CN108653308B - 江户樱花苷在治疗阿尔茨海默中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了江户樱花苷在治疗阿尔茨海默中的应用。本发明通过实验证实江户樱花苷可以促进Aβ_25‑35致损的PC‑12细胞的增殖率与活性，同时可以抑制Aβ_25‑35致损的PC‑12细胞的凋亡，本发明为阿尔茨海默的治疗提供了一种新的方法。

Description

江户樱花苷在治疗阿尔茨海默中的应用

技术领域

本发明属于生物医学领域，涉及江户樱花苷在治疗阿尔茨海默中的应用。

背景技术

阿尔茨海默症(Alzheimer’s Disease，AD)，又称为老年痴呆，该病是在老年时期发生，以慢性不能逆转的记忆衰退、认知功能阻塞为主要特性的神经退行性疾病，从诊断发病到死亡一般有十年时间，该疾病严重危害了人民健康，给家庭和社会带来了无数的情绪和经济负担。随着我国人民生活水平的提高，人口平均寿命延长，老龄化成了我国目前面临的重要问题，AD将成为影响人们生存质量和生活质量的严峻问题。目前尚无治愈AD的有效方法，并且在过去十年进行的100多项针对AD治疗的人体试验中没有发现任何成功案例。这些前所未有的挑战强调了寻找预防和早期干预AD的新药物的重要性和必要性(AsherMullard.Sting of Alzheimer's failures offset by upcoming prevention trials[J].Nature reviews Drug discovery.2012,11:657-660)。

较多的研究发现，细胞凋亡在AD的发生和发展中占据重要地位。细胞凋亡又称为细胞程序性死亡，可分为凋亡激活信号、启动、承诺、执行和清除五个步骤。正常的细胞凋亡是一个主动发起以便更好维持内环境稳定状态的过程(Sujoy Bhattacharya,RameshM.Ray,Leonard R.Johnson.Cyclin-dependent kinases regulate apoptosis ofintestinal epithelial cells[J].Apoptosis.2014,19(3):451-466)，当神经元受到各种有害物质刺激后会发生神经细胞的凋亡，而一旦正常凋亡过度活化，就很可能会导致神经退变性疾病。研究表明，Aβ可能引发神经细胞凋亡(E.J.Mufson,L.Mahady,D.Waters,etal.Hippocampal plasticity during the progression of Alzheimer’s disease[J].Neuroscience.2015,309:51-67)。

有证据表明，绝经后妇女的内源雌激素消耗是AD发病最重要的危险因素之一。雌激素可以在各种神经毒性存在的情况下发挥保护作用，例如谷氨酸盐过量、血清剥夺及Aβ毒性。不同神经元类型中的各种实例已经证实，雌激素可以通过基因组和非基因组机制发挥多效作用来预防Aβ毒性的发展。然而，雌激素可能使女性易发生乳腺癌和子宫癌，这无疑危及了雌激素的临床应用。在过去几年，植物雌激素作为雌激素治疗的潜在替代物被广泛关注，被推荐为AD可能的新型候选药物。研究植物激素与阿尔茨海默之间的相关性，对AD的临床治疗具有重要的意义。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的之一，在于提供一种治疗阿尔茨海默的药物组合物，所述药物组合物包含植物激素江户樱花苷。

本发明的目的之二，在于提供了一种保护神经细胞的方法，所述方法为施用江户樱花苷。

本发明的目的之三，在于提供了江户樱花苷在制备保护神经细胞以及治疗因神经细胞致损引起的疾病的药物中的应用。

具体地，本发明采用了如下技术方案：

本发明提供了一种治疗阿尔茨海默的药物组合物，所述药物组合物包含有效量的江户樱花苷。

进一步，所述药物组合物还包括木犀草素-7-O-β-D新橙皮苷、柚皮苷、江户樱花苷、江户樱花苷-7-O-β-D-葡萄糖苷、木犀草素、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷、新北美圣草苷、圣草酚、北美圣草素的一种或几种。

