JP5527900B2 - アスパラチン様ジヒドロカルコン、未発酵ルイボスからの抽出物およびその調製方法 - Google Patents
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Description
−発酵していない生の原料ルイボスを乾燥および粉砕した後、メタノールおよび/または水からなる抽出剤を用いて90℃以下、好ましくは60℃以下の温度で所定の時間抽出し、
−得られた抽出物をろ過した後、減圧下で蒸発乾固させ、次いで
−複数のクロマトグラフ分離ステップ、好ましくは、2本のセファデックスLH20カラムおよび次いで1本の疎水性c18−HPLCカラムを使用した3ステップのクロマトグラフ分離により精製する。
−乾燥および粉砕した、発酵していない生の原料ルイボスの提供
−提供された生の原料の、アルコール、好ましくはメタノールおよび/または水の混合物からなる抽出剤を用いた、90℃以下、好ましくは60℃以下の温度における所定の時間の抽出
−得られた抽出物のろ過
−ろ過した抽出物の減圧下における蒸発
−抽出物の3段階の精製:
−セファデックスLH20カラムクロマトグラフィーによる粗精製
−さらなるセファデックスLH20カラムクロマトグラフィーによる高精製
−疎水性c18−HPLCカラムによる分離
a)式Iの化合物、
b)カルコン(アスパラチンおよびノトファギン)からなる物質群、
c)ルトシド群(成分としてクエルセチン(すなわちルチンのアグリコン)を含有するフラボノイド、C−O−C結合した糖を含むフラボノイドを含む)、ならびに
d)ビテキシン群(C−C結合した糖を含むフラボノイド。たとえば、アグリコンがアピゲニンであるビテキシン(アピゲニン−8−C−グルコシド)、イソビテキシン(アピゲニン−6−C−グルコシド)、オリエンチン(ルテオリン−8−C−グルコシド)、イソオリエンチン(ルテオリン−6−C−グルコシド)等が挙げられる。)
・経口剤形の場合には、
1日用量当たり、好ましくは1〜1000mg、より好ましくは40〜800mg、特に好ましくは150〜500mg、さらに好ましくは300〜600mgのルイボス抽出物。式Iの化合物ならびにその薬学的に許容される塩、誘導体およびエステルの場合、上記の量の1/100〜1/20を使用する。1日量は毎日投与することができ、たとえば1〜3回、好ましくは2回に分けて投与される。また、式Iの化合物を含むルイボス抽出物を1日に1〜10回投与することも想定可能である。
・非経口(たとえば静脈内、皮下、筋肉内)剤形の場合には、
1日用量当たり、好ましくは3〜60mg、特に好ましくは10〜30mgの活性物質。1日量は毎日投与することができ、たとえば1〜3回に分けて、好ましくは単回で投与される。
・直腸に適用する剤形の場合には、
1日用量当たりの該抽出物中、式Iの活性物質は、好ましくは40〜80mg、特に好ましくは60mg。1日量は毎日投与することができ、たとえば1〜3回に分けて、好ましくは単回で投与される。
・皮膚または粘膜に適用する剤形(たとえば液剤、ローション、乳剤、軟膏等)の場合には、
1回当たり、好ましくは40〜80mg、特に好ましくは60mgの活性物質。調製した液剤、ローション、乳剤または軟膏に対する式Iの化合物の含有量は、このような軟膏状薬剤、クリーム状調製物に対する重量で0.05〜20重量%、好ましくは0.2〜1重量%である。1日量は毎日投与することができ、たとえば1〜6回、好ましくは1〜3回に分けて投与される。
薬学的に許容される塩の使用において、その使用量は、当業者に公知の方法で適切な量とする必要がある。
薬種からの抽出物を調製するために、製造業者であるルイボス社(南アフリカ、Clanwilliam)から入手した未発酵の緑のルイボスを使用する。
