CN111096972B - 一种预防和/或治疗阿尔茨海默症的药物组合物 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种预防和/或治疗阿尔茨海默症的药物组合物，其重量配比为：木犀草素20份，矢车菊素‑3‑O‑葡萄糖苷25～35份。本发明组合物能明显提高受损神经细胞株PC12的存活率，从不同途径，多靶点多位点的相互作用对阿尔茨海默症产生更显著的效果。经实验证明，组合物中单一药物浓度偏高后，对细胞有毒性，受到药物毒性的限制，而使用低浓度药物后，疗效不明显，本发明组合物通过药物协同作用降低了本身毒性，提高了疗效，具备良好的应用前景。

Description

一种预防和/或治疗阿尔茨海默症的药物组合物

技术领域

本发明具体涉及一种预防和/或治疗阿尔茨海默症的药物组合物。

背景技术

阿尔茨海默病(Alzheimer disease,AD)是一种神经系统病变引发的进行性痴呆。研究发现，阿尔茨海默症占所有痴呆类型的50％-70％。目前的治疗主要以多奈哌齐为代表的胆碱酶抑制剂和以美金刚为代表的受体拮抗剂为主。阿尔茨海默症的特征的病理学表现有：β淀粉样肽(β-amyloid peptide,Aβ)沉积形成的老年斑(senile plaque,SP)，tua蛋白过度磷酸化形成的神经原纤维缠结(neurofibri llary tangles,NFTs)以及中枢胆碱能神经元的大量死亡和丢失。近几年文献报道，AD的症状治疗取得一定的进展，但目前未有一个药物能够完全抑制或者逆转阿尔茨海默症病情的发展，因此对于研发天然，安全，有效抑制或者延缓AD的药物十分迫切。

矢车菊素-3-O-葡萄糖苷(Cyanidin-3-O-glucoside chloride,C3G)作为花色素糖苷的一种其分布广泛。据研究表明，C3G具有抗氧化、清除自由基、预防癌症等作用。据文献报道，C3G具有神经保护作用，其作用机制主要涉及C3G是PPARγ的有效激动剂，而PPARγ在能量代谢中发挥重要的作用，可直接影响线粒体功能和ATP的产生，而且C3G在神经发育及损伤修复可能起着重要作用，对于C3G改善阿尔茨海默症的潜力越来越受到关注。

木犀草素(Luteolin,Lu)归属于黄酮类化合物。根据研究表明，木犀草素主要报道具有抗炎、降低氧化应激，促进肿瘤细胞凋亡的作用。而对于阿尔茨海默症，有文献报道：基于木犀草素结构的氨基醌类化合物作为乙酰胆碱酯酶抑制剂的抑制率低，不适于治疗阿尔茨海默症；也有文献报道，木犀草素能够改善Aβ25–35诱导的SH-SY5Y细胞的凋亡。因此，对于木犀草素对阿尔茨海默症的治疗效果还不确切。

目前也没有将矢车菊素-3-O-葡萄糖苷和木犀草素组合用于治疗阿尔茨海默症的报道。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种预防和/或治疗阿尔茨海默症的药物组合物，它是以矢车菊素-3-O-葡萄糖苷和木犀草素为活性成分，加入药学上可接受的辅料制备而成的制剂。