进一步，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体或辅料。

进一步，所述药物组合物是粉末、凝胶、乳液或液体形式。

进一步，所述药物组合物是片剂、薄片胶囊、凝胶胶囊、棒、小袋、小瓶、滴管或可注射的形式。

本发明提供了一种保护神经细胞的方法，所述方法为施用有效量的江户樱花苷。进一步，所述保护神经细胞的方法包括促进神经细胞增殖或抑制神经细胞凋亡。其中，所述方法为非诊疗目的的方法。

进一步，所述神经细胞为PC-12细胞。

优选的，当PC12细胞为损伤的PC-12细胞时，江户樱花苷的浓度为4×10^-1μmol/L。

本发明提供了江户樱花苷在制备保护神经细胞的药物中的应用。

本发明提供了江户樱花苷在制备治疗神经细胞致损引起的疾病的药物中的应用。

在本发明中，药学上可接受的载体是包括任何和所有的生理适用的溶剂、分散介质、胞衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂或吸收延迟剂等中的一种或多种。医药学上可接受载体的例子包括一种或多种的水、盐水、磷酸缓冲盐水、葡萄糖、甘油或乙醇等及其组合物中的一种或多种。在许多情况下，在该组合物中最好包括等渗剂，例如，糖、诸如甘露醇、山梨醇、山梨醇的多元醇或氯化钠等中的一种或多种。医药学上可接受载体还可以包含少量的辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、防腐剂或缓冲液等中的一种或多种，它们增强了江户樱花苷及其它植物激素的有效期或效力。

从具体的分类上看，所说的药学上可接受的载体是指医药学领域常规的药物载体，包括赋形剂，如淀粉或水等中的一种或多种；润滑剂，如甘油或硬脂酸镁等中的一种或多种；崩解剂，如微晶纤维素、琼脂、碳酸钙或碳酸氢钠等中的一种或多种；填充剂，如淀粉或乳糖等中的一种或多种；粘接剂，如预胶化淀粉、糊精、纤维素衍生物、藻酸盐、明胶或聚乙烯吡咯烷酮等中的一种或多种；渗透压调节剂，如葡萄糖、蔗糖、山梨醇或甘露醇等中的一种或多种；稀释剂，如水等；吸收促进剂，如季铵化合物等；表面活性剂，如十六烷醇等；吸附载体，如高岭土或皂粘土等中的一种或多种；润滑剂，如滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁或聚乙二醇等中的一种或多种；另外，还可以在组合物中加入其它辅剂，如香味剂或甜味剂等中的一种或多种。

例如，将活性组分江户樱花苷等植物激素溶解、混悬或乳化于适宜的水性溶剂中(例如，蒸馏水、生理盐水或格林溶液等中的一种或多种)或油性溶剂中(例如，植物油例如橄榄油、芝麻油、棉籽油、玉米油或丙二醇等中的一种或多种)中，即可制得注射制剂，其中溶剂中可含有分散剂(例如，聚山梨酯80、聚氧乙烯硬化蓖麻油60、聚乙二醇、苯甲醇、氯代丁醇或苯酚等中的一种或多种)、渗透压调节剂(例如，氯化钠、甘油、D9-甘露糖、D-山梨醇或葡萄糖等中的一种或多种)。在这种情况下，如有必要，可加入添加剂，例如增溶剂(例如，水杨酸钠或醋酸钠等中的一种或多种)、稳定剂(例如，人血清白蛋白等)、止痛剂(例如，苯甲醇等)等。

江户樱花苷及其它植物激素的药物组合物可以采用本领域公知的常规生产方法制成各种剂型，例如使活性成分与一种或多种载体混合，然后将其制成所需的剂型。所述的剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、混悬剂、乳剂、溶液剂、糖浆剂或注射剂等中的一种或多种，采取口服或注射(包括静脉注射、静脉滴注、肌肉注射或皮下注射等中的一种或多种)、粘膜透析等中的一种或多种给药途径进行抗AD及其相关病症的治疗或科学研究。

