KR20220094109A - 마이크로코커스 루테우스 유래 세포외 소포를 포함하는 안질환 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 마이크로코커스 루테우스 유래 소포를 유효성분으로 포함하는 안질환의 예방, 개선, 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명자들은 상기 소포를 경구로 투여하였을 때 BBB(Blood-brain barrier)를 통과하여 망막을 포함한 중추신경계로 소포가 전달됨을 확인하였다. 또한, 상피세포 및 대식세포에 상기 소포를 처리하였을 때, 생물학적 원인 인자에 의한 염증성 매개체 분비를 현저히 억제할 뿐만 아니라 세포에 상기 소포를 처리하였을 때, 생물학적 원인 인자에 의한 NLRP3 단백질 발현을 억제함을 확인하였다. 나아가, 산화 스트레스에 의한 안질환 토끼 모델에 상기 소포를 투여하였을 때, 산화 스트레스에 의한 망막 변성의 발생을 유의하게 억제함을 확인하였는바, 본 발명에 따른 마이크로코커스 루테우스 유래 소포는 노화 관련 안질환 및 염증성 안질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물로 사용될 수 있을 뿐만 아니라 노화 관련 안질환 및 염증성 안질환의 예방, 증상 개선, 또는 치료하기 위한 의약품 또는 건강기능식품 등의 개발에도 유용하게 이용될 수 있을 것이다.
Description
본 발명은 마이크로코커스 루테우스 유래 세포외 소포 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로, 마이크로코커스 루테우스에서 유래하는 세포외 소포를 유효성분으로 포함하는 안질환의 예방 또는 치료용 조성물 등에 관한 것이다.
21세기에 들어서면서 과거 전염병으로 인식되던 급성 감염성 질환의 중요성은 감소된 반면, 인간과 공생 미생물과의 부조화에 의해 발생하는 면역기능 이상을 동반한 만성질환 및 우리 몸의 주요 장기에 발생하는 노화 관련 만성질환이 삶의 질 감소와 인간 수명을 결정하는 주요 질환으로 질병 패턴이 바뀌었다. 여러 가지 스트레스에 의한 면역기능 및 대사기능 이상을 특징으로 하는 21세기 난치성 만성질환으로서, 암, 심혈관질환, 만성폐질환, 대사질환, 및 신경-정신질환이 인간 수명과 삶의 질을 결정하는 주요 질환으로서 국민보건에 큰 문제가 되고 있다.
노화는 시간이 흐르면서 신체 기관의 기능이 저하되는 것을 의미하는 것으로, 시간에 따른 세포 손상의 축적을 노화의 일반적인 원인으로 보고 있으며, 세포 외 ATP, 고혈당, 세라미드, 아밀로이드, 요산결정, 콜레스테롤 결정 등 나이가 들수록 증가하는 다양한 손상관련 분자패턴(damage-associated molecular pattern; DAMPs)에 응답하여 활성화되는 NLRP3 inflammasaome은 특히 노화와 관련이 깊은 것으로 밝혀졌다. 따라서, NLRP3 inflammasaome은 노화 관련 질환의 예방과 치료의 표적이 되었으며, 노화 관련 만성질환은 면역기능 및 대사기능 이상을 동반한 만성 염증 및 세포사멸을 특징으로 하므로, NLRP3 inflammasaome 관련 염증을 억제하면 노화 관련 질환을 억제할 수 있는 것으로 보고되고 있다.
면역(immunity)은 생물학적, 화학적, 물리적, 정신적 스트레스에 대한 세포의 방어기작으로, 선천면역(innate immunity)과 후천면역(adaptive immunity)을 통해 일어나게 된다. 최근 염증질환의 병인과 관련해서 생물학적 원인 인자에서 유래하는 pathogen-associated molecular pattern(PAMP) 및 세포 손상에 의해 생기는 danger signal인 damage-associated molecular pattern(DAMP)이 유형 인식 수용체(pattern recognition receptor)인 NLRP(Nucleotide-binding oligomerization domain)에 의해 인지되고, 이 중에서 NLRP3는 NLRP3 inflammasaome을 형성하여 여러 가지 난치성 질환을 일으킨다는 사실이 주목받고 있다.
대사(metabolism)는 우리 몸에 필요한 에너지를 만들어 세포의 기능을 수행할 여러 가지 물질을 만드는 것으로 미토콘드리아에서 만들어진 ATP를 통해 소포체(endoplasmic reticulum, ER)에서 단백질과 지질이 만들어져 필요한 영역으로 물질을 공급한다. 세포는 생기는 순간부터 여러 가지 스트레스에 직면하게 되는데, 생물학적, 화학적, 물리적, 정신적 스트레스는 세포 내에서 소포체(ER) 스트레스, 미토콘드리아 기능 이상, 리소좀 손상(lysosomal damage) 등을 유도하여 NLRP3 inflammasome을 활성화하여 세포 사멸을 유도하여 여러 가지 질병을 일으키게 된다.
한편, 안구의 망막은 중추신경계에 속하는 기관으로, 성숙한 망막 세포는 뇌에 존재하는 대부분의 뉴런 세포와 마찬가지로 정상 상태에서는 분열하지 않는다. 따라서, 망막 세포의 기능이 저하되면 시각 기능에 이상이 나타나기 쉬우며 노화가 빠르게 진행되게 된다. 망막 세포의 기능이 저하되는 가장 큰 원인으로는 산화적 스트레스가 꼽히는데, 안구를 구성하는 망막, 시신경, 광수용체 세포, 수정체를 포함하는 조직은 일상생활에서 빛, 자외선과 같은 산화적 손상에 꾸준히 노출되기 때문이다. 이러한 산화적 손상에 의해 세포를 구성하는 DNA, 단백질, 지질에 변형이 나타나고 세포 사멸이 유도되면서 눈에 노화가 발생하고, 심각하게는 망막 지도모양 위축증(retinal geographic atrophy), 당뇨병성 망막증(diabetic retinopathy), 백내장(cataract), 녹내장(glaucoma) 및 안구건조증(xerophthalmia) 등과 같은 노화 관련 안질환이 발생하게 된다.
또한, 블루라이트(blue light), 자외선 등과 같은 환경적 스트레스에 대해 시각과 관련된 세포가 제대로 방어하지 못하면 눈에 염증이 발생하고, 반복적인 스트레스에 의해 만성 염증성 안질환이 발생하게 되며, 최근에는 이러한 만성 염증성 안질환을 치료 또는 예방하기 위하여 염증질환의 주요 매개체로 알려진 염증성 사이토카인인 TNF-α 억제제에 대한 관심이 증가되고 있다.
인체에 공생하는 미생물은 100조에 이르러 인간 세포보다 10배 많으며, 미생물의 유전자수는 인간 유전자수의 100배가 넘는 것으로 알려지고 있다. 미생물총(microbiota 혹은 microbiome)은 주어진 거주지에 존재하는 진정세균(bacteria), 고세균(archaea), 진핵생물(eukarya)을 포함한 미생물 군집(microbial community)을 말한다.
우리 몸에 공생하는 세균 및 주변 환경에 존재하는 세균은 다른 세포로의 유전자, 저분자화합물, 단백질 등의 정보를 교환하기 위하여 나노미터 크기의 소포(vesicle)를 분비한다. 점막은 200 나노미터(nm) 크기 이상의 입자는 통과할 수 없는 물리적인 방어막을 형성하여 점막에 공생하는 세균인 경우에는 점막을 통과하지 못하지만, 세균 유래 소포는 크기가 200 나노미터 크기 이하라서 비교적 자유롭게 점막을 통하여 상피세포를 통과하여 우리 몸에 흡수된다. 이와 같이, 세균 유래 소포는 세균에서 분비된 것이지만, 세균과 구성 성분, 체내 흡수율, 부작용 위험성 등이 서로 상이하며, 이로 인하여 세균 유래 소포를 사용하는 것은 살아있는 세균을 사용하는 것과는 전혀 상이하거나 현저한 효과를 나타낸다.
국소적으로 분비된 세균 유래 소포는 점막의 상피세포를 통해 흡수되어 국소 염증반응을 유도할 뿐만 아니라, 상피세포를 통과한 소포는 림프관을 통해 전신에 흡수되어 각 장기로 분포하고, 분포된 장기에서 면역 및 염증반응을 조절한다. 예를 들어, 대장균(Eshcherichia coli)와 같은 병원성 그람음성세균에서 유래하는 소포는 바이러스를 모사하는 병원성 나노 입자로서 국소적으로 대장염을 일으키고, 혈관으로 흡수된 경우에 혈관 내피세포 염증반응을 통해 전신적인 염증반응 및 혈액응고를 촉진시키고, 또한 인슐린이 작용하는 근육세포 등에 흡수되어 인슐린저항성과 당뇨병을 유발한다. 반면, 유익한 세균에서 유래하는 소포는 병원성 소포에 의한 면역기능 및 대사기능 이상을 조절하여 질병을 조절할 수 있다.
마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus)는 마이크로코커스 속에 속하는 그람양성세균으로, 물, 먼지, 토양 등과 같은 자연에 널리 분포하는 세균이다. 이 균은 피리딘과 같은 독성 유기오염물질에서 자랄 때 리보플라빈을 생성하고, 루테인 색소를 통해 자외선을 흡수하는 것으로 알려져 있다. 또한, 이 균은 유제품 및 맥주에서도 분리되고, 건조한 환경이나 고염 환경에서도 자라고, 포자(spore)를 형성하지는 않지만, 냉장고와 같은 냉장온도에서도 장기간 생존하는 것으로 알려져 있다.
