KR100739398B1 - 삼백초 추출물에서 분리된 ｓｃｅ２５­２０ 화합물을함유하는 염증, 알러지성 질환 또는 혈관질환의 예방 및치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 염증, 알러지성 질환 및 혈관질환의 예방 또는 치료용 조성물에 대한것으로서, 상세하게는 삼백초(Saururus chinensis)추출물로부터 분리한 화합물 SCE25-20을 유효성분으로 함유하는 염증, 알러지성 질환 및 혈관질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 화합물은 각종 알러지 및 천식질환의 원인이 되는 리폭시게나제(5-LO, 5-lipoxygenase)의 활성을 저해하며, 시클로옥시게나제-2 (COX-2, cyclooxygenase-2) 의존적인 프로스타글란딘(prostaglandin D₂, PGD₂)의 생성 억제, 비만세포 (mast cell)에서 탈 과립 반응억제, 니트릭 옥사이드(nitric oxide) 라디칼 생성 억제 및 iNOS(inducible nitric oxide synthase) 단백질발현을 저해하며, 또한 동맥경화 또는 혈관계 질환에 관련된 MMP-9활성을 억제함으로써, 염증, 알러지성 질환 및 혈관질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

삼백초 추출물, 항염증, 항알러지, 항천식, 혈관계 질병

Description

삼백초 추출물에서 분리된 ＳＣＥ２５­２０ 화합물을 함유하는 염증, 알러지성 질환 또는 혈관질환의 예방 및 치료용 조성물{Composition comprising compound ＳＣＥ２５­２０ isolated from Saururus chinensis for the prevention and treatment of inflammatory, allergy or blood circulatory diseases}

도 1은 본 발명의 삼백초 추출물에서 화합물 SCE25-20 을 분리하는 전체 과정을 나타내는 도이며,

도 2는 삼백초 추출물에서 분리한 화합물 SCE25-20 대한 쥐 골수유래 비만세포 (mouse bone marrow-derived mast cells, BMMC)에서 시클로옥시게나제-2 의존적인 프로스타글란딘 D₂ 생성을 억제하는 효과를 나타낸 도이고,

도 3은 기관지 천식 및 알러지 반응을 일으키는 류코트리엔 C₄의(leukotriene C₄) 합성에 관여하는 5-리폭시게나제 (5-lipoxygenase)의 저해활성 실험결과를 나타낸 도이며,

도 4는 각종 염증질환, 기관지 천식 및 알러지 반응을 일으키는 비만세포에서 탈 과립반응의 지표인 베타-헥소사미니다제 (β-hexosaminidase, β-HEX) 의 유리억제 반응에 대한 실험결과를 나타낸 도이고,

도 5는 각종 염증 질환을 일으키는 니트릭옥사이드 (NO) 라디칼 생성물 억제 도 (A) 및 이를 생성하는 니트릭옥사이드 신타제(iNOS)의 단백질 발현 실험결과(B)를 나타낸 도이며,

도 6은 혈관 평활근 이주에 관여하는 MMP-9억제 활성을 지모그래피(Zymography)의 실험결과를 나타낸 도이다.

본 발명은, 염증, 알러지성 질환 및 혈관질환의 예방 효과를 갖는 삼백초 추출물로부터 분리된 화합물인 SCE25-20을 유효성분으로 함유하는 염증, 알러지성 질환 또는 혈관질환의 예방 및 치료를 위한 약학조성물에 관한 것이다.

염증이란 신체 국소에 일어나는 상해에 대하여 생체조직의 방어반응이다. 즉, 각종의 유해한 자극(stressor)에 응답하여, 자극에 의한 상해를 제거하여 원래의 상태로 회복하려는 생체방어반응이 염증반응이다. 염증의 자극에는, 감염 혹은 화학적, 물리적 자극 등이 있다. 염증반응에 관련된 생체 구성 인자는 자유라디칼(free radical), 단백질, 당질, 지질 등의 저분자나 고분자의 화학물질과, 혈장, 혈구, 혈관 및 결합조직 등이 있다. 염증의 과정은 보통 2가지로 나누며, 급성과 만성 염증으로 나눌 수 있다. 급성염증은 수일 이내의 단기적인 반응이며, 혈장성분이나 혈구 등이 미소순환계를 게재하여 이물제거에 관련한다. 만성염증은 지속시간이 길며, 조직의 증식 등이 보여진다.

