CN115645426B - 酪氨酸酶抑制剂及其在制备治疗黑色素瘤药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医药领域，具体涉及酪氨酸酶抑制剂及其在制备治疗黑色素瘤药物中的应用。本发明提供的酪氨酸酶抑制剂包括新橙皮苷、橙皮素‑7‑O‑葡萄糖苷、橙皮素中的至少一种，具有与曲酸相当的抑制活性，且相较于曲酸具有更低的生物毒性，有效克服现有酪氨酸酶抑制剂的毒副作用，本发明酪氨酸酶抑制剂作为黑色素瘤的治疗药物，有效抑制黑色素瘤的发生及进展。
Description
技术领域
本发明属于医药领域，具体涉及酪氨酸酶抑制剂及其在制备治疗黑色素瘤药物中的应用。
背景技术
黑色素瘤是一种恶性肿瘤，来源于黑色素细胞，常常出现在皮肤、眼睛。它主要发生在成年人中，由于紫外照射过度使得黑色素沉积过量，遗传以及某些外伤刺激黑痣恶变等导致黑色素瘤的形成。目前对于黑色素瘤的治疗方式主要包括：①细胞毒性药物治疗，比如多西紫杉醇可以破坏肿瘤细胞有丝分裂，抑制黑色素瘤细胞增殖；②靶向药物治疗，索拉非尼(SRF)是一种多靶点酪氨酸激酶抑制剂，他能抑制血小板衍生生长因子受体(PDGFR)，血管内皮生长因子受体(VEGFR)，p38和C-Kit，是目前广泛研究的一种治疗黑色素瘤的抑制剂；③免疫治疗，相关药物可以通过增强T细胞对黑色素瘤细胞的识别作用，从而抑制黑色素瘤细胞增殖。
临床上多数恶性黑色素瘤患者多表现为黑色素沉着，这主要是黑色素细胞中的黑色素过表达导致，而合成黑色素的关键性酶是酪氨酸酶。酪氨酸酶对酪氨酸和其它酚类化合物的代谢以及黑色素的合成起催化作用，主要包含三个过程：酪氨酸酶催化L-酪氨酸，使其羟基化转变为L-多巴；并氧化L-多巴形成L-多巴醌；L-多巴醌在人体皮肤组织经一系列反应后，形成黑色素，从而导致各种雀斑、黑色素瘤等皮肤病，因此，抑制酪氨酸酶的活性对于抑制黑色素瘤的形成至关重要。
目前常用曲酸作为酪氨酸酶抑制剂，通过降低酪氨酸酶催化活性而抑制黑色素合成，药效良好，但伴随着皮肤癌等毒副作用。因此开发副作用小的酪氨酸酶抑制剂对于黑色素瘤的治疗具有重要意义。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明旨在提供酪氨酸酶抑制剂及其在制备治疗黑色素瘤药物中的应用。本发明提供的酪氨酸酶抑制剂能够有效抑制酪氨酸酶活性，且较现有酪氨酸酶抑制剂具有更低的生物毒性。
基于上述目的，本发明采用的技术方案如下：
第一方面，本发明提供一种酪氨酸酶抑制剂，所述酪氨酸酶抑制剂包括新橙皮苷、橙皮素-7-O-葡萄糖苷、橙皮素中的至少一种。
本发明首次证实新橙皮苷、橙皮素-7-O-葡萄糖苷、橙皮素对酪氨酸酶具有良好的抑制活性，且生物毒性低。
优选地，酪氨酸酶抑制剂由橙皮素和新橙皮苷组成，酪氨酸酶抑制剂中橙皮素与新橙皮苷的摩尔比为(1～6):1。
优选地，酪氨酸酶抑制剂中橙皮素与新橙皮苷的摩尔比为3:1。
优选地，橙皮素和新橙皮苷的总摩尔浓度为16μM。
经试验发现，当橙皮素和新橙皮苷的总摩尔浓度为16μM，且两者的摩尔比为(1～6):1时表现出协同抑制酪氨酸酶活性的效果，尤其是当两者摩尔比为3:1时，协同效果最佳。
优选地，酪氨酸酶抑制剂由橙皮素和橙皮素-7-O-葡萄糖苷组成，橙皮素与橙皮素-7-O-葡萄糖苷的摩尔比为(2～9):1。
优选地，橙皮素与橙皮素-7-O-葡萄糖苷的摩尔比为(3～9):1。
优选地，橙皮素和橙皮素-7-O-葡萄糖苷的总摩尔浓度为8μM。
经试验发现，当橙皮素和橙皮素-7-O-葡萄糖苷的总摩尔浓度为8μM，且两者的摩尔比为(2～9):1时表现出协同抑制酪氨酸酶活性的效果，尤其是当两者摩尔比为(3～9):1时，协同效果最佳。
第二方面，本发明提供上述酪氨酸酶抑制剂在制备治疗黑色素瘤药物中的应用。
第三方面，本发明提供一种用于治疗黑色素瘤的药物，所述药物中含有上述酪氨酸酶抑制剂。
与现有技术相比，本发明有益效果如下：
本发明提供的酪氨酸酶抑制剂具有与曲酸相当的抑制活性，且相较于曲酸具有更低的生物毒性，有效克服现有酪氨酸酶抑制剂的毒副作用，本发明酪氨酸酶抑制剂作为黑色素瘤的治疗药物，有效抑制黑色素瘤的发生及进展。
附图说明
图1为不同浓度的新橙皮苷对RAW264.7细胞抑制效果；
