KR100519716B1

KR100519716B1 - 사우치논을 포함하는 염증성 질환의 치료 및 예방용 조성물

Info

Publication number: KR100519716B1
Application number: KR10-2002-0025007A
Authority: KR
Inventors: 김상건; 김영중; 이애경; 성상현
Original assignee: 재단법인서울대학교산학협력재단
Priority date: 2002-05-07
Filing date: 2002-05-07
Publication date: 2005-10-10
Also published as: KR20030086819A

Abstract

본 발명은 하기 구조식 (I)의 사우치논(sauchinone)을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 치료 및 예방용 조성물에 관한 것이다:

Description

사우치논을 포함하는 염증성 질환의 치료 및 예방용 조성물{Composition comprising sauchinone for treatment and prophylaxis of inflammatory diseases}

본 발명은 하기 구조식 (I)의 사우치논(sauchinone) 화합물을 유효성분으로 포함하는 사이클로옥시게네이즈-2(cyclooxygenase-2: COX-2) 유도 발현의 억제 작용을 통하여 항염증 효과를 갖는, 염증성 질환의 치료 및 예방용 조성물에 관한 것이다:

(I)

만성 염증 질환(예, 류마티스 관절염, 천식)의 원인은 체내에 면역성의 이상으로 발생한다. 예를 들면, 균이나 바이러스의 침입으로부터 우리 몸의 면역계가 이들을 제거하면 자신의 관절이나 몸의 일부를 공격하여 류마티스 관절염의 증상을 일으키게 된다. 우리 나라 인구중 약 1%가 류마티스 관절염을 앓고 있을 정도로 심각하며, 더 나아가 합병증에 시달리고 있다. 기관지 천식은 기침, 호흡 곤란, 가슴 답답함 등과 기관지 경련을 동반하는 질환인데 통계적으로 전 인구의 7∼10%를 차지할 정도로 흔히 볼 수 있는 질환이지만 현재까지 나온 치료법에는 이 질환을 근절시킬 수가 없는 질환으로 증상이 심할 경우에 임시방편적으로 기관지 확장제 등의 치료로 치료의 모든 것을 대체하고 있는 실정인 질환이다. 요즈음 들어서는 환경 오염 등으로 인하여 환자의 수가 많아지는 경향을 나타내고 있다.

이제까지는 만성 염증 질환의 진통 증상에 비스테로이드성 진통 소염제, 부신 피질 호르몬제를 사용하였으나, 만성적으로 복용할 경우에 위장장애, 위궤양 등의 심각한 부작용을 초래한다. 최근, 이러한 부작용을 줄이는 목적으로 관절염 치료제로 COX-2 억제 작용을 갖는 세레브렉스(화이자 제약, 미국)만을 사용하고 있다. 따라서, 염증 질환을 치료할 수 있는 새로운 의약품의 개발은 시급하고 절박하다고 하겠다.

이에 본 발명자들은 염증 질환 치료제로 개발될 수 있는 새로운 후보 물질을 오랫동안 한약이나 민간약의 형태로 염증과 통증을 억제하는 목적으로 사용되어 오고 있거나, 고의약서에서 항염증 효과가 있다고 기술되어 있는 천연물에서부터 분리하고자 하였다. 즉, 본 발명에서는 내독소 물질을 사용하여 염증을 유발시키고 그 염증을 제거하는 효과를 검색한 결과 삼백초의 지상부의 메탄올 추출물이 유의성 있는 염증 제거 활성을 보여, 이로부터 대식세포의 염증에 대하여 효과가 있는 성분을 추적 분리하여 이를 새로운 염증 질환 치료제로 개발하였다.