알러지성 질환은 대부분이 항원-항체 반응에 의해 활성화된 조직의 비만세포 의 과립으로부터 유리되는 화학매개체들 (주로 histamine, prostaglandins, leukotrienes, TNFα, cytokines 등)에 의해서 야기된다. 현재 사용되는 알러지 치료 약물들의 용도는 증상완화에 머무르고 있기 때문에 보다 근본적인 치료 약물의 개발이 절실히 요구된다.

염증 및 알러지성 질환을 유도하는 핵심적인 매개물질은 프로스타글란딘류 (prostaglandindes), 류코티리엔류 (leukotriens), 혈소판활성화인자 (PAF) 등은 포스포리파제 A2 (phospholipase A2) 및 사이클로옥시게나제 (cyclooxygenase) 및 리폭시게나제 (lipoxygenase)에 의하여 전구체인 아라키돈산 (arachidonic acid)로부터 생성된다. 또한 니트릭옥사이드(nitric oxide; NO)를 발생시키는 효소인 니트릭옥사이드 신타제 (nitric oxide synthase; NOS) 생합성과 관련된 효소도 염증 반응을 매개하는데 있어서 중요한 역할을 하고 있는 것으로 알려져 있으며, 따라서 L-아르기닌(L-Arginine)으로부터 NO를 생성시키는 효소인 NOS나도 염증을 차단하는데 있어서 주된 목표가 되고 있다. 최근의 연구 결과에 따르면, NOS는 몇가지 종류가 존재하는데 뇌에 존재하는 bNOS (brain NOS), 신경계에 존재하는 nNOS(neuronal NOS), 혈관계에 존재하는 eNOS (endothelial NOS) 등은 체내에 항상 일정수준으로 발현되고 있으며, 이들에 의해 소량 생성되는 NO는 신경전달이나 혈관확장을 유도하는 등 정상적인 신체의 항상성 유지에 중요한 역할을 하는데 반하여, 각종 염증성 사이토카인(cytokines)이나 리포폴리사카라이드 (lipopolyssacharide, LPS)등과 같은 외부 자극물질에 의해 유도되는 iNOS(induced NOS)에 의해 급격히 과량 발생되는 NO는 세포독성이나 각종 염증반응을 일으키는 것으로 알려져 있으며, 만성 염 증은 iNOS 활성의 증가와 관련있다는 연구가 있다(Miller M. J. et al., Mediators of inflammation, 4, pp 387-396, 1995 : Appleton L. et al., Adv . Pharmacol., 35, pp 27-28, 1996).

상기의 염증성 질환을 치료하기 위하여, 여러 종류의 염증성 질환치료제가 개발되었는데, 현재까지 보고된 염증성 질환 치료물질은 급성염증에서 손상된 조직세포, 염증에 관여하는 세포 또는 주화인자 (Chemotactic factor)에 의해 유도되는 백혈구의 세포막으로부터 에이코사노이드이 생성을 억제하는 약물이다. 또한 알러지제도 항원-항체 반응시 유리되는 탈 과립반응 억제 (히스타민 유리) 억제, 히스타민 수용체 차단, 류코트리엔 생성 억제 및 류코트리엔 수용체 차단을 억제하는 약물들이다.

한편, 최근에는 염증, 알러지성 천식 치료제로서 주목을 받고 있는 약물들은 탈과립반응 억제, 류코트리엔 C₄ 생성 억제, 프로스타글란딘 D₂ 생성억제 및 니트릭옥사이드 (NO)라디칼 생성 억제 활성을 동시에 갖는 약물들이다.