그러나, 마이크로코커스 루테우스 유래 소포를 이용하여 안질환 치료에 응용한 사례는 보고된 바가 없다.
Choi YW et al., Gut microbe-derived extracellular vesicles induce insulin resistance, thereby impairing glucose metabolism in skeletal muscle. Scientific Reports, 2015.
본 발명자들은 상기와 같은 종래의 문제점을 해결하기 위하여 예의 연구한 결과, 마이크로코커스 루테우스 유래 소포를 세포에 처리하였을 때, 상기 소포가 병원성 나노 입자에 의한 염증성 매개체 분비를 현저히 억제할 뿐만 아니라 생물학적 병원성 인자에 의한 면역기능 이상을 효율적으로 억제하는 것을 확인하였다. 또한, 마이크로코커스 루테우스 유래 소포는 여러 질병의 병인과 관련된 유형 인식 수용체(pattern recognition receptor)인 NLRP3 단백질 발현을 억제하고, eNOS(endothelial NO synthase) 신호를 증가시켜 면역기능 이상을 억제함을 확인하였다. 또한, 상기 소포를 경구 투여하였을 때 상기 소포가 혈관-뇌 장벽(blood brain barrier, BBB)을 통과하여 중추신경계로 전달됨을 확인하였다. 나아가, 산화 스트레스에 의한 안질환 토끼 모델에 상기 소포를 처리하였을 때, 망막 변성(retinal degeneration)이 용량 의존적으로 억제됨을 확인하였는바, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명은 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus) 유래 소포를 유효성분으로 포함하는 안질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus) 유래 소포를 유효성분으로 포함하는, 안질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus) 유래 소포를 유효성분으로 포함하는, 안질환의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus) 유래 소포를 유효성분으로 포함하는, 안질환 예방 또는 개선용 흡입용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus) 유래 소포를 유효성분으로 포함하는, 안질환 치료 약물전달용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus) 유래 소포를 유효성분으로 포함하는, 안질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus) 유래 소포를 유효성분으로 포함하는, 안질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus) 유래 소포를 유효성분으로 포함하는, 안질환의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus) 유래 소포를 유효성분으로 포함하는, 안질환 예방 또는 개선용 흡입용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus) 유래 소포를 유효성분으로 포함하는, 안질환 치료 약물전달용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 안질환은 NLRP3 inflammasome(NOD-like receptor pyrin domain-containing protein 3 inflammasome)에 의해 매개되는 안질환일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 안질환은 노화 관련 안질환일 수 있으며, 구체적으로, 망막 지도모양 위축증(retinal geographic atrophy), 당뇨병성 망막증(diabetic retinopathy), 백내장(cataract), 녹내장(glaucoma) 및 안구건조증(xerophthalmia)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 질환일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 안질환은 염증성 안질환일 수 있으며, 구체적으로, 상기 안질환은 결막염(conjunctivitis), 공막염(scleritis), 각막염(keratitis), 홍채염(iritis), 포도막염(uveitis), 맥락망막염(chorioretinitis), 맥락염(choroiditis), 및 망막염(retinitis)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 질환일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 소포는 평균 직경이 10 내지 200 nm일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 소포는 마이크로코커스 루테우스 (Micrococcus luteus)에서 자연적 또는 인공적으로 분비될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 조성물은 NLRP3 inflammasome(NOD-like receptor pyrin domain-containing protein 3 inflammasome)의 활성을 억제할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 안질환은 망막 지도모양 위축증(retinal geographic atrophy), 당뇨병성 망막증(diabetic retinopathy), 백내장(cataract), 녹내장(glaucoma), 안구건조증(xerophthalmia), 결막염(conjunctivitis), 공막염(scleritis), 각막염(keratitis), 홍채염(iritis), 포도막염(uveitis), 맥락망막염(chorioretinitis), 맥락염(choroiditis), 및 망막염(retinitis)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 질환일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 마이크로코커스 루테우스 (Micrococcus luteus) 유래 소포를 유효성분으로 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 안질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 마이크로코커스 루테우스 (Micrococcus luteus) 유래 소포를 유효성분으로 포함하는 조성물의 안질환의 예방 또는 치료 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 마이크로코커스 루테우스 (Micrococcus luteus) 유래 소포의 안질환 예방 또는 치료용 약제의 제조를 위한 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 목적하는 안질환 치료 약물을 담지한 마이크로코커스 루테우스 유래 소포를 유효성분으로 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 안질환 치료 약물 전달 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 마이크로코커스 루테우스 (Micrococcus luteus) 유래 소포를 유효성분으로 포함하는 조성물의 안질환 치료 약물 전달 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 마이크로코커스 루테우스 (Micrococcus luteus) 유래 소포의 안질환 예방 또는 치료용 약제의 제조를 위한 용도를 제공한다.
본 발명자들은 마이크로코커스 루테우스 유래 소포를 경구 투여하였을 때 상기 소포가 혈관-뇌 장벽(blood brain barrier, BBB)을 통과하여 중추신경계로 전달됨을 확인하였다. 또한, 상피세포 및 대식세포에 상기 소포를 처리하였을 때, 생물학적 원인 인자에 의한 염증성 매개체 분비를 현저히 억제할 뿐만 아니라 세포에 상기 소포를 처리하였을 때, 생물학적 원인 인자에 의한 NLRP3 단백질 발현을 억제함을 확인하였다. 나아가, 산화 스트레스에 의한 안질환 토끼 모델에 상기 소포를 투여하였을 때, 산화 스트레스에 의한 망막 변성(retinal degeneration) 발생을 유의하게 억제함을 확인하였는바, 본 발명에 따른 마이크로코커스 루테우스 유래 소포는 안질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물뿐만 아니라 안질환 치료 약물전달체로 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 마이크로코커스 루테우스 유래 소포를 마우스에 경구 투여한 후, 시간별로 각 장기를 적출하여 각 장기에서 형광의 세기를 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 2는 마이크로코커스 루테우스 유래 소포를 마우스에 경구 투여한 후, 시간별로 소포가 뇌에 분포하고 있는 양상을 나타낸 도면이다.
도 3은 상피세포에서 마이크로코커스 루테우스 유래 소포(M. luteus EV)의 항염증 효과를 평가하기 위한 실험 프로토콜을 나타낸 도면이다.
도 4a 및 도 4b는 마이크로코커스 루테우스 유래 소포(M. luteus EV)의 항염증 효과를 평가하기 위해 상피세포에 마이크로코커스 루테우스 유래 소포(M. luteus EV)와 양성 대조 약물 덱사메타손(Dexamethasone; Dex)을 처리한 결과를 나타낸 것으로, 도 4a는 마이크로코커스 루테우스 유래 소포의 농도에 따른 IL-8 분비 억제 효과를 나타낸 도면이고, 도 4b는 양성 대조 약물 덱사메타손과 IL-8 분비 억제 효과를 비교한 도면이다 (*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, n.s.는 유의하지 않음을 의미함, 이하 동일).
도 5는 대식세포에서 마이크로코커스 루테우스 유래 소포(M. luteus EV)의 항염증 효과를 평가하기 위한 실험 프로토콜을 나타낸 도면이다.
도 6a 및 도 6b은 마이크로코커스 루테우스 유래 소포(M. luteus EV)의 항염증 효과를 평가하기 위해 대식세포에 마이크로코커스 루테우스 유래 소포(M. luteus EV)를 처리한 결과를 나타낸 것으로, 도 6a는 TNF-α의 분비 억제 효과를 나타낸 도면이고, 도 6b는 IL-6 분비 억제 효과를 나타낸 도면이다.
도 7은 말초혈액에서 분리한 호중구에 마이크로코커스 루테우스 유래 소포(M. luteus EV)와 양성 대조 약물 덱사메타손을 처리하여 생물학적 원인 인자인 대장균 유래 소포(E. coli EV)에 의한 호중구 활성화 정도를 평가하기 위한 실험 프로토콜을 나타낸 도면이다.
도 8은 말초혈액에서 분리한 호중구에 마이크로코커스 루테우스 유래 소포(M. luteus EV)와 양성 대조 약물인 덱사메타손을 처리하여 병원성 나노 입자인 대장균 유래 소포(E. coli EV)에 의한 호중구의 활성화 정도를 NE(neutrophil elastase) 분비로 평가한 결과를 도면이다.
도 9는 병원성 나노 입자인 대장균 유래 소포(E. coli EV)에 의한 염증질환 마우스 모델에서 마이크로코커스 루테우스 유래 소포(M. luteus EV)에 의한 염증질환 발생 억제 효과 및 작용기전을 확인하기 위한 실험 프로토콜을 나타낸 도면이다.
도 10a 및 도 10b는 병원성 나노 입자인 대장균 유래 소포(E. coli EV)에 의한 염증질환 마우스 모델에서 마이크로코커스 루테우스 유래 소포(M. luteus EV)에 의한 염증 억제 효과를 나타낸 것으로, 도 10a는 마우스 모델의 기관지폐포 세척액(BALF) 내 대식세포와 호중구 수를 확인한 결과를 나타낸 도면이고, 도 10b는 마우스 모델의 폐 조직에서 염증세포 침윤을 확인한 도면이다.
