CN105287659B - 含有奎尼酸类及糖苷类化合物的檵木提取物及其医药用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种白花檵木提取物，所述提取物含有奎尼酸衍生物类成分和糖苷类成分。其中奎尼酸衍生物类成分为绿原酸甲酯、绿原酸乙酯、5‑O‑p‑香豆酰奎尼酸甲酯的一种或多种；糖苷类成分为红景天苷、(Z)‑3‑己烯基‑O‑α‑L‑吡喃鼠李糖‑(1→6)‑β‑D‑吡喃葡萄糖苷、苄基‑O‑α‑L吡喃鼠李糖‑(1→6)‑β‑D‑吡喃葡萄糖苷、杨梅苷、槲皮素‑3‑O‑(6″‑O‑没食子酰基)‑β‑葡萄糖苷的一种或多种。本发明还涉及白花檵木提取物的制备方法、药物组合物及其在制备止血药物或产品中的应用。本发明提取物的药效学和急性毒性实验表明，本发明提取物具有有效成分清楚、药效作用强、毒副作用小，以及产品纯度高，服用剂量小，质量可控等优点。

Description

含有奎尼酸类及糖苷类化合物的檵木提取物及其医药用途

技术领域

本发明属于中药、化学药物领域，具体地，本发明涉及富含奎尼酸衍生物和糖苷类成分的白花檵木提取物、其制备方法及其在治疗出血性疾病和制备止血药物方面的应用。

背景技术

出血是许多疾病的临床表现，也是导致患者死亡的重要原因之一。临床上的出血性疾病是由于先天性或获得性止血机制(包括血管、血小板数量和质量、凝血因子)异常引起的自发性或创伤造成的出血不止的一类疾病，该类疾病严重威胁着患者的生命和健康。止血药可通过收缩小动脉及毛细血管、增强血小板功能、加速血液凝固过程、抑制血块溶解过程而产生止血作用。目前国内临床常用的止血药约有20多种，根据其凝血作用机制可分为四大类：促凝血因子活性药如血凝酶、去氨加压素、维生素K类止血药等；降低毛细血管通透性药如卡巴克洛、卡络磺钠；抗纤维蛋白溶解药如氨基己酸、氨甲苯酸、止血环酸、抑肽酶等；外用止血药如纤维蛋白胶、胶原蛋白、壳聚糖、可吸收性明胶海绵、氧化纤维素、微纤维胶原等。现有的止血药物在应用中都存在一定的局限性，如容易导致血栓、不适用于创面及大手术出血、止血速度慢等。由于上述局限性的存在，新止血药的研发一直受到较多关注。

檵木(Loropetalum chinense)也称为白花檵木，为金缕梅科(Hamamelidaceae)檵木属(Loropetalum)植物，其味苦、涩，以花、叶和根入药，具有清热解毒、收敛止血的作用，广泛用于治疗各种出血、烧烫伤、皮肤感染、痢疾腹泻等。现代药理研究发现白花檵木具有止血、抑菌、抗炎、促愈合和抗氧化等作用。白花檵木中主要含有挥发油、鞣质、黄酮、木脂素等成分。迄今为止，国内外学者从白花檵木中分离得到了约50余个化合物，主要为鞣质和黄酮类化合物。

在现有的有关檵木的专利中，公开号为CN101153303A的专利为檵木总黄酮的提取工艺专利，不涉及用途，该专利中的总黄酮定量方法存在较大误差；公开号为CN101485701A和CN102579524A的专利所涉及的医药用途分别为檵木治疗烧烫伤和促进伤口愈合，其有效成分并不明确。公开号为CN102134187B的专利公开了一种由檵木中分离得到的化合物及其抗炎、抗菌的医药用途。公开号为CN102716157A的专利公布了一种檵木总酚的制备方法及其止血作用，采用乙醇回流提取和大孔树脂分离得到总酚类化合物，但总酚中的主要成分没食子酸、芦丁、杨梅素、槲皮素、山奈酚等化合物的止血作用未经过实验确证，因而上述化合物不能代表檵木止血作用的有效成分。