혈관평활근세포(vascular smooth muscle cells)의 증식과 이주능은 동맥경화와 동맥벽손상후 혈관협착(intimal thickening, stenosis) 발생의 주요 요인이다 (Ross R., J. Med . 314, pp 488-500, 1986). 혈관조직 중간층(media)에 존재하는 VSMC는 낮은 세포 분열능을 가지지만, 동맥경화나 혈관벽 손상 개시단계에서 혈관평활근 세포(aortic smooth muscle cells)는 여러 가지 성장 인자들의 협조로 증식 단계로 들어가 혈관 비대를 유발시킨다 (Chamley-Campbell J. et al., Physiol . Rev. 59, pp 1-61, 1979 ; Schwartz R. S. et al., J. Am. Coll . Cardio 20, pp 1284-1293, 1992) 그러나, VSMC의 복제와 이주는 세포주위의 세포 외 기질의 리모델링과 분해를 필요로 한다 (Matrisian L. M., Trends. Genet. 6, pp 121-125, 1990). 그 분해효소 중에서 MMP들이 중요하다 (Dollery C.M. et al., Circ . Res. 77, pp 863-868, 1995 ; Pauly R.R. et al., Circ . Res. 75, pp 41-54, 1994 ; Cho A. et al., Circ . Res. 91, pp 845-851, 2002). 많은 연구들이 MMP-9가 동맥평활근 세포의 증식과 내막으로의 이주에 중요하다고 보고하였다 (Newby A. C. et al., J. Pathol. 190, pp 300-309, 2000).

한편, 삼백초는 후추목 삼백초과에 속하는 여러해살이풀로, 높이 0.5∼1m. 땅속줄기는 길게 옆으로 뻗고, 잎은 어긋나며 달걀모양이고, 기부는 심장모양이다. 꽃차례 밑의 2∼3장의 잎은 흰색이다. 6월 말∼7월에 수상꽃차례가 잎과 마주나며 아래로 늘어진다. 기부에서 끝을 향해 서서히 흰색의 작은 꽃이 피면서 꽃차례는 이윽고 곧게 선다. 꽃 턱잎은 꽃 차례축에는 없고, 길이 2∼3㎜의 작은 꽃자루 끝에 붙는다. 꽃은 양성화이며 꽃 덮이는 없다. 수술은 6개로 심피와 마주나며, 기부는 심피와 붙어 있다. 암술은 4장의 심피로 되어 있으며, 기부는 서로 붙어 난다. 밑씨는 1장의 심피당 2개이나, 종자는 1장의 심피에 1개 생긴다. 잎·꽃·뿌리가 흰색이고, 또한 윗부분에 달린 2∼3개의 잎이 희어지기 때문에 삼백초라고 한다. 저습지에 군생하며, 한국·일본·동남아시아에 분포한다. 삼백초속은 2종이 있으며, 그 중 S. cernuus는 북아메리카 동부에 분포한다.

전초를 채취하여 말린 것을 소승마(赤小麻) 또는 적승마(赤升麻)라고도 부른 다. 혈액순환을 좋게 하고, 어혈(瘀血)을 풀어주며, 열을 내리고, 독을 풀어주며, 경련을 멈추게 하고, 통증을 멈추게 하는 효능이 있어서 과로로 오는 병, 근육과 뼈마디가 시리고 아픈 증상, 타박상, 관절통, 수술 후 통증, 뱀에게 물린 독을 푸는 데 사용한다(배기환, 한국의 약용식물, 교학사, p 204, 2000).

이에 본 발명자들은 삼백초 추출물에 분리한 화합물 SCE25-20 이 쥐 골수에서 비만세포에서 프로스타글란딘 D₂ (PGD₂)의 생성의 강한 억제능은 특히 COX-2에 대하여 억제함과 동시에 류코트리엔 C₄ (LTC₄) 생성을 강력하게 억제하는 효능을 보유하며, 비만세포에서 탈 과립반응의 지표인 베타-헥소사미니다제 (β-HEX)의 유리억제능이 있음을 알아내었다. 또한 식세포 유래의 세포주인 RAW264.6에서 니트릭 옥사이드(NO) 라디칼 생성억제 및 NO합성 효소인 iNOS 단백질 발현을 강력하게 억제함과 동시에 혈관 평활근 이주에 중요한 역할을 담당하는 MMP-9 억제 활성을 알아내어 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 염증, 알러지성 질환 및 혈관질환에 효과적인 삼백초 추출물에서 분리한 화합물 SCE25-20을 함유하는 염증, 알러지성 질환 및 혈관질환의 예방 및 치료를 위한 약학조성물 및 식품조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 염증, 알러지성 질환 및 혈관질환의 예방 및 치료효과를 갖는 삼백초 추출물에서 분리된 하기 구조식 (1)로 표기되 는 화합물 SCE25-20을 포함하는 염증, 알러지성 질환 및 혈관질환의 예방 및 치료를 위한 약학조성물을 제공한다.