进一步地，所述木犀草素和矢车菊素-3-O-葡萄糖苷的摩尔比为20：25～35。

更进一步地，所述木犀草素和矢车菊素-3-O-葡萄糖苷的摩尔比为20：25或20：35。

更进一步地，所述木犀草素和矢车菊素-3-O-葡萄糖苷的摩尔比为20：25。

进一步地，所述制剂为口服制剂。

更进一步地，所述口服制剂为颗粒剂、散剂、丸剂或溶液剂。

本发明还提供了一种前述药物组合物的制备方法，它包括如下步骤：

按配比称取矢车菊素-3-O-葡萄糖苷和木犀草素，混匀，加入药学上常用的辅料或辅助性成分，即得。

本发明还提供了一种前述药物组合物在制备预防和/或治疗阿尔茨海默症的药物中的用途。

进一步地，所述药物是提高受损神经细胞存活率的药物。

本发明最后提供了一种预防和/或治疗阿尔茨海默症的联合用药物，它含有用于同时或者分别给药的矢车菊素-3-O-葡萄糖苷和木犀草素，以及药学上可接受的载体。

进一步地，所述所述木犀草素和矢车菊素-3-O-葡萄糖苷的摩尔比为20：25～35。

更进一步地，所述木犀草素和矢车菊素-3-O-葡萄糖苷的摩尔比为20：25～35，优选20：25。

本发明组合物能明显提高受损神经细胞株的存活率，从不同途径，多靶点多位点的相互作用对阿尔茨海默症产生更显著的效果。经实验证明，本发明组合物中单一药物浓度偏高后，对细胞有毒性，受到药物毒性的限制，而使用低浓度药物后，疗效不明显。本发明组合物通过药物协同作用降低了本身毒性，提高了疗效，具备良好的应用前景。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1不同浓度的Aβ25-35作用24h后PC12的细胞存活率

图2不同浓度的Lu对PC12细胞存活率的影响

图3不同浓度的C3G对PC12细胞存活率的影响

图4不同浓度的Lu对Aβ25-35诱导的PC12细胞存活率

图5不同浓度的C3G对Aβ25-35诱导的PC12细胞损伤的细胞存活率

图6Lu,C3G,Lu+C3G对Aβ25-35诱导的PC12细胞损伤的细胞存活率

图7荧光相差显微镜下通过Hoechst 33258检测Lu,C3G,Lu+C3G对PC12细胞凋亡的抑制

图8用荧光相差显微镜观察Lu,C3G,Lu+C3G对PC12细胞形态学

图9用细胞流式仪检测Lu,C3G,Lu+C3G对PC12细胞凋亡的抑制

图10Lu药物组和C3G药物组对Aβ25-35诱导PC12细胞凋亡的抑制定量统计结果

具体实施方式

实施例1 本发明组合物

取木犀草素(LU)20μmol，矢车菊素-3-O-葡萄糖苷(C3G)35μmol，混合均匀，得到LU:C3G＝4:7的组合物。

实施例2 本发明组合物

取木犀草素(LU)20μmol，矢车菊素-3-O-葡萄糖苷(C3G)25μmol，混合均匀，得到LU:C3G＝4:5的组合物。

实施例3 本发明组合物

取木犀草素(LU)20μmol，矢车菊素-3-O-葡萄糖苷(C3G)30μmol混合均匀，得到LU:C3G＝4:6的组合物。

以下通过具体试验例证明本发明的有益效果：

试验例1动物细胞实验

本专利使用研究神经系统公认的细胞株PC12细胞，验证药物活性，该细胞具有神经细胞的功能，结果能作为验证药物疗效的指标。

1实验材料

1.1主要仪器和设备

1.2主要药物和试剂

1.3细胞株、培养基和主要试剂配方

鼠嗜硌瘤细胞株PC12上海科学院上海细胞库

DME:F12＝1：1培养基GE Healthcare Life Science

PBS缓冲液 博士德生物工程

超纯水 自制

青链霉素混合液美国Gibco公司

DMEM培养基 GE Healthcare Life Science

胎牛血清 美国Gibco公司

胰蛋白酶 上海源叶生物科技有限公司

1.3.1 DMEM高糖培养基，DME:F12＝1：1培养基

按照100mL的单位体积配制完全培养基，取无菌的具刻度的玻璃瓶，89mLDMEM高糖培养基(DME:F12＝1：1培养基)+10m灭活的胎牛血清(FBS)+1mL的青链霉素混合液(青霉素的浓度为10000U/mL，链霉素的浓度为10mg/mL)，混合均匀，终浓度为含10％FBS，1％青链霉素混合液(青霉素的浓度为100U/mL，链霉素的浓度为0.1mg/mL)的完全培养基。将完全培养基放置于4℃冰箱保存，现配现用。