图2为不同浓度的橙皮素-7-O-葡萄糖苷对RAW264.7细胞抑制效果；
图3为不同浓度的橙皮素对RAW264.7细胞抑制效果；
图4为曲酸、橙皮素、新橙皮苷、橙皮素-7-O-葡萄糖苷对酪氨酸酶的抑制率；
图5为曲酸、橙皮素(A)、新橙皮苷(B)、橙皮素-7-O-葡萄糖苷(C)以及后三者不同组合对酪氨酸酶的抑制率曲线。
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。本领域技术人员应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例中所用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
本实施例通过新橙皮苷、橙皮素-7-O-葡萄糖苷、橙皮素对RAW264.7细胞株增殖的抑制作用试验，分析其生物毒性，具体实验方法如下。
取处于对数生长期的RAW264.7细胞株，按5000个/孔的密度接种于96孔板，分别设置空白组，新橙皮苷、橙皮素-7-O-葡萄糖苷、橙皮素作用24小时后，每孔加入10μL MTT，4小时后测不同实验组RAW264.7细胞的增殖情况。其中，新橙皮苷由文献(He Y,Zhu S,Wu C,LuY,Tang Q.Bioactivity-Guided Separation of Potential D2 Dopamine ReceptorAntagonists from Aurantii Fructus based on Molecular Docking Combined withHigh-Speed Counter-Current Chromatography.Molecules.2018Nov 29；23(12))中记载的方法分离纯化得到；橙皮素-7-O-葡萄糖苷由文献(Céliz G,Rodriguez J,Soria F,etal.Synthesis of hesperetin7-O-glucoside from flavonoids extracted from Citruswaste using both free and immobilizedα-l-rhamnosidases[J].Biocatalysis andAgricultural Biotechnology,2015,4(3):335-341)中记载的方法分离纯化得到；橙皮素由文献(Sammani MS,Clavijo S,Portugal L,Suárez R,Seddik H,CerdàV.Use ofmultiresponse statistical techniques to optimize the separation of diosmin,hesperidin,diosmetin and hesperitin in different pharmaceutical preparationsby high performance liquid chromatography with UV-DAD.Talanta.2017May 15；167:695-702)中记载的方法分离纯化得到。
结果如图1～3所示，如图可知新橙皮苷、橙皮素-7-O-葡萄糖苷、橙皮素不会对RAW264.7细胞的生长产生抑制作用。
实施例2
本实施例分析新橙皮苷、橙皮素-7-O-葡萄糖苷、橙皮素对酪氨酸酶活性的影响，具体方法及结果如下。
2.1、为了避免假阳性、假阴性现象的出现，经过多次预实验，当10min内的△OD(Optical density；光密度)为0.2时，酪氨酸酶的酶活与△OD之间呈现出较好的相关性，此时对应的酪氨酸酶的酶活浓度为测试样品抑制率、以及测试酶抑制机制的最佳测试酶浓度。在测试中，发现选择酶活初浓度为0.85kU/mL(终浓度为21U/mL)最适宜。
其中，酶活力在本实验中是指每分钟在37℃，pH＝6.81±0.01的溶液条件下反应生成1mol多巴醌所需的酶摩尔量；单位是U(1000倍酶活力的单位为kU)。抑制剂活力是指在37℃，pH＝6.81±0.01的溶液条件下，使1个单位的酶完全失活所需的抑制剂的量。
2.2、样品组及其阴性对照组
