WO2006103939A1 - ネオヘスペリジンの抗酸化作用に基づく美白剤または色素沈着症改善剤 - Google Patents

ネオヘスペリジンの抗酸化作用に基づく美白剤または色素沈着症改善剤 Download PDF

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Hideaki Matsuda
Norimichi Tomohiro
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A Pharma Kindai Co., Ltd.
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Definitions

  • the present invention comprises neohesperidin, which is a flavanone glycoside contained in immature citrus fruits such as Japanese cherry, daidai, and daidaidai as an active ingredient.
  • neohesperidin is a flavanone glycoside contained in immature citrus fruits such as Japanese cherry, daidai, and daidaidai as an active ingredient.
  • It relates to a whitening agent or a pigmentation-improving agent based on wrinkle action.
  • Pigmentation such as blemishes, buckwheat, dark skin, or melanosis of skin caused by drugs is a disease in which melanin is excessively deposited on the skin.
  • This disease is particularly cosmetically unfavorable for women. Therefore, it can improve spots, freckles, darkness, or melanosis of the skin caused by drugs, and can effectively whiten the skin. It has been desired.
  • melanin is widely distributed in the animal and plant kingdoms, its biosynthesis in vertebrates is a cytoplasmic granule melanoma in melanocytes, where tyrosine is acidified by the enzyme 'tyrosinase, and dopa and dopaquinone are It is known that melanin is biosynthesized through complex pathways such as biosynthesis and indolequinone biosynthesis by dopaquinone ultraviolet light auto-oxidation! /
  • Citrus fruits of Citrus and Fortunella plants of the Citrus family are collectively called citrus fruits, and there are many that are edible worldwide.
  • Citrus fruits have been used for medicinal purposes since ancient times, and the 14th revised Japanese Pharmacopoeia includes [Cutrus unshiu of Citrus reticulata or mature fruit peel of Citrus reticulata] 'Crustacea [Rutaceae daidai, Citrus aurantium var. Daidai, Citrus aurantium or Natsumikan Citrus natsudaidai immature fruit as it is or cut in half], orange peel [Rutacea Citrus aurantium or mature fruit skin of Citrus anrantium var. daidai].
  • All of these citrus herbal medicines have a unique aroma and bitterness.
  • the skin is used as an aromatic bitter stomachic medicine, and the fruit seeds are blended in Chinese herbal medicines for the purpose of improving solid and solid stasis and swelling caused by depressive blood.
  • Citrus herbal medicines include limonene as an essential oil component, hesperidin as a flavanone glycoside, neohesperidin, naringin, narirutin, and synephrin as an alkaloid. ) Etc. are included.
  • Citrus herbal medicines (Chen bark, tachibana bark, persimmon, orange peel) have been shown to have an action on the digestive system, such as an anti-allergic action.
  • antiallergic effects rat passive skin anaphylactic reaction can be suppressed by oral administration of Chensuisui extract.
  • Anti-allergic effects have also been studied on the citrus fruit of C. umbilicals, using compound 48/80 as a target for inhibiting histamine release from mast cells, and stronger effects have been observed on immature ones than mature ones (for example, Patent Document 1.)
  • hesperidin is considered a major component (e.g., see Patent Document 2.) 0
  • Furano-nonglycoside components nobiletin, tangelitin, and 3-methoxynobiletin have also been observed to have an inhibitory effect on histamine release from rat abdominal peritoneal mast cells.
  • the water extract of coconut and rice husk and 50% ethanol extract have been reported to inhibit rat passive skin anaphylactic reaction and mouse-induced picryl chloride-induced contact dermatitis.
  • Patent Document 1 JP-A 63-170323
  • Patent Document 2 JP-A-4-295428
  • the whitening effect of hesperidin is based on the inhibition of the enzyme 'tyrosinase and the conversion of dopa to dopa quinone. This is not due to the suppression of the biosynthesis of melanin through a complex route such as synthesis.
  • vitamin C is abundant, but the amount of vitamin C in citrus fruits increases as it ripens as it is less matured.
  • vitamin eg has a very strong acidity, and it has the problems of being inactivated and susceptible to degradation, which is extremely weak against heat and oxidation.
  • the object of the present invention is to provide superior efficacy and broad-spectrum suppression for melanin biosynthesis that is biosynthesized by a complex route and promoted by an oxidation reaction, compared to conventionally known whitening agents. It is to provide a whitening agent or a pigmentation ameliorating agent having a mechanism.