約50gのブタノール抽出物を、50容量%のメタノールを用いて、セファデックスLH20カラム充填クロマトグラフィー(内径6cm、高さ80cm、2260mlのセファデックスLH20を充填)によって分離する。この目的のために、使用する50gのブタノール抽出物は、400mlの移動相に溶解した後、分離カラムに加える。カラムは、3Lの溶出液が滴下するまで、1.8mL/分の流速で洗浄する。残っている移動相が完全に滴下した後、カラムの内容物を取り出し、これを3Lの100%メタノール中で10分間十分に攪拌(抽出)する。固定相はろ過により除去し、溶出液を乾燥させる。残留物は、使用した植物部位の量の約0.5〜1%となる(=メタノール抽出物)。
約4gのメタノール抽出物を、セファデックスLH20カラム(内径3.5cm、高さ50cm、480mlのセファデックスLH20を充填)を用いて、80容量%のメタノールでクロマトグラフィーによって分離する。この目的のために、使用する4gのブタノール抽出物は、40mlの移動相に溶解した後、分離カラムに加える。2.4mL/minの流速でカラムを操作し、10分毎の分画(=24mlの溶出液)を回収する。目的の物質は、分画48〜65に含まれる。メタノール抽出物が4gの場合、収量は約0.5〜1gとなる。
分離カラム:250×30mm
固定相:Reprosil C18 Aqua 10μm
移動相:35%(v/v)メタノール
流速:1.5mL/分
分画サイズ:10分=15mL
物質Iは、分画51〜52に含まれる。
分画41〜52を合わせ、凍結乾燥する。
4gのメタノール抽出物から約125mgの物質Iが得られる。
クロマトグラフィーによる純度:約97%(HPLC)。
カラムクロマトグラフィーによる分離で得た化合物について、以下に挙げる装置を使用して特性決定を行ったところ、以下に記載する測定値が得られた。
DMSO中の該物質の1H−NMRスペクトルでは、重水を加えた結果、9つのフェノールプロトンおよび5つの脂肪族HOプロトンの交換がシグナル減衰(H/D交換)によって識別できた。さらに、5.5〜8.0ppmというオレフィンの範囲で8つのプロトン、また−CHxOH/−CHxOR基(x=1または2)に典型的なシフト範囲内で9つのプロトンが現れている。2つの脂肪族プロトンが2.7ppm前後において識別可能であり、またさらなる脂肪族のシグナル(3つのプロトン)が−CHxOH/−CHxORのシグナルとオーバーラップしている。シグナルには、二重線になったり、ブロードになったりしているものもある。そのため、個々の積分値は名目上異性体の1つにのみ相当するが、2つの異性体が統合されているものもある。
該物質の13C−NMRスペクトルでは、ほとんどの炭素原子のシグナルが二重線になっている。2つの異性体の比率は使用する溶媒によってわずかに変化する。25〜90ppmの範囲に脂肪族炭素原子の11のシグナルが、またオレフィン炭素原子に典型的な90〜165ppmの範囲には24のシグナル群が現れる。205ppmに見られるさらなるシグナルは溶媒とオーバーラップするが、d6−DMSO中でははっきりと識別できる。このオーバーラップのために、すべての実験をさらに二次元で、d6−DMSO中で実施した。
相関スペクトルで評価できるシグナルはごく少数であるが、これは、相互作用の大部分が3.1〜3.5ppmの範囲で強くオーバーラップすることによる。4.0〜4.4ppmの範囲において、アルキル鎖(H7(2.7ppm)〜H8(3.3ppm))の相関と同様に、シグナル群H2”〜H4”が明確に識別できる。4.7/4.8ppmのH1’からは、3.1〜3.5ppmの範囲において1つの相関のみ識別できる。
第4級炭素原子に隣接するプロトンおよび個々の構造エレメントの結合は、CH長距離相関スペクトル(HMBC)から推定できる。直接相関の帰属により、構造体の帰属の妥当性を確認することもできる。