1.3.2 PBS溶液

一袋PBS粉末溶解于2000mL的UP水中，用玻璃棒搅拌成澄清的溶液，分装到玻璃瓶灭菌后紫外照射30分钟，放置于4°冻库保存。

1.3.3胰酶

以100mL的单位体积配制，分别称取0.25g的胰酶和0.02g的EDTA于50mL塑料离心管，带入细胞间，加入30mLPBS溶液充分溶解，轻微晃动后，吹打均匀，过滤到一个新的100mL盐水瓶中，补加PBS溶液到总体积100mL，放入4°冻库储存。

1.3.4细胞冻存液

胎牛血清9mL，DMSO1mL，生物安全柜中分装为1mL每管，-20°冻库保存。

1.3.5 Aβ_25-35聚集体

用无菌水将1mgβ淀粉样蛋白，溶解成终浓度1mmol/mL的Aβ_25-35溶液，置于培养箱37°孵育7天，使其形成凝聚态，老化后产生神经毒性，置于-20°冰箱中备用。

1.3.6细胞存活率(MTT)试剂(5mg/mL)

取MTT粉末50mg，加入10mLPBS溶液溶解，充分搅拌后，在小型的超声仪里面超声5分钟完全溶解后，分装至1.5mL的EP管中，-20°冻库储存，现用时4°避光保存。

1.3.7 C3G，Lu药物配制

精密称取C3G药物粉末0.0237g，Lu药物粉末0.0150g，两种药物分别充分溶解于500μL的DMSO中，配制成终浓度为100000μmo/L的药物，用两种药物配成的含药培养基中DMSO浓度低于0.1％。

2、方法

2.1 MTT比色法筛选Aβ_25-35致PC12细胞损伤浓度

按照细胞传代的方法，收集处于对数生长期的PC12细胞细胞沉淀，加入相应的完全培养基，吹打混匀后，吸取50μL细胞悬液用PBS稀释10倍后，经分选型流式细胞仪计数后，用完全培养基调节细胞浓度至1×10⁵/mL，按每孔1x10⁴个细胞接种于96孔板，每孔中加入100μL细胞混悬液，轻轻振摇后，使细胞分布均匀，每组设置4个副孔。孔板边缘加入每孔100μLPBS，于CO₂培养箱(37℃,5％CO₂)培养过夜；待细胞贴壁，细胞均匀铺满瓶底70％左右，弃去原有的培养基，在避光的条件下，加入浓度为1，5，10，20，40和80μM的Aβ_25-35现配的培养基，对照组加入不含Aβ_25-35现配的培养基，每孔加入100μL，于CO₂培养箱孵育24h；24h后，在孔板中避光加入每孔10μL的MTT试剂，约占总液体体积的10％，孔板于振荡器上振荡15S使MTT试剂混匀后，避光放置于CO₂培养箱中孵育4h；孵育结束后取出96孔板，小心吸出上清液，不能吸出甲瓒，于每孔中加入150μL的DMSO溶解底部的紫色甲瓒，置于振荡器上震荡10min观察底部的紫色甲瓒完全溶解后，使用酶标仪在490nm下测OD值。实验重复三次，以正常对照为100％计算各组细胞存活率，数据表示形式为均数±标准差，数据处理采用SPSS，采用单因素方差分析，当P<0.05时差异具有统计学意义。并用GraphPad软件处理数据，绘制细胞生长率柱状图。

2.2 Lu、C3G对PC12神经细胞的毒性作用

收集处于对数生长期的PC12细胞沉淀，加入相应的完全培养基，吹打混匀后，吸取50μL细胞悬液用PBS稀释10倍后，经分选型流式细胞仪计数后，用完全培养基调节细胞浓度至1×10⁵/mL，按每孔1x10⁴个细胞接种于96孔板，每孔中加入100μL细胞混悬液，轻轻振摇后，使细胞分布均匀，每组设置4个副孔。孔板边缘加入每孔100μLPBS，于CO₂培养箱培养过夜；待细胞贴壁，细胞均匀铺满瓶底70％左右，弃去原有的培养基，在避光的条件下，加入相应的不完全培养基。PC12细胞Lu的药物浓度为(0，0.5，2，2.5，3.5，5，10，15，20，25，30，35，40，50和100μM)；PC12细胞C3G的药物浓度为(0，0.5，2，2.5，3.5，5，10，12.5，15，25，35，50和100μM)。每孔加入100μL，于CO₂培养箱孵育24h，按照上述MTT比色法检测药物的效应。