用于口服时，可将其制成常规的固体制剂如片剂、粉剂、粒剂或胶囊等中的一种或多种。在实施时，本发明江户樱花苷及其衍生物可以与例如惰性稀释剂或可同化的食用载体一同口服。该江户樱花苷及其它植物提取物(如果需要)亦可以包于硬或软壳明胶胶囊、压制成片剂或直接加入受治疗者的膳食中。关于口服治疗给药，可以将所述江户樱花苷及其它植物提取物与赋形剂一起加入并以可食片剂、颊含片剂、锭剂、胶囊、悬液、糖浆或糯米纸囊剂等中的一种或多种形式使用。

为了以非肠道给药之外给予本发明的江户樱花苷药物组合物，可能需要用防止其失活的材料对江户樱花苷包衣或与江户樱花苷一同给予。亦可以将补充的活性化合物加入该组合物中。在具体实施时，将本发明江户樱花苷与一种或多种可以用于治疗疾病的其它治疗药物共配制和/或共给予。这种联合使用，可以优越地利用较低剂量给予的治疗药物，因此避免可能的毒性或与各种单一疗法相关的并发症。

制成液体制剂如水剂、油悬浮剂或其它液体制剂中的一种或多种，如糖浆或酏剂等中的一种或多种；用于肠胃外给药时，可将其制成注射用的溶液剂、水剂或油性悬浮剂等中的一种或多种。

以上所述的使用形式中，优选的形式是片剂、包衣片剂、胶囊、栓剂或注射剂等中的一种或多种，进一步优选片剂、胶囊或注射剂等中的一种或多种，特别优选注射剂。

江户樱花苷的药物组合物一般必须无菌且在生产储存条件下稳定。可以将该组合物配制成溶液、微乳液、分散液、脂质体或其它适合于高药物浓度的有序结构。通过将所需量的该江户樱花苷与所需上述成分的一种或组合一起加入适当的溶剂中并接着进行除菌过滤制备无菌注射液。一般而言，通过将该江户樱花苷加入含有基本分散介质和所需的上述其它成分的无菌溶媒中制备分散液。在用于制备无菌注射液的无菌粉剂的情况下，推荐的制备方法是真空干燥和冷冻干燥剂。例如，通过诸如卵磷脂的包衣、在分散液的情况下通过保持所需颗粒大小和通过使用表面活性剂，可以保持溶液的适当流动性。通过在该组合物中包括延迟吸收的药剂(例如单硬脂酸盐或明胶)可以达到注射组合物的延长吸收。

术语“有效量”是指其用量足以治疗疾病，以适用于任何医学治疗的合理的利益/风险比率。组合物的有效剂量水平可以根据受试者的类型、疾病的严重程度、受试者的年龄和性别、药物活性、对药物的敏感性、给药时间，给药途径、排泄率、治疗时间、与组合物联用的药物和医疗领域中其他已知因素来确定。本发明的药物组合物可单独使用或与其它治疗剂组合施用，并且可以与常规的治疗剂依次或同时给药。可采用一种或多种剂型中施用组合物。考虑所有上述因素，在能够表现出最大效果而不引起副作用的最小量下施用组合物至关重要，该最小量可由本领域技术人员容易地确定。

本发明的优点及有益效果：

本发明对江户樱花苷拓展了新的医药用途，也为阿尔茨海默症的预防和治疗提供了一种新的药物来源，本发明的江户樱花苷安全低毒，药理作用强，可用于制备预防、治疗阿尔茨海默的产品。

本发明的江户樱花苷来源广泛、制备工艺简单，使用范围广，能最大限度发挥作用，易应用于临床。

具体实施方式

下面结合具体的实施例进一步说明本发明，本发明的实施例仅用于解释本发明，并不意味着限制本发明的保护范围。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1 MTT法检测雌二醇(E₂)对Aβ_25-35对PC-12细胞活力的影响