本发明采用丙酮室温浸泡的方法对檵木进行提取，采用与中国专利CN102716157A中所用的型号不同的大孔树脂分离得到具有明确止血活性的部位，通过对活性部位中的各类化学成分进行系统分离和活性筛选研究，首次公开了此前并未在檵木中发现的绿原酸甲酯、绿原酸乙酯、5-O-p-香豆酰奎尼酸甲酯等奎尼酸衍生物和红景天苷、(Z)-3-己烯基-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷、苄基-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷、槲皮素-3-O-(6″-O-没食子酰基)-β-葡萄糖苷等糖苷类化合物，并且通过动物实验证实了这些化合物的止血作用。国内外相关研究中未见有从白花檵木中获得止血活性良好的奎尼酸衍生物和糖苷类成分复合物的相关报道。

发明内容

本发明的一个方面涉及一种白花檵木提取物，其富含有奎尼酸衍生物类成分和糖苷类成分。其中，奎尼酸衍生物类成分为绿原酸甲酯、绿原酸乙酯、5-O-p-香豆酰奎尼酸甲酯的一种或多种；糖苷类成分为红景天苷、(Z)-3-己烯基-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷、苄基-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷、杨梅苷、槲皮素-3-O-(6″-O-没食子酰基)-β-葡萄糖苷的一种或多种。

在本发明的一个实施方案中，以提取物的总重量计算，上述奎尼酸衍生物和糖苷类成分以重量比合计为30％-90％，30-90％，优选为60％-80％。

在本发明的一个实施方案中，以提取物的总重量计算，绿原酸甲酯、绿原酸乙酯、红景天苷、杨梅苷四种成分的含量以重量百分比记分别为：1-5％、0.6-3％、0.3-1.5％、5-20％；优选为1-3.5％、1-2％、0.5-1％、5-15％。

本发明的另一方面涉及上述的白花檵木提取物的制备方法，包括如下步骤：

1)将白花檵木药材以丙酮室温浸泡提取，浓缩后得到粗提物；

2)将药材粗提物在水中分散均匀，用低级性溶剂萃取除去低级性成分，得到水溶性部分；

3)水溶性部分浓缩后，过大孔树脂柱，以10％、20％、30％、40％、50％、70％、95％乙醇-水梯度洗脱，将20％、30％、40％洗脱液减压蒸干，得到不同极性部位。

4)将3)所得30％乙醇洗脱物加水溶解，用反相C₁₈硅胶柱层析，以不同浓度的甲醇水溶液(10％，20％，30％，40％，50％，70％，95％)梯度洗脱，划分成F1-F46段。

F19-20段合并记为组分B，再用反相C₁₈硅胶柱层析，以不同浓度的甲醇水溶液(5％，10％，15％，20％，25％，30％，40％，50％，100％)梯度洗脱，划分成B1-B58。其中B8-B10合并，用LH-20柱层析，甲醇洗脱，划分成B-8-1至B-8-58，其中组分B-8-16至B-8-26合并，用硅胶柱层析，以二氯甲烷∶甲醇∶水＝9∶1∶0.1-8∶2∶0.2洗脱，得到单体化合物红景天苷；组分B-8-27用硅胶柱层析，以二氯甲烷∶甲醇∶水＝8∶2∶0.2洗脱，得到单体化合物5-O-p-香豆酰奎尼酸甲酯；组分B-8-29至B-8-33合并，用硅胶柱层析，以二氯甲烷∶甲醇∶水＝8∶2∶0.2洗脱，得到单体化合物绿原酸甲酯；组分B48-B51合并，用硅胶柱层析，以二氯甲烷∶甲醇＝95∶5洗脱，得到单体化合物绿原酸乙酯。

F39-41段合并记为组分I，用硅胶柱层析，以二氯甲烷∶甲醇∶水＝9∶1∶0.1-8∶2∶0.2洗脱，划分成I1-I52。其中I20-I21合并，用LH-20柱层析，甲醇∶水＝2∶1洗脱，得到单体化合物苄基-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷；I24-I25合并，用LH-20柱层析，甲醇∶水＝2∶1洗脱，得到单体化合物(Z)-3-己烯基-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷；I29-I32合并，用LH-20柱层析，甲醇洗脱，得到单体化合物槲皮素-3-O-(6″-O-没食子酰基)-β-葡萄糖苷。