2.3 MTT法检测Lu对Aβ_25-35致PC12神经细胞损伤的保护作用

根据AD模型实验选定Aβ_25-35溶液的浓度，实验选取Aβ_25-35溶液的浓度为25μM处理PC12细胞24小时构建AD模型。收集处于对数生长期的PC12细胞沉淀，加入相应的完全培养基，吹打混匀后，吸取50μL细胞悬液用PBS稀释10倍后，经分选型流式细胞仪计数后，用完全培养基调节细胞浓度至1×10⁵/mL，按每孔1x10⁴个细胞接种于96孔板，每孔中加入100μL细胞混悬液，轻轻振摇后，使细胞分布均匀，每组设置4个副孔。孔板边缘加入每孔100μLPBS，于CO₂培养箱(37℃,5％CO₂)培养过夜；待细胞贴壁，细胞均匀铺满瓶底70％左右，弃去原有的培养基，在避光的条件下，加入相应的不完全培养基。PC12细胞Lu的药物浓度为(0，0.5，2，2.5，3.5，5，15，20，25，50和100μM。每孔加入不完全培养基100μL后，于CO₂培养箱孵育4h后，随后每孔加入相应浓度的Aβ_25-35溶液，PC12细胞Aβ_25-35溶液的浓度为25μM，于CO₂培养箱共同孵育24h后。按照上述MTT比色法检测药物的效应。

2.4 MTT法检测C3G对Aβ_25-35致PC12神经细胞损伤的保护作用

根据AD模型实验选定Aβ_25-35溶液的浓度，实验选取Aβ_25-35溶液的浓度为25μM处理PC12细胞24小时构建AD模型，收集处于对数生长期的PC12细胞沉淀，加入相应的完全培养基，吹打混匀后，吸取50μL细胞悬液用PBS稀释10倍后，经分选型流式细胞仪计数后，用完全培养基调节细胞浓度至1×10⁵/mL，按每孔1x10⁴个细胞接种于96孔板，每孔中加入100μL细胞混悬液，轻轻振摇后，使细胞分布均匀，每组设置4个副孔。孔板边缘加入每孔100μLPBS，于CO₂培养箱(37℃,5％CO₂)培养过夜；待细胞贴壁，细胞均匀铺满瓶底70％左右，弃去原有的培养基，在避光的条件下，加入相应的不完全培养基。PC12细胞C3G的药物浓度为(0，0.5，2，2.5，3.5，5，12.5，25，35，50和100μM)。每孔加入不完全培养基100μL，于CO₂培养箱孵育4h后，随后每孔加入相应浓度的Aβ_25-35溶液，PC12细胞Aβ_25-35溶液的浓度为25μM，于CO₂培养箱共同孵育24h后。按照上述MTT比色法检测药物的效应。