  • neohesperidin which is a flavanone glycoside contained in citrus fruits such as immature chopsticks, Daidai, and Natsudaidai, has an excellent antioxidant action. And the present invention has been completed by finding that it has a whitening effect and an improvement effect on pigmentation.
  • neohesperidin is inert to heat and oxidation and is not susceptible to degradation.
  • the pigmentation in the present invention is a disease in which the melanin pigment is excessively deposited on the skin as described above, and specific examples thereof include skin caused by drugs such as stains, buckwheat, color black, steroids, etc. Can be mentioned.
  • the immature citrus fruit containing neo-hesperidin of the present invention is generally in the process of growth after fruiting of citrus fruit, so that the immature stage of citrus fruit, It means fruits such as Natsudaidai.
  • fruits such as Natsudaidai.
  • the fruit diameter reached about 20 cm, and the lateral diameter after 2 to 3 months passed was about 3.0 cm.
  • immature citrus fruit strength of about 6.5 cm or less S corresponds to this.
  • neo-hesberidine When contained in fruits such as immature blossoms, Daidai, Natsudaidai, etc., neo-hesberidine can also obtain a dry powder of the fruit and extract extract power.
  • neohesperidine contained in the immature chopsticks, Daidai, Natsudaidai and other fruits is preferable to use as a dry powder or as an extracted extract.
  • Concerned Dry powders of immature octopus, daidai, and nattodai fruits can be obtained by general drying methods. In other words, immature blossoms, Daidai, Natsudaidai fruits are directly or after being shredded, and are then shaded or dried in the sun, or dried using a dryer to form a powder.
  • the immature fruit extract such as Japanese cherry, Daidai, Natsudaidai, etc.
  • those extracted using a solvent usually used for extraction of herbal extracts such as water, hot water, ethanol, hydrous ethanol, etc.
  • powder obtained by removing the solvent from the extract by freeze drying, spray drying, distillation under reduced pressure, or a single component obtained by making full use of purification techniques such as column chromatography. Can also be mentioned.
  • Examples of administration methods for neohesperidin which is a flavanone glycoside contained in citrus fruits such as immature octopus, Daidai, and Natsudaidai, include various methods such as oral administration, topical administration, and topical administration. Can do.
  • neohesperidin which is a flavonone glycoside component contained in citrus fruits such as immature hatsaku, daidai, and natsudaidai, varies depending on the administration method, but when administered as an external preparation, An appropriate amount of an external preparation may be applied to the diseased part.
  • neohesperidin contained in citrus fruits such as immature chopsticks, daidai, and natto daidai shows an inhibitory effect on the production of melanin pigments based on an excellent antioxidant action. Therefore, it is suitable for a whitening agent.
  • neo-hesperidin contained in citrus fruits such as chopsticks, daidai, natsudaidai, etc. produces melanin pigment that is a cause of pigmentation such as melanosis due to spots, buckwheat, dark black, or drugs. On the other hand, it exhibits an inhibitory effect based on excellent antioxidant action and is suitable as a pigmentation improving agent.
  • Specimen 2 Ten times the amount of 50% ethanol was added to the powder of the above-mentioned chopped berries and extracted at about 80 ° C for 2 hours. The extract was filtered through filter paper, and the filtrate was concentrated under reduced pressure with an evaporator to distill off ethanol. The concentrated extract was lyophilized to obtain an extract.
  • Neohesperidin was extracted three times with five times the amount of 80% methanol extracted from the dried powder of the cherries collected on July 10th. The extract was filtered through filter paper, and the filtrate was concentrated under reduced pressure using an evaporator. Thereafter, it washed and washed with black mouth form to obtain a large amount of crystals. The obtained crude crystals were recrystallized with hydrous methanol to obtain neohesperidin.
  • Hesperidin, Narillin, and Naringin were sold by Extrasy.
  • Neo hesperidin and hesperidin standard products purchased from SIGMA were used. After adjusting to 1 mg / mL with methanol, adjust to 25, 50, 100, 250, 500 ( ⁇ g / mL) and filter with Ultra Free MC (0.22 ⁇ m) (MILLIPORE). A solution for preparing a calibration curve was obtained. With respect to this, HPLC analysis was performed under the following conditions, and a peak area value calibration curve of the obtained neohesperidin and hesperidin was prepared.
