성 과정을 저해하거나, 콜레스테롤이 CE로 흡수되는 것을 억제하는 방법이 있다. 현재 알려져 있는 고콜레스테롤혈증의 치료제로는 콜레스테롤 생합성 경로중에서 HMG-CoA가 메발론산염(mevalonate)으로 되는 단계를 조절하는 효소인 HMG-CoA 환원효소(3-히드록시-3-메틸글루타릴-코엔자임 A 환원효소)에 대한 저해제, VLDL의 합성 및 분비를 억제시키는 피브린산(fibric acids), LDL의 농도를 저하시키는 콜레스티라민 수지(cholestyramine resin) 및 콜레스티폴(colestipol), 니코틴산(nicotinic acids), 프로부콜(probucol), 네오마이신(neomycin), 덱스트로티록신(dextrothyroxine), 콜레스테롤과 그 구조가 유사하여 소장, 간에서 콜레스테롤이 흡수되는 것을 상경적으로 방해하는 β-시토스테롤(β-sitosterol) 등이 있다. 이 중 HMG-CoA 환원효소에 대한 저해제 이외의 치료제들은 그 작용 부위가 정확하게 알려져 있지 않다. HMG-CoA 환원효소 저해제로는 사상균의 대사산물인 메바스타틴(mevastatin; Penicillium sp.; 원래 컴팩틴(compactin)으로 명명함), 로바스타틴(lovastatin; Aspergillus 및 Mona-scus sp.; 원래 모나콜린 케이, 메비놀린(monacolin K, mevinolin)으로 불리었음), 반합성 화합물인 심바스타틴(simvastatin) 및 프라바스타틴(pravastatin) 등이 상품화되어 임상에서 쓰이고 있다. 그러나 이들은 장기간 사용할 때 콜레스테롤 생합성 중간 단계에서 부경로로 생성되는 코엔자임 큐(coenzyme Q; ubiquinone), 돌리콜(dolichol), 햄 에이(haem A), 파네실화된 단백질(farnesylated proteins; Ras, lamin B) 및 콜레스테롤에서 생성되는 스테로이드 호르몬, 비타민 D, 담즙산 및 지단백질의 생산에 영향을 끼치므로 부적절한 것으로 보고되고 있다. 특히 지속적인 사용으로 심장기능과 면역기능에 중요한 역할을 수행하는 코엔자임 큐의 합성이 감소됨으로써 동맥경화 및 심장질환자에게 역효과를 줄 수 있다는 연구결과가 보고되고 있다(Willis, et al., PNAS, 87, 8928-8930(1990)).

기존의 고콜레스테롤혈증 및 동맥경화증 치료제의 문제점을 보완할 수 있는 새로운 형태의 치료제로서 현재 ACAT 활성 저해제가 유망한 것으로 기대되고 있다. ACAT는 콜레스테롤을 CE 형태로 변화시켜 소장내로 콜레스테롤의 흡수를 촉진시키며, 간에서 VLDL을 형성함으로써 LDL을 형성하는데 관여하고 혈관내벽 상처의 주변 세포에 CE가 축적되는데 관여한다(J. C. Goldstein, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 3178(1978). 또한, 필요 이상의 CE가 존재할 경우 혈관벽 등에 축적되거나 혈중의 점도를 증가시켜서 각종 심혈관 질환을 일으킨다는 것이 밝혀졌는데(D. Steinburg, N. Engl. J. Med., 320, 915(1989)), ACAT의 활성을 저해할 경우, 혈중 CE의 양을 저하시켜서 혈액의 점도를 낮추고 간에서는 콜레스테롤 양이 증가되어 그 합성을 감소시키고 장에서 흡수되는 콜레스테롤의 양 또한 줄일 수 있어서 궁극적으로 각종 심혈관 질환의 치료 뿐만 아니라 예방도 가능하리라 사료된다.