도 11a 내지 도 11c는 병원성 나노 입자인 대장균 유래 소포(E. coli EV)에 의한 염증질환 마우스 모델에서 마이크로코커스 루테우스 유래 소포(M. luteus EV)에 의한 염증성 매개체 분비 억제 효과를 나타낸 것으로, 도 11a는 기관지폐포 세척액(BALF) 내 CXCL-1 분비를 측정한 결과이고, 도 11b는 기관지폐포 세척액(BALF) 내 TNF-α 분비를 측정한 결과이며, 도 11c는 IL-1β 분비를 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 12a 내지 도 12c는 병원성 나노 입자인 대장균 유래 소포(E. coli EV)에 의한 염증질환 마우스 모델에서 마이크로코커스 루테우스 유래 소포(M. luteus EV)가 면역조절 관련 사이토카인의 분비에 미치는 효과를 나타낸 것으로, 도 12a는 IL-6 분비를 측정한 결과이고, 도 12b는 IL-17 분비를 측정한 결과이며, 도 12c는 IL-10 분비를 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 13은 병원성 나노 입자인 대장균 유래 소포(E. coli EV)에 의한 염증질환 마우스 모델에서 마이크로코커스 루테우스 유래 소포(M. luteus EV)가 기도과민성의 발생에 미치는 효과를 나타낸 도면이다.
도 14는 LPS에 오염된 단백질에 의한 면역질환 마우스 모델에서 마이크로코커스 루테우스 유래 소포 (M. luteus EV)의 염증질환 치료 효과를 평가하기 위한 실험 프로토콜을 나타낸 도면이다.
도 15a 내지 도 15c는 LPS에 오염된 단백질에 의한 면역질환 마우스 모델에서 마이크로코커스 루테우스 유래 소포(M. luteus EV)의 염증 억제 효과를 나타낸 것으로, 도 15a는 기관지폐포 세척액(BALF) 내 총 염증세포 수를 측정한 결과이고, 도 15b는 기관지폐포 세척액(BALF) 내 호중구 수를 측정한 결과이며, 도 15c는 폐 조직에서 염증세포 침윤을 확인한 도면이다.
도 16a 및 도 16b는 LPS에 오염된 단백질에 의한 면역질환 마우스 모델에서 마이크로코커스 루테우스 유래 소포(M. luteus EV)가 염증성 매개체인 IL-1β 및 Th17 면역반응 지표인 IL-17에 미치는 영향을 확인한 것으로, 도 16a는 IL-1β 농도를 측정한 결과이고, 도 16b는 Th17 면역반응 지표인 IL-17 농도를 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 17은 마이크로코커스 루테우스 유래 소포(M. luteus EV)에 의한 면역기능 조절 기전을 평가하기 위하여, LPS에 오염된 단백질에 의한 면역질환 마우스 모델에서 분리한 폐 조직에서 면역기능 조절 단백질인 NLRP3, T-bet, 및 ROR-rt의 발현 양상을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 18a 및 도 18b는 마이크로코커스 루테우스 유래 소포(M. luteus EV)에 의한 NO 생성 분자생물학적 기전을 평가하기 위하여, 상피세포에 마이크로코커스 루테우스 유래 소포와 양성 대조 약물인 덱사메타손(Dexamethasone)을 처리하여 바이러스 모사 나노 입자인 대장균 유래 소포(E. coli EV)에 의한 eNOS 신호 활성 및 iNOS 신호 활성을 확인한 것으로, 도 18a는 eNOS 신호 활성을 확인한 결과이고, 도 18b는 iNOS 신호 활성을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 19는 마이크로코커스 루테우스 유래 소포(M. luteus EV)의 안질환에 대한 효과를 평가하기 위한 동물 모델 실험 방법 및 평가 방법에 관해 나타낸 도면이다.
도 20은 마이크로코커스 루테우스 유래 소포(M. luteus EV)의 안질환에 대한 효과를 평가하기 위해 산화 스트레스에 의한 안질환 토끼 모델에 소포를 경구 투여하여 대조군 대비 마이크로코커스 루테우스 유래 소포 처리군의 망막변성 면적(retinal degenerated area)를 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 21은 산화 스트레스에 의한 안질환 토끼 모델에 소포를 경구 투여한 후, 안저카메라(TRC-50IX, TOPCON, Japan)로 안저를 촬영한 도면이다.
도 22는 마이크로코커스 루테우스 유래 소포(M. luteus EV)의 안질환에 대한 작용기작을 도식화한 도면이다.
도 2는 마이크로코커스 루테우스 유래 소포를 마우스에 경구 투여한 후, 시간별로 소포가 뇌에 분포하고 있는 양상을 나타낸 도면이다.
도 3은 상피세포에서 마이크로코커스 루테우스 유래 소포(M. luteus EV)의 항염증 효과를 평가하기 위한 실험 프로토콜을 나타낸 도면이다.
도 4a 및 도 4b는 마이크로코커스 루테우스 유래 소포(M. luteus EV)의 항염증 효과를 평가하기 위해 상피세포에 마이크로코커스 루테우스 유래 소포(M. luteus EV)와 양성 대조 약물 덱사메타손(Dexamethasone; Dex)을 처리한 결과를 나타낸 것으로, 도 4a는 마이크로코커스 루테우스 유래 소포의 농도에 따른 IL-8 분비 억제 효과를 나타낸 도면이고, 도 4b는 양성 대조 약물 덱사메타손과 IL-8 분비 억제 효과를 비교한 도면이다 (*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, n.s.는 유의하지 않음을 의미함, 이하 동일).
도 5는 대식세포에서 마이크로코커스 루테우스 유래 소포(M. luteus EV)의 항염증 효과를 평가하기 위한 실험 프로토콜을 나타낸 도면이다.
도 6a 및 도 6b은 마이크로코커스 루테우스 유래 소포(M. luteus EV)의 항염증 효과를 평가하기 위해 대식세포에 마이크로코커스 루테우스 유래 소포(M. luteus EV)를 처리한 결과를 나타낸 것으로, 도 6a는 TNF-α의 분비 억제 효과를 나타낸 도면이고, 도 6b는 IL-6 분비 억제 효과를 나타낸 도면이다.
도 7은 말초혈액에서 분리한 호중구에 마이크로코커스 루테우스 유래 소포(M. luteus EV)와 양성 대조 약물 덱사메타손을 처리하여 생물학적 원인 인자인 대장균 유래 소포(E. coli EV)에 의한 호중구 활성화 정도를 평가하기 위한 실험 프로토콜을 나타낸 도면이다.
도 8은 말초혈액에서 분리한 호중구에 마이크로코커스 루테우스 유래 소포(M. luteus EV)와 양성 대조 약물인 덱사메타손을 처리하여 병원성 나노 입자인 대장균 유래 소포(E. coli EV)에 의한 호중구의 활성화 정도를 NE(neutrophil elastase) 분비로 평가한 결과를 도면이다.
도 9는 병원성 나노 입자인 대장균 유래 소포(E. coli EV)에 의한 염증질환 마우스 모델에서 마이크로코커스 루테우스 유래 소포(M. luteus EV)에 의한 염증질환 발생 억제 효과 및 작용기전을 확인하기 위한 실험 프로토콜을 나타낸 도면이다.
도 10a 및 도 10b는 병원성 나노 입자인 대장균 유래 소포(E. coli EV)에 의한 염증질환 마우스 모델에서 마이크로코커스 루테우스 유래 소포(M. luteus EV)에 의한 염증 억제 효과를 나타낸 것으로, 도 10a는 마우스 모델의 기관지폐포 세척액(BALF) 내 대식세포와 호중구 수를 확인한 결과를 나타낸 도면이고, 도 10b는 마우스 모델의 폐 조직에서 염증세포 침윤을 확인한 도면이다.
도 11a 내지 도 11c는 병원성 나노 입자인 대장균 유래 소포(E. coli EV)에 의한 염증질환 마우스 모델에서 마이크로코커스 루테우스 유래 소포(M. luteus EV)에 의한 염증성 매개체 분비 억제 효과를 나타낸 것으로, 도 11a는 기관지폐포 세척액(BALF) 내 CXCL-1 분비를 측정한 결과이고, 도 11b는 기관지폐포 세척액(BALF) 내 TNF-α 분비를 측정한 결과이며, 도 11c는 IL-1β 분비를 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 12a 내지 도 12c는 병원성 나노 입자인 대장균 유래 소포(E. coli EV)에 의한 염증질환 마우스 모델에서 마이크로코커스 루테우스 유래 소포(M. luteus EV)가 면역조절 관련 사이토카인의 분비에 미치는 효과를 나타낸 것으로, 도 12a는 IL-6 분비를 측정한 결과이고, 도 12b는 IL-17 분비를 측정한 결과이며, 도 12c는 IL-10 분비를 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 13은 병원성 나노 입자인 대장균 유래 소포(E. coli EV)에 의한 염증질환 마우스 모델에서 마이크로코커스 루테우스 유래 소포(M. luteus EV)가 기도과민성의 발생에 미치는 효과를 나타낸 도면이다.
도 14는 LPS에 오염된 단백질에 의한 면역질환 마우스 모델에서 마이크로코커스 루테우스 유래 소포 (M. luteus EV)의 염증질환 치료 효과를 평가하기 위한 실험 프로토콜을 나타낸 도면이다.