삼백초는 삼백초과(Saururaceae)에 속하는 다년생 초본으로 풀 전체 또는 뿌리나 잎이 풍독(風毒), 이뇨(利尿), 수종(水腫), 임질(淋疾), 간염(肝炎), 폐렴(肺炎), 변독(便毒), 고혈압(高血壓) 등의 치료에 민간에서 사용해 왔다. 삼백초는 잎, 꽃 및 뿌리가 백색이며, 윗부분의 화서(花序) 밑에 달린 3개의 잎이 흰색으로 변하므로 삼백초(三白草)라 불린다. 삼백초과에는 전세계적으로 3속 4∼5종의 식물이 분포하며, 우리나라에는 삼백초과 식물로 삼백초속에 속하는 삼백초와 일본에서 귀화한 것으로 추정되는 약모밀속에 속하는 약모밀(Houttuynia cordata Thunb.)의 2속 2종이 분포된다. 삼백초속 식물은 전세계에 2종이 분포하며 아시아에 분포하는 삼백초속(Saururus chinensis)와 북아메리카에 1종(Saururus cernuus, Lizard tail)이 있다.

삼백초는 중국의 고대 의약서인 명의별록(名醫別錄)에 수재되어 있으며, 7∼9월에 지상부를 채집하여 햇빛에 말려 사용한다. 미(味)는 고신(苦辛)하고, 성(性)은 한(寒)하며, 간(肝), 폐(肺), 신경에 들어간다. 습열(濕熱), 청리(淸利), 소독(消毒), 해독(解毒)의 효능이 있는 것으로 알려져 있으며, 부종(浮腫), 각기(脚氣), 황달(黃疸), 임질(淋疾), 대하(帶下) 등을 치료하는데 이용했다. 또한 삼백초근은 신수본초 (新修本草)에 수재되어 있으며, 7∼9월에 지하경을 캐내어 이토(泥土)를 제거하고 열탕에 수분 담갔다가 꺼내 햇볕에 말려 사용한다. 미(味)는 감신(甘辛)하고 성(性)은 한(寒)하다. 이수(利水), 제습(除濕), 청열(淸熱), 해독(解毒)의 효능이 있고 각기(脚氣), 임질(淋疾), 대하(帶下), 개선(疥癬) 등을 치료하는데 이용했다.

삼백초의 화학성분에 대한 연구는 그 동안 주로 지상부의 플라보노이드류(flavonoids), 알칼로이드류(alkaloids), 아미노산류(amino acids), 지방산류(fatty acids), 퀴논류(quinone) 및 정유 성분에 대하여 진행되었다. 전초의 정유 성분으로는 메틸-n-노닐-케톤(methyl-n-nonyl-ketone)이 주성분으로 보고되었으며 이 이외에도 알파-피넨(a-piene), 캄펜(camphene), 리날룰(linalool), 사프롤(safrol), 베타-카리오필렌(b-caryophyllene), 휴물렌(humulene) 등이 보고된 바 있다. 삼백초 지상부의 주된 성분의 하나인 플라보노이드류로는 하이페린(hyperin), 퀘세틴(quercetin), 이소쿼시트린(isoquercitrin), 쿼시트린(quercitrin) 등이 보고되었으며, 에모딘(emodin), 피시온(physcion) 등의 퀴논(quinone) 계열 성분과 카르파논(carpanone) 계열의 리그난(lignan)인 사우치논도 보고되었다. 또한 아리스톨락탐(aristolactam) 계열의 알칼로이드인 사우롤락탐(saurolactam)이 삼백초의 세포독성 성분으로 분리되었으며, 같은 계열의 알칼로이드인 아리스톨락탐 B II도 분리 보고되었다. 또한 제 2 구리산(cupric acid), 리놀산(linoleic acid) 및 라우린산(lauric acid)의 지방산과 알라닌(alanine), 발린(valine), 글루탐산(glutamic acid), 아스파라긴산 (aspartic acid), 류신(leucine), 이소류신(isoleucine) 및 프롤린(proline) 등의 아미노산의 존재도 확인하였다.