이에 따라 많은 연구자들에 의해서 ACAT 활성 저해제를 합성하거나 천연자원으로부터 추출하려는 시도가 계속되어 왔다(K. Matsuda, Med. Res. Rev., 14, 271(1994)). 예를 들어, 합성 ACAT 저해제로는 우레아 유도체(D. R. Sliskovic, et al., J. Med. Chem., 37, 560(1994)) 또는 이미다졸 유도체(R. G. Wilde, et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 5, 167(1995))가 있으며, 미생물 대사산물로부터 분리된 것으로는 아스페르질러스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus)로부터 생산된 피리피로펜(Pyripyropenes) 유도체(S. Omura, et al., J. Antibiotics, 46, 116-119(1993); Kwon, et al., Tetraheron Lett., 35, 3567(1994); J. Antibiotics, 48, 751(1995)), 스케도스피로움 속(Scedosporium sp.)으로부터 생산된 AS-183(IK. Kuroda et al., J. Antibiotis, 46, 1196-1202(1993))가 있고, 또한 천연 생약재로부터 분리된 것으로는 후박잎으로부터 분리된 오보바톨(Obovatol), 매그놀올(Magnolol) 및 호노키올(Honokiol)(대한민국 특허출원 제 95-41207 호), 오미자로부터 분리된 리그난계 화합물(대한민국 특허출원 제 96-31440 호) 등이 개발된 바 있다.

이에 본 발명자들은 오랜 동안 사용되어 안정성이 확보된 천연 생약재로부터 혈중 콜레스테롤 농도를 저하시킬 수 있는 ACAT 저해제를 개발하기 위해 연구를 계속 진행한 결과, 각종 성인병 치료 및 예방제로 사용되고 있는 한국에 자생하는 후박 나뭇잎에 함유되어 있는 리카린계 화합물을 분리 및 합성하여 본 발명의 완성에 이르게 되었다.

본 발명의 목적은 후박 나뭇잎으로부터 ACAT 활성 저해 작용이 있는 리카린계 화합물을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 ACAT 활성 저해제를 함유하는 혈중 콜레스테롤 저하용 조성물을 제공하는 것이다.

도 1은 리카린 A의 수소 핵자기 공명(NMR) 스펙트럼을 나타낸 것이다.

도 2는 리카린 A의 탄소 핵자기 공명(NMR) 스펙트럼을 나타낸 것이다.

도 3은 리카린 A의 자외선 스펙트럼을 나타낸 것이다.

도 4는 리카린 A의 적외선 스펙트럼을 나타낸 것이다.

도 5는 리카린 D의 수소 핵자기 공명(NMR) 스펙트럼을 나타낸 것이다.

도 6은 리카린 D의 탄소 핵자기 공명(NMR) 스펙트럼을 나타낸 것이다.

상기 목적에 따라, 본 발명에서는 후박 나뭇잎을 건조 및 분쇄하고, 분쇄된 잎을 알콜 용매로 추출하고, 추출액을 농축하여 정제하는 것을 포함하는 하기 화학식 1의 화합물의 제조방법 및 화학식 1의 화합물을 메틸화 반응시키는 것을 포함하는 하기 화학식 2의 화합물의 제조방법을 제공한다.

상기 다른 목적에 따라, 본 발명에서는 상기 방법으로 제조된 리카린계 화합물을 포함하는, 고콜레스테롤혈증에 기인한 심혈관 질환 예방 및 치료용 조성물이 제공된다.

이하 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

화학식 1의 화합물은 리카린 A, 화학식 2의 화합물은 리카린 D인 것으로 확인되었다(El-Feraly, F. S. et al., Phytochemistry, 21, 1133-1135 (1982); 및 Gonzalezcoloma, A. et al., Phytochemistry, 35, 607-610(1994)).

리카린 A는 후박 나뭇잎을 건조 및 분쇄하고, 분쇄된 잎을 알콜용매, 바람직하게는 메탄올 또는 에탄올로 추출한 후 농축하고, 농축물에 에틸아세테이트와 물을 가하여 층분리시키고, 유기층을 분리하여 농축하고, 농축액을 실리카겔 크로마토그래피 등으로 정제하는 것을 포함하는 방법에 의해 제조할 수 있다. 리카린 D는 후박 나뭇잎으로부터 분리 정제한 리카린 A를 다이아조메탄(Diazomethane)과 반응시킴으로써 정량적으로 얻을 수 있다.