상기 염증 관련 질환에는 동맥경화, 류마티스성 관절염, 천식, 급성 통증, 만성 통증, 신경병적 통증, 수술 후 통증, 편두통 및 관절통과 같은 통증, 신경병증, 신경손상, 과민성 장 증후군, 내독소에 의한 쇼크, 염증성 장 질환 및 암, 바람직하게는 동맥경화, 류마티스성 관절염을 포함된다.

상기 알러지성 질환은 기관지천식, 알러지성 비염, 알러지성 천식 또는 알러지성 피부염, 바람직하게는 알러지성 비염, 알러지성 피부염을 포함한다.

상기 혈관질환은 허혈성 심근경색, 협심증, 심근경색증과 같은 관상동맥질환, 고혈압, 뇌졸중, 고지혈증, 빈혈, 편두통, 동맥경화, 부정맥, 중풍, 혈관종, 혈관섬유종, 혈관기형, 혈관 유착, 바람직하게는 허혈성 심근경색, 뇌졸중을 포함한다.

이하, 본 발명의 화합물을 분리하는 공정을 더욱 상세히 설명한다.

본 발명의 삼백초 조 추출물은, 건조된 삼백초의 뿌리 또는 지상부(잎, 줄기)를 세절하여 무게(㎏)의 약 3배 내지 20배, 바람직하게는 약 5배 내지 10배의 물, C₁ 내지 C₄의 저급 알콜 또는 이들의 혼합용매, 바람직하게는 메탄올로, 20 내 지 50℃, 바람직하게는 20 내지 30℃ 추출온도에서 약 1시간 내지 10일, 바람직하게는 약 3일 내지 8일간 냉침, 초음파 추출, 환류 냉각 추출, 바람직하게는 냉침 추출방법을 이용하여 수득한 추출액을 여과, 감압 농축하여 극성용매 가용추출물인 조 추출물을 수득할 수 있다.

또한 본 발명의 비극성 용매 가용 추출물은 상기 조 추출물을 증류수에 현탁한 후, 이를 현탁액이 약 1 내지 100배, 바람직하게는 약 1 내지 5배 부피의 헥산, 에틸아세테이트, 클로르포름과 같은 비극성 용매를 가하여 1회 내지 10회, 바람직하게는 2회 내지 5회 비극성 용매 가용층을 추출, 분리하여 수득할 수 있다. 또한 추가로 통상의 분획 공정을 수행할 수도 있다(Harborne J.B. Phytochemical methods: A guide to modern techniques of plant analysis. 3rd Ed. pp 6-7, 1998).

상기 본 발명의 화합물은 상기 공정에서 얻은 비극성 용매 가용추출물을 가지고 실리카겔 컬럼 크로마토그래피와 같은 흡착크로마토그래피를 수행하고, 실리카겔 컬럼에 헥산/에틸아세테이트 혼합용매 또는 에틸아세테이트:메탄올 혼합물, 1:0 내지 10:1(w/w)비 갖는 전개용매를 컬럼에 전개시켜 분획 후, 다시 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 또는 Rp-18 컬럼 크로마토그래피와 같은 역상 크로마토그래피를 반복 수행하여 상기 구조식 1의 사우세르네올 F를 분리할 수 있다.

상기 전개용매로 디클로로메탄, 클로로포름, 헥산, 에틸아세테이트, 메탄올, 증류수 또는 이들의 혼합용매를 사용하여 수행할 수도 있다.

본 발명의 바람직한 실시예로 상기 삼백초의 메탄올 조 추출물을 증류수에 현탁 시키고 n-헥산, 에틸아세테이트, n-부탄올, 물 순으로 분획하여 각 용매분획을 제조한다. 에틸 아세테이트층을 컬럼을 이용하여 사우세르네올 F를 얻을 수 있다.

본 발명은 상기 제법으로 얻어진 삼백초 추출물에서 분리된 화합물 SCE25-20을 유효성분으로 함유하고, 염증, 알러지성 질환, 혈관질환의 예방 또는 치료에 효과적인 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 삼백초 추출물에서 분리한 화합물 SCE25-20을 함유하는 약학조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 화합물을 0.01 ~ 99.9% 함유하는 것이 바람직하고, 0.1 ~ 90% 함유하는 것이 더욱 바람직하다. 그러나 상기와 같은 조성은 반드시 이에 한정되는 것은 아니고, 환자의 상태 및 질환의 종류 및 진행 정도에 따라 변할 수 있다.