1、细胞培养

大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞PC-12细胞系(BIOSYNTHESIS BIOTECHNOLOGY CO.,LTD)，以含10％FBS和1％P/S的DMEM培养基，在37℃，5％CO₂的培养箱中培养，2-3天换液1次，使用0.25％含EDTA的胰蛋白酶常规消化传代，取处于对数生长期的细胞用于实验。

2、分组

1)E₂安全浓度筛选分组：

空白组：DMEM培养液培养24h后更换一次DMEM培养液，继续培养24h；

E₂组：DMEM培养液培养24h后，更换成终浓度分别为10μmol/L、1μmol/L、10^-1μmol/L、10^-2μmol/L、10^-3μmol/L、10^-4μmol/L、10^-5μmol/L的E₂溶液继续培养24h；

2)E₂有效浓度筛选分组：

空白组：DMEM培养液培养24h后更换一次DMEM培养液，继续培养26h；

模型组：DMEM培养液培养24h，更换DMEM培养液培养2h后给予Aβ₂₅-35溶液，使其终浓度为20μmol/L，继续培养24h；

E₂+Aβ_25-35组：DMEM培养液培养24h，更换成终浓度分别为1μmol/L、10^-1μmol/L、10^-2μmol/L、10^-3μmol/L、10^-4μmol/L、10^-5μmol/L的E₂溶液培养2h，给予Aβ_25-35溶液，使其终浓度为20μmol/L，继续培养24h

3、MTT检测

1)将处于对数期的细胞悬液种植至96孔板中，2500个细胞/200μL/孔，每组设置6个重复组；

2)加入MTT溶液(5g/L)20μL/孔，37℃继续孵育4h；

3)弃掉废液，加入DMSO 150μL/孔，恒温振荡器上振荡10min；

4)酶标仪570nm处检测各孔吸光度(OD)。

4、统计学处理

结果用SPSS18.0软件处理，以

表示，多组间比较使用单因素方差处理，两样本比较采用LSD检验，P<0.05为差异显著。

5、实验结果

1)E₂安全浓度的筛选结果如表1所示，与空白组相比，10μmol/L的E₂组细胞增殖率明显降低(P<0.01)，1、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4和10^-5μmol/L的E₂组细胞的增殖率无明显变化。可知，E2的安全浓度范围为1、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4和10^-5μmol/L，可用于后续E2有效浓度的筛选。

表1 E₂对正常PC12细胞增殖率的影响(

n＝6)

注：与空白组相比，**为P<0.01

2)E₂有效浓度的筛选的筛选结果如表2所示，与空白组相比，模型组细胞增殖率明显降低(P<0.01)；与模型组相比，1、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4和10^-5μmol/L的E₂组细胞增殖率明显升高(P<0.01，P<0.05)，其中，10^-3μmol/L的E₂组细胞增殖率最高，因此选用E₂的10^-3μmol/L浓度为最佳有效浓度，用于后续实验研究。

表2 E₂对Aβ_25-35损伤PC12细胞增殖率的影响(

n＝6)

注：与空白组相比，**为P<0.01，与模型组相比，^##为P<0.01，^#为P<0.05。

实施例2 MTT法检测江户樱花苷对Aβ_25-35对PC-12细胞活力的影响

1、细胞培养步骤同实施例1

2、分组

1)江户樱花苷安全浓度筛选分组：

空白组：DMEM培养液培养24h后更换一次DMEM培养液，继续培养24h；

江户樱花苷组：DMEM培养液培养24h后，更换成终浓度分别为4×10²μmol/L、40μmol/L、4μmol/L、4×10^-1μmol/L、4×10^-2μmol/L、4×10^-3μmol/L、4×10^-4μmol/L、4×10^-5μmol/L的江户樱花苷溶液继续培养24h；