2.5 MTT法检测Lu、C3G联用对Aβ25-35致PC12神经细胞损伤的保护作用

根据AD模型实验选定Aβ_25-35溶液的浓度，实验选取Aβ_25-35溶液的浓度为25μM处理PC12细胞24小时构建AD模型。收集处于对数生长期的PC12细胞沉淀，加入相应的完全培养基，吹打混匀后，吸取50μL细胞悬液用PBS稀释10倍后，经分选型流式细胞仪计数后，用完全培养基调节细胞浓度至1×10⁵/mL，按每孔1x10⁴个细胞接种于96孔板，每孔中加入100μL细胞混悬液，轻轻振摇后，使细胞分布均匀，每组设置4个副孔。孔板边缘加入每孔100μLPBS，于CO₂培养箱(37℃,5％CO₂)培养过夜；待细胞贴壁，细胞均匀铺满瓶底70％左右，弃去原有的培养基，在避光的条件下，加入相应的不完全培养基。PC12细胞Lu和C3G的药物浓度为(0+0，2.5+2.5，5+5，15+12.5，20+25，25+35和30μM+50μM)。每孔加入不完全培养基100μL，于CO₂培养箱孵育4h后，随后每孔加入相应浓度的Aβ_25-35溶液，PC12细胞Aβ_25-35溶液的浓度为25μM，于CO₂培养箱共同孵育24h后。按照上述MTT比色法检测药物的效应。

2.6 Hochest 33258染色检测PC12神经细胞凋亡

根据AD模型实验选定Aβ_25-35溶液的浓度，实验选取Aβ_25-35溶液的浓度为25μM处理PC12细胞24小时构建AD模型。收集处于对数生长期的PC12细胞沉淀，加入相应的完全培养基，吹打混匀后，吸取50μL细胞悬液用PBS稀释10倍后，经分选型流式细胞仪计数后，用完全培养基调节细胞浓度至7×10⁴/mL。先取出6片洁净的盖玻片于70％的乙醇中浸泡5min或者更长时间，在生物安全柜中挥干后，用无菌的PBS或0.9％NaCl等溶液冲刷洗涤2-3遍，再用细胞培养液洗涤1遍，将盖玻片置于六孔板中，然后按每孔7x10⁴个细胞接种于6孔板中，每孔中加入1mL细胞混悬液，轻轻振摇后，于CO₂培养箱培养过夜；待细胞贴壁，细胞均匀铺满盖玻片大约70％左右，弃去原有的培养基，在避光的条件下，加入相应的不完全培养基。PC12细胞分组为(空白组，模型组，Lu药物浓度20μM组，C3G药物浓度25μM组，Lu药物浓度20μM+C3G药物浓度25μM)；每孔加入不完全培养基1mL，于CO₂培养箱避光孵育4h后，随后每孔加入相应浓度的Aβ_25-35溶液，PC12细胞Aβ_25-35溶液的浓度为25μM。先用1-2mLPBS洗涤细胞2次，轻轻晃动洗涤，每次3min；吸尽液体后，加入0.5mL细胞固定液于6孔培养板中，常温条件下固定15分钟之后，用缓冲液PBS洗涤2次，轻轻晃动洗涤，每次3min；吸尽液体后，加入浓度为5mg/L的Hochest33258液0.2mL于6孔培养板中染色15分钟，染色过程中每5min轻轻晃动染液，使染色液尽量在盖玻片上；染色结束后，用缓冲液PBS洗涤3-4次后，用吸管吸尽液体后，用针头弯曲后将盖玻片取出，倒扣于滴有防淬灭剂的载玻片上，从一侧开始覆盖，避免产生大量气泡，于正置荧光显微镜40X下观察细胞内荧光呈现情况。正常细胞为有弥漫均匀的蓝色荧光，凋亡细胞有浓染或碎裂的致密蓝色荧光，细胞核不成形或有凋亡小体。