지금까지의 삼백초 성분에 대한 연구로는, 삼백초에서 분리한 성분 중 사우치논이 사염화탄소(carbon tetrachloride)에 의해 유발되는 간독성에 대해 간세포보호 활성을 보였으며, 이는 글루타치온(glutathione)과 항산화 효소의 고갈에 의한 것으로 밝혀졌다(Sung, S. H., Lee, E. J., Cho, J. H., Kim, H. S. and Kim, Y. C., Biol. Pharm. Bull. 23, 666-668 (2000)). 그러나 삼백초 추출물이나 그의 성분이 항염증 작용을 갖는 것을 보고한 문헌은 없다.

본 발명자들은 삼백초에 대한 연구를 예의 수행한 결과, 삼백초의 추출물 및 그로부터 분리된 사우치논이 사이클로옥시게네이즈-2(cyclooxygenase-2: COX-2) 유도 발현의 억제 작용을 통하여 항염증 효과를 갖는 것을 처음으로 확인하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

따라서, 본 발명의 목적은 삼백초로부터 분리된 사우치논 화합물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 치료 및 예방 효과를 갖는 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명은 하기 구조식 (I)의 사우치논을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 치료 및 예방용 조성물을 제공한다:

(I)

본 발명은 또한 상기 염증성 질환이 류마티스 관절염 또는 천식인 것을 특징으로 하는 염증성 질환의 치료 및 예방용 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한 삼백초를 메탄올, 에탄올 또는 프로판올과 같은 저급 알칸올, 메틸렌클로라이드 또는 클로로포름과 같은 염소화 탄화수소, 헥산 또는 헵탄과 같은 탄화수소류, 벤젠, 톨루엔 등과 같은 방향족 탄화수소, 또는 이들의 혼합용매중에서 추출하거나, 이를 컬럼 크로마토그래피하여 제조한 삼백초 추출물을 유효성분으로 하는 염증성 질환의 치료 및 예방용 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명의 구성 및 작용효과를 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명의 제 일면은 하기 구조식 (I)의 사우치논을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 치료 및 예방용 조성물을 제공하는 것이다:

(I)

본 발명의 상기 구조식 (I)의 사우치논은 삼백초에서 분리, 정제한다.

구체적으로, 본 발명을 삼백초의 추출과정의 일예를 들어 하기에 설명한다.

삼백초를 메탄올, 에탄올 또는 프로판올과 같은 저급 알칸올 및 메틸렌클로라이드 또는 클로로포름과 같은 염소화 탄화수소의 혼합용매, 바람직하게는 클로로포름과 메탄올 (1 : 1)의 혼합용매로 열탕 추출하고, 감압농축하여 총 추출물을 얻는다. 얻어진 삼백초 추출물을 증류수에 현탁시킨 다음, 염소화 탄화수소로 분획하고, 얻어진 염소화 탄화수소 분획물을 다시 메탄올에 현탁시킨 다음, n-헥산으로 분획하여 메탄올 분획물과 n-헥산 분획물을 얻는다. 얻어진 n-헥산 분획을 n-헥산 : 에틸아세테이트의 혼합용매로 실라카겔 컬럼크로마토그래피하여 본 발명의 사우치논을 얻는다.

본 발명의 사우치논은 통상의 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제와 함께 약제학적 분야에서 공지의 방법에 의해. 약제학적으로 통상으로 허용되는 약학적 제제, 예를들면 주사제, 액제, 시럽제, 정제, 캡슐제 등으로 제제화할 수 있다.

또한 본 발명의 사우치논은 통상의 약제학적 방법으로 약제학적으로 허용되는 무기 또는 유기염으로 전환될 수 있다. 또한 이들은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있다.

본 발명의 사우치논은 체내에서 활성성분의 흡수도, 배설속도, 환자의 연령 및 체중, 성별 및 상태, 치료할 질병의 중증정도 등에 따라 적절히 선택되나, 일반적으로 성인에게 1일 일일 10mg 내지 5,000mg을 1 내지 3회 투여할 수 있고, 환자의 체중, 성별, 나이 및 질병의 정도에 따라서 그 사용량을 증감할 수 있다.

