CN110294673B - 咖啡酰奎宁酸丁酯类同分异构体及其制备方法和应用 - Google Patents

咖啡酰奎宁酸丁酯类同分异构体及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及咖啡酰奎宁酸丁酯类同分异构体及其制备方法和应用。咖啡酰奎宁酸丁酯类同分异构体，具有式Ⅰ所示的结构，
Figure DDA0002143479140000011
其中，当R1、R2、R3中的一种为
Figure DDA0002143479140000012
时，另两种为羟基。所述咖啡酰奎宁酸丁酯类同分异构体由青竹标中分离得到，具有抗炎活性。

Description

咖啡酰奎宁酸丁酯类同分异构体及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于中药有效成分的高效制备技术领域，具体涉及利用循环高速逆流色谱分离纯化青竹标中具有抗炎活性的三种咖啡酰奎宁酸丁酯类同分异构体及方法。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
青竹标(Scindapsus officinalis Schott.)别名密腺崖角藤、水蜈蚣、爬树龙、金竹标，天南星科岩角藤的全株，主要分布于云南、贵州、广西，是一种在当地应用广泛的珍稀民族药。《云南中草药选》记载其具有祛瘀镇痛、润肺止咳的功效，可治跌打损伤、骨折、风湿麻木、支气管炎、百日咳；《广西药植名录》记载其“消肿，止痛，治跌打，风湿，痈疮”；《贵州药植目录》记载其“去瘀生新，镇痛”。
目前从乳香中分离到的主要化学成分为五环三萜、四环三萜和大环二萜等化合物，其中乳香酸类及大环二萜类成分为其抗炎、抗肿瘤作用的有效成分。目前文献报道，乳香中该类活性成分的分离纯化方法为柱层析，如硅胶柱层析法。发明人发现，该方法不足之处是：分离周期长，回收率低，分离效果不理想，在使用硅胶柱层析分离时因长时间与硅胶填料接触而致使该类成分结构发生变化。
发明内容
针对上述现有技术中存在的问题，本发明的一个目的是提供咖啡酰奎宁酸丁酯类同分异构体及其制备方法和应用。
为了解决以上技术问题，本发明的技术方案为：
第一方面，咖啡酰奎宁酸丁酯类同分异构体，具有式Ⅰ所示的结构，
Figure BDA0002143479120000021
其中，当R1、R2、R3中的一种为
Figure BDA0002143479120000022
时，另两种为羟基。
在一些实施例中，当R1为
Figure BDA0002143479120000023
时，得到的同分异构体的结构式如式Ⅱ所示，
Figure BDA0002143479120000024
在一些实施例中，当R2为
Figure BDA0002143479120000025
时，得到的同分异构体的结构式如式Ⅲ所示，
Figure BDA0002143479120000031
在一些实施例中，当R3为
Figure BDA0002143479120000032
时，得到的同分异构体的结构式如式Ⅳ所示，
Figure BDA0002143479120000033
第二方面，上述咖啡酰奎宁酸丁酯类同分异构体的制备方法，具体步骤为：
将青竹标药材，粉碎，利用95％乙醇加热回流提取，合并滤液，减压旋蒸得到青竹标粗提物；
将青竹标粗提物用水打散，分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，萃取液过滤、减压浓缩分别得到石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水萃取部位；
通过液液萃取法处理正丁醇萃取部位得到不同极性部位：先用溶剂系统A的下相溶解正丁醇萃取部位，然后加入乙酸乙酯-正丁醇-水的上相进行萃取，两相溶剂平衡后，分离出上相和下相萃取物；将所得下相萃取物减压蒸干后溶于溶剂系统B的下相中，然后加入乙酸乙酯-正丁醇-水的上相进行萃取，两相溶剂平衡后，分离出上相和下相萃取物；对上相和下相萃取物进行检测(比如HPLC法)，然后将上相萃取物减压蒸干后得到的萃取物A；
利用溶剂系统A对萃取物A进行高速逆流色谱(HSCCC)分离，对分离物进行检测(比如紫外检测器)，分别收集不同馏分并减压干燥，得到目标萃取物，即式Ⅰ所示化合物；高速逆流色谱(HSCCC)分离的溶剂系统为氯仿-甲醇-水，氯仿、甲醇、水的体积比为4:3:2；
溶剂系统A即乙酸乙酯-正丁醇-水，乙酸乙酯、正丁醇、水的体积比为9:0:9；溶剂系统B即乙酸乙酯-正丁醇-水，乙酸乙酯、正丁醇、水的体积比为5:4:9。