F42-44段合并记为组分J，用聚酰胺柱层析，以甲醇∶水＝1∶1-9∶1梯度洗脱，划分成J1-J71，其中组分J14-J40合并，用LH-20柱层析，甲醇∶水＝2∶1洗脱，得到单体化合物杨梅苷。

采用室温冷浸提取时，包括以下步骤：取适量白花檵木药材切为2-3cm小段，加入固液比为1∶8-1∶10的丙酮，室温浸泡提取，然后合并提取液，减压浓缩至干。

采用溶剂萃取法除去低级性成分时，包括以下步骤：取药材的粗提物在水中分散，然后加入体积比为1∶1-1∶4的低级性的酯类、烷烃类或醚类溶剂萃取3-5次，以除去其中的色素等。其中优选的溶剂为石油醚、环己烷、乙酸乙酯。萃取后水层挥干有机溶剂得到水溶性成分。

采用大孔吸附树脂法时，包括以下步骤：将萃取除杂后的水溶性成分减压浓缩至浓度为200-300g/L的提取液，上大孔树脂柱，树脂柱径高比为1∶6-1∶10，上样后用2-4倍BV的10％、20％、30％、40％、50％、70％、95％乙醇-水梯度洗脱，洗脱流速为3-9BV/h，收集20％、30％、40％洗脱液减压浓缩至干，得到富含有奎尼酸衍生物类成分和糖苷类成分的白花檵木提取物。

大孔树脂包括非极性、弱极性、中等极性、弱碱性或弱酸性等任意一种类型的树脂，如HP20、D4020、S-8、HZ-806、D4006、X-5、NKA-II、NKA-9等，其中优选的为弱极性或中等极性的树脂HP20、I-IPD400、D4006、X-5等，更优选为HP20型树脂。

本发明的又一方面涉及该提取物制备的药物组合物，该提取物可以单独或与其它任何中西药物或食品按任意比例配伍，用于制备药物或功能性食品，所制得的药物或功能性食品可以是胶囊剂、片剂、丸剂、颗粒剂、口服液、糖浆、冲剂、注射剂、酒剂、膏剂、外用散剂、外用膜剂、外用贴剂、凝胶剂、饮料等。

本发明药物组合物中含有的载体或赋形剂包括药剂学常规应用的载体和赋形剂，例如填充剂、粘合剂、防腐剂、矫味剂、稀释剂、着色剂等，本发明药物组合物可按本领域已知方法制备。

本发明的又一方面涉及白花檵木提取物在制备治疗出血性疾病和止血产品或药物中的应用，其中的出血包括皮肤、粘膜和内脏的自发性出血或由外力所致损伤引起的出血不止。

本发明的提取物可采用本领域已知的或者本文公开的途径给药。给药途径包括但不局限于下述几种：外用(包括眼、鼻)；吸入(包括气管内、口腔内、过皮或皮外的乳化剂或喷雾剂)；口服；注射或点滴(包括静脉、动脉、皮下腹腔或肌肉内)；颅内给药(包括鞘膜、脑室内)。

本发明提取物及其有效成分的用量取决于适用对象的年龄、体重和疾病的类型及严重程度等因素。

发明的有益效果

基于白花檵木的传统用途及现代药理实验，本发明经实验研究确诊白花檵木止血作用的有效部位并分离得到本发明的富含富含有奎尼酸衍生物类成分和糖苷类成分的白花檵木提取物，用以止血和治疗出血性疾病。本发明解决了长期以来存在的白花檵木提取物有效剂量高、质量难以控制等中药使用局限。本发明提取物的药效学和急性毒性实验表明，本发明提取物具有有效成分清楚、药效作用强、毒副作用小，以及产品纯度高，服用剂量小，质量可控等优点。