본 발명에 따라 후박 나뭇잎으로부터 분리정제 또는 합성된 리카린계 화합물은 ACAT 저해활성 측정 결과 IC₅₀는 12 내지 20㎍/㎖이다. ACAT의 작용을 저해하는 이 화합물들은 장내에서 콜레스테롤의 흡수를 저해하는 기능과 콜레스테롤의 축적을 감소시키는 작용을 하기 때문에, 혈중 콜레스테롤치를 감소시켜 고지혈증으로부터 유발되는 각종 심혈관 질환의 치료 및 예방에 사용될 수 있다. 더욱이 후박 나뭇잎은 오랫동안 생약 및 식용으로 쓰여왔던 약재로서 이들로부터 추출분리된 본 발명의 화합물들 역시 독성 및 부작용 등의 문제가 없을 것임을 예상할 수 있다.

본 발명에 따라 분리정제 또는 합성된 리카린계 화합물은 통상적인 방법에 의해 정제, 캅셀제, 산제, 과립제, 현탁제, 유제 또는 비경구용 제제와 같은 단위 투여형 또는 수회 투여형 제제로 제형화하여 콜레스테롤 흡수 저해, 고지혈증 예방 및 치료, 그리고 고콜레스테롤 혈증에 기인한 각종 심혈관계 질환 예방 및 치료용 제제로 사용할 수 있다.

본 발명에서 분리한 유도체들을 유효성분으로 함유하는 약학 조성물은 목적하는 바에 따라 비경구 투여하거나 경구 투여할 수 있으며, 화학식 1의 리카린 A 또는 화학식 2의 리카린 D는 하루에 체중 1㎏ 당 15 내지 20㎎의 양을 1 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다. 특정 환자에 대한 투여용량 수준은 사용될 특정 화합물의 종류, 체중, 연령, 성별, 건강 상태, 식이, 투여 시간, 투여 방법 및 배설, 그리고 약제 혼합 및 질환의 중증도에 따라 변화시킬 수 있다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의거하여 좀더 상세히 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 만으로 제한되는 것은 아니다.

실시예 1: 후박잎으로부터 리카린 A의 분리 및 정제

본 발명에 사용한 후박 잎은 대한민국 경상북도 울릉군 울릉읍에서 채취하였다. 완전히 건조한 1㎏의 후박 잎을 잘게 분쇄하고, 여기에 2ℓ의 메탄올을 가하여 상온에서 3 일간 방치한 후 교반하고 여과지를 사용하여 분리하였다. 여액을 합하여 감압하에서 농축한 후 1ℓ의 에틸아세테이트와 1ℓ의 물을 가하여 물층과 유기용매층으로 분리하고, 물층을 1ℓ의 에틸아세테이트로 3번 추출하여 유기용매에 녹는 부분을 모았다.

유기 용매층과 물층을 분리하여 효소활성 저해도를 측정한 결과 유기용매 층에 활성물질이 함유되어 있음을 확인하였다. 유기 용매층을 감압하에서 농축 건조하여 얻은 액체 물질을 50㎖의 메탄올에 녹이고 500㎖의 C18에 흡착시킨 후 메탄올/물(60/30)로부터 메탄올/물(100/0)까지 용리하여 활성물질 분획을 얻었다. 용리액을 감압하에서 농축하여 황갈색의 액체 물질을 얻었다. 실리카겔(Merck사, 상품명: 9385) 650g을 헥산/에틸아세테이트(8:2) 용액을 사용하여 칼럼(4.5x40㎝)을 충진한 후, 황갈색의 유성 물질을 메틸렌클로라이드에 용해시켜 실리카겔에 흡착시키고, 헥산:에틸아세테이트의 비율을 8:2부터 7:3으로 변화시키면서 실리카겔 칼럼 크로마토그래피를 2회 수행하여 활성분획을 분리하였다. 최종적으로 상기 분획을 페노메넥스(Phenomenex)사의 울트라카브(ultracarb)10 ODS(250x21.2㎜)를 사용하고 용출제로는 메탄올/물(4:1)을 사용하며 HPLC에 의해 정제하여 무색 고체의 리카린 A를 20 ㎎ 수율로 얻었다.