본 발명의 화합물을 포함하는 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 화합물을 포함하는 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 추출물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤 조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 화합물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 화합물은 1일 0.0001 내지 100mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 10 mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수 있다. 따라서, 상기 투여량 은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 화합물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내 (intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 추출물의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.

본 발명은 염증, 알러지성 질환 및 혈관질환 예방 및 치료 효과를 나타내는 삼백초에서 분리한 화합물 SCE25-20 및 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제를 포함하는 건강보조식품을 제공한다.

본 발명의 화합물은 염증, 알러지성 질환 및 혈관질환의 예방 및 치료를 위한 약제, 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있다. 본 발명의 화합물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있고, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있다.

본 발명의 화합물은 독성 및 부작용은 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있는 약제이다.

본 발명의 상기 화합물은 염증, 알러지성 질환 또는 혈관질환의 예방 및 치료를 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이때, 식품 또는 음료 중의 상기 화합물의 양은 일반적으로 본 발명의 건강식품 조성물은 전체 식품 중량의 0.01 내 지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 30 g, 바람직하게는 0.3 내지 10 g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 건강 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 화합물을 함유하는 것 외에 액체성분에는 특별한 제한점은 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등의 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등의 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다.

상기 외에 본 발명의 화합물은 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반 적이다.

이하, 본 발명을 실시예 및 실험예 에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 삼백초 조추출물 제조

대구 약령시에서 구입한 건조된 삼백초 뿌리 9.7 ㎏을 세절하여 70 % 메탄올 13 ℓ에 침지 시킨 후 실온에서 추출액을 수득하고, 다시 각각 10ℓ의 메탄올을 가하여 2회 더 추출하였고, 상기 각 추출액을 여과한 후, 여과액을 혼합하였다. 상기 메탄올 추출물을 감압, 농축 및 건조하여 총 추출물 1 kg을 수득하였다.

영남대학교 약학대학 약초원에서 재배한 건조된 삼백초 지상부(줄기, 잎) 1.0 ㎏을 상기 제조방법과 동일한 방법으로 추출물을 제조하여 총 추출물 100g을 수득하였다.

실시예 2. 삼백초 추출물의 분획물 제조

2-1. 삼백초 헥산 분획물 제조

상기 실시예 1의 삼백초 뿌리 조추출물 중 950g을 1.4ℓ의 증류수에 현탁시킨 다음, 헥산 가용성 분획물 및 수가용성 분획물을 수득하여 각각을 감압, 농축 및 건조하여 헥산 가용성 분획물 136g 및 수가용성 분획물 850g을 수득하였다.

2-2. 삼백초 에틸아세테이트 분획물 제조

상기 실시예 2-1의 삼백초 수가용성 분획물에 1.4 ℓ의 증류수에 현탁시킨 다음, 에틸아세테이트 1.4 ℓ를 가하여 3회 추출하였으며, 에틸아세테이트 가용성 분획물 및 수가용성 분획물을 수득하여 각각을 감압, 농축 및 건조하여 에틸아세테이트 가용성 분획물 182g 및 수가용성 분획물 680g을 수득하였다.

2-3. 삼백초 부탄올 분획물 제조

상기 실시예 2-2의 삼백초 수가용성 분획물에 1.4 ℓ의 증류수에 현탁시킨 다음, 부탄올 1.4 ℓ를 가하여 3회 추출하였으며, 부탄올 가용성 분획물 및 수가용성 분획물을 수득하여 각각을 감압, 농축하여 부탄올 가용성분획물 42g 및 수가용성 분획물 620g을 수득하였다.

실시예 3. SCE25 -20 화합물의 분리

상기 실시예 2-2의 삼백초 에틸아세테이트 가용부 130g을 250g의 실리카겔 (No.7734, 70-230 mesh, Merck사)에 흡착시킨 후 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(12×60㎝)를 시간당 1000㎖로 수행하였다. 이때 전개용매로서 n-헥산을 초기 용매로 하여 점점 극성을 증가시키면서(n-헥산 : 에틸아세테이트(n-헥산 100% → 에틸아세테이트 100%) → 에틸아세테이트 : 메탄올(에틸아세테이트 100% → 메탄올 100%)) 용출시켰으며, 최종적으로 메탄올로 극성분획을 세척하여 PGD₂, LTC₄, 탈과립억제, NO iNOS 단백질 발현 억제를 통한 NO 생성억제 및 MMP-9 저해활성 물질을 용출시켜 39개의 분획으로 나누었다.