  • Liquid feeding unit Liquid feeding unit: LC lOATvp (manufactured by Shimadzu) Detector; UV—Vis detector SPD— 1 OAVP (manufactured by Shimadzu)
  • Chromatocoder 21 system instrument
  • YMC Pack Pro C18 (150 X 4.6 mm, i. D.) (Manufactured by YMC)
  • Neohesperidin Retention Time 21. 5— 23. lmin
  • Each sample was accurately weighed 500 mg, added with 5% metaphosphoric acid solution and key sand, and ground and extracted. 50m
  • the L volumetric flask was rinsed with a 5% metaphosphoric acid solution to a constant volume, centrifuged at 3000 rpm for 10 minutes, and filtered.
  • the filtrate after extraction was diluted as a measurement solution of vitamin C to 10 ⁇ gZmL, and 10 mL thereof was dispensed into a test tube, and 1 mL of a 5% metaphosphoric acid solution was added. Indophenol solution is added dropwise until 30 seconds have passed and the color does not disappear. 0.5 mL of the solution was added and shaken.
  • the test tube was capped and heated in a 50 ° C.
  • UV Vis detector SPD— 1 OAVP (manufactured by Shimadzu)
  • Chromatocoder 21 (system instrumentation)
  • Tyrosinase activity inhibition test Mason et al. The sample was dissolved in a 1: 9 solution of dimethyl sulfoxide and phosphate buffer (PBS, pH 6.8). Substrate dopa solution adjusted to 0.03% (dissolved in PBS) 0.5 mL of the test solution was added to 0.5 mL and incubated at 25 ° C. for 10 minutes. 0.5 mL of enzyme tyrosinase solution (dissolved in PBS) adjusted to 135 U / mL was added and incubated for 5 minutes. After the reaction, the absorbance at 475 nm was measured (UV—2400PC, Shimadzu).
  • the inhibition rate was determined by the following equation.
  • Inhibition rate (%) (Absorbance of control without addition of sample Absorbance of sample) Z (Absorbance of control without addition of sample) X 100 [0041]
  • SOD-like activity test was in accordance with the method of Oyanagi et al. That is, a mixture of lOmM hydroxylamine and lmg / mL hydroxylamine-0-sulfonic acid in 0.2 mL of buffer solution (65 mM potassium dihydrogen phosphate and 35 mM sodium borate, 0.5 mM EDTA-2 sodium; pH 8.2) 0 lmL, subject 0. ImL and 0.5mL hypoxanthine solution 0.2mL were added and preincubated at 37 ° C for 10 minutes.
  • buffer solution 65 mM potassium dihydrogen phosphate and 35 mM sodium borate, 0.5 mM EDTA-2 sodium; pH 8.2
  • the inhibition rate was determined by the following equation.
  • Inhibition rate (%) (Absorbance of control without addition of sample Absorbance of sample) Z (Absorbance of control without addition of sample) X 100
  • Heartbeat fruit extract 1000 40.3 ⁇ 1.7 67.2
  • OmL once (4000 rpm, 20 minutes, room temperature) [After washing with trowel, 2. OmL soluene 350 ( Packerd) [Dissolved (about 12 hours). When it was difficult to dissolve, it was forcibly dissolved using a soaker. The absorbance of the lysate was measured at 400 nm, and the amount of melanin produced was calculated from the absorbance curve of the standard melanin.
  • Inhibition rate (%) (Absorbance of control without addition of sample Absorbance of sample) Z (Absorbance of control without addition of sample) X 100
  • neohesperidin a flavanone glycoside that is contained in a high content in the early-matured cherries, was also found to inhibit melanin biosynthesis.