상기 리카린 A는 물에는 불용성이고 유기 용매에는 가용성이었다.

분리 정제된 물질이 리카닌 A임을 하기의 방법에 의해 확인하였다.

자외선(UV)-가시광선(Visible) 흡광도 분석: HPLC에 의해 최종적으로 분리정제된 활성물질을 100% 메탄올을 녹여서 자외선-가시광선 분광기(시마주(Shimadzu)사, UV-265)를 이용하여 흡수파장을 분석하였다.

적외선(IR) 흡광도 분석: 활성물질 시료 1㎎을 클로로포름에 녹여 AgBr 창에 바른 후 건조하여 비율 기록 적외선 분광기(Bio-Rad Digilab Division, FTS-80)로 분석하였다.

IR(NaCl): 3400(OH), 3015, 1605, 1510, 1480, 1220, 1130 cm^-1

분자량 분석: VG70-VSEQ 질량분석기를 이용하여 HRCI(high-resolution electron chemical ionization)-MS 방법으로 분자량을 측정하였다.

EI-MS(m/z): 326([M]⁺)

핵자기 공명(NMR) 분석: 활성 물질을 완전건조하여 CDCl₃에 녹인 후 5㎜ 튜브에 넣어 Bruker 400 MHz 기종으로 NMR 분석을 하였다.

¹H-NMR (CDCl₃) δ 1.19(d, J=6.4, 1H), 1.42(d, J=6.8, CH₃), 3.49(m, 1H), 3.91(s, OCH₃), 3.92(s, OCH₃), 5.14(d, J=9.4, 1H), 5.65(1H, OH), 6.16(dq, J=6.51, 15.61, 1H), 6.41(d, J=15.66, 1H), 6.81-7.1(방항족 H).

¹³C-NMR (CDCl₃) δ 18.21, 19.06, 46.28, 56.58, 56.64, 94.47, 109.57, 109.85, 113.96, 114.72, 120.65, 124.17, 131.58, 132.72, 132.85, 133.92, 144.81, 146.43, 147.21, 147.32.

실시예 2: 리카린 A로부터 리카린 D의 제조

리카린 D를 제조하기 위해 먼저 다이아조메탄을 제조하였다. 이를 위해 다이아조메탄은 알드리히(Aldrich)의 디아잘드 킷트(Diazald kit)를 이용하여 제조하였다. 삼목 반응 용기를 물중탕조에 설치하고, 에탄올(95%, 50㎖)과 수산화 칼륨(25g)이 녹아있는 증류수 40㎖을 반응용기에 넣었다. 반응기를 65℃가 되도록 가열한 후 225㎖의 에테르에 녹아 있는 디아잘드(25.0g, 23mmol)를 분획 깔때기를 이용하여 서서히 가했다. 이때 농축기에 농축되어 떨어지는 속도와 디아잘드가 녹아있는 에테르를 가하는 속도를 같게 유지시켰다.

리카린 A를 상기의 방법으로부터 생성한 다이아조메탄과 다음과 같은 방법으로 반응시켜서 리카린 D를 제조하였다. 즉, 50㎎의 리카린 A를 30㎖의 메탄올에 녹인 후 에테르에 용해시킨 다이아조메탄을 가하여 반응시켰다. 상온에서 30분 정도 교반한 후 박막크로마토그래피법으로 반응이 80% 정도 진행되었음을 확인하였다. 반응용액을 1 시간 정도 더 교반한 후 용매를 감압하에서 농축시키고 실리카겔 칼럼 크로마토그래피를 이용하여 무색 액체의 순수한 리카린 D를 48㎎의 수율로 얻었다.

분리 정제된 물질이 리카린 D임을 실시예 1의 분석 방법에 따라 분석한 결과로부터 확인하였다.