在一些实施例中，高速逆流色谱(HSCCC)分离的溶剂系统的上相为固定相，下相为流动相，高速逆流色谱仪柱体积为300mL，上样量0.2g，分离柱转速为800rpm，流速2.0mL/min，固定相保留率57.4％，检测波长280nm。
在一些实施例中，利用循环高速逆流色谱对目标萃取物经高速逆流色谱分离后富集部位进行循环洗脱分离，分别得到式Ⅱ、式Ⅲ、式Ⅳ所示化合物；溶剂系统为氯仿-甲醇-水，氯仿、甲醇、水的体积比为4:3:2。
优选的，循环高速逆流色谱(R-HSCCC)分离的溶剂系统的上相为固定相，下相为流动相，循环高速逆流色谱仪柱体积为300mL，上样量0.1g，分离柱转速为800rpm，流速2.0mL/min，固定相保留率38.7％，检测波长280nm，循环次数6次。
循环高速逆流色谱(R-HSCCC)是一种改进的高速逆流色谱，主要适用于结构、极性类似化合物的分离，尤其是同分异构体的分离。
溶剂系统A、溶剂系统B的极性范围是发明人通过研究选择的，对分离目标产物具有很好的分离效果，不同的溶剂系统，极性不同，影响分离得到的最终目标物。
青竹标正丁醇部位极性相对较大，故选取极性大的溶剂系统进行萃取，可实现目标出发的有效获取。溶剂系统A、溶剂系统B为极性相对较大的溶剂系统，适合用于该部位的萃取。
第三方面，上述咖啡酰奎宁酸丁酯类同分异构体在制备抗炎药物中的应用。
一种抗炎药物，包含上述的咖啡酰奎宁酸丁酯类同分异构体。
本发明的有益效果：
青竹标提取物分离后得到各单体成分经HPLC进行纯度检测，可得到95％以上的纯品3-O-咖啡酰奎宁酸丁酯,5-O-咖啡酰奎宁酸丁酯,4-O-咖啡酰奎宁酸丁酯，该方法适用于从青竹标中一步纯化制备出高纯度的3-O-咖啡酰奎宁酸丁酯,5-O-咖啡酰奎宁酸丁酯,4-O-咖啡酰奎宁酸丁酯。操作简便，稳定性好。其中，3-O-咖啡酰奎宁酸丁酯和5-O-咖啡酰奎宁酸丁酯具有较好的抗炎活性，具有良好的抗炎药用前景。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为高速逆流色谱分离纯化乙酸乙酯-正丁醇-水(5:4:9)溶剂系统经液液萃取后的上相萃取物的色谱图；
图2为循环高速逆流色谱分离纯化三个咖啡酰奎宁酸丁酯类同分异构体的混合物的色谱图；
图3为青竹标正丁醇粗提物的高效液相色谱图；
图4为分离纯化得到3-O-咖啡酰奎宁酸丁酯(3-O-CAB)的高效液相色谱图；
图5为分离纯化得到5-O-咖啡酰奎宁酸丁酯(5-O-CAB)的高效液相色谱图；
图6为分离纯化得到4-O-咖啡酰奎宁酸丁酯(4-O-CAB)的高效液相色谱图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。下面结合实施例对本发明进一步说明
实施例1
取青竹标药材，粉碎至40-60目，95％乙醇加热回流提取，固液比为1:2，提取三次，时间分别为2h，1h，1h，合并滤液，减压旋蒸，冷冻干燥，得青竹标乙醇粗提物；将步骤1中粗提物用水打散，分别用石油醚，乙酸乙酯，正丁醇萃取，萃取液过滤，减压浓缩分别得到石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水萃取部位，正丁醇粗提物如图3所示。
应用液液萃取法对所得青竹标正丁醇部位进行极性分段前处理：
首先按照乙酸乙酯-正丁醇-水(9:0:9)的溶剂比例配制溶剂系统，置于分液漏斗中，摇匀后静置分层，待平衡一段时间后分别将上相和下相分开。取该溶剂系统50mL下相溶解1.5g正丁醇样品，溶解完全后转移到分液漏斗中，随后加入该溶剂系统50mL上相，摇匀后静置分层，待平衡一段时间后分别将上相和下相分开，将所得下相萃取物减压蒸干。其次，按照乙酸乙酯-正丁醇-水(5:4:9)的溶剂比例配制溶剂系统，置于分液漏斗中，摇匀后静置分层，待平衡一段时间后分别将上相和下相分开。取该溶剂系统50mL下相溶解上述所得乙酸乙酯-正丁醇-水(9:0:9)下相萃取物样品，溶解完全后转移到分液漏斗中，随后加入乙酸乙酯-正丁醇-水(5:4:9)溶剂系统50mL上相，摇匀后静置分层，待平衡一段时间后分别将上相和下相分开，分离出上相和下相萃取物。将所得两相萃取物经HPLC分析，发现目标同分异构体位于乙酸乙酯-正丁醇-水(5:4:9)溶剂系统液液萃取后的上相中，将该上相萃取物减压干燥后得到461mg目标萃取物。
应用高速逆流色谱对所得乙酸乙酯-正丁醇-水(5:4:9)溶剂系统液液萃取后的上相萃取物进行三个咖啡酰奎宁酸丁酯类同分异构体的分离纯化，如图1所示：