도 15a 내지 도 15c는 LPS에 오염된 단백질에 의한 면역질환 마우스 모델에서 마이크로코커스 루테우스 유래 소포(M. luteus EV)의 염증 억제 효과를 나타낸 것으로, 도 15a는 기관지폐포 세척액(BALF) 내 총 염증세포 수를 측정한 결과이고, 도 15b는 기관지폐포 세척액(BALF) 내 호중구 수를 측정한 결과이며, 도 15c는 폐 조직에서 염증세포 침윤을 확인한 도면이다.
도 16a 및 도 16b는 LPS에 오염된 단백질에 의한 면역질환 마우스 모델에서 마이크로코커스 루테우스 유래 소포(M. luteus EV)가 염증성 매개체인 IL-1β 및 Th17 면역반응 지표인 IL-17에 미치는 영향을 확인한 것으로, 도 16a는 IL-1β 농도를 측정한 결과이고, 도 16b는 Th17 면역반응 지표인 IL-17 농도를 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 17은 마이크로코커스 루테우스 유래 소포(M. luteus EV)에 의한 면역기능 조절 기전을 평가하기 위하여, LPS에 오염된 단백질에 의한 면역질환 마우스 모델에서 분리한 폐 조직에서 면역기능 조절 단백질인 NLRP3, T-bet, 및 ROR-rt의 발현 양상을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 18a 및 도 18b는 마이크로코커스 루테우스 유래 소포(M. luteus EV)에 의한 NO 생성 분자생물학적 기전을 평가하기 위하여, 상피세포에 마이크로코커스 루테우스 유래 소포와 양성 대조 약물인 덱사메타손(Dexamethasone)을 처리하여 바이러스 모사 나노 입자인 대장균 유래 소포(E. coli EV)에 의한 eNOS 신호 활성 및 iNOS 신호 활성을 확인한 것으로, 도 18a는 eNOS 신호 활성을 확인한 결과이고, 도 18b는 iNOS 신호 활성을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 19는 마이크로코커스 루테우스 유래 소포(M. luteus EV)의 안질환에 대한 효과를 평가하기 위한 동물 모델 실험 방법 및 평가 방법에 관해 나타낸 도면이다.
도 20은 마이크로코커스 루테우스 유래 소포(M. luteus EV)의 안질환에 대한 효과를 평가하기 위해 산화 스트레스에 의한 안질환 토끼 모델에 소포를 경구 투여하여 대조군 대비 마이크로코커스 루테우스 유래 소포 처리군의 망막변성 면적(retinal degenerated area)를 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 21은 산화 스트레스에 의한 안질환 토끼 모델에 소포를 경구 투여한 후, 안저카메라(TRC-50IX, TOPCON, Japan)로 안저를 촬영한 도면이다.
도 22는 마이크로코커스 루테우스 유래 소포(M. luteus EV)의 안질환에 대한 작용기작을 도식화한 도면이다.
본 발명은 마이크로코커스 루테우스 유래 소포 및 이의 용도에 관한 것이다.
본 발명자들은 마이크로코커스 루테우스 유래 소포를 마우스에 경구 투여하였을 때 소포가 점막을 통과하여 전신적으로 흡수되고, 특히 뇌 조직에 분포함을 확인하였다. 또한, 상피세포에 상기 소포를 처리하였을 때, 상기 소포가 병원성 나노 입자에 의한 염증성 매개체 분비를 현저히 억제하였고, 이는 상기 소포가 eNOS(endothelial NO synthase) 신호를 통해 활성화하는 반면, iNOS(inducible NO synthase) 발현을 억제하여 일어남을 확인하였다. 또한, 대표적인 염증세포인 대식세포와 호중구에 상기 소포를 처리하였을 때, 병원성 나노 입자에 의한 염증성 매개체 분비와 호중구의 활성화를 용량 의존적으로 억제할 뿐만 아니라 병원성 나노 입자에 의한 염증질환 마우스 모델에 상기 소포를 투여하였을 때, 병원성 나노 입자에 의한 염증의 발생을 유의하게 억제함을 확인하였다. 또한, LPS에 오염된 단백질에 의한 면역질환 마우스 모델에 상기 소포를 투여하였을 때, PAMP(pathogen-associated molecular pattern)에 의한 염증의 발생을 유의하게 억제하고, 이는 면역기능 이상을 조절하는 것을 통해 나타냄을 확인하였는바, 이에 기초하여 본 발명에 따른 마이크로코커스 루테우스 유래 소포가 노화 관련 안질환 및 염증성 안질환에 대한 예방, 개선 또는 치료용 조성물 등으로 유용하게 이용할 수 있음을 확인하였다.
이하, 본 발명에 대하여 상세히 설명한다.
본 발명자들은 마이크로코커스 루테우스 유래 소포를 마우스에 경구 투여하였을 때 상기 소포가 뇌 조직에 분포하는 것을 확인함으로써 혈관-뇌 장벽(blood brain barrier, BBB)를 통과하여 망막을 포함한 중추신경계로 소포가 전달됨을 확인하였다. 또한, 상피세포에 상기 소포를 처리하였을 때, 생물학적 원인 인자에 의한 염증성 매개체 분비를 현저히 억제할 뿐만 아니라 대표적인 염증세포인 대식세포와 호중구에 상기 소포를 처리하였을 때, 생물학적 원인 인자에 의한 염증성 매개체 분비와 호중구의 활성화를 용량 의존적으로 억제함을 확인하였다. 나아가, 생물학적 원인 인자에 의해 발현되는 조직 내 NLRP3 단백질이 상기 소포를 투여하였을 때 현저히 억제될 뿐만 아니라 생물학적 원인 인자에 의해 억제되는 eNOS(endothelial NO synthase) 신호가 상기 소포를 투여하였을 때 유의하게 회복되는 것을 확인하였다. 또한, 산화 스트레스에 의한 안질환 토끼 모델에 상기 소포를 투여하였을 때, 상기 소포가 망막 변성의 발생을 용량 의존적으로 유의하게 억제함을 확인하였는바, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명은 마이크로코커스 루테우스 유래 소포를 유효성분으로 포함하는 안질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "안질환"이란 눈과 관련하여 발병하는 질환을 의미하는 것으로, 본 발명에서 있어서, 안질환이란 노화 관련 안질환 또는 염증성 안질환일 수 있으며, 구체적으로, NLRP3 inflammasome(NOD-like receptor pyrin domain-containing protein 3 inflammasome)에 의해 매개되는 안질환 또는 산화적 스트레스에 기이한 안질환일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 사용되는 용어 "노화 관련 안질환(age-related ocular disease)"이란 나이가 들어 감에 따른 생체 기능 퇴화에 기이한 안질환뿐만 아니라, 실제 연령대보다 생체 기능이 퇴화하여 노인에게서 주로 나타나는 질환의 증상과 유사한 증상을 나타내는 안질환을 모두 포함하는 개념으로, 상기 노화 관련 안질환은 예를 들어, 망막 지도모양 위축증(retinal geographic atrophy), 당뇨병성 망막증(diabetic retinopathy, DR), 녹내장(glaucoma), 백내장(cataract) 및 안구건조증(xerophthalmia) 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 "망막 지도모양 위축증(retinal geographic atrophy)"이란 노화로 인해 눈의 기능이 저하되고 혈류 공급이 원할하게 이뤄지지 않아 망막색소상피에 쌓이는 노폐물인 드루젠(drusen)이 석회화되면서 망막과 맥락막모세혈관이 위축되고, 위축된 부위가 지도모양으로 커져서 중심부위까지 퍼지게 되어 시력을 상실하게 되는 질환을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "염증성 안질환(inflammatory ocular disease)"이란 염증성 원인인자에 의해 눈에 염증이 발생하여 나타나는 안질환을 모두 포함하는 개념으로, 상기 염증성 안질환은 예를 들어, 결막염(conjunctivitis), 공막염(scleritis), 각막염(keratitis), 홍채염(iritis), 포도막염(uveitis), 맥락망막염(chorioretinitis), 맥락염(choroiditis), 및 망막염(retinitis) 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 "NLRP3 inflammasome(NOD-like receptor pyrin domain-containing protein 3 inflammasome)에 의해 매개되는 안질환"이란 NLRP3 inflammasome이 비정상적으로 과도하게 활성화되어 발생되는 안질환을 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 마이크로코커스 루테우스 유래 소포는 NLRP3 inflammasome의 활성을 억제할 수 있으므로, 이를 통하여 NLRP3 inflammasome에 의해 매개되는 안질환에 대한 예방, 치료 또는 개선용 조성물로 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 사용되는 용어, "세포외 소포(Extracellular vesicle)" 또는 "소포(Vesicle)"란, 다양한 세균에서 분비되는 나노 크기의 막으로 된 구조물을 의미하며, 예를 들어, 내독소(lipopolysaccharide), 독성 단백질 및 세균 DNA와 RNA도 가지고 있는 대장균과 같은 그람음성균(gram-negative bacteria) 유래 소포 또는 외막 소포체(outer membrane vesicles, OMVs) 및 단백질과 핵산 외에도 세균의 세포벽 구성성분인 펩티도글리칸(peptidoglycan)과 리포테이코산(lipoteichoic acid)도 가지고 있는 마이크로코커스 속 세균과 같은 그람양성균(gram-positive bacteria) 유래 소포 등이 있다.