2.7 Annexin-V/PI染色，流式细胞仪检测PC12神经细胞凋亡

根据AD模型实验选定Aβ_25-35溶液的浓度，实验选取Aβ_25-35溶液的浓度为25μM处理PC12细胞24小时构建AD模型。收集处于对数生长期的PC12细胞沉淀，加入相应的完全培养基，吹打混匀后，吸取50μL细胞悬液用PBS稀释10倍后，经分选型流式细胞仪计数后，用完全培养基调节细胞浓度至7×10⁴/mL。先取出6片洁净的盖玻片于70％的乙醇中浸泡5min或者更长时间，在生物安全柜中挥干后，用无菌的PBS或0.9％NaCl等溶液冲刷洗涤2-3遍，再用细胞培养液洗涤1遍，将盖玻片置于六孔板中，然后按每孔7x10⁴个细胞接种于6孔板中，每孔中加入1mL细胞混悬液，轻轻振摇后，于CO₂培养箱(37℃,5％CO₂)培养过夜；待细胞贴壁，细胞均匀铺满盖玻片大约70％左右，弃去原有的培养基，在避光的条件下，加入相应的不完全培养基。PC12细胞分组为(空白组，模型组，Lu药物浓度20μM组，C3G药物浓度25μM组，Lu药物浓度20μM+C3G药物浓度25μM)；每孔加入不完全培养基1mL，于CO₂培养箱避光孵育4h后，随后每孔加入相应浓度的Aβ_25-35溶液，PC12细胞Aβ_25-35溶液的浓度为25μM，于CO₂培养箱共同孵育24h后，用倒置荧光显微镜拍照后观察细胞形态。开始染色时，吸出细胞6孔板中的不完全培养基于塑料型EP管中，并做好不同分组标记；每孔加入0.5mL含量为0.25％的不含EDTA的胰蛋白酶消化，在显微镜下观察细胞间距变大，细胞形态逐渐变圆，则加入对应EP管中的不完全培养基，终止消化，吹打使细胞悬浮后又将其加入对应的EP管中；将EP管放入小型离心机离心(2500rpm,5min)，离心后取出EP管，除去上清液，加入1mL无血清培养基重悬，吸出100μL到96孔板中，经分选型流式细胞仪计数后，选取含5-10x10⁴的细胞悬液到新的塑料型EP管中，将EP管放入小型离心机离心(2500rpm,5min)，离心后取出EP管，除去上清液；避光每管加入染料(100uLBuffer,1uLPI,2uLFITC)，在室温下染色15min，操作时避光；反应时间结束后，将细胞吸入96孔板中，用流式细胞仪分析细胞状态；流式细胞仪激发波长调节为488nm，发射波长分别为530nm和570nm。

2.8统计学分析

实验结果用

表示，釆用SPSS16.0统计软件及GraphPad软件处理数据，组间均数间的差异采用单因素方差分析。P＜0.05即被认为差异具有统计学意义。

3.结果

3.1 Aβ_25-35诱导PC12神经细胞成功构建AD模型

按照2.1项下所描述的方法，对PC12细胞进行MTT实验，检测细胞的生存率。结果如图1所示，图1表明：随着Aβ25-35溶液浓度的增大，PC12细胞生存率逐渐下降，具有显著地浓度依赖性，(P<0.05，***)证明Aβ25-35溶液成功诱导PC12细胞构建AD模型。其定量检测结果见表1。

表1 不同浓度的Aβ_25-35作用24h后PC12的细胞存活率

如表1所示，当Aβ_25-35溶液浓度为25μmo/L时，细胞存活率为49.49±6.52％，因此PC12细胞的AD模型选定该Aβ_25-35溶液的浓度完成后续实验。

3.2 Lu对PC12神经细胞的毒性作用

根据2.2项下所描述的方法，探究Lu对PC12细胞的毒性作用。结果如图2所示：

图2表明：Lu对PC12细胞具有一定的毒性作用，随药物浓度的增加，PC12细胞各实验组存活率有明显的降低。当Lu的浓度>10μmol/L时，随着药物浓度增大，PC12细胞存活率明显下降，证明Lu高浓度对PC12细胞有毒性，在后续的实验中选择低浓度的Lu给药，最大的药物浓度应≤20μmol/L。

3.3 C3G对PC12神经细胞的毒性作用

根据2.2项下所描述的方法，探究C3G对PC12细胞的毒性作用。结果如图3所示：

图3表明：C3G对PC12细胞的生存率无明显影响。随着药物浓度的增大，各实验组存活率无明显变化，与对照组相比较，各实验组组明显差异(P>0.05)。证明C3G对于PC12细胞有较好的安全性，在后续实验中可选取该范围内不同浓度的C3G进行实验。