각각의 분획에 대해 실리카겔크로마토그래피, Rp-18(ODS) 컬럼 크로마토그래피를 반복적으로 행하여 하기 1개의 화합물을 얻었다. 상기 분리과정을 도 1에 나타내었다.

화합물 SCE25-20 은 실시예 2-2의 에틸아세테이트 분획을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(12 x 6O㎝, 전개용매; n-헥산 : 에틸아세테이트(n-헥산 100% → 에틸아세테이트 100%) → 에틸아세테이트 : 메탄올(에틸아세테이트 100% → 메탄올 100%))를 수행하여 시간당 1000㎖로 수행하여 39개 분획물을 얻었다. 이중 25번째 분획물(1.3g)을 Rp-18(ODS) 컬럼 크로마토그래피 (4 × 50 cm, 전개용매; 메탄올 : 물 (50:50) → 메탄올 100 %)를 수행하여 시간당 200㎖로 수행하여 24개의 분획물을 얻었다. 이 중 20번째에서 C화합물 SCE25-20 0.23g 을 수득하였으며, 화합물을 선광(optical rotation), NMR 분석기기로 분석한 결과는 하기와 같다.

60.6° (c 0.2, CHCl₃)

¹H-NMR (CDCl₃, 250 MHz) δ 6.74 ~ 6.93(9H, m, aromatic protons), 5.93 (2H, s, -OCH₂O-), 5.92 (2H, s, -OCH₂O-), 5.40 (2H, d, J = 6.0 Hz, H-7, H-7´), 4.61 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-7´´), 4.09 (1H, m, H-8´´), 3.90 (3H, s, -OCH₃), 2.20 ~ 2.30 (2H, m, H-8, 8´), 1.14 (3H, d, J = 6.2 Hz, H-9´´), 0.69 (6H, d, J = 6.3 Hz, H-9, 9´)

¹³C-NMR (CDCl₃, 62.9 MHz) δ 150.9 (C-3´), 148.1 (C-3´´), 147.9 (C-4´´), 147.8 (C-3), 146.8 (C-4), 146.7 (C-4´), 137.1 (C-1´), 135.8 (C-1), 134.4 (C-1´´), 121.5 (C- 6´´), 119.7 (C-6), 119.3 (C-6´), 119.1 (C-5´), 110.5 (C-5´´), 108.5 (C-2´), 108.2 (C-2´´), 108.0 (C-5), 107.3 (C-2), 101.4 (-OCH₂O-), 101.3 (-OCH₂O-), 84.5 (C-8´´), 84.1 (C-7), 83.9 (C-7´), 78.8 (C-7´´), 56.2 (-OCH₃), 44.3 (C-8), 44.2 (C-8´), 17.4 (C-9´´), 15.1 (C-9, 9´)

실험예 1. 프로스타글란딘 D ₂ 생합성에 대한 영향 조사

상기 실시예에서 제조된 삼백초에서 분리 정제한 화합물 SCE25-20의 프로스타글란딘 D₂ (PGD₂) 생성에 미치는 영향을 검토하기 위하여 하기 실험을 실시하였다.

쥐 골수 유래의 비만세포 (BMMC, mouse bone marrow-derived mast cells)를 BALB/C 마우스로부터 무라카미 등의 방법 [Murakami et al.; J. Biol . Chem . 269, pp 22269-22275 (1994)]으로 골수에서 분리하여, IL-3 생산 세포인 WEHI-3 세포(일본 Showa 대학 약학부 Kudo Ichiro 교수 제공)의 배양 상등액을 함유한 50% WEHI-3 조건 하 배지(conditioned medium, 10% FCS함유)로 배양하였다.

배양 3주 후 비만세포에 SCF/LPS/IL-10 혼합자극제(Sigma 사)를 30분 처리 처리하였다. 세포 자극 후의 상층액의 PGD₂ 정량은 PGD₂ 분석 키트(Cayman 사)를 이용하여 EIA(Enzyme linked immuno assay)로 측정하였다. 이때 COX-1에 의해서 생성되는 PGD₂의 생성을 억제시키기 위하여 BMMC에 아스피린(aspirin, 10 ug/ml)을 미리 1시간 전 처리한 BMMC를 사용하였다. 안스리신은 미리 15분간 전처리 한 후 자극제를 가하여 생성되는 PGD₂의 생성량을 측정하였다. 그리고 사이크로옥시게나제-1 (COX-1)에 의한 PGD₂의 생성은 SCF/LPS/IL-10 혼합자극제(Sigma 사)를 처리한 후 1시간 후 생성되는 량을 측정하였다.