본 발명에 있어서, 상기 세포외 소포 또는 소포는 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus)에서 자연적으로 분비되거나 또는 인공적으로 생산된 막으로 된 모든 구조물을 총칭할 수 있으며, 본 발명에 있어서, MDH-101, MDH-101 EV, M. luteus EV 또는 MlEV로 다양하게 표시될 수 있다.
상기 소포는 마이크로코커스 루테우스 세균 배양과정에서 열처리, 고압처리 하거나, 상기 세균 배양액을 원심분리, 초고속 원심분리, 고압처리, 압출, 초음파분해, 세포 용해, 균질화, 냉동-해동, 전기천공, 기계적 분해, 화학물질 처리, 필터에 의한 여과, 겔 여과 크로마토그래피, 프리-플로우 전기영동, 및 모세관 전기영동으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 방법을 사용하여 분리할 수 있다. 또한, 불순물의 제거를 위한 세척, 수득된 소포의 농축 등의 과정을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 방법에 의하여 분리된 소포는 구형의 형태로, 평균 직경이 10 내지 200 nm, 10 내지 190 nm, 10 내지 180 nm, 10 내지 170 nm, 10 내지 160 nm, 10 내지 150 nm, 10 내지 140 nm, 10 내지 130 nm, 10 내지 120 nm, 10 내지 110 nm, 10 내지 100 nm, 10 내지 90 nm, 10 내지 80 nm, 10 내지 70 nm, 10 내지 60 nm, 10 내지 50 nm, 20 내지 200 nm, 20 내지 180 nm, 20 내지 160 nm, 20 내지 140 nm, 20 내지 120 nm, 20 내지 100 nm, 또는 20 내지 80 nm 일 수 있으며, 바람직하게는, 20 내지 200 nm 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 조성물 내의 상기 소포의 함량은 질환의 증상, 증상의 진행 정도, 환자의 상태 등에 따라서 적절히 조절 가능하며, 예컨대, 전체 조성물 중량을 기준으로 0.0001 내지 99.9중량%, 또는 0.001 내지 50중량%일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 함량비는 용매를 제거한 건조량을 기준으로 한 값이다.
본 발명에서 사용되는 용어 "유효성분으로 포함하는"이란 상기 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus) 유래 소포의 효능 또는 활성을 달성하는데 충분한 양을 포함하는 것을 의미한다.
본 발명에서 "약학적 조성물"은 안질환의 예방 또는 치료를 목적으로 제조된 것을 의미하며, 각각 통상의 방법에 따라 다양한 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 예컨데, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽 등의 경구형 제형으로 제형화활 수 있고, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 사이클로덱스트린, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 등을 포함하지만 이에 한정되지 않으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 등 다른 통상의 첨가제를 더 포함할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제, 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립, 또는 정제로 제제화할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제화에 관해서는 레밍턴의 문헌에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 제형에 특별한 제한은 없으나 주사제, 흡입제, 피부 외용제, 점안제 또는 경구 섭취제 등으로 제제화할 수 있다.
나아가, 본 발명의 약학적 조성물은 유효성분으로서 상기 소포 이외에 안질환의 예방, 개선, 또는 치료에 유용한 성분, 예를 들어 항산화제, 스테로이드계 또는 비스테로이드계 소염성 약물 등을 포함할 수 있다.
상기 항산화제로는 아스코르브산, 중아황산 나트륨, 부틸화 히드록시톨루엔, 부틸화 히드록시아니솔, 토코페롤 또는 이들의 조합이 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 소염성 약물로는 덱사메타손, 플루오로메톨론, 프레드니솔론, 브롬페낙, 디클로페낙, 프루비프로펜, 케토로락, 또는 그의 염을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 약학적 조성물은 개체에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구 복용, 피하 주사, 복강 투여, 정맥 주사, 근육 주사, 척수 주위 공간(경막내) 주사, 설하 투여, 볼점막 투여, 직장 내 삽입, 질 내 삽입, 안구 투여, 귀 투여, 비강 투여, 흡입, 입 또는 코를 통한 분무, 피부 투여, 경피 투여 등에 따라 투여될 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
본 발명에서 상기 안구 투여는 결막낭 내 투여, 유리체 내 투여, 망막하 투여, 맥락막 상강 투여, 결막 하 투여 및 테논낭 하 투여로 이루어진 군으로부터 선택된 하나일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, 약학적으로 유효한 양은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 따른 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
구체적으로, 본 발명에 따른 약학적 조성물의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1 kg 당 0.001 내지 150 mg, 바람직하게는 0.01 내지 100 mg을 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명에서 "예방"이란 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 안질환의 발생을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 "치료"란 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 안질환에 대한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 "개선"이란 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 목적하는 질환과 관련된 파라미터 또는 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 감소시키는 모든 행위를 의미한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 안질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 마이크로코커스 루테우스 유래 소포의 안질환의 예방 또는 치료 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 노화 관련 안질환 치료용 약제 제조를 위한 마이크로코커스 루테우스 유래 소포의 용도를 제공한다.
본 발명에서 “개체”란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 쥐(rat), 개, 고양이, 말, 및 소 등의 포유류일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 “투여”란 임의의 적절한 방법으로 개체에게 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다.
또한, 본 발명은 마이크로코커스 루테우스 유래 소포를 유효성분으로 포함하는 안질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
상기 식품 조성물은 건강기능성 식품 조성물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 식품 조성물은 유효성분을 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합량은 그의 사용 목적(예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조 시에 본 발명의 조성물은 원료에 대하여 15 중량% 이하, 바람직하게는 10 중량% 이하의 양으로 첨가된다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 유효성분을 함유하는 것 외에 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카 라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물, 예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 당업자의 선택에 의해 적절하게 결정될 수 있다.
상기 외에 본 발명의 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율 또한 당업자에 의해 적절히 선택될 수 있다.
또한, 본 발명은 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus) 유래 소포를 유효성분으로 포함하는 안질환의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "의약외품"은 사람이나 동물의 질병을 진단, 치료, 개선, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용되는 물품들 중 의약품보다 작용이 경미한 물품들을 의미하는 것이다. 예를 들어 약사법에 따르면 의약외품이란 의약품의 용도로 사용되는 물품을 제외한 것으로, 사람ㆍ동물의 질병 치료나 예방에 쓰이는 섬유ㆍ고무 제품, 인체에 대한 작용이 경미하거나 직접 작용하지 않으며, 기구 또는 기계가 아닌 것과 이와 유사한 것, 감염병을 막기 위한 살균ㆍ살충제 등도 이에 포함된다.
본 발명에 있어서, 의약외품 조성물은 안과용 조성물의 제형으로 제형화하여 사용할 수 있고, 예컨대 안과용 액제, 점안제, 안연고, 주사액, 및 세안약(eyewash)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 제형으로 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus) 유래 소포를 유효성분으로 포함하는 흡입용 조성물 형태로 제공될 수 있다.
흡입 투여제의 경우, 당업계에 공지된 방법에 따라 제형화될 수 있으며, 적합한 추진제, 예를 들면, 디클로로플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 다른 적합한 기체를 사용하여, 가압 팩 또는 연무기로부터 에어로졸 스프레이 형태로 편리하게 전달할 수 있다. 가압 에어로졸의 경우, 투약 단위는 계량된 양을 전달하는 밸브를 제공하여 결정할 수 있다. 예를 들면, 흡입기 또는 취입기에 사용되는 젤라틴 캡슐 및 카트리지는 화합물 및 락토오즈 또는 전분과 같은 적합한 분말 기제의 분말 혼합물을 함유하도록 제형화할 수 있다.
또한, 본 발명은 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus) 유래 소포를 유효성분으로 포함하는, 안질환 치료 약물전달용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "약물전달"이란 특정 장기, 조직, 세포 또는 세포소기관으로 약물을 전달하기 위하여 본 발명에 따른 조성물에 약물을 로딩하여 전달하는 모든 수단 또는 행위를 의미한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 마이크로코커스 루테우스 배양액에서 소포 분리
마이크로코커스 루테우스 균주를 배양한 후 이의 소포를 분리하여 특성을 분석하였다. 마이크로코커스 루테우스를 37℃호기성 챔버에서 흡광도(OD 600)가 1.0~1.5가 될 때까지 MRS(de Man-Rogosa and Sharpe) 배지에서 배양한 후 sub-culture 하였다. 이후 균주가 포함되어 있는 배지 상등액을 회수하여 10,000 g, 4 ℃에서 20분 동안 원심분리하고 균주를 제거하고, 0.22μm 필터에 여과하였다. 여과한 상등액을 100 kDa Pellicon 2 Cassette 필터 멤브레인(Merck Millipore, US)으로 MasterFlex pump system(Cole-Parmer, US)를 이용하여 microfiltration을 통해 50 ㎖ 부피로 농축하였다. 이후 농축시킨 상등액을 다시 한 번 0.22 μm 필터로 여과하였다. 이후 BCA assay를 이용해 단백질을 정량하였고, 얻어진 소포에 대하여 하기 실험들을 실시하였다.
실시예 2. 마이크로코커스 루테우스 유래 소포의 약동학적 특성 평가
마이크로코커스 루테우스 유래 소포의 약동학적 특성을 알아보기 위해, 형광 염색시약으로 염색한 마이크로코커스 루테우스 유래 소포를 마우스 경구로 투여하여 72시간까지 각 장기에서 발현된 형광을 측정하였다.