본 발명의 제 이면은 삼백초를 메탄올, 에탄올 또는 프로판올과 같은 저급 알칸올, 메틸렌클로라이드 또는 클로로포름과 같은 염소화 탄화수소, 헥산 또는 헵탄과 같은 탄화수소류, 벤젠, 톨루엔 등과 같은 방향족 탄화수소, 또는 이들의 혼합용매중에서 추출하거나, 이를 컬럼 크로마토그래피하여 제조한 삼백초 추출물을 유효성분으로 하는 염증성 질환의 치료 및 예방용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 삼백초 추출물도 통상으로 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제와 함께 약제학적 분야에서 공지의 방법에 의해. 약제학적으로 통상으로 허용되는 약학적 제제, 예를들면 주사제, 액제, 시럽제, 정제, 캡슐제 등으로 제제화할 수 있다. 이들은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있으며, 일반적으로 성인에게 1일 일일 10mg 내지 10,000mg을 1 내지 3회 투여할 수 있고, 환자의 체중, 성별, 나이 및 질병의 정도에 따라서 그 사용량을 증감할 수 있다.

이하, 본 발명을 하기 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 이들 실시예는 본 발명의 예시 목적을 위한 것이며, 본 발명의 보호범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.

실시예 1. 삼백초의 추출 및 분획

음건한 삼백초 10kg을 클로로포름과 메탄올 (1 : 1)의 혼합용매로 3회, 2시간 동안 열탕 추출하였고, 감압농축하여 총 추출물 1.8kg을 얻었다. 삼백초 추출물(1.8kg)을 증류수에 현탁시킨 다음, 염소화 탄화수소로 분획하고 감압농축하여 염소화 탄화수소 분획과 물 분획을 얻었다. 농축한 염소화 탄화수소 분획물을 다시 90% 메탄올에 현탁시킨 다음, n-헥산으로 분획하여 90% 메탄올 분획물(120g)과 n-헥산 분획물(60g)을 얻었다.

실시예 2. 사우치논의 분리 및 동정

n-헥산 분획(60g)을 n-헥산 : 에틸아세테이트의 혼합용매 (100:1 ∼ 0:1)로 실라카겔 컬럼크로마토그래피하여 20개의 소분획(Fr. 1 ∼ 20)으로 나누었다. 이 중 6번 소분획(2g)을 n-헥산 : 염소화 탄화수소 : 메탄올 (5 : 1 : 1)의 혼합용매로 세파덱스 LH-20 컬럼 크로마토그래피를 실시하여 무색 침상 결정으로 사우치논(800 mg)을 얻었다.

사우치논의 구조 결정

C₂₀H₂₀O₆

[α]_D ; +95.0°(c, 0.63 ; CHCl₃),

R _f ; 0.35 (n-hexane : EtOAc = 5 : 1),

UV (CHCl₃) λ_max (log ε) ; 299.5 (2.55), 254.2 (2.74) nm,

IR (neat) ν_max ; 2916, 1676, 1664, 1418, 1433, 1321, 1241, 1184, 1155, 979, 926, 892, 756 cm^-1,

EIMS (m/z) (rel. int.) ; 356 [M⁺] (100), 270 (13), 257 (18), 205 (26), 175 (57), 151 (39), 138 (23),

HR EIMS ; m/z 356.1262 (calcd for C₂₀H₂₀O₆ m/z 356.1260),

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 6.82 (1 H, s, H-6), 6.38 (1 H, s, H-3), 5.90 (1 H, d, J = 1.40 Hz, aromatic -OCH ₂ O-), 5.87 (1 H, d, J = 1.40 Hz, aromatic -OCH ₂ O-), 5.65 (1 H, s, aliphatic -OCH ₂ O-), 5.60 (1 H, s, aliphatic -OCH ₂ O-), 5.57 (1 H, s, H-3'), 3.03 (1 H, d, J = 5.40 Hz, H-7), 2.52 (1 H, td, J = 11.93, 3.47 Hz, H-1'), 2.48 (1 H, d, J = 5.40 Hz, H-6'), 2.44 (1 H, m, H-8), 1.92 (1 H, m, 7'-H_ax), 1.88 (1 H, m, H-8'), 1.64 (1 H, m, 7'-H_eq), 1.22 (3 H, d, J = 7.26 Hz, H-9), 0.71 (3 H, d, J = 7.39 Hz, H-9'),

¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃) δ 199.69 (C-2'), 168.66 (C-4'), 146.72 (C-5), 145.70 (C-2), 143.26 (C-4), 115.73 (C-1), 105.54 (C-6), 101.34 (C-3'), 101.24 (aromatic -OCH₂O-), 100.42 (C-5'), 99.50 (C-3), 98.19 (aliphatic -OCH ₂O-), 37.60 (C-6'), 37.55 (C-1'), 35.06 (C-7), 34.82 (C-8), 33.45 (C-8'), 25.27 (C-7'), 21.29 (C-9), 20.92 (C-9')

이상의 분광학적 기기 분석 결과를 문헌치(Sang Hyun Sung and Young Choong Kim, J. Nat. Prod. 63 (7), 1019-1021 (2000))와 비교, 검토하여 사우치논으로 동정하였다.

실험예: 대식세포의 염증 방어 활성 검색

대식세포(macrophage)의 염증 방어 활성을 갖는 물질을 천연물로부터 창출하는 과정에서 우선 요구되는 것은 이러한 활성을 갖는 물질을 탐색할 수 있는 적절한 검색법의 확립이다. 천연물로부터 염증 방어 활성을 갖는 물질을 찾기 위하여 인간의 대식세포와 생리, 생화학적으로 유사하다고 알려진 흰쥐의 대식세포가 검색계로 널리 사용되고 있다. 천연물을 대상으로 대식세포 보호 활성을 검색하기 위해서는 먼저 배양한 대식세포에 천연물을 처치하고 어느 정도의 시간이 흐른 뒤, 내독소 물질을 처치하여 인위적으로 염증을 일으킬 때 방어효과의 정도를 측정한다.

본 발명에서는 대식세포에 염증을 유발하기 위해 지질다당류 (lipopolysaccharide: LPS)를 사용하였다. LPS는 그람 음성균 세포벽을 구성하는 주 구성요소이며, 세포질에서 혈장 LPS 결합단백질(LPB)과 결합하여 세포막의 인지질로 이동하여 대식세포 표면에 존재하는 CD14에 결합하거나 LPS 자체가 직접 세포막에 존재하는 95kDa, 80kDa 단백질 등과 결합하여 염증반응을 나타낸다 (Hewett, J. A. and Roth, R. A.: Hepatic and extrahepatic pathobiology of bacterial lipopolysaccharides. Pharmacol. Rev. 45, 382-411 (1993)). LPS와 수용체와의 결합은 세포내 G1 단백질을 자극하고 미토젠 활성화 단백질 카이네이즈(mitogen activated protein kinase: MAPK)의 신호전달체계를 통하여 세포로부터 종양괴사인자(tumor nacrosis factor: TNF-a), 인터루킨-1(IL-1), IL-6, 프로스타노이드(prostanoids), 루코트리엔(leukotriens) 등의 사이토카인 (cytokine)류와 니트로 옥사이드(nitro oxide: NO) 등과 같은 다양한 염증 매개 물질들이 유리된다.

본 실험예에서는 대식세포에서의 사이클로옥시게네이즈-2(COX-2)의 억제를 통한 항염증 효과를 알아보기 위하여 LPS에 대한 방어효과를 사이클로옥시게네이즈-2의 mRNA와 단백질 수준에서 측정하고, COX-2의 전사인자의 활성을 측정하였다. 또한 사우치논의 독성을 관찰하기 위하여 MTT [3-(4,5-dimethylthiazole-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide] 분석을 통하여 세포 생존율을 측정하였다. 본 실험예에서 나타낸 데이터는 약물학적 계산(pharmacologic calculation) 프로그램을 이용하여 분석하였다. 여러 처치군간의 유의성을 one way analysis of variance (ANOVA)로 검정한 후 Newmann-Kelus test로 판정하였다 (**p<0.01).