2)江户樱花苷有效浓度筛选分组：

空白组：DMEM培养液培养24h后更换一次DMEM培养液，继续培养26h；

模型组：DMEM培养液培养24h，更换DMEM培养液培养2h后给予Aβ_25-35溶液，使其终浓度为20μmol/L，继续培养24h；

江户樱花苷+Aβ_25-35组：DMEM培养液培养24h，更换成终浓度分别为4×10^-1μmol/L、4×10^-2μmol/L、4×10^-3μmol/L、4×10^-4μmol/L、4×10^-5μmol/L的江户樱花苷溶液培养2h后给予Aβ_25-35溶液，使其终浓度为20μmol/L，继续培养24h；

3、MTT检测步骤同实施例1

4、统计学处理

结果用SPSS18.0软件处理，以

表示，多组间比较使用单因素方差处理，两样本比较采用LSD检验，P<0.05为差异显著。

5、结果

1)江户樱花苷安全浓度的筛选结果如表3所示，与空白组相比，4×10²μmol/L的江户樱花苷组细胞增殖率明显降低(P<0.01)，40μmol/L和4μmol/L江户樱花苷组细胞的增殖率明显升高(P<0.01)，4×10^-1μmol/L、4×10^-2μmol/L、4×10^-3μmol/L、4×10^-4μmol/L和4×10^-5μmol/L的江户樱花苷组细胞增殖率无明显变化。可知4×10^-1μmol/L、4×10^-2μmol/L、4×10^-3μmol/L、4×10^-4μmol/L和4×10^-5μmol/L的江户樱花苷对细胞增殖无明显影响。故江户樱花苷的安全浓度范围为4×10^-1μmol/L、4×10^-2μmol/L、4×10^-3μmol/L、4×10^-4μmol/L和4×10^-5μmol/L，可用于后续江户樱花苷有效浓度的筛选。

表3江户樱花苷对正常PC12细胞增殖率的影响(

n＝6)

注：与空白组相比，**为P<0.01

2)江户樱花苷有效浓度的筛选结果如表4所示，与空白组相比，模型组细胞增殖率明显降低(P<0.01)；与模型组相比，4×10^-1μmol/L的江户樱花苷组细胞的增殖率明显升高(P<0.01)，4×10^-2μmol/L、4×10^-3μmol/L、4×10^-4μmol/L和4×10^-5μmol/L的江户樱花苷组细胞增殖率无明显变化。可知江户樱花苷的有效浓度为4×10^-1μmol/L，可用于后续实验研究。

表4江户樱花苷对Aβ_25-35损伤PC-12细胞活性的影响(

n＝6)

注：与空白组相比，**为P<0.01，与模型组相比，^##为P<0.01。

实施例3江户樱花苷对Aβ_25-35诱导的PC12细胞损伤保护作用的研究

1、细胞培养步骤同实施例1

2、分组

空白组：DMEM培养液培养24h后更换一次DMEM培养液，继续培养26h；

模型组：DMEM培养液培养24h，更换DMEM培养液培养2h后给予Aβ_25-35溶液，使其终浓度为20μmol/L，继续培养24h；

E2+Aβ_25-35组：DMEM培养液培养24h，更换成终浓度10^-3μmol/L的E₂溶液培养2h，给予Aβ_25-35溶液，使其终浓度为20μmol/L，继续培养24h；

江户樱花苷+Aβ_25-35组：DMEM培养液培养24h，更换成终浓度为4×10^-1μmol/L的江户樱花苷溶液培养2h，给予Aβ_25-35溶液，使其终浓度为20μmol/L，继续培养24h。

3、MTT检测具体步骤同实施例1

4、统计学处理

结果用SPSS18.0软件处理，以

表示，多组间比较使用单因素方差处理，两样本比较采用LSD检验，P<0.05为差异显著。

5、结果

结果如表5所示，与空白组相比，模型组细胞增殖率明显降低(P<0.01)；与模型组相比，江户樱花苷+Aβ_25-35组细胞增殖率明显升高(P<0.01)。可知江户樱花苷对Aβ_25-35引发的PC12细胞活力损伤起保护功能，作用与E₂相似。