실험결과, 하기 도 2에 화합물 SCE25-20의 각각의 PGD₂ 생성 억제율이 나타나 있으며, 화합물 SCE25-20 은 용량 의존적으로 PGD₂의 생성을 저해하였으며, 50% 저해하는데 필요한 농도는 COX-2의 경우 7.1 μM이었다.

실험예 2. 류코트리엔 생성에 대한 영향 분석 실험

상기 실시예에서 제조된 화합물 SCE25-20의 류코트리엔 C₄(LTC₄) 생성에 미치는 영향을 검토하기 위하여 하기 실험을 실시하였다.

쥐 골수 유래의 비만세포를 BALB/C 마우스로부터 무라카미 등의 방법 [Murakami et al.; J. Biol . Chem. 269, pp 22269-22275, 1994]으로 골수에서 분리하여, IL-3 생산 세포인 WEHI-3 세포(일본 Showa 대학 약학부 Kudo Ichiro 교수 제 공)의 배양상등액을 함유한 50% WEHI-3 조건하 배지(conditioned medium, 10% FCS함유)로 배양하였다.

배양 3주 후 비만세포에 SCF(Sigma 사)를 30분 처리하였다. 세포 자극 후의 상층액의 LTC₄ 정량은 LTC₄ 분석 키트(Cayman 사)를 이용하여 EIA로 측정하였다. 화합물 SCE25-20 을 미리 15분간 전 처리한 후 자극제를 가하여 생성되는 LTC₄의 생성량을 측정하였다.

실험결과, 하기 도 3에 SCE25-20 화합물들의 각각의 LTC₄ 생성 억제율이 나타나 있으며, 화합물 SCE25-20 은 용량 의존적으로 LTC₄의 생성을 저해하였으며, 50% 저해하는데 필요한 농도는 1.34 μM 이었다..

실험예 3. 비만세포 탈과립반응에 미치는 화합물 SCE25 -20의 영향 (β-Hexosaminidase, β-HEX)

상기 제조한 쥐 골수유래의 비만세포 (BMMC) 2Ｘ105 cells/ml에 화합물 SCE25-20 을 농도(0.1-10 μM) 별로 처리하여 37℃, 5% CO2 조건 하에서 30분간 동안 전배양(preincubation)한 후 SCF (KL, c-kit ligand, 100 ng/ml)로 자극하여 15분간 배양하고 3000rpm, 4℃에서 5분간 원심분리 하였다. 상층 액을 β-hex (substrate [100mM citrate buffer (citric acid 0.955%, sodium citratedihydrate 1.478%, pH 4.5), 1.3mg/ml p-nitrophenyl-N-acetyl-b-D-glucosaminide] 와 1:2 혼합시키고 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 후, 0.2 M 글리신(glycine)(pH 10.7)으로 반응을 정지시켜 ELASA를 사용하여 405nm 파장에서 흡광도를 측정하고 그 측정값을 탈 과립(release) %로 환산하였다.

실험결과, 하기 도 4에 β-HEX(β-Hexosaminidase)유리억제 효과에 대해 나타내었다.

실험예 4. LPS 로 유도한 식세포로부터 방출된 NO 라디칼의 제거 효과

본 발명의 화합물 SCE25-20의 라디칼 제거 효과를 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

포함된 RPMI 1640 배지 (pH 7.6)에 용해시킨 화합물 SCE25-20 을 미리 1.6-50 μM의 농도를 가하여 30분간 전 처리한 후 LPS (200 ng/ml)를 가하여 24시간 배양하였다. 배양 후, NO의 농도는 그리에스 법을 이용하여 측정하였다.