6.8〜6.4ppmの範囲におけるプロトンのカップリングパターンから、1,3,4位に置換基を有する非常によく似た2つの芳香族系の存在が明確に示唆される。HMBCスペクトルのカップリング、および関与する炭素原子の化学シフト(145/143/131/119/116/115ppm)から、3,4−ジヒドロキシベンジル構造が推定できる。C7に相当する2.7ppm(30ppm)のメチレン基、およびC2”に帰属される4.4ppm(82.5ppm)の−CHOR基が、結合点として識別可能である。C7を有するフラグメントについては、第2のメチレン基(C8:3.26/46.0ppm)を経てケトンC9(205ppm)まで延長できることは明らかである。しかしながら、C9以降、それ以上の相関は検出できない。C2”を含むフラグメントは、さらに別のCHOR基(4.1ppm/71ppm)に結合している。
装置:Micromass Quattro micro API(Waters製);LC−MS
方法:エレクトロスプレーイオン化(ESI)/二次イオン化EI
ESIスペクトルでは、m/z=741[M+H]+の分子ラジカルカチオンおよびm/z=763[M+Na]+のクラスターイオンが現れる。さらに、m/z=453[M−カテキン]+および289[M−カテキン−グリコシド]にフラグメントが現れる。質量740は、該物質に帰属する。
該物質の紫外スペクトルを、HPLCによるクロマトグラフィー精度の試験およびダイオードアレイ検出(DAD)(分離システム1)において記録した。
紫外スペクトルでは、285nmに吸収極大、228nmに肩が見られる。
生理食塩水(対照)および式Iの化合物(3mg/kg体重または6mg/kg体重)を経口投与した後、EEG(脳波記録法)周波数の変化を測定した。
物質の投与プロトコル:各物質は、測定開始(初期値)から45分後に経口投与した。5分後に測定を再開し、少なくともその後5時間にわたって連続分析を行い、60分毎にデータを収集した。試験物質は、用量3mg/kgおよび6mg/kg(式Iの化合物)で投与した。実験系列は、生理食塩水(対照)の投与により開始されたが、これが異常な変化をもたらすことはなかった(図6)。
ルイボスおよびルイボスからの調製物(茶、抽出物、タブレット)中の式1の化合物の含有量を、外部標準法によるHPLC/DADを用いて測定する。分析では、式Iの化合物の物質を外部標準として使用する。評価は、検出波長280nmで実施する。分析溶液中での酸化を防止するために、試料にはアスコルビン酸を添加する。
溶離液:溶離液A:水/ギ酸=100/0.2(v/v)
溶離液B:アセトニトリル/メタノール/水/ギ酸=50/25/25/0.2(v/v/v/v)
注入量:20μL
分析時間:95分
式Iの化合物の保持時間:39.5分
正確に1mgを量り取った式Iの化合物と約20mgのアスコルビン酸とを2mLのメタノールに溶かし、水を加えて20.00mLとした。
必要濃度:式Iの化合物0.05mg/mL、アスコルビン酸1mg/mL
医薬製剤:
分析試料、たとえばタブレットは、パウダーミルで粉砕し、メッシュサイズ250μmのふるいにかける。粉砕した試料約0.5gを、アスコルビン酸約50mgとともに50mLのメスフラスコに正確に量り入れ、40℃のメタノール10mLを加え、40℃の超音波浴中で10分間の抽出を行う。その後、この混合物に標線まで水を加えて激しく振り混ぜ、再度、40℃の超音波浴中で10分間の抽出を行う。冷却後、必要であれば混合物に標線まで水を加え、この溶液を9,300gで5分間の遠心分離にかける。上澄みを0.45μmメンブレンフィルタでろ過し、HPLCユニットオートサンプラー用の琥珀色をした小型ガラスびんに直接注ぐ。
ルイボス抽出物約125mgを、アスコルビン酸約25mgとともに25mLのメスフラスコに量り入れ、約22mLの水を加え、この混合物を激しく振り混ぜる。必要であれば超音波浴中で処理を行い、標線まで水を加える。