表5江户樱花苷对Aβ_25-35损伤PC-12细胞活性的影响(

n＝6)

注：与空白组相比，**为P<0.01，与模型组相比，^##为P<0.01。

实施例4江户樱花苷对Aβ_25-35诱导的PC12细胞损凋亡的影响

1、细胞培养具体步骤同实施例1

2、分组同实施例3

3、流式细胞仪检测细胞的凋亡率

1)将处于对数期的细胞悬液种植至6孔板中，4×10⁵个细胞/2ml/孔进行培养；

2)将上清液吸至15ml离心管，PBS洗涤6孔板中的细胞一次，加入0.25％胰蛋白酶，然后用吸出的上清液停止消化；

3)离心收集细胞，加入1ml PBS重悬细胞并计数，取含约10⁵个细胞的重悬液，1000rpm离心5min后移除上清；

4)按照凋亡试剂盒操作，进行流式细胞仪检测。

4、统计学处理

结果用SPSS18.0软件处理，以

表示，多组间比较使用单因素方差处理，两样本比较采用LSD检验，P<0.05为差异显著。

5、结果

结果如表6所示，与空白组相比，模型组细胞凋亡率明显升高(P<0.01)；与模型组相比，江户樱花苷+Aβ_25-35组细胞凋亡率明显降低(P<0.01)。这表明江户樱花苷可以抑制Aβ_25-35引发的细胞凋亡，作用与E₂相似。

表6江户樱花苷对Aβ_25-35损伤PC-12细胞凋亡的影响(

n＝6)

注：与空白组相比，**为P<0.01，与模型组相比，^##为P<0.01。

实施例5江户樱花苷对Aβ_25-35损伤PC12细胞中ROS、MDA及SOD含量变化的影响

1、细胞培养具体步骤同实施例1

2、分组同实施例3

3、T-SOD的测定

1)将处于对数期的细胞悬液种植至6孔板中，4×10⁵个细胞/2ml/孔进行培养；

2)将上清液吸至15ml离心管，将RIPA裂解液(含1％PMSF)添加到各离心管中，静置3min后将所有液体移至1.5ml离心管中，静置30min；

3)4℃，12000rpm离心5min收集上清于1.5ml离心管中；

4)应用BCA试剂盒进行蛋白定量，按照总超氧化物歧化酶测试盒说明书步骤，应用半自动生化分析仪，在波长550nm处，测定各组OD值。应用下列公式计算各组细胞中总SOD值：

4、MDA的测定

1)蛋白的提取步骤同T-SOD测定中的1)-3)；

2)按照丙二醛测试盒说明书步骤，应用半自动生化分析仪，在波长532nm处，测定各组OD值。应用下列公式计算各组细胞中MDA含量：

5、ROS测定

1)将处于对数期的细胞悬液种植至6孔板中，4×10⁵个细胞/2ml/孔进行培养；

2)移除培养液，加入10μmol/L的DCFH-DA 1ml/孔，将6孔板放在培养箱内静置20min，每5min将孔板中的各孔混一次，使细胞充分接触探针；

3)无血清培养液洗涤细胞三次，收集细胞，加入1ml无血清培养液，上流式细胞仪检测。

6、统计学处理

结果用SPSS18.0软件处理，以

表示，多组间比较使用单因素方差处理，两样本比较采用LSD检验，P<0.05为差异显著。

7、结果

结果如表7所示，与空白组相比，模型组细胞中ROS及MDA的含量明显升高，SOD活性明显降低(P<0.01)；与模型组相比，江户樱花苷+Aβ_25-35组细胞中ROS及MDA的含量明显降低，SOD活性明显升高(P<0.01)。说明江户樱花苷能保护Aβ_25-35引发的PC12细胞氧化损伤，其作用与E₂相似。

表7 Aβ_25-35损伤PC12细胞中ROS、MDA及SOD含量的表达(

n＝6)