IR(NaCl): 3020, 1210, 760 cm^-1

EI-MS(m/z): 340([M]⁺, 110%), 325(17.0%), 309(5.6%), 297(4.1%)

¹H-NMR (CDCl₃) δ 1.39(d, J=6.8, CH₃), 1.87(d, J=6.5, CH₃), 3.46(m, 1H), 3.87(s, OCH₃), 3.88(s, OCH₃), 3.90(s, OCH₃), 5.12(d, J=9.3, 1H), 6.10(m, 1H), 6.36(m, 1H), 6.76-6.99(m, 방항족 H).

¹³C-NMR (CDCl₃) δ 17.61, 18.29, 45.56, 55.92, 55.96, 93.63, 109.39, 109.60, 113.39, 119.18, 123.44, 130.94, 132.22, 132.74, 133.27, 144.16, 146.63, 149.17, 149.23

실시예 3: 리카린계 화합물의 ACAT 저해활성 검정

ACAT 활성의 측정은 [1-¹⁴C] 올레오일-CoA를 기질로하여 타바스(Tabas) 등의 방법(Tabas, et al., J. Biol. Chem., 261, 3147-3154(1986))을 응용하여 실시하였다.

쥐의 간조직 마이크로좀 효소 4.0㎕, 분석 완충액(0.5M KH₂PO₄, 10mM DTT, pH 7.4) 20.0㎕, 40㎎/㎖ 소 혈청 알부민(지방산 부재) 15.0㎕, 20㎎/㎖의 콜레스테롤 2.0㎕ 및 물 41.0㎕를 혼합하여 37℃에서 15 분간 예비반응시켰다. 이 반응액에 [1-¹⁴C] 올레오일-CoA(0.02μCi, 최종농도 10μM) 8㎕를 첨가하여 37℃에서 15분간 다시 반응시킨 후, 이소프로판올-헵탄(4:1, 부피/부피) 1㎖을 가하여 반응을 정지시키고, 헵탄 0.6㎖와 5배로 희석한 분석 완충액 0.4㎖를 첨가하여 원심분리하였다. 원심분리하여 얻은 상층액 100㎕에 칵테일 5㎖를 첨가한 후 액체 신틸레이션 카운터(liquid scintillation counter)를 사용하여 효소활성을 측정하였다. ACAT 저해 활성은 다음 수학식 1과 같이 계산한다.

여기서, 공시험은 0℃에서 반응시킨 것이고, 양성 대조구로는 클로르프로마진(chlorpromazine)을 사용하였다.

이들 화합물들의 ACAT 저해도 측정 결과 IC₅₀가 15 내지 50㎍/㎖인 것으로 확인되었다. 다음 표 1는 본 발명의 활성 화합물의 효소 저해 활성도를 측정한 결과를 나타낸다.

본 발명에 따라, 장기간에 걸친 사용으로 안정성이 확보된 생약인 후박으로부터 추출 정제하여 얻은 리카린계 화합물은 ACAT 저해 활성을 가져 혈중 콜레스테롤 농도를 저하시키는데 유효하므로, 고콜레스테롤 혈증에 기인하는 고지혈증, 동맥경화증 등 각종 심혈관계 질환의 예방 및 치료용 제제로 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (4)

1. 후박 나뭇잎을 건조 및 분쇄하고, 분쇄된 잎을 알콜 용매로 추출하고, 추출액을 농축하여 정제하는 것을 포함하는 하기 화학식 1의 화합물의 제조 방법.

   
2. 제 1 항의 방법에 따라 제조된 화학식 1의 화합물을 함유하는 고콜레스테롤 혈증에 기인한 심혈관 질환 예방 및 치료용 조성물.
3. 제 1 항의 방법에 따라 제조된 화학식 1의 화합물을 메틸화 반응시키는 것을 포함하는 하기 화학식 2의 화합물의 제조 방법.

   
4. 제 3 항의 방법에 따라 제조된 화학식 2의 화합물을 포함하는 고콜레스테롤 혈증에 기인한 심혈관 질환 예방 및 치료용 조성물.

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