도 1에 나타난 바와 같이, 형광 염색된 마이크로코커스 루테우스 유래 소포의 시간에 따른 장기 분포를 이미지로 확인하였을 때, 상기 소포가 여러 장기에 분포하고 있는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 뇌에서 발현되는 마이크로코커스 루테우스 유래 세포외 소포의 형광 세기를 그래프로 나타냈을 때, 도 2에 나타난 바와 같이, 뇌에서 상기 소포는 경구 투여 1시간 후부터 시그널이 나타나 24시간까지 지속되었으며, 이후 형광 시그널이 사라지는 양상을 나타내는 것을 확인하였다. 상기 결과로부터, 마이크로코커스 루테우스 유래 소포를 경구 투여하였을 때 점막을 통과하여 체내에 흡수되어 여러 장기에 분포함을 알 수 있으며, 특히 혈관-뇌 장벽(blood brain barrier, BBB)를 통과하여 망막을 포함한 중추신경계로 이동하여 분포함을 알 수 있다.
실시예 3. 상피세포에서 마이크로코커스 루테우스 유래 소포의 항염증 효과 평가
도 3에 나타난 바와 같이, 마이크로코커스 루테우스 유래 소포(M. luteus EV)와 양성 대조 약물인 덱사메타손(Dexamethasone)을 상피세포(A549 세포)에 전처리한 후, 염증을 유도하는 대장균 유래 소포(E. coli EV)를 처리하여 염증성 사이토카인 IL-8의 분비량을 ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay, R&D Systems)로 측정하였다. 구체적으로, A549 세포에 마이크로코커스 루테우스 유래 소포를 다양한 농도 (1, 10, 100 ㎍/mL)로 24시간 전처리한 후 대장균 유래 소포를 1 ng/mL 농도로 24시간 처리하여 배지로 분비된 IL-8을 측정하였다.
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 마이크로코커스 루테우스 유래 소포에 의해 IL-8의 분비가 용량 의존적으로 억제됨을 확인하였다 (도 4a). 또한, 대조 약물인 덱사메타손과 비교하였을 때, IL-8 분비 억제 효과가 더욱 탁월하였고, 상기 소포에 열처리를 하여 투여하였을 때에는 IL-8 분비 억제 효과가 없어짐을 확인하였다 (도 4b). 상기 결과로부터, 마이크로코커스 루테우스 유래 소포가 대표적인 항염증 약물인 덱사메타손에 비해 항염증 효능이 더 우수함을 알 수 있으며, 마이크로코커스 루테우스 유래 소포에 의한 항염증 효능이 열처리 시 없어지는 것을 통해 항염증 작용이 소포 내 단백질에 의해 매개됨을 알 수 있다.
실시예 4. 염증세포인 대식세포에서 마이크로코커스 루테우스 유래 소포의 항염증 효과 평가
도 5에 나타난 바와 같이, 마이크로코커스 루테우스 유래 소포(M. luteus EV)를 대식세포(RAW 264.7 세포)에 전처리한 후, 염증을 유발하는 대장균 유래 소포(E. coli EV)를 처리하여 염증성 사이토카인 TNF-α 및 IL-6을 ELISA (R&D Systems) 방법으로 측정하였다. 구체적으로, 마이크로코커스 루테우스 유래 소포를 다양한 농도 (1 ㎍/mL, 10 ㎍/mL, 및 100 ㎍/mL)로 24시간동안 전처리한 후, 대장균 유래 소포를 1 ng/mL 농도로 24시간 처리하여 배지로 분비된 TNF-α와 IL-6를 측정하였다.
그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, 마이크로코커스 루테우스 유래 소포를 전처리한 경우에 대장균 유래 소포에 의한 TNF-α (도 6a) 및 IL-6 (도 6b)의 분비가 용량 의존적으로 억제됨을 확인하였다. 상기 결과는, 병원성 생물학적 원인 인자(병원성 세균 또는 바이러스)에 의한 염증의 발생을 마이크로코커스 루테우스 유래 소포가 효율적으로 억제함을 의미한다.
실시예 5. 염증세포인 호중구에서 마이크로코커스 루테우스 유래 소포의 호중구 활성화 억제 효과 평가
도 7에 나타난 바와 같이, lymphoprep을 이용해 사람 혈액을 분리하여 호중구를 추출한 후, 호중구의 활성화를 평가하기 위하여 호중구 내 과립 단백질인 NE(neutrophil elastase)를 ELISA (R&D Systems)로 측정하였다. 구체적으로, 혈액 10 mL을 ACD solution을 포함하는 tube에 모아준 뒤, 20 mL lymphoprep 위에 혈액을 조심히 넣고 원심분리를 진행하였다. 원심분리 후 red blood layer를 모아 12 mL의 Dextran과 섞어주고 상온에 45 분간 방치하였다. 층 분리 후 상층액에 1X HBSS를 40 mL 넣고 한번 더 원심분리를 진행한 후, autoclaved millipore water로 적혈구를 제거해 주고 neutrophil isolation kit (MACS)를 이용해 호중구를 분리하였다. 분리한 호중구를 RPMI1640 배지를 이용해 배양하고 대장균 유래 소포(E coli EV)와 마이크로코커스 루테우스 유래 소포(M. luteus EV)를 24시간 동안 동시 처리한 후, 배지에서 NE를 측정하였다. 양성 대조 약물로는 덱사메타손(Dex)을 처리하였다.
그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이 대조 약물인 덱사메타손은 호중구 활성화 지표인 NE 분비를 억제하지 못하였지만, 마이크로코커스 루테우스 유래 소포는 용량 의존적으로 호중구에서 NE 분비를 억제하였다. 상기 결과로부터, 마이크로코커스 루테우스 유래 소포는 호중구가 활성화되어 일어나는 질환을 효율적으로 치료할 수 있음을 알 수 있다.
실시예 6. 병원성 나노 입자에 의한 염증질환 마우스 모델에서 마이크로코커스 루테우스 유래 소포의 항염증 효과 평가
도 9에 나타난 바와 같이, 병원성 나노 입자인 대장균 유래 소포(E. coli EV) 10 ng/ml를 비강으로 투여하여 염증질환 마우스 모델을 제작하였다. 상기 모델에 마이크로코커스 루테우스 유래 소포의 면역기능 조절 효과룰 평가하기 위하여 상기 대장균 유래 소포를 투여하기 5일전부터 마이크로코커스 루테우스 유래 소포 10 ng/ml 또는 100 ng/ml을 비강으로 투여하여 기관지폐포 세척액(BALF) 및 폐 조직에서 항염증 효과를 평가하였다. 구체적으로, 기관지폐포 세척액(BALF)에서의 항염증 효과를 평가하기 위하여, PBS 1 mL이 담긴 주사기를 기도에 연결하여 기관지폐포 세척액(BALF)을 채취한 후 Trypan blue(Abcam)을 사용하여 총 세포, 대식세포 및 호중구 수를 측정하였다. 또한, 폐 조직에서 항염증 효과를 평가하기 위하여, Cytopro(ELItech)에 슬라이드 글라스를 장착하여 세포를 고정시킨 후 Hematoxylin (DAKO) 및 Eosin (Sigma, USA)을 사용하여 염색한 뒤 호중구 수를 측정하였다.
그 결과, 도 10a에 나타낸 바와 같이, 마이크로코커스 루테우스 유래 소포를 투여한 그룹의 기관지폐포 세척액(BALF)에서 용량 의존적으로 대식세포와 호중구 수가 감소된 것을 확인하였다. 또한, 도 10b에 나타난 바와 같이, Hematoxylin&Eosin 염색법을 이용하여 폐의 조직학적 변화를 평가한 결과, 마이크로코커스 루테우스 유래 소포를 투여한 그룹의 페 조직에서 면역세포와 염증세포 침윤이 현저히 감소된 것을 확인하였다.
나아가, 도 11에 나타난 바와 같이, 기관지폐포 세척액(BALF)에서 염증성 매개체 분비 정도를 평가한 결과, 염증 유도 사이토카인인 CXCL-1(도 11a), TNF-α(도 11b), 및 IL-1β(도 11c)의 분비가 마이크로코커스 루테우스 유래 소포에 의해 용량 의존적으로 억제됨을 확인하였다.
상기 결과로부터, 마이크로코커스 루테우스 유래 소포가 병원성 나노 입자에 의해 발생하는 염증질환을 효율적으로 억제할 수 있음을 알 수 있다.
실시예 7. 병원성 나노 입자에 의한 염증질환 마우스 모델에서 마이크로코커스 루테우스 유래 소포의 면역 조절 효과 평가
실시예 6의 염증질환 마우스 모델에 마이크로코커스 루테우스 유래 소포를 투여하여 면역기능 조절 효과를 평가하였다.
그 결과, 대장균 유래 소포에 의한 염증을 유발하는 면역반응과 관련된 사이토카인인 IL-6(도 12a) 및 IL-17(도 12b)의 분비가 마이크로코커스 루테우스 유래 소포에 의해 용량 의존적으로 억제됨을 확인하였다.