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Abstract

従来、知られている美白剤に比べ、複雑な経路で生合成され、かつ酸化反応によって促進されるメラニン生合成に対して優れた効力および幅広い抑制機序を有する美白剤又は色素沈着症改善剤を提供することを目的とする。 その構成は、美白剤が、未熟な柑橘類果実に含まれているネオヘスペリジンを有効成分として含有すること。また、シミ、ソバカス、色黒、又は薬物による皮膚の黒化症等による色素沈着症改善剤が、未熟な柑橘類果実に含まれているネオヘスペリジンを有効成分として含有すること。

Description

明 細 書
ネオヘスペリジンの抗酸化作用に基づく美白剤または色素沈着症改善剤 技術分野
[0001] 本発明はハツサク、ダイダイ、ナツダイダイ等の未成熟な柑橘類果実に含まれて ヽ るフラバノン配糖体であるネオヘスペリジンを有効成分として含有することを特徴とす る当該ネオヘスペリジンの抗酸ィ匕作用に基づく美白剤または色素沈着症改善剤に 関する。
背景技術
[0002] シミ、ソバカス、色黒、又は薬物による皮膚の黒色化症等の色素沈着症は、皮膚に メラニン色素が過剰に沈着した疾患である。
[0003] 本疾患は、特に、女性にとって美容上好ましくなぐしたがって、シミ、ソバカス、色 黒、又は薬物による皮膚の黒色化症等を改善したり、肌を効果的に美白したりするこ とが望まれてきた。
[0004] 前記メラニンは、動植物界に広く分布しているが、脊髄動物におけるその生合成に ついては、メラノサイト中の細胞質顆粒メラノノームで、チロシンが酵素'チロシナーゼ により酸ィ匕されて、ドーパ、ドーパキノンが生合成され、さらにドーパキノン力 紫外線 による自動酸ィ匕によってインドールキノン等が生合成されるといった複雑な経路を経 てメラニンが生合成されることが知られて！/、る。
[0005] 一方、ミカン科植物の Citrus属植物や Fortunella属植物の果実は柑橘類果実と 総称され、世界的に食用とされているものが数多くある。また、柑橘類果実は古来、 薬用に供されるものも多ぐ『第十四改正日本薬局方』には陳皮 [ミカン科 (Rutaceae )のゥンシユウミカン（Citrus unshiu)あるいは Citrus reticulataの成熟した果皮] 、枳実'枳殻 [ミカン科（Rutaceae)のダイダイ Citrus aurantium var. daidai、 Citrus aurantium又はナツミカン Citrus natsudaidaiの未熟果をそのまま或い はそれを半分に横切したもの]、橙皮 [ミカン科（Rutacea)の Citrus aurantium又 はダイダイ Citrus anrantium var. daidaiの成熟した果皮]が収載されている。
[0006] これら柑橘類生薬はいずれも特有の芳香と苦味を有し、中国では、陳皮および橙 皮は芳香性苦味健胃薬として用いられ、枳実は堅く充実したうっ滞、うつ血による腫 脹の改善を目的とした漢方方剤に配合されている。
[0007] 柑橘類生薬には、精油成分としてリモネン (limonene)、フラバノン配糖体としてへ スぺリジン (hesperidin)、ネオヘスペリジン (neohesperidin)、ナリンギン (naringin )、ナリルチン (narirutin)、アルカロイドとしてシネフリン（syneohrin)等が含まれて いる。
[0008] ミカン類生薬 (陳皮、橘皮、枳実、橙皮）には、消化器系に対する作用ゃ抗アレルギ 一作用等が証明されている。抗アレルギー作用に関しては、陳皮水製エキスの経口 投与によりラット受身皮膚アナフィラキシー反応は抑制される。ゥンシユウミカン果実 についてもマスト細胞からの compound 48/80によるヒスタミン遊離抑制作用を指 標に、抗アレルギー作用が検討され、成熟したものよりも未成熟なものにより強い作 用が認められている（たとえば、特許文献 1参照。 ) oまた、抗アレルギー作用につい ては、ヘスペリジンが主要成分と考えられている（たとえば、特許文献 2参照。 )0
[0009] また、フラノくノン配糖体成分のノビレチン、タンゲリチン、 3—メトキシノビレチンにもラ ット腹腔マスト細胞力ものヒスタミン遊離抑制作用が認められている。また、枳実、枳 殻の水抽出エキスや 50%エタノールエキスにはラット受身皮膚アナフィラキシー反応 やマウス塩化ピクリル誘発接触性皮膚炎を抑制する作用が報告されている。また、未 成熟な柑橘類果実に含まれるフラバノン配糖体であるヘスペリジン自身については、 美白効果やシミ、ソバカス等の色素沈着症の改善効果があることが知られている。