注：与空白组组比，**为P<0.01；与模型组比，^##为P<0.01。

实施例6江户樱花苷对Aβ_25-35损伤PC12细胞中p-Tau蛋白表达的影响

1、细胞培养具体步骤同实施例1

2、分组具体分组同实施例3

3、Western Blot检测蛋白的含量

1)细胞总蛋白的提取

将各组细胞收集至15ml离心管中，4℃预冷的PBS洗涤两次，按每培养瓶300μl的量添加RIPA裂解液(含1％PMSF)，静置3min后将液体移至1.5ml离心管中，静置30min然后离心(4℃，12000rpm，5min)，将上清吸出至另一个新1.5ml离心管中；

2)蛋白变性

将蛋白样品与5×SDS上样缓冲液以4：1比例混合，沸水加热7min，使蛋白充分变性；

3)SDS-PAGE电泳

配置10％分离胶和5％浓缩胶，加入变性后的蛋白样品60μg进行电泳，电泳条件:浓缩胶80V，分离胶100V；

4)转膜

(1)准备PVDF膜及两张一样的滤纸，膜依次放置在甲醇、去离子水、转膜缓冲液中浸泡，按照由下往上依次为滤纸、PVDF膜、凝胶、滤纸的顺序铺平，玻璃板赶走气泡，置于半干转印仪上，10V，30min；

5)封闭

将PVDF膜取出后，放在配制好的封闭液中室温条件下孵育2h；

6)抗体孵育

将PVDF膜取出之后放至于杂交袋，留出一个缺口添加约1ml一抗稀释液使膜正面充分与之接触，密封后4℃过夜；倾去一抗稀释液，TBST洗涤三次，5min/次；取出PVDF膜，置于杂交袋，将大概1ml配制好的二抗稀释液添加到袋中，密封后室温放置1h；

7)洗膜

倾去二抗稀释液，TBST洗涤三次，5min/次；

8)化学发光

ECL发光液A液和B液按照相同量混合均匀，滴至PVDF膜上，使其均匀覆盖，于暗室中曝光并显影，分析结果

4、统计学处理

结果用SPSS18.0软件处理，以

表示，多组间比较使用单因素方差处理，两样本比较采用LSD检验，P<0.05为差异显著。

5、结果

结果如表8所示，与空白组相比，模型组细胞内Tau蛋白磷酸化水平明显提高(P<0.01)，与模型组相比，江户樱花苷+Aβ_25-35组Tau蛋白磷酸化水平明显下降(P<0.01)，作用与E₂相似。提示江户樱花苷可以通过抑制Tau蛋白磷酸化水平抑制Aβ毒性，发挥细胞保护作用。

表8 Aβ_25-35损伤PC12细胞中p-Tau蛋白的表达(

n＝6)

注：空白组比较，**为P<0.01，模型组比较，^##为P<0.01。

实施例7 Western blot检测PC-12细胞ERβ、p-Akt、t-Akt、p-GSK-3β、t-GSK-3β、p-Tau、t-Tau及caspase-3

为了研究江户樱花苷对PC12细胞中蛋白的影响，应用ER拮抗剂ICI182,780进行干预，观察江户樱花苷处理后细胞中蛋白分子的变化。

1、细胞培养具体步骤同实施例1

2、分组：

空白组(1)、模型组(2)、E₂+Aβ_25-35组(3)、江户樱花苷+Aβ_25-35组(4)同实施例3；

E₂+Aβ_25-35+ICI182,780组(5)：DMEM培养液培养24h，更换成终浓度1μmol/L的ICI182,780培养1h，更换成终浓度10^-3μmol/L的E₂溶液培养2h，给予Aβ_25-35溶液，使其终浓度为20μmol/L，继续培养24h；

江户樱花苷+Aβ_25-35+ICI182,780组(6)：DMEM培养液培养24h，更换成终浓度1μmol/L的ICI182,780培养1h，更换成终浓度4×10^-1μmol/L的江户樱花苷溶液培养2h，给予Aβ_25-35溶液，使其终浓度为20μmol/L，继续培养24h