한편, 면역기능을 억제하는 사이토카인 IL-10의 분비는 마이크로코커스 루테우스 유래 소포에 의해 억제되지 않았다 (도 12c). 상기의 결과로부터, 마이크로코커스 루테우스 유래 소포에 의한 항염증 효과가 병원성 나노 입자에 의한 면역반응을 억제함으로써 일어남을 알 수 있다.
실시예 8. 바이러스 모사 병원성 나노 입자에 의한 염증질환 마우스 모델에서 마이크로코커스 루테우스 유래 소포의 면역기능 이상에 대한 치료 효과 평가
면역기능 이상에 의해 발생하는 염증반응은 장기의 기능적인 변화를 초래하여 질환을 일으키게 된다. 실시예 6의 염증질환 마우스 모델에 마이크로코커스 루테우스 유래 소포를 투여하여 염증에 의해 유도되는 폐의 기능적인 변화를 평가하였다. 구체적으로, 각 마우스에 다양한 농도로(0 mg/mL, 6.25 mg/mL, 12.5 mg/mL 및 25 mg/mL)로 에어로졸 메타콜린(Sigma, USA)을 투여한 후 flexiVent(SCIREQ, Canada)를 사용하여 흡입된 메타콜린에 대한 최고 기도반응을 측정함으로써 메타콜린에 의한 기도과민성(Airway hyperresponsiveness, AHR)을 측정하여 기능적인 변화를 평가하였다.
그 결과, 도 13에 나타난 바와 같이, 마이크로코커스 루테우스 유래 소포를 투여한 그룹에서 메타콜린에 의해 유도된 기도저항성이 용량 의존적으로 개선된 것을 확인하였다. 상기의 결과로부터, 병원성 나노 입자에 의해 유도되는 질환의 병인에서 염증과 관련된 면역기능의 변화가 마이크로코커스 루테우스 유래 소포에 의해 효율적으로 치료될 수 있음을 알 수 있다.
실시예 9. LPS에 오염된 단백질에 의한 면역질환 마우스 모델에서 마이크로코커스 루테우스 유래 소포의 항염증 효과 평가
도 14에 나타낸 바와 같이, LPS에 오염된 단백질에 의한 면역질환 마우스 모델을 제작하기 위하여, 생물학적 원인 인자에서 유래한 PAMP(pathogen-associated molecular pattern) 중의 하나인 LPS 10 μg 및 단백질(ovalbumin, OVA) 75 μg 를 마우스에 흡입 투여하여 LPS에 오염된 단백질에 의한 면역질환 마우스 모델을 제작하였다. 이후, 3주간 OVA 50 μg와 마이크로코커스 루테우스 유래 소포 100ng을 동시에 비강으로 투여하였다. 대조 약물로는 덱사멕타손 (Dex) 20 μg을 복강으로 투여하였다.
그 결과, 마이크로코커스 루테우스 유래 소포를 투여한 그룹은 덱사메타손을 투여한 그룹과 유사하게 기관지폐포 세척액(BALF) 내 총 염증세포 수(도 15a) 및 호중구 수(도 15b)가 유의하게 감소한 것을 확인하였다.
또한, Hematoxylin&Eosin 염색법을 이용하여 폐의 조직학적 변화를 평가한 결과, 마이크로코커스 루테우스 유래 소포를 투여한 그룹은 덱사메타손을 투여한 그룹과 유사하게 폐 조직에서 염증세포 침윤이 현저히 억제된 것을 확인하였다 (도 15c). 상기 결과로부터, PAMP에 의해 유도되는 면역질환을 마이크로코커스 루테우스 유래 소포가 효율적으로 치료할 수 있음을 알 수 있다.
실시예 10. LPS에 오염된 단백질에 면역질환 마우스 모델에서 마이크로코커스 루테우스 유래 소포의 항염증 효과에 대한 면역학적 작용기전 확인
실시예 9의 마우스 모델을 이용하여 마이크로코커스 루테우스 유래 소포의 항염증 효과에 대한 면역학적 작용기전을 확인하기 위하여, 도 16에 나타난 바와 같이 기관지폐포 세척액(BALF) 내 IL-1β와 IL-17을 ELISA(R&D Systems)를 이용하여 측정하였다.
그 결과, 기관지폐포 세척액(BALF) 내 염증성 사이토카인 IL-1β(도 16a) 및 PAMP에 의한 Th17 면역반응의 지표인 IL-17(도 16b)의 농도가 마이크로코커스 루테우스 유래 소포에 의해 유의하게 감소한 것을 확인하였다. 상기의 결과로부터, 마이크로코커스 루테우스 유래 소포가 LPS에 의한 Th17 면역반응을 효율적으로 억제함으로써 PAMP에 의해 유도되는 질환을 치료할 수 있음을 알 수 있다.
실시예 11. LPS에 오염된 단백질에 면역질환 마우스 모델에서 마이크로코커스 루테우스 유래 소포의 면역기능 조절 분자생물학적 작용기전 확인
여러 가지 스트레스에 대한 선천면역 반응은 질병의 병인에 매우 중요하다고 알려져 있다. 특히, 세포질에 존재하는 NLRP3 단백질은 노화 관련 안질환 및 염증성 안질환의 병인에 핵심적인 신호전달 경로로 알려지고 있다. 또한, 항원에 대한 후천면역 반응 발생과 관련있는 t-bet과 ROR-γt는 각각 항원에 대한 Th1 및 Th17 면역세포로의 분화에 관련된 핵심적인 신호전달 물질로 알려져 있다.
마이크로코커스 루테우스 유래 소포의 면역기능 조절에 대한 분자생물학적 작용기전을 평가하기 위하여, 실시예 9의 마우스 모델의 폐 조직에서 NLRP3(NOD-like receptor pyrin domain-containing protein 3), t-bet (t-box protein expressed in T cells), ROR-γt (retineic-acid-receptor-related orphan nuclear receptor gamma) 발현을 western blotting으로 확인하였다. 구체적으로, 각 단백질의 발현양을 측정하기 위해 단백질 50 μg을 사용하였으며, 덱사메타손 (Dexamethasone; Dex) 또는 마이크로코커스 루테우스 유래 소포를 투여한 마우스 그룹의 폐 조직에서 단백질의 발현을 확인하였다.
그 결과, LPS에 오염된 단백질을 투여한 그룹에서는 음성 대조군에 비해 NLRP3 발현이 현저히 증가되었고, 마이크로코커스 루테우스 유래 소포를 투여한 그룹의 폐 조직에서는 덱사메타손을 투여한 그룹과 유사하게 NLRP3, t-bet 및 ROR-γt의 발현이 현저히 억제됨을 확인하였다 (도 17).
NLRP3는 세균 및 바이러스 감염 시 단핵구와 대식세포에서 발현되어 IL-1β를 분비하는 핵심적인 pattern-recognition receptor (PRR)이다. 상기 결과로부터, 마이크로코커스 루테우스 유래 소포가 NLRP3 발현을 억제하여 선천면역 기능을 조절함을 알 수 있다. 또한, 항원에 대한 후천면역 반응 발생과 관련있는 t-bet과 ROR-γt는 각각 항원에 대한 Th1 및 Th17 면역세포로의 분화에 관련된 핵심적인 신호전달 물질이다. 상기 결과로부터 마이크로코커스 루테우스 유래 소포는 t-bet과 ROR-γt 발현을 억제함으로써 Th1 및 IL-17을 분비하는 Th17 면역세포로의 분화 및 활성화를 억제함을 알 수 있다.
이는 LPS와 같은 PAMP에 의해 유도되는 면역기능 이상이 상기 마이크로코커스 루테우스 유래 소포에 의해 효율적으로 억제됨을 의미한다.
실시예 12. 산화 스트레스에 대한 세포의 항상성 조절에 마이크로코커스 루테우스 유래 소포의 효능 평가
세포가 여러 가지 스트레스에 반복적으로 노출 시 세포 내에서는 산화 스트레스(oxidative stress)에 의해 세포 노화가 발생하고, 세포 기능에 이상이 초래되며, 또한 세포 사멸이 초래되어 노화에 따른 퇴행성 질환이 발생한다. 특히, eNOS 신호를 통해 생성되는 저농도의 NO(nitric oxide)는 산화 스트레스의 주범인 활성 산소(reactive oxygen species, ROS) 작용을 길항하여 세포의 항상성을 유지하는 핵심적인 역할을 담당한다. 반면, iNOS 신호를 통해 생성되는 고농도의 NO는 오히려 세포에 과도한 스트레스를 초래하여 면역기능과 대사기능 이상을 초래하여 질병 발생을 촉진한다.
산화 스트레스에 대한 세포의 항상성에 미치는 마이크로코커스 루테우스 유래 소포의 효과를 평가하기 위하여, 실시예 3에 기술된 방법으로 마이크로코커스 루테우스 유래 소포(M. luteus EV)를 A549 세포에 처리한 후, 세포 신호전달 단백질의 발현 양상을 평가하였다. 신호전달 단백질 발현을 평가하기 위한 구체적인 방법으로, lysis buffer를 이용해 세포를 용해시키고 단백질을 추출하였으며, BCA protein assay kit(Thermo, USA)를 사용하여 단백질을 정량하였다. 샘플 당 50 μg의 단백질을 10% polyacrylamide gel에서 전기영동 하였으며, 분리된 단백질은 nitrocellulose membrane에 transfer하였다. skim milk를 첨가한 tris-buffered saline(0.05% tween 20) (TBST)로 실온에서 30분간 blocking 한 후, p-ERK, ERK, p-p38, p38, p-JNK, JNK, p-p65, p65, iNOS, p- eNOS, eNOS, 및 β-actin에 특이적인 1차 항체를 1/1,000으로 희석하여 4°C에서 24시간 동안 반응시켰다. 이후, 10분씩 3회 PBST(0.05% tween-20이 들어있는 phosphate buffer saline)로 세척하고, 1/5,000으로 희석한 2차 항체를 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 10분씩 5회 PBST로 세척 후 ECL select reagent를 이용해 band를 확인하였다.