[0010] 特許文献 1 :特開昭 63— 170323
特許文献 2：特開平 4— 295428
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0011] ただし、ヘスペリジンの美白作用は、酵素'チロシナーゼを阻害し、ドーパからドーパ キノンへの変換を阻害することに基づくものであり、ドーパキノン力 紫外線による自 動酸ィ匕によってインドールキノン等が生合成されるといった複雑な経路を経てメラ- ンが生合成されることを抑制することによるものではない。
[0012] 一般的に柑橘類果実中には、美白作用のあるビタミン Cが含まれており、柑橘類には ビタミン Cが豊富に含まれていると思われがちだが、柑橘類果実中のビタミン C含量 は未熟な時期のもの程少なぐ完熟するにつれその量は多くなる。また、ビタミン eg 身、大変酸味が強いものであり、かつ、熱や酸化に対して極めて弱ぐ不活性化なら びに分解を受けやす 、と 、う問題点があった。
[0013] そこで本発明の目的は、従来、知られている美白剤に比べ、複雑な経路で生合成 され、かつ酸化反応によって促進されるメラニン生合成に対して優れた効力および幅 広ヽ抑制機序を有する美白剤又は色素沈着症改善剤を提供することである。
課題を解決するための手段
[0014] 本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、未成熟なハツサク、ダイダイ、ナツダイダイ 等の柑橘類果実に含まれているフラバノン配糖体であるネオヘスペリジンが優れた 抗酸化作用を有することを発見し、それに基づく美白効果および色素沈着症の改善 効果を有することを見出し、本発明を完成したものである。
[0015] さらに、ネオヘスペリジンは、熱や酸化に対し強ぐ不活性ィ匕ならびに分解を受けにく いことを発見した。
[0016] 本発明における色素沈着症としては、前述の如ぐメラニン色素が皮膚に過剰に沈 着した疾患であり、その具体例としては、シミ、ソバカス、色黒、ステロイド等の薬物に よる皮膚の黒ィ匕症等を挙げることができる。
[0017] 本発明のネオヘスペリジンを含有する未成熟な柑橘類果実とは、一般に柑橘類果 実の着果後の生長過程にぉ 、て、果皮が黄変する以前の未成熟段階のハツサク、 ダイダイ、ナツダイダイ等の果実を意味するものである。たとえば、実施例で実験材料 に供した和歌山有田郡金屋町産のノ、ッサクにおいては、 5月 20日頃に着果し、その 後 2ヶ月ないし 3ヶ月を経過した横径が約 3. 0 cm以上、約 6. 5 cm以下の未成熟 な柑橘類果実力 Sこれに相当する。また、これらの果実は日本でのみ生産されており、 入手が簡単で費用も安く済むものである。
[0018] 未成熟なハツサク、ダイダイ、ナツダイダイ等の果実に含まれて 、るネオヘスベリジ ンは、その果実の乾燥粉末、抽出エキス力も得られる。
当該未成熟なハツサク、ダイダイ、ナツダイダイ等の果実に含まれているネオへスぺ リジンは乾燥粉末として、又は抽出したエキスとして使用されるのが好適である。当該 未成熟なハツサク、ダイダイ、ナツダイダイ果実の乾燥粉末は、一般の乾燥方法によ つて得られる。すなわち、未成熟なハツサク、ダイダイ、ナツダイダイ果実をそのままあ るいは細切後、日陰あるいは陽干し、あるいは乾燥機を用いて乾燥し、粉末とするも のである。
[0019] 当該未成熟なハツサク、ダイダイ、ナツダイダイ等の果実のエキスにっ ヽては、水、 温湯、エタノール、含水エタノール等の通常生薬エキスの抽出に使用される溶媒を 用いて抽出したものや、又、その抽出液から前記溶媒を凍結乾燥、噴霧乾燥、減圧 留去等の方法で除去することにより得られる粉末や、さらにはカラムクロマト等の精製 技術を駆使して得た単独の成分をも挙げることができる。
[0020] 当該未成熟なハツサク、ダイダイ、ナツダイダイ等の柑橘類果実に含まれるフラバノ ン配糖体であるネオヘスペリジンの投与方法としては、経口投与、局所投与、外用投 与等種々の方法を挙げることができる。
[0021] これらの製剤は、当該未成熟なハツサク、ダイダイ、ナツダイダイ等の柑橘類果実に 含まれるフラバノン配糖体であるネオヘスペリジンに、製剤学的に受容可能な添加剤 、賦形剤等を混合し、公知の製剤技術を用いて製造することができる。
[0022] 当該未成熟なハツサク、ダイダイ、ナツダイダイ等の柑橘類果実に含まれるフラバノ ン配糖体成分であるネオヘスペリジンの投与量は、投与方法により異なるが、外用剤 として投与する場合には、皮膚疾患部に外用剤を適当量塗布すればよい。
発明の効果