具体的操作步骤是：按溶剂系统氯仿-甲醇-水(4:3:2,v/v)溶剂比例配制溶剂系统，置于分液漏斗中，摇匀后静置分层，待平衡一段时间后将上下两相分开，上相为固定相，下相为流动相，取0.2g上述目标萃取物，溶解于5mL上相和5mL下相中待用。高速逆流色谱仪，它是由柱塞泵、进样阀、紫外检测仪、记录仪和色谱分离柱(由聚四氟乙烯管多层缠绕形成的螺旋管柱，容量为300mL)等组成，首先将固定相用泵以40mL/min的流速灌满色谱分离柱，停泵。开启速度控制器，使高速流色谱仪的色谱分离柱正转，转速达800rpm时，设置流动相流速为2.0mL/min，开始泵流动相，直至两相平衡，不停泵，然后使进样阀处于进样状态，将溶解好的样品用注射器注入逆流色谱仪进样阀的贮液管中，旋转进样阀为接柱状态，使样品进入色谱分离柱。然后根据检测器紫外光谱图(如图2所示)接收目标成分，得三个咖啡酰奎宁酸丁酯类同分异构体的混合物，且在HSCCC分离图中三者在同一大峰中洗脱出。将富集的三个咖啡酰奎宁酸丁酯类同分异构体的混合物流份减压干燥，随后采用循环高速逆流色谱对其进行循环洗脱分离。循环高速逆流色谱的特点在于进样阀为六通阀，进样后通过调整六通阀的位置而实现流动相在色谱柱中的循环。循环高速逆流色谱分离中采用溶剂系统为氯仿-甲醇-水(4:3:2,v/v)，上相为固定相，下相为流动相。取0.1g富集的三个咖啡酰奎宁酸丁酯类同分异构体的混合物，溶解于5mL上相和5mL下相中待用。首先将固定相用泵以40mL/min的流速灌满色谱分离柱，停泵。开启速度控制器，使高速流色谱仪的色谱分离柱正转，转速达800rpm时，设置流动相流速为2.0mL/min，开始泵流动相，直至两相平衡，不停泵，然后使六通阀处于进样状态，将溶解好的样品用注射器注入逆流色谱仪进样阀的贮液管中，旋转六通阀为内循环状态，使样品进入色谱分离柱，流动相开启循环洗脱模式。然后根据检测器紫外光谱图待成分实现完全分离后，使六通阀改为成分收集模式，最终经过6次循环分离后三个咖啡酰奎宁酸丁酯类同分异构体实现完全分离，经NMR确证，结构分别为3-O-咖啡酰奎宁酸丁酯,5-O-咖啡酰奎宁酸丁酯,4-O-咖啡酰奎宁酸丁酯，HPLC分析纯度均为95％以上，3-O-咖啡酰奎宁酸丁酯的高效液相色谱图如图4所示，5-O-咖啡酰奎宁酸丁酯的高效液相色谱图如图5所示,4-O-咖啡酰奎宁酸丁酯的高效液相色谱图如图6所示。
利用高效液相色谱分析分离物，液相条件：Waters-C18(250×4.6mm,5μm)，紫外检测波长254nm，柱温：25℃，流速：1.0mL/min，进样量：10μL，流动相采用乙腈(A)和水溶液(B)梯度洗脱，梯度条件如下：0-20min,15％A to 25％A；20-30min,25％A to 35％A。
高速流色谱仪为半制备型高速逆流色谱仪。
结构鉴定：对分离得到的单体成分应用Agilent 5973N质谱仪和Burker 400MHz核磁共振波谱仪分别进行MS，NMR谱的测定，所得数据如下：
3-O-咖啡酰奎宁酸丁酯：ESI-MS,m/z409[M-H]-.1H-NMR(DMSO-d6,400MHz)δ:0.90(3H,t,J＝7.2Hz,Me-4'),1.38(2H,m,H-3'),1.62(2H,m,H-2'),1.85(1H,m,H-6a),1.86-2.01(2H,m,H-2a,H-2b),2.07(1H,dd,J＝13.2,3.2Hz,H-6b),3.96(1H,m,H-3),4.03(2H,m,H-1'),4.09(1H,m,H-5),4.71(1H,dd,J＝7.2,2.8Hz,H-4),6.25(1H,d,J＝16.0Hz,H-α),6.77(1H,d,J＝8.0Hz,H-5”),7.05(1H,dd,J＝8.0,2.0Hz,H-6”),7.048(1H,d,J＝2.0Hz,H-2”),7.50(1H,d,J＝16.0Hz,H-β).13C-NMR(DMSO-d6,100MHz)δ:14.0(C-4'),19.0(C-3'),30.6(C-2'),38.3(C-6),42.3(C-2),64.4(C-1'),64.7(C-3),66.3(C-5),74.3(C-1),76.5(C-4),115.0(C-α),115.2(C-2”),116.3(C-5”),121.7(C-6”),126.0(C-1”),145.3(C-3”),146.1(C-β),148.8(C-4”),166.7(C-9”),173.8(C-7).