ルイボス抽出物約125mgを、アスコルビン酸約25mgとともに25mLのメスフラスコに量り入れ、約2.5mLのメタノールを加え、超音波浴中で10分間の処理を行う。次いで、この混合物に標線まで水を加えて激しく振り混ぜ、再度、超音波浴中で10分間の処理を行う。
標準液および分析溶液については、同一条件下、直接クロマトグラフによる連続分析を行う。基準物質の紫外スペクトルを、分析クロマトグラムにおいて同じ保持時間で検知された物質の紫外スペクトルと比較し、一致が見られた場合、ピークを式Iの化合物と見なし、以下の計算式に従って計算を行う。
含有量[%]=(分析物のピーク面積´分析物希釈液(mL)´標準物質の重量(mg)´100)/(標準物質のピーク面積´標準物質希釈液(mL)´分析物(mg)の重量)
各実施例において、「化合物I」は、式Iで示されるあらゆる化合物、ならびにその薬学的に許容される塩、誘導体およびエステルを示す。
フィルムコーティング錠:
式Iの化合物 50mg
アスコルビン酸 60mg
ソルビトール粉末(Karion instant) 120mg
Aerosil(ヒュームドシリカ) 3mg
タブレット賦形剤K 2.8mg
235.8mg
フィルム:
セラック 3.5mg
エタノール(セラックの溶媒) 97% 約70mg
硬カプセル:
カプセル内容物:
式Iの化合物 20mg
アスコルビン酸 60mg
マルトデキストリン 120mg
Aerosil(ヒュームドシリカ) 2mg
ステアリン酸マグネシウム 1.5mg
フィルムコーティング錠:
抽出物(式Iの化合物を含む)(1%) 150mg
アスコルビン酸 60mg
ソルビトール粉末(Karion instant) 80mg
Aerosil(ヒュームドシリカ) 3mg
ステアリン酸マグネシウム 2.5mg
295.5mg
フィルム:
セラック 4.2mg
エタノール(セラックの溶媒) 97% 約84mg
硬カプセル:
カプセル内容物:
抽出物(式Iの化合物を含む)(1%) 150mg
アスコルビン酸 40mg
マルトデキストリン 20mg
Aerosil(ヒュームドシリカ) 1mg
ステアリン酸マグネシウム 1.5mg
212.5mg
a)抽出
出発物質として、温和な条件下で著しく急速に乾燥したAspalathus linearis(未発酵)の葉および若枝、すなわち残留する水分量をできる限り低くした(<5%)「緑色」のルイボスを使用した。
この抽出物は、20%、30%、または50%のエタノール水溶液といった様々な抽出剤を用いることによって得られた。あるいは、まず純粋なアルコールに薬種を加え、少なくとも30分間の軟化段階の後、相当する分量の水を加えることもできる。
これらの抽出は、式Iの物質と総フラボノイドとをできる限り完全に同時に抽出するため、最適化される。
この抽出物は、総フラボノイド含有量が高い点において、茶飲料(純粋な水抽出)に内用として使用するための現在市販で入手可能な抽出物とは異なっている。また、各フラボノイド群の比率においても、化粧品(エタノール80%)に使用するための外用抽出物とも異なっている。エタノール80%の抽出液は、アスパラチン含有量をできる限り高くするために最適化されたものである。3つのフラボノイド群(アスパラチン様、ルトシド様、およびビテキシン様すなわちC−グリコシド)の比率は、比較的疎水性の高い抽出を行ったことにより、該薬種の出発状態における比率から変化している。これは、ビテキシン様フラボノイドのルトシド様フラボノイドに対する比率を見れば特に明白である。
使用したアスコルビン酸および溶媒は、Roth社(ドイツ、Karlsruhe)から、分析用品質のものを入手した。薬種は、ルイボス社(南アフリカ、Clanwilliam)から入手した。