3.4 Lu对Aβ25-35诱导的PC12神经细胞损伤的保护作用

根据2.3项下所描述的方法，探究Lu单独使用时对Aβ25-35诱导的PC12细胞损伤的保护作用。结果见图4所示：

图4表明：模型组使用Aβ25-35诱导PC12细胞进行AD造模，相对于对照组，AD模型组的PC12细胞生存率降低至69.12+3.72％，两组具有显著性的差异(P<0.05，***)。实验组使用不同浓度的Lu作用后，相对于Aβ25-35模型组，其细胞生存率有升高的趋势，但不具有显著性差异(P>0.05)，随着浓度的持续增大，细胞存活率开始下降，是由于Lu对PC12细胞的毒性作用大于药物的保护作用，说明Lu低浓度有一定保护作用。

3.5 C3G对Aβ25-35致PC12神经细胞损伤的保护作用

根据2.4项下所描述的方法，探究C3G单独使用时对Aβ25-35诱导的PC12细胞细胞损伤的保护作用。结果见图5所示：

图5表明：模型组使用Aβ25-35诱导PC12细胞进行AD造模，相对于对照组，AD模型组的PC12细胞生存率降低至68.22+2.51％，两组具有显著性的差异(P<0.05，***)。实验组使用不同浓度的C3G作用后，相对于AD模型组，其细胞生存率有显著升高的趋势，具有显著的浓度依赖性。C3G药物分组为12.5μmol/L，25μmol/L，25μmol/L，35μmol/L，50μmol/L和100μmol/L时，与AD模型组相比，具有显著性差异(P<0.01,###)。结果显示C3G对于Aβ25-35诱导的PC12细胞的损伤具有保护作用。

3.6 Lu、C3G联用对Aβ25-35致PC12神经细胞损伤的保护作用

根据2.5项下所描述的方法，探究C3G和Lu联合使用时对Aβ25-35诱导的PC12细胞损伤的保护作用。结果见图6所示：

图6显示：模型组使用Aβ25-35诱导PC12细胞进行AD造模，AD模型组的PC12细胞生存率降低至71.30+1.33％，与对照组相比，具有显著性差异(P<0.01，***)。Lu和C3G联合用药组与Lu药物组，C3G药物组相比，损伤的PC12细胞存活率明显提高，联合用药组Lu+C3G(15μmol/L+12.5μmol/L)、(20μmol/L+25μmol/L)、(25μmol/L+35μmol/L)、(30μmol/L+50μmol/L)，与相应的Lu单用组，C3G单用组相比均具有显著性差异(P<0.01，###)，表明两药具有一定的协同作用。结果显示随药物浓度的增大，保护作用趋于饱和，Lu药物浓度为30μmol/L时，细胞活性有下降趋势，提示Lu毒性作用大于药物联用作用。

3.7 Hochest 33258染色检测凋亡

根据2.6项下所描述的方法，探究Lu与C3G联用组，Lu药物组和C3G药物组对Aβ25-35诱导PC12细胞凋亡的抑制作用，结果如图7所示:

图7显示:正置荧光相差显微镜下，观察到不同实验组细胞核的变化和荧光强度的差异。阴性对照组的细胞核出现规则的圆形或者椭圆形，蓝色荧光分布均匀，细胞核的大小均匀；模型组使用Aβ25-35后，细胞核开始碎裂和皱缩的现象，细胞核形态变大，荧光强度高，细胞核部分呈现出致密的蓝色浓染，表现出明显的凋亡特征；Lu药物组和C3G药物组处理后，细胞核部分呈现出致密的蓝色浓染减少，细胞形态和大小规则，有部分细胞核出现皱缩的现象，明显减轻了细胞凋亡，C3G药物组的效果更加明显；Lu与C3G联用组细胞形态细胞核呈规则的圆形或者椭圆形，蓝色荧光分布较均匀，细胞核的大小均匀，基本减少细胞的凋亡。结果表明Lu与C3G联用组能够明显减少Aβ25-35诱导的PC12细胞的凋亡。