附图说明

附各个化合物的核磁共振氢谱

图1为红景天苷的氢谱图。

图2为5-O-p-香豆酰奎尼酸甲酯的氢谱图。

图3为绿原酸甲酯的氢谱图。

图4为绿原酸乙酯的氢谱图。

图5(A)为苄基-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷的氢谱图；图5(B)为苄基-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷的碳谱图。

图6(A)为(Z)-3-己烯基-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷的氢谱图；图6(B)为(Z)-3-己烯基-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷的碳谱图。

图7(A)为槲皮素-3-O-(6″-O-没食子酰基)-β-D-葡萄糖苷的氢谱图；图7(B)为槲皮素-3-O-(6″-O-没食子酰基)-β-D-葡萄糖苷的碳谱图。

图8为杨梅苷的氢谱图。

具体实施方式

本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明具体生产厂商者，均可以通过市购获得的常规产品。

实施实例1：白花檵木总提取物及不同极性部位的制备

取白花檵木干燥药材20kg，切为2-3cm小段，用8-10倍丙酮室温浸泡提取3次，每次5天，合并提取液，减压浓缩至干，得白花檵木总提取物902g。称取丙酮提取物793.5g，加入4L去离子水超声分散，加入4L石油醚萃取5次。将水层蒸干，得到水溶性部位564.5g。加入2L去离子水溶解，过滤后上HP20大孔树脂，树脂柱径高比1∶8，上样后用2倍BV的10％、20％、30％、40％、50％、70％、95％乙醇-水梯度洗脱，收集20％、30％、40％乙醇洗脱液减压蒸干，得到白花檵木20％、30％、40％乙醇洗脱部位。

实施实例2：各单体化合物的制备和光谱分析

取白花檵木干燥药材20kg，用实施实例1方法制备白花檵木30％乙醇洗脱部位。将制得的30％乙醇洗脱部位取30.7g，以20ml水溶解，过滤后用反相C₁₈硅胶柱层析，以不同浓度的甲醇水溶液(10％，20％，30％，40％，50％，70％，95％)梯度洗脱，划分成F1-F46段。F19-20段合并记为组分B，再用反相C₁₈硅胶柱层析，以不同浓度的甲醇水溶液(5％，10％，15％，20％，25％，30％，40％，50％，100％)梯度洗脱，划分成B1-B58。其中B8-B10合并，用LH-20柱层析，甲醇洗脱，划分成B-8-1至B-8-58，其中组分B-8-16至B-8-26合并，用硅胶柱层析，以二氯甲烷∶甲醇∶水＝9∶1∶0.1-8∶2∶0.2洗脱，得到单体化合物红景天苷；组分B-8-27用硅胶柱层析，以二氯甲烷∶甲醇∶水＝8∶2∶0.2洗脱，得到单体化合物5-O-p-香豆酰奎尼酸甲酯；组分B-8-29至B-8-33用硅胶柱层析，以二氯甲烷∶甲醇∶水＝8∶2∶0.2洗脱，得到单体化合物绿原酸甲酯；组分B48-B51合并，用硅胶柱层析，以二氯甲烷∶甲醇＝95∶5洗脱，得到单体化合物绿原酸乙酯。F39-41段合并记为组分I，用硅胶柱层析，以二氯甲烷∶甲醇∶水＝9∶1∶0.1-8∶2∶0.2洗脱，划分成I1-I52。其中I20-I21合并，用LH-20柱层析，甲醇∶水＝2∶1洗脱，得到单体化合物苄基-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷；I24-I25合并，用LH-20柱层析，甲醇∶水＝2∶1洗脱，得到单体化合物(Z)-3-己烯基-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷；I29-I32合并，用LH-20柱层析，甲醇洗脱，得到单体化合物槲皮素-3-O-(6″-O-没食子酰基)-β-葡萄糖苷。F42-44段合并记为组分J，用聚酰胺柱层析，以甲醇∶水＝1∶1-9∶1梯度洗脱，划分成J1-J71，其中组分J14-J40合并，用LH-20柱层析，甲醇∶水＝2∶1洗脱，得到单体化合物杨梅苷。