[0023] 本発明における、未成熟なハツサク、ダイダイ、ナツダイダイ等の柑橘類果実に含ま れるネオヘスペリジンは、メラニン色素の産生に対して、優れた抗酸化作用に基づく 抑制効果を示す。したがって、美白剤に好適である。
[0024] 本発明における、ハツサク、ダイダイ、ナツダイダイ等の柑橘類果実に含まれるネオ ヘスペリジンは、シミ、ソバカス、色黒、又は薬物による黒化症等の色素沈着症の原 因であるメラニン色素の産生に対して、優れた抗酸化作用に基づく抑制効果を示し、 色素沈着改善剤として好適である。
実施例
[0025] 以下、ハツサク、ダイダイ、ナツダイダイ等の柑橘類果実のうち、ノ、ッサクの検体例、 実験例を挙げて、本発明を説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
[0026] 検体 1 ; 2004年 7月 10日、 8月 8日、 9月 8日、 10月 8日に和歌山県有田郡金屋町 内で栽培されているハツサク果実を採取、細切後乾燥し、粉砕、粉末とした。
[0027] 検体 2 ;上記に示したハツサク果実の粉末に 10倍量の 50%エタノールをカ卩え、約 8 0°Cで 2時間抽出した。抽出液をろ紙ろ過し、そのろ液をエバポレーターで減圧下濃 縮しエタノールを留去した。濃縮した抽出液を凍結乾燥し、エキスとした。ネオへスぺ リジンは 7月 10日に採取したハツサク果実の乾燥粉末を 5倍量の 80%メタノールで 3 回熱時抽出した。抽出液をろ紙ろ過し、そのろ液をエバポレーターで減圧下濃縮し た。その後、クロ口ホルムで洗浄放置したところ、多量の結晶を得た。得られた粗結晶 を含水メタノールで再結晶し、ネオヘスペリジンを得た。その他、ヘスペリジン、ナリル チン、ナリンギンは巿販（Extrasythese)のものを用いた。
[0028] 実験例 1
ノ、ッサク果実中のネオヘスペリジン及びヘスペリジン含量の季節的推移 (試験方法）
各検体を 500 mg精秤した。 lOOmLのメタノールで 30分、 3回還流抽出した（水 浴 80°C)。抽出液をろ紙ろ過し、そのろ液をエバポレーターで濃縮した。濃縮した抽 出液をメタノールで 50 mLにメスアップ後、メタノールで 10倍に希釈した。希釈液を ウルトラフリー MC (0. 22 m) (MILLIPORE)にてろ過した後、下記の方法で HPL C分析を行った。
[0029] [HPLC分析条件]
1)検量線の作成；ネオヘスペリジン及びヘスペリジンの標準品は SIGMA社より購 入したものを使用した。メタノールにて 1 mg/mLに調製後、 25、 50、 100、 250、 5 00 ( μ g/mL)に調製し、ウルトラフリー MC (0. 22 μ m) (MILLIPORE)にてろ過 したものを検量線作成用の溶液とした。これについて、下記の条件により、 HPLC分 析を行 、、得られたネオヘスペリジン及びヘスペリジンのピーク面積値力 検量線を 作成した。
[0030] 2) HPLCの分析条件
装置 ；送液ユニット： LC lOATvp (Shimadzu製） 検出器； UV— Vis検出器 SPD— 1 OAVP (Shimadzu製）
カラム恒温槽； U— 620 (Sugai製）
記録およびデータ解析； Chromatocoder 21 (システムインスノレメンッ) カラム； YMC— Pack Pro C18 (150 X 4. 6mm、 i. d. ) (YMC製）
ガードカラム； C— KGC - 324ASC- 3 (YMC製）
移動相； acetonitrile/10 mM H PO (20 : 80 (v/v) )
3 4
流速； 0. 5mL/ min
温度； 37°C
検出波長； 280nm
注入量；
ネオヘスペリジンの Retention Time ; 21. 5— 23. lmin
ヘスペリジンの Retention Time ; 17. 1— 19. 5min
[0031] 結果を下記表 1に示す。
表 1
Figure imgf000007_0001
[0032] 表 1に示したように、 7月 10日に採取した未成熟なハツサク果実には高含量にネオ ヘスペリジンが含まれ、 8月 8日に採取されたものも高い含量を示した力 9月 8日採 取分では急激に低下し、 10月 8日ではさらに低下した。さらに、ヘスペリジンの量は ネオヘスペリジンの量と比較し非常に少なかった。
[0033] 実験例 2
ノ、ッサク果実中の総ビタミン C含量の季節的推移
(試験方法）