標準のオリエンチン、ホモオリエンチン、ビテキシンは、たとえばExtrasynthese社(フランス、Genay)やRoth社(ドイツ、Karlsruhe)から市販品を入手できる。
使用したシリンジフィルタは、Roth社(ドイツ、Karlsruhe)の13mm Rotilaboシリンジフィルタ(0.45μm、PVDF)であった。
HPLC測定用には、LC 3D Rev.A.10.02(Agilent Technologies)用ChemStationソフトウェアおよびReprosil−Pur ODS−3カラム、125×3mm、3μm(Dr.Maisch、ドイツ、Ammerbuch)を備え、ダイオードアレイ検出器E−3014を有するHP190シリーズII液体クロマトグラフ装置(Hewlett Packard)を、カラム温度60℃で使用した。
移動相A:水/ギ酸=100/0.2(v/v)および
移動相B:アセトニトリル/メタノール/水/ギ酸=50/25/25/0.2(v/v/v/v)を使用し、以下の条件を選択した。
6.c)1)抽出:20%メタノール抽出物
抽出物0.5gを、アスコルビン酸約50mgとともに50.0mLのメスフラスコに量り入れ、40℃のメタノール10mLを加え、40℃の超音波浴中で10分間の抽出を行う。次いで、この混合物に標線まで水を加えて激しく振り混ぜ、再度、40℃の超音波浴中で10分間の抽出を行う。冷却後、必要であれば溶液に標線まで水を加え、この溶液を9,300gで5分間の遠心分離にかける。
上澄みを1mL取り、シリンジフィルタでろ過して琥珀色のガラスバイアルに入れ、HPLCで測定を行った。
抽出物1(G110907SA)のクロマトグラフにおける物質1の識別は、入手可能な比較スペクトル、紫外比較スペクトル(図12)、およびオンラインの紫外スペクトルにより達成された。
様々な抽出物中の物質1の含有量は、抽出物1(G110907SA)中の既知の含有量(0.95%)を用いて、下記式によって計算した(A−面積,V−容量,m−質量,g−含有量,Ana−分析物,St−標準物質)。
相対面積relAは、以下のように計算する。
物質A群のフラボノイドは、287nmおよび228nmに最大紫外吸収を有することを特徴とする。このスペクトル(図13)と実質的に一致するピークはすべてこの群に含むものとし、その含有量を下記式によって計算した。
標準物質としてルトシドを使用し、補正係数kfは0.4とする。
ルトシド比較スペクトル(図14)に基づいて、この群へのフラボノイドの帰属が行われる。含有量は以下の式により計算される。
ビテキシン比較スペクトル(図15〜17)に基づき、この群へのフラボノイドの帰属が行われる。オリエンチンとホモオリエンチンも、この群に属している。ビテキシン(さらにオリエンチンも)が標準液の調製において溶解度に関する問題を呈したため、ビテキシンの代わりにホモオリエンチンを標準液として使用する。含有量は以下の式により計算される。
分析により得られた結果を、以下の表3にまとめて示す。
本発明による抽出物の場合には、3つのフラボノイド群を出発物質としての薬種中に存在するのと可能な限り同じ比率で(薬種内の自然変動およびバッチ間変動を考慮しつつ)抽出物中に得るために努力がなされた。したがって、この比率は、高品質(低発酵)の緑色のルイボスから得られる通常の茶飲料に匹敵するものである。
(B)抽出の最初から最後まで、記載のアルコール濃度を有するアルコール/水混合物を用いた。
各抽出物中に存在する各フラボノイドが、該薬種と比較して何%、また何倍に相当するかを、括弧内に示した。
式Iの物質および総フラボノイドの含有量がさらに高い抽出物を調製した。
該抽出物は、まず実施例6aの記載通りに調製し、次いで実施例1における純物質を得るための第1のセファデックスステップと同様に、セファデックスカラムを用いてさらに精製した。