以下为上述实验得到的各个单体化合物的理化性质及波谱特征：

化合物1(红景天苷，salidroside)：白色无定型粉末；三氯化铁乙醇溶液喷雾显蓝色；ESI-MS m/z：323[M+Na]⁺，299[M-H]^-；¹H NMR(CD₃OD，400MHz)δ：6.96(2H，d，J＝8.4Hz，H-2，H-6)，6.60(2H，d，J＝8.4Hz，H-3，H-5)，4.18(1H，d，J＝7.8Hz，H-1′)，3.93(1H，m，H-8a)，2.73(2H，m，H-7)，3.76(1H，dd，J＝1.7，11.8Hz，H-6a′)，3.58(1H，m，H-8b)，3.58(1H，m，H-6b′)，3.00-3.30(4H，m，H-2′，H-3′，H-4′，H-5′)(图1)。

化合物2(5-O-p-香豆酰奎尼酸甲酯，5-O-p-coumaroylquinic acid methylester)：白色无定型粉末；三氯化铁乙醇溶液喷雾显蓝色；ESI-MS m/z：353[M+H]⁺，375[M+Na]⁺，351[M-H]^-。¹H-NMR(CD₃OD，400MHz)δ：7.57(1H，d，J＝16.0Hz，H-7′)，7.45(2H，d，J＝8.0Hz，H-2′，6′)，6.80(2H，d，J＝8.0Hz，H-3′，5′)，6.27(1H，d，J＝16.0Hz，H-8′)，5.26(1H，m，H-3)，4.13(1H，m，H-5)，3.68(3H，s，H-8)，2.23-1.98(4H，m，H-2、H-6)(图2)。

化合物3(绿原酸甲酯，methyl chlorogenate)：白色无定型粉末；三氯化铁乙醇溶液喷雾显蓝色；ESI-MS m/z：369[M+H]⁺，391[M+Na]⁺，367[M-H]^-。¹H-NMR(CD₃OD，400MHz)δ：7.52(1H，d，J＝16.0Hz，H-7′)，7.04(1H，d，J＝2.0Hz，H-2′)，6.94(1H，dd，J＝8.0，2.0Hz，H-6′)，6.79(1H，d，J＝8.0Hz，H-5′)，6.21(1H，d，J＝16.0Hz，H-8′)，5.27(1H，m，H-3)，4.13(1H，m，H-5)，3.73(1H，m，H-4)，3.69(3H，s，H-8)，2.23-1.98(4H，m，H-2，6)(图3)。

化合物4(绿原酸乙酯，ethyl chlorogenate)：白色无定型粉末；三氯化铁乙醇溶液喷雾显蓝色；ESI-MS m/z：383[M+H]⁺，405[M+Na]⁺，381.2[M-H]^-。¹H-NMR(CD₃OD，400MHz)δ：7.52(1H，d，J＝16.0Hz，H-7′)，7.02(1H，d，J＝2.0Hz，H-2′)，6.93(1H，dd，J＝8.0，2.0Hz，H-6′)，6.77(1H，d，J＝8.0Hz，H-5′)，6.21(1H，d，J＝16.0Hz，H-8′)，5.27(1H，m，H-3)，4.13(2H，m，H-CH₂ CH₃)，4.13(1H，m，H-5)，3.73(1H，m，H-4)，2.21-2.00(4H，m，H-2，6)，1.22(3H，t，J＝7.0Hz，H-CH₂ CH₃ )(图4)。

化合物5[苄基-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷，Benzyl-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyrano-side]：淡黄色无定形粉末。ESI-MS m/z：439[M+Na]⁺，415[M-H]^-。¹H NMR(CD₃OD，400MHz)δ7.33-7.17(5H，m，H-2～H-6)，4.78(1H，overlap，H-7^a)，4.68(1H，d，J＝1.7Hz，H-1″)，4.54(1H，d，J＝11.8Hz，H-7b)，4.22(1H，d，J＝7.8Hz，H-1′)，3.90(1H，dd，J＝11.2，1.7Hz，H-6′a)，3.77(1H，q-like，J＝1.7Hz，H-6′^b)，3.62-3.52(3H，m)，3.31-3.11(3H，m，overlap)，1.17(3H，d，J＝6.2Hz，H-6″)(图5A)。¹³C NMR(CD₃OD，100MHz)δ：138.6(C-1)，129.0(C-2，3，5，6)，128.5(C-4)，73.7(C-7)，102.8(C-1′)，74.8(C-2′)，77.7(C-3′)，71.4(C-4′)，76.6(C-5′)，67.8(C-6′)，102.0(C-1″)，71.5(C-2″)，71.9(C-3″)，72.0(C-4″)，69.5(C-5″)，17.8(C-6″)(图5B)。