在冰浴条件下，每孔先后加入85μL的pH＝6.81±0.01的PBS溶液，然后加10μL的酪氨酸酶液，再加入5μL不同浓度的样品溶液，如图4所示，阴性对照组只加相应体积的DMSO。每个样品测试3个复孔，相对标准偏差＞10％的样品浓度需重新测试。
结果如图4所示，本发明所述新橙皮苷、橙皮素-7-O-葡萄糖苷、橙皮素在4μM～64μM浓度范围内具有较为明显的浓度依赖性。与曲酸(IC50＝20.90±3.12μM)相比，本发明的三种橙苷类化合物对酪氨酸酶的抑制活性超过曲酸，而且实施例1的细胞试验已证实上述三种精油无细胞毒性，另外目前尚无天然提取的橙苷类化合物引发人体明显的不良反应的报道，因此，本发明提供的三种橙苷类化合物相对于现有酪氨酸酶抑制剂曲酸具有更优的酪氨酸酶抑制活性，且对人体更安全。
实施例3
本实施例目的在于分析新橙皮苷、橙皮素-7-O-葡萄糖苷、橙皮素复配对络氨酸酶活性的影响，实验原理和方法如下：
3.1实验原理
本发明利用CI指数(Combination index)、Dm值对药物联合作用进行量化描述，其中，CI指数公式如下：
其中，Dna，Dnb分别为在抑制率n％的情况下a-b组合中所需的单药a和单药b的剂量(或浓度)；Dn，Dn’分别指在同一抑制率n％的情况下单药a，b各自所需的剂量(浓度)。
根据下表的自定义对实验测得的CI指数进行联合作用定性：
表1
| CI | Effect | Addv. | Translation |
| ＜0.3 | Very strong synergism | VSA | 强协同 |
| 0.3-0.7 | Synergism | S | 协同 |
| 0.7-0.85 | Moderate synergism | MS | 中协同 |
| 0.85-0.9 | Slight synergism | SS | 微协同 |
| 0.9-1.1 | Nearly addition | NA | 相加 |
| 1.1-1.2 | Slight antagonism | SA | 微拮抗 |
| 1.2-1.45 | Moderate antagonism | MA | 中拮抗 |
| 1.45-3.3 | Antagonism | A | 拮抗 |
| ＞3.3 | Very strong antagonism | VSA | 强拮抗 |
备注：该列“Addv.”为“Effect”一列各自对应的单词首字母，第六章下文所示的“Effect”均以此表示。
另外，存在公式：Fa＝1-Fu。由于每个组合的固定比例只存在一个Dm值，因此，可以lg D为横坐标，lg(Fa/Fu)为纵坐标，拟合线性方程，理论上这些方程对应的直线交于一点。“Dm”表示联合用药后的IC50值，其中，IC50指的是半数有效抑制浓度。
3.2参照实施例2方法测定新橙皮苷、橙皮素-7-O-葡萄糖苷、橙皮素复配比例的酪氨酸酶抑制活性，其中，橙皮素与新橙皮苷的复配比例为1:1，复配浓度如表2所示，不同复配比例的橙皮素与新橙皮苷对酪氨酸酶的抑制协同作用如表3所示。
表2橙皮素(A)与新橙皮苷(B)的复配浓度及对酪氨酸酶的抑制率
备注：“Dm”表示A与B联合用药后的IC50值，其中，IC50指的是半数有效抑制浓度，即供试品使酪氨酸酶的活性降低一半时所需的供试品浓度。“r”表示A与B联合用药后，药物浓度与抑制率关系拟合的相关系数。
表3
由表2、3结果可知，当橙皮素与新橙皮苷按照摩尔比1:1复配时的协同作用不明显，但当该组合终浓度为16μM(8μM A+8μM B)时具有中协同作用，因此，以该浓度继续探索其不同比例的联合作用。因此，对具有中协同作用的8μM+8μM组合进行进一步的不同混合比例地探索，结果如下表4所示。
表4
备注：ωA表示组分A在组合中的摩尔量占比；IR表示Inhibition rate，意思是抑制率，其表示形式为0-1的，保留四位小数的数字。
由表4可知，当橙皮素与新橙皮苷的总摩尔浓度为16μM，且两者的复配比例为(1～6):1时，对酪氨酸酶具有协同抑制效果，尤其是当两者的复配比例为3:1时表现出更优的协同抑制效果。
3.3、橙皮素(A)与橙皮素-7-O-葡萄糖苷(C)的复配比例为1:1，复配浓度如表5所示，不同复配比例的橙皮素(A)与橙皮素-7-O-葡萄糖苷(C)对酪氨酸酶的抑制协同作用如表6所示。