各検体を 500 mg精秤し、 5%メタリン酸溶液とケィ砂を加え、摩砕抽出した。 50m Lのメスフラスコに 5%メタリン酸溶液で洗いこみ、定容とした後、 3000rpm、 10分間 遠心分離し、ろ過した。抽出後のろ液をビタミン Cの測定溶液として 10 μ gZmLと なるように希釈して、その 10 mLを試験管に分注し、 5%メタリン酸溶液 lmLをカロえ た。インドフエノール溶液を 30秒間経過しても色が消失しなくなるまで滴下し、 2%チ ォ尿素'メタリン酸溶液 2mLをカ卩え、最後に 2% 2, 4ージニトロフエ-ルヒドラジン · 4 . 5molZL硫酸溶液 0. 5mLをカ卩え、振り混ぜた。試験管に栓をし、 50°Cの温浴中 で 1. 5時間加温し、ォサゾンを生成させた後、水冷して室温に戻した。酢酸ェチル 2 . OmLを加えて 1時間振とうし、生成したォサゾンを酢酸ェチル層に転用させた。静 置後、下層を除き、無水硫酸ナトリウムで酢酸ェチルを脱水し、試験溶液とし、下記 の方法で HPLC分析を行った。
[0034] [HPLC分析条件]
1)検量線の作成;ビタミン C (ァスコルビン酸)の標準品は WAKO社より購入したも のを使用した。 50/0メタリン酸【こて 1 mg/mUこ調製後、 25、 50、 100、 250、 500 ( μ g/mL)に調製し、ウルトラフリー MC (0. 22 μ m) (MILLIPORE)にてろ過した ものを検量線作成用の溶液とした。これについて、下記の条件により、 HPLC分析を 行 、、得られたァスコルビン酸のピーク面積値力 検量線を作成した。
[0035] 2) HPLCの分析条件
装置 ；送液ユニット： LC lOATvp (Shimadzu製）
検出器； UV— Vis検出器 SPD— 1 OAVP (Shimadzu製）
カラム恒温槽； U— 620 (Sugai製）
記録およびデータ解析； Chromatocoder 21 (システムインスノレメンッ）
カラム； Silica— 2150— N (150 X 4. 6mm、 i. d. ) (センシユー製）
移動相；酢酸ェチル Zへキサン Z酢酸（5 :4 : 1 (v/v) )
流速； 1. 5mL/ mm
温度； 40°C
検出波長; 495nm
注入量；
[0036] 結果を下記表 2に示す。 表 2
Figure imgf000009_0001
[0037] 表 2に示したように、 7月 10日および 8月 8日に採取した未成熟なハツサク果実には ビタミン C含量は低ぐ 9月 8日および 10月 8日に採取した成熟してきたハツサク果実 のビタミン C含量は高かった。
[0038] 実験例 3
チロシナーゼ活性抑制試験； Masonらの方法に従った。被検体をディメチル スル フオキサイド（dimethyl sulfoxide)、リン酸緩衝液（PBS、 pH 6. 8)の 1： 9溶液に溶解 した。 0. 03%に調整した基質ドーパ溶液 (PBSに溶解) 0. 5mLに被検液 0. 5mLを 加え、 25°C、 10分間インキュベートした。 135U/mLに調整した酵素チロシナーゼ 液 (PBSに溶解）を 0. 5mLカ卩え、 5分間インキュベートした.反応後 475nmにおける 吸光度を測定（UV— 2400PC、 Shimadzu)した。
[0039] 結果を下記表 3および表 4に示す。
[0040] 抑制率は、次式により求めた。
抑制率 (％) = (検体無添加である対照の吸光度 被検体の吸光度) Z (検体無添 加である対照の吸光度） X 100 [0041]
Figure imgf000010_0001
[0042] 表 3に示したように、 9月 8日、 10月 8日に採取したハツサク果実よりも 7月 10日、 8 月 8日に採取された未成熟なハツサク果実のエキスの方がチロシナーゼ活性を抑制 する作用が強力 た。また、ネオヘスペリジン含量の低下する 9月、 10月に採取した 果実では、その活性は認められなかった。
[謝 3] 表 4
Figure imgf000010_0002
[0044] 表 4に示したように、未熟な時期のハツサク果実に高含量に含まれるフラバノン配糖 体のネオヘスペリジンにチロシナーゼ活性を抑制する作用が認められた。 [0045] 実験例 4
SOD様作用試験； SOD様活性試験は Oyanagiらの方法に準じた。すなわち、緩衝 液（65 mMリン酸 2水素カリウムおよび 35mMホウ酸ナトリウム、 0.5mM EDTA— 2ナトリウム； pH 8.2)0.2mLに lOmMヒドロキシルァミンと lmg/mLヒドロキシル ァミン -0-スルホン酸の混合液 0. lmL、被検体 0. ImLおよび 0.5mMヒポキサンチ ン溶液 0.2mLを加え、 37°C、 10分間プレインキュペートした。この混合液に 5mUZ mLキサンチン酸ィ匕酵素液 0.2mLを添加し、 37°C、 30分間反応させた。その反応 液に発色液（30 M N-1-ナフチル 'エチレン'ジァミン · 2塩酸、および 3mMスルフ ァニル酸、 25%酢酸の混合液） 2. OmLをカ卩え、 30分間室温放置し発色させた。吸 光波長 550nmで吸光度を測定した。