化合物6[(Z)-3-己烯基-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷，(Z)-3-Hexenyl-O O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranoside]：无色无定型粉末；ESI-MS m/z：431[M+Na]⁺，407[M-H]^-。¹H-NMR(CD₃OD，400MHz)δ：5.50-5.35(2H，m)，4.72(1H，d，J＝1.4Hz)，4.24(1H，d，J＝7.8Hz)，3.95(1H，dd，J＝11.1，1.8Hz)，3.84-3.78(2H，m)，3.68-3.10(8H，m)，2.37(2H，td，J＝6.8，6.8Hz)，2.07(2H，qd，J＝7.3，7.3Hz)，1.25(3H，d，J＝6.4Hz)，0.96(3H，d，J＝7.6Hz)(图6A)。¹³C-NMR(CD₃OD，100MHz)δ：134.4(C-4)，125.7(C-3)，104.3(C-1′)，102.1(C-1″)，77.9(C-3′)，76.7(C-5′)，74.9(C-2′)，73.9(C-4″)，72.2(C-3″)，72.1(C-2″)，71.5(C-4′)，70.5(C-1)，69.7(C-5″)，68.0(C-6′)，28.7(C-2)，21.5(C-5)，17.9(C-6″)，14.6(C-6)(图6B)。

化合物7[槲皮素-3-O-(6″-O-没食子酰基)-β-D-葡萄糖苷，quercetin-3-O-(6″-O-galloyl)-β-D-glucopyranoside]：淡黄色无定型粉末；三氯化铁乙醇溶液喷雾显蓝色；ESI-MS m/z：617[M+H]⁺，639[M+Na]⁺，615[M-H]^-。¹H-NMR(CD₃OD，400MHz)δ：7.51(1H，dd，J＝8.0，2.0Hz，H-6′)，7.51(1H，d，J＝2.0Hz，H-2′)，6.92(2H，s，H-2″′，6″′)，6.69(1H，d，J＝8.0Hz，H-5′)，6.31(1H，d，J＝2.2Hz，H-8)，6.15(1H，d，J＝2.2Hz，H-6)，5.18(1H，d，J＝7.8Hz，H-1″)，4.31(1H，dd，J＝12.0，5.0Hz，H-6″)，4.26(1H，dd，J＝12.0，2.0Hz，H-6″)，3.3-3.5(4H，m)(图7A)；¹³C-NMR(CD₃OD，100MHz)δ：159.3(C-2)，135.2(C-3)，179.3(C-4)，161.6(C-5)，100.0(C-6)，166.0(C-7)，94.9(C-8)，158.3(C-9)，105.4(C-10)，122.9(C-1′)，117.1(C-2′)，145.7(C-3′)，149.7(C-4′)，115.9(C-5′)，123.5(C-6′)，104.2(C-1″)，75.6(C-2″)，78.0(C-3″)，71.4(C-4″)，75.8(C-5″)，64.2(C-6″)，121.1(C-1″′)，110.1(C-2″′，6″′)，139.7(C-3″′，5″′)，146.3(C-4″′)，168.2(C＝O at 6″)(图7B)。

化合物8(杨梅苷，myricitrin)：淡黄色无定型粉末；三氯化铁乙醇溶液喷雾显蓝色；ESI-MS m/z：465[M+H]⁺，487[M+Na]⁺，463[M-H]^-。¹H-NMR(CD₃OD，400MHz)δ：6.95(2H，s，H-2′，6′)，6.34(1H，d，J＝2.0Hz，H-8)，6.18(1H，d，J＝2.0Hz，H-6)，5.31(1H，d，J＝1.6Hz，H-1″)，3.30-4.23(4H，m)，0.96(3H，d，J＝6.0Hz，H-6″)(图8)。