3、Western blot法检测ERβ、p-Akt、t-Akt、p-GSK-3β、t-GSK-3β、p-Tau、t-Tau及caspase-3蛋白的表达具体步骤同实施例6

4、统计学处理

结果用SPSS18.0软件处理，以

表示，多组间比较使用单因素方差处理，两样本比较采用LSD检验，P<0.05为差异显著。

5、结果

结果如表9所示，与空白组相比，模型组细胞内ERβ、p-Akt/t-Akt以及p-GSK-3β/t-GSK-3β的表达明显降低(P<0.01)，p-Tau/t-Tau及caspase-3的含量明显升高(P<0.01)；与模型组相比，江户樱花苷+Aβ_25-35组细胞内ERβ、p-Akt/t-Akt以及p-GSK-3β/t-GSK-3β的表达明显升高(P<0.01)，p-Tau/t-Tau及caspase-3的表达明显降低(P<0.01)；与江户樱花苷+Aβ_25-35组相比，江户樱花苷+Aβ_25-35+ICI182,780组细胞内ERβ、p-Akt/t-Akt以及p-GSK-3β/t-GSK-3β的表达明显降低(P<0.01)，p-Tau/t-Tau及caspase-3的含量明显升高(P<0.01)。江户樱花苷的作用效果与E₂相似。ER拮抗剂的存在，减弱了江户樱花苷对Aβ_25-35的抑制作用。表明江户樱花苷可以通过激活ER途径活化Akt，激活GSK-3β从而降低Tau蛋白的过磷酸化水平、抑制细胞凋亡，对Aβ_25-35诱导的PC12细胞损伤发挥保护作用。

表9PC-12细胞中ERβ、p-Akt/t-Akt、p-GSK-3β/t-GSK-3β、p-Tau/t-Tau及caspase-3蛋白(

n＝3)

注：与空白组组比，**为P<0.01；与模型组比，^##为P<0.01；与给药组比，⁺⁺为P<0.01

实施例8联合用药对Aβ_25-35诱导的PC12细胞损伤保护作用的研究

为评估不同的植物激素联合对Aβ_25-35诱导的PC12细胞损伤保护的作用，发明人采用棋盘法进行实验。

1、细胞分组及培养

细胞分组及培养同实施例1，联合用药组加入两种不同倍比稀释的被测药物培养2h后，给予Aβ_25-35溶液，使其终浓度为20μmol/L，继续培养24h。

2、MTT检测具体步骤同实施例1

3、数据统计

实验结果用MacSynergyII软件分析。

4、结果

江户樱花苷、木犀草素-7-O-β-D新橙皮苷、柚皮苷、江户樱花苷、江户樱花苷-7-O-β-D-葡萄糖苷、木犀草素、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷、新北美圣草苷、圣草酚、北美圣草素和山奈酚进行不同组合，在保护Aβ_25-35诱导的PC12细胞损伤中产生协同、叠加等不同的效果，结果如表10所示，江户樱花苷与木犀草素-7-O-β-D新橙皮苷、圣草酚或山奈酚产生强协同效应。

表10联合用药对Aβ_25-35诱导的PC12细胞损伤保护作用

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (5)

1.一种治疗阿尔茨海默的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物选自有效量的有效成分江户樱花苷；和木犀草素-7-O-β-D新橙皮苷、柚皮素-7-O-β-D-葡萄糖苷、木犀草素、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷、圣草酚、山奈酚的任意一种。

2.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体或辅料。

3.根据权利要求1或2所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物是粉末、凝胶或液体形式。

4.根据权利要求3所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物是片剂、薄片胶囊、凝胶胶囊、 棒、小袋、小瓶、滴管或可注射的形式。

5.权利要求1-4任一项所述的药物组合物在制备治疗阿尔茨海默产品中的应用。