그 결과, 도 18a에 나타난 바와 같이, 마이크로코커스 루테우스 유래 소포를 처리하였을 때, ERK 및 eNOS의 인산화가 덱사메타손(Dex) 및 마이크로코커스 루테우스 유래 소포(M luteus EV)에 의해 증가하였다. 또한, 마이크로코커스 루테우스 유래 소포에 의한 eNOS 신호는 상기 마이크로코커스 루테우스 유래 소포에 열처리를 하였을 때 억제되었다. 상기 결과로부터, 마이크로코커스 루테우스 유래 소포는 eNOS 신호를 활성화하여 세포 내에서 저농도의 NO을 유도하여 세포의 항상성을 증가시키며, 이러한 eNOS 신호를 통한 저농도의 NO 생성 및 산화 스트레스 억제 효과는 열에 취약한 소포 내 단백질에 의해 매개됨을 알 수 있다.
한편, 도 18b에 나타난 바와 같이, 마이크로코커스 루테우스 유래 소포를 처리하였을 때, JNK, p65, p38의 인산화 및 iNOS의 발현이 억제되었다. 또한, iNOS의 발현은 마이크로코커스 루테우스 유래 소포에 열처리하여 막단백질 기능을 억제하였을 때도 상기 소포의 억제효과가 유지되는 것으로 나타났다. 상기 결과로부터, iNOS 신호를 통한 고농도 NO 생성과 이로 인한 염증은 상기 소포에 존재하는 단백질 이외의 성분에 의해 매개됨을 알 수 있다.
실시예 13. 산화 스트레스(oxidative stress)에 의한 안질환 토끼모델에서 마이크로코커스 루테우스 유래 소포의 치료 효과 평가
안질환을 유발하기 위하여 산화 스트레스에 의해 망막의 변성을 유발하는 물질인 SI(Sodium iodate)를 토끼 모델에 단회 정맥 투여하였다. 마이크로코커스 루테우스 유래 소포의 치료 효과를 평가하기 위해, 마이크로코커스 루테우스 유래 소포(M. luteus EV) 0.025mg/kg 및 0.25mg/kg를 안질환 유발 3일 전부터 유발 후 7일째까지 매일 1회씩 경구 투여하였다. 평가 방법은 retinal degenerated area(변성된 망막의 면적)을 안저카메라(TRC-50IX, TOPCON, Japan)로 질환 유발 후 7일째 마지막 투여 날에 촬영하여 분석하였다 (도 19).
그 결과, 도 20에 나타난 바와 같이, 저용량 소포 처리군(G3)과 고용량 소포 처리군(G4)에서 양성 대조군(G2) 대비 변성된 망막의 면적이 통계적으로 유의하게 감소되었고, 이는 용량 의존적임을 확인하였다.
한편, 마이크로코커스 루테우스 유래 소포의 망막 지도모양 위축증(retinal geographic atrophy) 치료 효과를 평가하기 위해, 토끼의 우측 안구에 산동제(미드리아실 1% 점안액)를 점안한 후, 동물을 마취하고, 안저카메라를 이용하여, 안저를 촬영한 결과를 도 21에 나타내었다.
도 21에 나타낸 바와 같이, 양성 대조군(G2)은 음성 대조군(G1)에 비해 망막의 변성이 현저히 증가되어 있음을 알 수 있고, 저용량 소포 처리군(G3) 및 고용량 소포 처리군(G4)은 망막의 변성이 양성 대조군에 비해 현저히 감소되어 있음을 알 수 있었다.
상기 결과로부터, 본 발명의 마이크로코커스 루테우스 유래 소포는 노화 또는 염증과 관련하여 발생하는 안질환의 발생을 효율적으로 억제함을 알 수 있었다. 특히, 상기 마이크로코커스 루테우스 유래 소포는 산화 스트레스, 미토콘드리아 기능 이상, 리소좀 손상 등에 의해 유도되는 NLRP3 inflammasome 신호를 억제하여 선천면역과 후천면역 기능을 회복시킴을 알 수 있다. 또한, eNOS 신호를 통해 저농도 NO 생성을 유도하여 세포의 항상성을 증가시킨다는 사실을 알 수 있다. 특히, 도 1에 나타낸 바와 같이, 마이크로코커스 루테우스 유래 소포를 경구 투여하였을 때 BBB(Blood-brain barrier)를 통과하여 중추신경계에 분포하여, 시각과 관련된 신경세포의 면역기능 이상에 의한 세포 사멸을 억제함과 동시에 세포의 항상성을 효율적으로 증가시킬 수 있음을 확인하였는바 (도 22), 본 발명의 마이크로코커스 루테우스 유래 소포는 노화 관련 안질환 및 염증성 안질환의 개선, 예방, 또는 치료 용도로서 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
실시예 14. 병원성 나노 입자에 의한 염증질환 마우스 모델에서 마이크로코커스 속 세균 유래 소포의 효과 평가
상기 실시예 6과 같이 병원성 나노 입자에 의한 염증질환 마우스 모델에서 마이크로코커스 속 세균 유래 소포의 효과를 확인한 결과, 마이크로코커스 속 세균 유래 소포를 투여한 그룹에서 용량 의존적으로 천식, 폐렴 등의 호흡기질환; 간염, 간경변, 간암 등의 간질환; 사구체신염, 당뇨병성 신증 등의 신장질환; 및/또는 알츠하이머병, 파킨슨병, 루게릭병 등의 뇌질환 등의 난치성 질환에 치료 효과가 있음을 확인할 수 있었다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
Claims (16)
- 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus) 유래 소포를 유효성분으로 포함하는, 안질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 안질환은 NLRP3 inflammasome(NOD-like receptor pyrin domain-containing protein 3 inflammasome)에 의해 매개되는 안질환인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 안질환은 노화 관련 안질환인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
- 제3항에 있어서,
상기 안질환은 망막 지도모양 위축증(retinal geographic atrophy), 당뇨병성 망막증(diabetic retinopathy), 백내장(cataract), 녹내장(glaucoma) 및 안구건조증(xerophthalmia)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 질환인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 안질환은 염증성 안질환인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
- 제5항에 있어서,
상기 안질환은 결막염(conjunctivitis), 공막염(scleritis), 각막염(keratitis), 홍채염(iritis), 포도막염(uveitis), 맥락망막염(chorioretinitis), 맥락염(choroiditis), 및 망막염(retinitis)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 질환인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 소포는 평균 직경이 10 내지 200 nm인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 소포는 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus)에서 자연적 또는 인공적으로 분비되는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 조성물은 NLRP3 inflammasome(NOD-like receptor pyrin domain-containing protein 3 inflammasome)의 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
- 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus) 유래 소포를 유효성분으로 포함하는, 안질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
- 제10항에 있어서,
상기 안질환은 망막 지도모양 위축증(retinal geographic atrophy), 당뇨병성 망막증(diabetic retinopathy), 백내장(cataract), 녹내장(glaucoma), 안구건조증(xerophthalmia), 결막염(conjunctivitis), 공막염(scleritis), 각막염(keratitis), 홍채염(iritis), 포도막염(uveitis), 맥락망막염(chorioretinitis), 맥락염(choroiditis), 및 망막염(retinitis)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 질환인 것을 특징으로 하는, 식품 조성물.
- 마이크로코커스 루테우스 (Micrococcus luteus) 유래 소포를 유효성분으로 포함하는, 안질환의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물.
- 제12항에 있어서,
상기 안질환은 망막 지도모양 위축증(retinal geographic atrophy), 당뇨병성 망막증(diabetic retinopathy), 백내장(cataract), 녹내장(glaucoma), 안구건조증(xerophthalmia), 결막염(conjunctivitis), 공막염(scleritis), 각막염(keratitis), 홍채염(iritis), 포도막염(uveitis), 맥락망막염(chorioretinitis), 맥락염(choroiditis), 및 망막염(retinitis)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 질환인 것을 특징으로 하는, 의약외품 조성물.
- 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus) 유래 소포를 유효성분으로 포함하는, 안질환 예방 또는 개선용 흡입용 조성물.
- 제14항에 있어서,
상기 안질환은 망막 지도모양 위축증(retinal geographic atrophy), 당뇨병성 망막증(diabetic retinopathy), 백내장(cataract), 녹내장(glaucoma), 안구건조증(xerophthalmia), 결막염(conjunctivitis), 공막염(scleritis), 각막염(keratitis), 홍채염(iritis), 포도막염(uveitis), 맥락망막염(chorioretinitis), 맥락염(choroiditis), 및 망막염(retinitis)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 질환인 것을 특징으로 하는, 흡입용 조성물.
- 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus) 유래 소포를 유효성분으로 포함하는, 안질환 치료 약물전달용 조성물.
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