证明各单体化合物符合下述的结构。

部分单体化合物的结构

实施实例3：白花檵木总提取物、不同极性部位及单体化合物的止血作用评价。

1.大鼠断尾法评价实施例1的总提取物对出血时间、出血量的影响

实验动物：Wistar大鼠，雌雄各半，体重180g±10g，购自北京维通利华公司，饲养于本单位实验动物中心。

受试样品：实施例1的总提取物，以生理盐水溶解。

实验方法及结果：Wistar大鼠18只，随机分为3组，每组6只，在距尾根3cm处断尾后，腹腔注射给药，观察出血停止时间和出血量；或者腹腔注射给药30min后，距尾根3cm处断尾，观察出血停止时间和出血量。结果见表1。

表1.实施例1的总提取物(LC)对大鼠出血时间、出血量的影响(n＝6，x±s)

与空白对照组比较，^**P＜0.01

2.小鼠毛细玻管法评价实施例1的总提取物对凝血时间的影响

实验动物：ICR小鼠，雌雄各半，体重18-20g，购自北京维通利华公司，饲养于本单位实验动物中心。

受试样品：实施例1的总提取物(LC)、阳性药止血环酸(购自sigma公司)，以生理盐水溶解。

实验方法及结果：小鼠随机分组，每组10只，连续灌胃给药6天，每天1次。于第6天灌胃给药后1h，采用毛细管眼眶静脉丛取血，每间隔2-3s折断毛细管，观察有无血丝出现，记录毛细管中有血丝出现的时间，即为凝血时间；或者一次腹腔注射给药30min后，采用毛细管眼眶静脉丛取血，每间隔2-3s折断毛细管，观察有无血丝出现，记录毛细管中有血丝出现的时间，即为凝血时间。结果见表2-表3。

缩短率＝(空白组凝血时间-给药组凝血时间)/空白组凝血时间×100％

或

缩短率＝(给药前凝血时间-给药后凝血时间)/给药前组凝血时间×100％

表2.实施例1的总提取物(LC)灌胃给药对小鼠凝血时间的影响(n＝10，x±s)

与空白对照组比较，^**P＜0.01

表3.实施例1的总提取物(LC)腹腔注射给药对小鼠凝血时间的影响(n＝10，x±s)

与空白对照组比较，^**P＜0.01

3.小鼠毛细玻管法评价实施例1中20％、30％、40％乙醇洗脱部位对凝血时间的影响

实验动物：ICR小鼠，雌雄各半，体重18-20g，购自北京维通利华公司，饲养于本单位实验动物中心。

受试样品：实施例1中的白花檵木20％、30％、40％乙醇洗脱部位(LC20、LC30、LC40)，以生理盐水溶解。

实验方法及结果：小鼠随机分组，每组9只，腹腔注射给药30min后，采用毛细管眼眶静脉丛取血，每间隔2-3s折断毛细管，观察有无血丝出现，记录毛细管中有血丝出现的时间，即为凝血时间。结果见表4。

缩短率＝(空白组凝血时间-给药组凝血时间)/空白组凝血时间×100％

表4.实施例1中20％、30％、40％乙醇洗脱部位(LC20、LC30、LC40)腹腔注射给药对小鼠凝血时间的影响(n＝9，x±s)

与空白对照组比较，**P＜0.01

4.小鼠毛细玻管法评价实施例2中30％乙醇洗脱部位(LC30)所分离的单体化合物对小鼠凝血时间的影响

实验动物：ICR小鼠，雌雄各半，体重18-20g，购自北京维通利华公司，饲养于本单位实验动物中心。

受试样品：实施例2中白花檵木30％乙醇洗脱部位(LC30)单体化合物(化合物1-化合物8)，阳性药止血环酸(购自sigma公司)，以生理盐水溶解。

实验方法及结果：小鼠随机分组，每组8只，腹腔注射给药30min后，采用毛细管眼眶静脉丛取血，每间隔2-3s折断毛细管，观察有无血丝出现，记录毛细管中有血丝出现的时间，即为凝血时间。结果见表5。