산화질소의 양은 배양된 상층액에서 아질산염을 분석함으로써 확인하였다. Raw 264.7 cell을 24-well plate에 5Ｘ105개로 분주하고 24시간 동안 안정화시킨 후, 배양액을 교체하고 SCE25-20를 농도별로 30분 전처리 한 다음 LPS (200 ng/ml)을 처리하여 활성화시켰다. 24시간 동안 37℃ 5% CO2에서 배양한 후 120Ｘg, 4℃에서 5분간 원심분리 하여 상층액을 취했다. 배양 상층액을 100 ml 그리스시약(Griess reagent, 1% sulfanilamide, 0.1% naphylethylenedimine dihydrochloride, 2.5% phosphoric acid)와 1:1로 혼합하여 상온에서 10분 반응하였다. 반응 후 발색 된 흡광도는 ELISA 리더(reader)를 사용하여 570nm 파장에서 측정하였다. 새로운 배양액 배지를 모든 실험에서 공시료로 사용하였으며 아질산염의 농도는, 질산나트 륨(NaNO₂) 반응으로부터 얻어진 표준 곡선으로부터 환산하였다.

실험 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이 화합물 SCE25-20 은 용량 의존적으로 NO라디칼을 현저하게 저해함을 보여주었으며, 50% 억제에 필요한 농도는 1.66 μM 이었다. 또한 화합물 SCE25-20 은 용량 의존적으로 NO 라디칼 생성에 관여하는 iNOS의 단백질 발현을 용량의존으로 억제함으로서 NO 라디칼의 억제는 iNOS 단백질 발현에 기인함을 알 수 있었다.

실험예 5. MMP -9 저해 활성 실험

MMP-9 활성은 문헌에 기재된 방법으로 실시하였다 (Demeule, et al., Biochimica et Biophysica Acta 1478, pp 51-60, 2000 ; Chung, et al., FASEB Journal 18(14), pp 1670-1681, 2004b ; Ha, et al., Toxicology and Applied Pharmacology 200(1), pp 1-6, 2004a). 화합물 SCE25-20을 농도별로 ( 0, 3.2, 6.4, 12.5, 25, 50 μM) 실시하였다.

실험 결과 화합물 SCE25-20 은 도 6에 나타낸 바와 같이 용량 의존적으로 MMP-9의 활성을 억제하였다.

제제예 1. 주사제제의 제조

화합물 SCE25-20..............................10 mg

만니톨.......................................180 mg

주사용 멸균 증류수..........................2974 mg

Na₂HPO₄·12H₂O..............................26 mg

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다.

제제예 2. 정제의 제조

실시예 2-1의 화합물 SCE25-20....................10㎎

유당...........................................100㎎

전분...........................................100㎎

스테아린산 마그네슘 ............................적량

상기의 성분을 혼합하고 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

제제예 3. 캡슐제의 제조

화합물 SCE25-20...............................10 mg

결정성 셀룰로오스..............................3 mg

락토오스 ....................................14.8 mg

마그네슘 스테아레이트.........................0.2 mg

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전 하여 캡슐제를 제조한다.

제제예 4. 액제의 제조

화합물 SCE25-20 .............................20 mg

이성화당.......................................10 g

만니톨......................................... 5 g

정제수.........................................적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.

제제예 5. 건강 음료의 제조

화합물 SCE25-20............................... 100 ㎎

비타민 C....................................... .15 g

비타민 E (분말).................................100 g

젖산철 ........................................19.75 g

산화아연........................................ 3.5 g

니코틴산아미드...................................3.5 g

비타민 A.........................................0.2 g

비타민 B1...................................... 0.25 g

비타민 B2 ........................................0.3g

물 ...............................................정량

통상의 건강 음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2ℓ용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강 음료 조성물 제조에 사용한다.

상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요계층, 수요국가, 사용 용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

상기에 언급한 바와 같이, 본 발명의 신규 화합물인 SCE25-20는 삼백초로부터 분리한 것으로 염증, 알러지반응에 관여하는 프로스타글란딘 D₂, 류코트리엔 C₄의 생성을 억제, 탈과립반응 억제, 니트릭 옥사이드 (NO) 라디칼 생성물을 억제함으로써 항염증, 항알러지 효과를 나타내며, 또한 MMP-9을 억제하여 혈관질환의 예방 및 치료를 위한 약학조성물 및 건강기능식품으로 이용될 수 있다.

Claims (6)

1. 하기 구조식(1)의 화합물 SCE25-20 을 유효성분으로 포함하는 동맥경화, 류마티스성 관절염, 알러지성 비염, 알러지성 피부염, 허혈성 심근경색 또는 뇌졸중의 예방 및 치료를 위한 약학조성물:

   
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