式Iの化合物の含有量:>5%
総フラボノイド含有量(アスパラチン類+ルトシド類+ビテキシン類の総量、式Iの化合物は含まない):>35%
ビテキシン類(=C−グリコシド)のルトシド類に対する比:</=1.6
総アスパラチン:>25%
上述の条件下でのおよその保持時間(HPLC、実施例6の含有量の測定参照)は、以下の通りであった:
式Iの化合物:45分
アスパラチン:39分
ルトシド:42分
オリエンチン/ホモオリエンチン:38分
ビテキシン:41.5分
Claims (16)
- 式Iで示される化合物:
- −発酵していない生の原料ルイボスを乾燥および粉砕した後、アルコールおよび/または水からなる抽出剤を用いて60℃以下の温度で所定の時間抽出すること、ならびに
−得られた抽出物をろ過した後、減圧下で蒸発乾固させること
を特徴とし、さらに
前記抽出剤がアルコールと水の混合物の場合には10〜60%(vol/vol)がアルコールであり、残りが水であることを特徴とする方法により調製され、請求項1に記載の式Iの化合物を少なくとも0.4重量%含むルイボス抽出物。 - 式Iの化合物を少なくとも1.0重量%含有することを特徴とする、請求項2に記載のルイボス抽出物。
- 式Iの化合物を少なくとも2重量%含有することを特徴とする、請求項3に記載のルイボス抽出物。
- 総フラボノイド含有量が少なくとも20重量%であることを特徴とする、請求項2〜4のいずれかに記載のルイボス抽出物。
- 請求項2〜5のいずれかに記載のルイボス抽出物を調製する方法であって、
−発酵していない生の原料ルイボスを乾燥および粉砕した後、アルコールおよび/または水からなる抽出剤を用いて60℃以下の温度で所定の時間抽出すること、ならびに
−得られた抽出物をろ過した後、減圧下で蒸発乾固させること
を特徴とし、さらに
前記抽出剤がアルコールと水の混合物の場合には10〜60%(vol/vol)がアルコールであり、残りが水であることを特徴とする方法。 - 請求項1に記載の式Iの化合物を調製する方法であって、
請求項6に記載の方法により調製されたルイボス抽出物を少なくとも1ステップのクロマトグラフ分離に供し、さらに実質的な精製が達成されることを特徴とする方法。 - 前記クロマトグラフ分離ステップがサイズ排除クロマトグラフィーであることを特徴とする、請求項7に記載の方法。
- 請求項1に記載の式Iの化合物を、1g当たり少なくとも1mg含有することを特徴とする補助食品。
- 請求項2〜5に記載のルイボス抽出物を、少なくとも10mg/g含有することを特徴とする補助食品。
- 請求項1に記載の式Iの化合物を、1日用量当たり少なくとも1mg含有するよう調製されていることを特徴とする、請求項9または10に記載の補助食品。
- 請求項1に記載の式Iの化合物を、1日用量当たり少なくとも5mg含有するよう調製されていることを特徴とする、請求項11に記載の補助食品。
- 請求項1に記載の式Iの化合物または請求項2〜5のいずれかに記載のルイボス抽出物を含有することを特徴とする薬剤。
- 請求項1に記載の化合物または請求項2〜5のいずれかに記載のルイボス抽出物の、中枢神経系の神経学的疾患および精神医学的疾患を予防および/または治療するための薬剤を調製するための使用。
- 前記中枢神経系の神経学的疾患および精神医学的疾患が認知症、パーキンソン病、うつ病および疼痛であることを特徴とする、請求項14に記載の使用。
- 前記中枢神経系の疾患がアルツハイマー病または老年性認知症であることを特徴とする、請求項15に記載の使用。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
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