缩短率＝(空白组凝血时间-给药组凝血时间)/空白组凝血时间×100％

表5.实施例2中的各单体化合物腹腔注射给药对小鼠凝血时间的影响(n＝9，x±s)

与空白对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

实施实例4：白花檵木总提取物、30％醇洗脱部位的急性毒性试验。

体重18-20g的ICR小鼠10只，雌雄各半，禁食12h，自由饮水，以5g/kg的剂量灌胃给予实施例1中所制得的白花檵木总提取物溶液，连续观察两周，小鼠无死亡，饮水量、耗食量、体重、表观体征无明显异常。

体重18-20g的ICR小鼠10只，雌雄各半，自由饮水进食，以300mg/kg的剂量腹腔注射给予实施例1中所制得的白花檵木总提取物溶液，观察24h小鼠无死亡。

体重18-20g的ICR小鼠10只，雌雄各半，自由饮水进食，以300mg/kg的剂量腹腔注射给予实施例1中所制得的白花檵木30％乙醇洗脱部位，观察24h小鼠无死亡。

实施实例5：白花檵木30％乙醇洗脱部位片剂的制备。

实施实例1所得白花檵木30％乙醇洗脱部位 100g

淀粉 100g

上述组分混合均匀，加滑石粉适量，压制成1000片。

尽管本发明的具体实施方案已经得到详细的描述。本领域的技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对哪些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims (7)

1.一种白花檵木提取物，其含有奎尼酸衍生物类成分和糖苷类成分，所述奎尼酸衍生物类成分为绿原酸甲酯、绿原酸乙酯和5-O-p-香豆酰奎尼酸甲酯；所述糖苷类成分为红景天苷、(Z)-3-己烯基-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷、苄基-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷、杨梅苷和槲皮素-3-O-(6”-O-没食子酰基)-β-葡萄糖苷其中，所述提取物通过以下方法制备得到：

1)将干燥的白花檵木药材加入固液比为1:8-1:10的丙酮，室温浸泡法进行提取，得到提取液，浓缩得到药材粗提物；

2)将药材粗提物在水中分散均匀，加入体积比为1:1-1:4的石油醚或环己烷萃取3-5次，除去有机溶剂得到水溶性成分；

3)将水溶性成分浓缩至浓度为200-300g/L的提取液，过HP20大孔树脂柱，树脂柱径高比为1:6-1:10，用2-4BV的乙醇-水梯度洗脱，收集30％乙醇洗脱液减压蒸干，得到所述提取物。

2.根据权利要求1所述的提取物，其中，以提取物总重量计算，奎尼酸衍生物和糖苷类成分以重量比计算合计为30％-90％。

3.根据权利要求1所述的提取物，其中，以提取物总重量计算，奎尼酸衍生物和糖苷类成分以重量比计算合计为60％-80％。

4.根据权利要求1所述的提取物，以提取物的总重量计算，绿原酸甲酯、绿原酸乙酯、红景天苷、杨梅苷四种成分以重量比计算，含量分别为1-5％、0.6-3％、0.3-1.5％和5-20％。

5.根据权利要求1所述的提取物，以提取物的总重量计算，绿原酸甲酯、绿原酸乙酯、红景天苷、杨梅苷四种成分以重量比计算，含量分别为1-3.5％、1-2％、0.5-1％和5-15％。

6.一种药物组合物，其特征在于包含权利要求1-5任一项所述的提取物和药学上可接受的辅料，所述提取物可以单独或与其他任何中西药按任意比例配伍，所述药物组合物的剂型为胶囊剂、片剂、丸剂、颗粒剂、口服液、糖浆、注射剂、酒剂、膏剂、外用散剂、外用膜剂、外用贴剂或凝胶剂。

7.含有权利要求1-5任一项所述提取物用于制备止血药物的用途。