根据2.6项下所描述的方法，探究Lu与C3G联用对PC12细胞的协同作用，结果如图8所示：

图8表示：倒置荧光相差显微镜下，不同浓度的药物对细胞形态学的改变。可以看出，与阴性对照组相比，模型组使用Aβ25-35后，细胞数量明显减少，部分细胞漂浮，细胞壁不规整，失去神经细胞基本形态，变圆、漂浮、解体成细胞碎片；Lu药物组和C3G药物组处理后，细胞形态和大小规则，细胞数量增多，细胞形态得到改善，但Lu组细胞呈现聚集状态；Lu与C3G联用组(20μmol/L+25μmol/L)、(20μmol/L+35μmol/L)细胞数量明显增多，细胞形态恢复正常。结果显示Lu与C3G联用药物对Aβ25-35诱导PC12细胞形态的改善，能够明显增加PC12细胞的数量。

3.8 Annexin-V/PI染色，流式细胞仪检测凋亡

根据2.7项所描述的方法，探究Lu与C3G联用组，Lu药物组和C3G药物组对Aβ25-35诱导PC12细胞凋亡的抑制作用。结果如图9所示，其定量与统计结果见图10。

图9～10表明：第一、二、三、四象限分别表示晚凋细胞，细胞碎片和死细胞、活细胞和早凋细胞，对于PC12细胞，与对照组相比，Aβ25-35组诱导PC12细胞凋亡率达到44.85％，两组有显著性差异(P<0.01，***)，Lu药物组，C3G药物组和Lu联用C3G药物组都显著性的降低了Aβ25-35诱导PC12细胞的凋亡率，Lu联用C3G药物组(20μmol/L+25μmol/L)效果最好，凋亡率为(6.12％)；Lu药物组(20μmol/L)晚凋细胞多，凋亡率为(15.60％)，可能是由于该药物毒性作用；C3G药物组(25μmol/L)显著减少了晚凋细胞和早凋细胞，凋亡率为(8.47％)；Lu联用C3G药物组(5μmol/L+35μmol/L)，降低了Lu药物的浓度，提高了C3G药物的浓度，凋亡率相比最佳联合比例，凋亡率上升为(11.85％)。结果显示，联合运用与单用Lu和C3G相比，并没有显著降低Aβ25-35诱导PC12细胞的凋亡率，但联合运用组抑制凋亡效果最佳。

通过对PC12细胞的保护作用实验发现，细胞对于Lu和C3G联合运用与Lu单用、C3G单用的结果有明显差异：

单用药物在一定程度上受到药物毒性的限制，使得用药浓度偏低后，疗效不明显，C3G的药物保护作用优于Lu，PC12对Lu药物更加敏感，因此毒性更大，影响了药物的疗效；而Lu和C3G联合运用具有更加显著的优势，明显提高了受损的PC12细胞的存活率，这可能是Lu和C3G联合运用更能从不同的途径，多靶点多位点的相互作用于PC12细胞，从而对阿尔茨海默症产生更显著的效果。

综上，基于PC12细胞损伤模型得到的本发明组合物，能明显提高受损神经细胞株的存活率。本发明组合物从不同途径，多靶点多位点的相互作用对阿尔茨海默症产生更显著的效果，降低了药物毒性，提高了疗效，具备良好的应用前景。

Claims (5)

1.一种预防和/或治疗阿尔茨海默症的药物组合物，其特征在于：它是以矢车菊素-3-O-葡萄糖苷和木犀草素为活性成分，加入药学上可接受的辅料制备而成的制剂；所述木犀草素和矢车菊素-3-O-葡萄糖苷的摩尔比为20：25。

2.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于：所述制剂为口服制剂。

3.根据权利要求2所述的药物组合物，其特征在于：所述口服制剂为颗粒剂、散剂、丸剂或溶液剂。

4.权利要求1～3任一项所述药物组合物的制备方法，其特征在于：它包括如下步骤：

按配比称取矢车菊素-3-O-葡萄糖苷和木犀草素，混匀，加入药学上常用的辅料或辅助性成分，即得。

5.权利要求1～3任意一项所述的药物组合物在制备预防和/或治疗阿尔茨海默症的药物中的用途。

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