(1) Mouse의 대식세포주인 RAW264.7 세포배양

RAW264.7 세포는 마우스 대식세포주(한국 세포주 은행, 서울, 한국)로서, 10% 소 태아 혈청(fetal bovine serum), 100 U/ml 페니실린과 100 mg/ml 스트렙토마이신을 함유하고 있는 Dulbeco's Modified Eagles 배지에서 배양하였다. 1∼2×10⁶/ml의 RAW264.7 세포는 5% CO₂와 95% 공기를 함유한 37 ℃ 챔버에서 24 시간동안 전 배양하였다. 모든 실험에서 80∼90% 컨플루언시(confluency)를 유지하였고, 20 계대배양을 넘지 않았다.

(2) COX-2 발현억제에 대한 사우치논의 효과측정

2-1) 노던 블롯(Northern blot) 분석

(1)에서 배양한 RAW264.7 세포에 사우치논을 디메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide)에 녹여 1, 3, 10 및 30μM의 농도로 처치하고, 1시간 후 상기 RAW264.7 세포에 LPS (Escherichia coli 0111:B4; Sigma, St. Louis, MO)는 1 ㎍/ml를 처치하였다. 이와 같이 처리된 RAW264.7 세포로부터 총 RNA는 Chomczynski 및 Sacchi의 방법에 의해 분리하였다. 분리한 총 RNA는 샘플 희석 버퍼(1×MOPS 버퍼안에 50% 포름아마이드, 2.2M 포름 알데히드를 넣어 조건을 맞추었다)에 넣어 용해시켰다. RNA를 65℃에서 15분간 변성시켰다. 1% 아가로즈 겔(agarose gel)에 전기영동시켰다. 전기영동이 끝난 후 겔에 존재하는 RNA를 니트로셀룰로즈(nitrocellulose) 종이에 전이시켰으며, 전이된 니트로셀룰로즈 종이를 80℃ 진공오븐에서 건조하였다.

변성시킨 COX-2 cDNA를 ³²P로 무작위로 프라임 라벨링(prime labeling)하여 프로브(probe)로 사용하였다. 혼성화는 50% 탈이온화 포름아마이드, 5× Denhardt's 용액, 0.1% SDS, ssDNA, 5× SSPE를 함유한 혼성화 버퍼에 니트로셀룰로즈 종이를 42℃에서 2시간 전 혼성화를 시켰다. 라벨된 프로브를 가하고 42℃에서 18시간 동안 인큐베이션(incubation)한 후 2×SSC/0.1%S DS 및 0.1×SSC/0.1% SDS로 42℃에서 15분간 각 2회씩 세척하고 0.1×SSC/0.1% SDS로 55℃에서 1시간동안 세척하였고, 그 결과를 도 1a에 나타내었다.

2-2) 면역화학적 분석

상기 2-1)과 같이 사우치논과 LPS가 처리된 Raw264.7 세포주에서 세포들을 스크래퍼(scrapper)로 긁어내어 라이시스(lysis) 버퍼 [20mM 염화 트리스 (pH 7.5), 1% 트리톤 엑스-100, 137mM 염화 나트륨, 10% 글리세롤, 20mM EDTA, 1mM 오소바나데이트 나트륨(sodium orthovanadate), 25mM 베타 글리세로포스페이트(β-glycerophosphate), 2mM 피로포스페이트 나트륨(sodium pyrophosphate), 1mM 페닐메틸설포닐플루오라이드(phenylmethylsulfonylfluoride, 1㎍/ml 류펩틴(leupeptin)]를 100 ㎕를 넣고 1시간 얼음에 방치한 후 10,000g에서 10분간 원심분리하여 상등액을 취하여 라이세이트(lysate)를 분리하였다. 분리한 라이세이트를 전기영동시켜 니트로세룰로즈에 전이시켜 항-마우스 COX-2 항체(1:1000 in 1×PBS)를 결합하였고, 2차 항체는 알칼라인-포스파테이즈-융합 항-염소(alkaline-phosphatase-conjugated anti-goat) 항체(1:1000 in 1×PBS)를 사용하여 상온에서 인큐베이션하였다. 5-브로모-4-클로로-3-인돌일포스파테이트/4-니트로블루테트라졸륨 클로라이드로 발색하였고, 그 결과를 도 1b에 나타내었다.