表5橙皮素(A)与橙皮素-7-O-葡萄糖苷(C)的复配浓度及对酪氨酸酶的抑制率
备注：“Dm”表示A与B联合用药后的IC50值，其中，IC50指的是半数有效抑制浓度，即供试品使酪氨酸酶的活性降低一半时所需的供试品浓度。“r”表示A与B联合用药后，药物浓度与抑制率关系拟合的相关系数。
表6
由表5、表6可知，橙皮素(A)与橙皮素-7-O-葡萄糖苷(C)的复配比例为1:1时的协同作用不明显，但该组合的终浓度为8μM(4μM A+4μM C)时具有微协同作用，因此，以该浓度继续探索其不同比例的联合作用。因此，对具有微协同作用的4μM+4μM组合进行进一步的不同混合比例地探索，结果如下7所示：
表7
| A:C | Dose A/(μM) | Dose C/(μM) | ωA | IR | CI | Effect |
| 9:1 | 7.2 | 0.8 | 90％ | 0.7470 | 0.68 | 协同 |
| 6:1 | 6.9 | 1.1 | 86％ | 0.7514 | 0.66 | 协同 |
| 4:1 | 6.4 | 1.6 | 80％ | 0.7545 | 0.65 | 协同 |
| 3:1 | 6.0 | 2.0 | 75％ | 0.7791 | 0.56 | 协同 |
| 2:1 | 5.3 | 2.7 | 67％ | 0.7347 | 0.71 | 中协同 |
| 1:1 | 4.0 | 4.0 | 50％ | 0.6914 | 0.87 | 微协同 |
| 1:2 | 2.7 | 5.3 | 33％ | 0.6604 | 1.00 | 相加 |
| 1:4 | 1.6 | 6.4 | 20％ | 0.6142 | 1.22 | 中拮抗 |
由表7可知，当橙皮素与橙皮素-7-O-葡萄糖苷的总摩尔浓度为8μM，且两者的复配比例为(2～9):1时，对酪氨酸酶具有协同抑制效果，尤其是当两者的复配比例为(3～9):1时表现出更优的协同抑制效果。
3.4、新橙皮苷(B)与橙皮素-7-O-葡萄糖苷(C)的复配比例为1:1，复配浓度如表8所示，不同复配比例的新橙皮苷(B)与橙皮素-7-O-葡萄糖苷(C)对酪氨酸酶的抑制协同作用如表9所示。
表8新橙皮苷(B)与橙皮素-7-O-葡萄糖苷(C)的复配浓度及对酪氨酸酶的抑制率
备注：“Dm”表示A与B联合用药后的IC50值，其中，IC50指的是半数有效抑制浓度，即供试品使酪氨酸酶的活性降低一半时所需的供试品浓度。“r”表示A与B联合用药后，药物浓度与抑制率关系拟合的相关系数。
表9
由表8和表9结果可知，新橙皮苷(B)与橙皮素-7-O-葡萄糖苷(C)复配的组合表现为强拮抗作用，不适合继续探索其联合用药作用。
综上所述，将橙皮素(A)、新橙皮苷(B)、橙皮素-7-O-葡萄糖苷(C)以及三者不同组合与曲酸对酪氨酸酶的抑制率作图如图5所示，除了新橙皮苷(B)和橙皮素-7-O-葡萄糖苷(C)的复配组合比曲酸对酪氨酸酶的抑制率较弱以外，其余组别均与曲酸作用接近，且本案所述橙皮素(A)、新橙皮苷(B)、橙皮素-7-O-葡萄糖苷(C)在低摩尔浓度(低于20μM)时对酪氨酸酶的抑制率优于曲酸。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (5)
1.一种酪氨酸酶抑制剂，其特征在于，所述酪氨酸酶抑制剂由橙皮素和新橙皮苷组成，所述酪氨酸酶抑制剂中橙皮素与新橙皮苷的摩尔比为(1～6):1；
所述橙皮素和新橙皮苷的总摩尔浓度为16μM；
或者所述酪氨酸酶抑制剂由橙皮素和橙皮素-7-O-葡萄糖苷组成，所述橙皮素与橙皮素-7-O-葡萄糖苷的摩尔比为(2～9):1；
所述橙皮素和橙皮素-7-O-葡萄糖苷的总摩尔浓度为8μM。
2.根据权利要求1所述酪氨酸酶抑制剂，其特征在于，所述酪氨酸酶抑制剂中橙皮素与新橙皮苷的摩尔比为3:1。
3.根据权利要求1所述酪氨酸酶抑制剂，其特征在于，所述橙皮素与橙皮素-7-O-葡萄糖苷的摩尔比为(3～9):1。
4.权利要求1-3任一项所述酪氨酸酶抑制剂在制备治疗黑色素瘤药物中的应用。
5.一种用于治疗黑色素瘤的药物，其特征在于，所述药物中含有权利要求1-3任一项所述酪氨酸酶抑制剂。
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