[0046] その結果を表 5および表 6に示した。
[0047] 抑制率は、次式により求めた。
抑制率 (％) = (検体無添加である対照の吸光度 被検体の吸光度) Z (検体無添 加である対照の吸光度） X 100
[0048]
翻本名 最終濃度 吸) feSxiooo 抑制率 (%)
(^ug (550
対照 一 123.0±0.6 一 ハツサク果実エキス 500 62.8±0.6** 48.9
(7月 10日採取）
ハツサク果実エキス 1000 40.3±1.7 67.2
(7月 10曰採取）
ハツサク果 ¾ ^キス 500 75.2 ±0.4* 38.8
(8月 8曰採取）
ハツサク果実エキス 1000 48.6±1.0ネ * 60.4
(8月 8曰採取）
ハツサク果実エキス 500 87.8±0.4ネ氺 28.7
(9月 8曰採取）
ハツサク果 ¾ ^キス 1000 56.4±0.6** 54.2
(9月 8日翻
ハツサク果 ¾ ^キス 500 99.3±0.6氺* 19.3
(10月 8日採取）
ハツサク果^キス 1000 69.3±0.4** 43.7
(10月 8日採取）
対照；検体無 口群。 （有意差検定 * Pく 0. 05 (対照との比較)、 ** P く 0. 01 (対照との比較)） [0049] 表 5に示したように、 7月から 8月に採取された未成熟なハツサク果実に強い SOD 様作用が認められた。
[0050] 表6
Figure imgf000012_0001
[0051] 表 6に示したように、未成熟な時期のハツサク果実に高含量に含まれるフラバノン配 糖体のネオヘスペリジンにも強い SOD様作用が認められた。他の柑橘類に含まれて いるフラバノン配糖体のヘスペリジン、ナリルチン、ナリンギンにも SOD様作用が認め られたが、その作用はネオヘスペリジンよりも極めて弱かった。
[0052] 実験例 5
自動酸ィ匕によるメラニン産生抑制試験 ;0. 03%に調整した基質ドーパ溶液 (リン酸 緩衝液に溶解） 0. 5mLを 25°C、 10分間インキュベートし、 135U/mLに調整した 酵素チロシナーゼ液 (リン酸緩衝液に溶解)を 0. 5mL加えた。 5分間インキュベート した後、被検液 0. 5mLを加え、さらに 45分間インキュベートした。次に、 1N塩酸 0. 2mLで反応を停止させ、室温で 3000rpm、 15分間の遠心分離にて沈查を得た。こ の沈查を、さらに 6N塩酸 1. OmLで 1回、蒸留水 2. OmLで 1回の遠心分離（4000 rpm、 20分、室温）【こて洗净後、 2. OmLの soluene 350 (Packerd)【こ溶解（約 12 時間）し、溶解し難いときはソ-ケ一ターを用いて強制溶解させた。溶解液の吸光度 400nmで測定し、標準品メラニンの吸光度曲線から生成メラニン量を算出した。
[0053] その結果を表 7および表 8に示した。
[0054] 抑制率は、次式により求めた。 抑制率 (％) = (検体無添加である対照の吸光度 被検体の吸光度) Z (検体無添 加である対照の吸光度） X 100
[0055] 表 7
Figure imgf000013_0001
[0056] 表 7に示したように、 7月 10日の未成熟な時期に採取されたハツサク果実エキスにド 一パクロム力 メラニンへの生合成を抑制する作用が認められた。
[0057]
表 8
Figure imgf000013_0002
[0058] 表 8に示したように、未成熟な時期のハツサク果実に高含量に含まれるフラバノン配 糖体のネオヘスペリジンにも同様にメラニンの生合成を抑制する作用が認められた。

Claims

請求の範囲
[1] 未熟な柑橘類果実に含まれて 、るネオヘスペリジンを有効成分として含有すること を特徴とする当該ネオヘスペリジンの抗酸化作用に基づく美白剤。
[2] 未成熟な柑橘類果実に含まれて!/、るネオヘスペリジンを有効成分として含有するこ とを特徴とする当該ネオヘスペリジンの抗酸ィ匕作用に基づく色素沈着症改善剤。
[3] 前記改善すべき色素沈着症がシミ、ソバカス、色黒、又は薬物による皮膚の黒化症 であることを特徴とする請求項 2記載の色素沈着症改善剤。
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