도 1a 및 b와 같이, 사우치논을 1시간 전처치한 후 LPS를 가하고 COX-2 mRNA와 단백질의 발현변화를 관찰한 결과, 사우치논 1∼30 μM 에서의 농도에서 LPS에 대한 COX-2 mRNA와 단백질의 발현을 90% 정도 억제하였다. 즉, 사우치논은 염증 반응에 관여하는 COX-2를 선택적으로 억제하였다.

(3) 겔 이동지체 분석(Gel retardation assay)

NF-kB(Nuclear factor-kappa B)는 유전자의 프로모터 부위에 존재하여 LPS에 의해 활성화되어 COX-2 유전자 발현을 증가시킨다. LPS에 의해 유도된 NF-kB 활성에 대한 사우치논의 효과를 측정하기 위해, 사우치논 3 μM 농도에서 NF-kB DNA 결합 효과를 측정하기 위하여 겔 쉬프트(gel shift) 분석을 하였다. 또한 C/EBP(CCAAT/enhancer binding protein)는 COX-2 유전자의 프로모터(promoter) 부위에 존재하며 LPS에 의해 활성화되어 유전자 발현을 증가시킨다. LPS에 의해 유도된 C/EBP 활성에 대한 사우치논의 효과를 측정하기 위해, 사우치논 3 μM 농도에서 C/EBP DNA 결합 효과를 측정하기 위하여 RAW264.7 세포에서 핵단백질을 분리하여 겔 쉬프트(gel shift) 분석을 하였다.

구체적 실험 방법은 하기와 같다.

NF-kB, C/EBP의 공통(consensus) 염기서열을 말단-라벨링(end-labeling)하여 겔 쉬프트 분석을 실행하였다. 상기 2-1)과 같이 사우치논(3 μM)과 LPS가 처리된 Raw264.7 세포에 라이시스 버퍼 [10mM HEPES (pH 7.5), 10mM 염화 칼륨, 0.1mM EDTA, 1mM 디티오트레이톨(dithiothreitol), 0.5mM 페닐메틸설포닐프루오라이드)]를 넣어 얼음에 10분 방치한 후 7,200g에서 6분간 원심분리하여 상등액을 제거하고 추출(extraction) 버퍼 [20mM HEPES (pH7.9), 400mM 염화 나트륨, 1mM EDTA, 1mM 디티오트레이톨, 1mM 페닐메틸설포닐프루오라이드]를 넣어 얼음에 30분간 방치한 후 15,000g에서 10분간 원심분리하여 상등액을 취하여 핵단백질을 분리한다. 분리한 핵단백질과 5× 바인딩 버퍼(binding buffer)(20% 글리세롤, 250mM EDTA, 2.5mM 디티오트레이톨(dithiothreitol: DTT), O.25 mg/ml poly dI-dc, 50mM Tris-Cl(pH 7.5))를 상온에서 10분간 미리 반응시킨 후, NF-kB, C/EBP 공통 염기서열을 방사성 동위원소로 라벨링한 프로브를 첨가하여 상온에서 20분간 반응하였다. 반응 혼합액을 0.5% TBE 버퍼의 4% 폴리아크릴아마이드 겔(polyacrylamide gel)에 전기영동하여 겔을 고정시킨 후 오토래디오그래피(autoradiography)하였다. LPS에 의해 유도된 NF-kB 활성에 대한 사우치논의 효과를 도 2에, LPS에 의해 유도된 C/EBP 활성에 대한 사우치논의 효과를 도 3에 각각 나타내었다.

도 2와 같이, LPS에 의해서 유도된 NF-kB의 활성은 사우치논에 의해서 억제되었다. 또한 LPS에 의해서 NF-kB의 구성 단백질인 p50과 p65 중 p65가 결합하며, 사우치논은 p65 단백질이 핵내로 이동하는 것을 억제하여 NF-kB의 활성을 억제하는 것을 확인하였다. 또한 도 3과 같이, LPS에 의해서 유도된 C/EBP 활성은 사우치논에 의해서 억제되었다.

상기와 같이 본 발명의 사우치논(sauchinone) 화합물은 사이클로옥시게네이즈-2(cyclooxygenase-2 : COX-2)의 유도 발현의 억제 작용을 통하여 항염증 효과를 갖는 것을 알 수 있다.

(4) 세포의 생존활성 측정 (MTT 분석)

사우치논의 독성을 관찰하기 위하여 MTT 분석을 통하여 세포 생존율을 측정하였다. (1)에서 배양한 RAW264.7 세포가 1×10⁵/ml cell/well가 되도록 96 well에 깔고, 사우치논을 1, 3, 10, 30 및 100μM의 농도로 처치하고(콘트롤), 사우치논을 1, 3, 10, 30 및 100μM의 농도로 처치하고 1시간 후 LPS(1 ㎍/ml)를 처치하여(LPS+사우치논), 5% CO₂와 95% 공기를 함유한 37 ℃ 챔버에서 24 시간동안 반응시켰다. 사우치논(1, 3, 10, 30 및 100μM)과 LPS가 처리된 RAW264. 7 세포에 대하여, MTT를 가하여 생성된 포마존(formazon)을 540 nm 에서 Titertek Multiskan Automatic ELISA 판독기로 읽어서 세포의 생존율을 확인하였고, 그 결과를 도 4에 나타내었다. 사우치논을 단독 처리한 군을 콘트롤로 하였다.

도 4와 같이, 사우치논을 1, 3, 10, 30 및 100μM 농도로 처치하고 LPS를 처치한 군도 24시간까지 세포 생존율은 영향이 없었다.

다음에 제제실시예로서 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

제제실시예 1

사우치논 100mg

주사용 멸균증류수 적량

pH 조절제 적량

사우치논을 주사용 증류수에 용해하고 pH 조절제로 pH 약 7.6로 조절한 다음 전체를 2ml로 한 후 2ml용량의 앰플에 충진하고 멸균하여 주사제를 제조한다.

제제실시예 2

사우치논 10mg

유당 100mg

전분 50mg

스테아린산 마그네슘 적량

상기의 성분을 혼합하고 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

제제실시예 3

사우치논 5mg

유당 100mg

전분 93mg

탈클 2mg

스테아린산 마그네슘 적량

상기의 성분을 혼합하고 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충진하여 캡슐제를 제조한다.

제제실시예 4

사우치논 100mg

설탕 20g

이성화당 20g

레몬향 적량

정제수를 가하여 전체 100ml

상기의 성분을 통상의 액제의 제조방법에 따라서 혼합하고 100ml의 갈색병에 충진하고 멸균시켜서 액제를 제조한다.

이상에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 상기 구조식 (I)의 사우치논 및 삼백초 추출물은 사이클로옥시게네이즈-2 (COX-2) 억제 작용을 나타내므로 새로운 염증질환의 예방 및 치료제, 특히 류마티스 관절염, 천식 등 만성 염증 질환의 예방 및 치료제로서 사용될 수 있다.

도 1은 COX-2 발현억제에 대한 사우치논의 효과를 나타낸 그래프이고,

도 2는 LPS에 의해 유도된 NF-kB 활성에 대한 사우치논의 효과를 나타낸 그래프이며,

도 3은 LPS에 의해 유도된 C/EBP 활성에 대한 사우치논의 효과를 나타낸 그래프이고.

도 4는 사우치논의 세포 생존율을 나타낸 그래프이다.

Claims

하기 구조식 (I)의 사우치논을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 치료 및 예방용 조성물:

(I)
제1항에 있어서, 상기 염증성 질환은 천식인 것을 특징으로 하는 염증성 질환의 치료 및 예방용 조성물.
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