5-O-咖啡酰奎宁酸丁酯：ESI-MS,m/z409[M-H]-.1H-NMR(DMSO-d6,400MHz)δ:0.80(3H,t,J＝7.2Hz,Me-4'),1.24(2H,m,H-3'),1.48(2H,m,H-2'),1.75(1H,m,H-6a),1.93(1H,dd,J＝13.2,3.2Hz,H-2b),2.11(2H,m,H-2a,H-6a),3.56(1H,dd,J＝5.7,3.2Hz,,H-4),3.93(1H,m,H-3),4.01(2H,m,H-1'),5.01(1H,m,H-5),6.10(1H,d,J＝16.0Hz,H-α),6.76(1H,d,J＝8.0Hz,H-5”),6.96(1H,dd,J＝8.0,2.0Hz,H-6”),7.01(1H,d,J＝2.0Hz,H-2”),7.38(1H,d,J＝16.0Hz,H-β).13C-NMR(DMSO-d6,100MHz)δ:13.9(C-4'),19.0(C-3'),30.5(C-2'),35.6(C-6),37.6(C-2),64.5(C-1'),67.4(C-3),69.9(C-4),71.5(C-5),73.6(C-1),114.3(C-α),115.0(C-2”),116.3(C-5”),121.7(C-6”),125.8(C-1”),145.6(C-3”),146.1(C-β),149.0(C-4”),165.9(C-9”),173.6(C-7).
4-O-咖啡酰奎宁酸丁酯：ESI-MS,m/z409[M-H]-.1H-NMR(DMSO-d6,400MHz)δ:0.80(3H,t,J＝7.2Hz,Me-4'),1.23(2H,m,H-3'),1.47(2H,m,H-2'),1.76(1H,m,H-6a),1.92(1H,dd,J＝13.2,3.2Hz,H-2a),2.09(1H,m,H-6a),2.11(1H,m,H-2b),3.56(1H,dd,J＝5.3,2.4Hz,,H-4),3.91(2H,m,H-1'),3.97(1H,m,H-5),5.02(1H,m,H-3),6.08(1H,d,J＝16.0Hz,H-α),6.74(1H,d,J＝8.0Hz,H-5”),6.96(1H,dd,J＝8.0,2.0Hz,H-6”),7.01(1H,d,J＝2.0Hz,H-2”),7.38(1H,d,J＝16.0Hz,H-β).13C-NMR(DMSO-d6,100MHz)δ:14.0(C-4'),19.1(C-3'),30.6(C-2'),35.6(C-6),37.8(C-2),64.6(C-1'),67.4(C-4),69.9(C-3),71.6(C-5),73.6(C-1),114.3(C-α),115.1(C-2”),116.4(C-5”),121.9(C-6”),125.9(C-1”),145.7(C-3”),146.2(C-β),149.1(C-4”),165.9(C-9”),173.7(C-7).
试验例
抗炎活性：取RAW264.7小鼠巨噬细胞，计数，按3×104/孔接种于96孔细胞培养板。采用含有10％牛胎血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM培养基，将细胞在37℃、5％CO2饱和湿度的培养箱中贴壁24h。实验分为空白对照组，LPS组，给药组和阳性对照药地塞米松(DEX)组，对照组中只加入培养基，LPS组中只加入1μg/mL的LPS，DEX组中加入1μg/mL的LPS和5个不同浓度的地塞米松(20，10，5，2.5，1.25μM)，给药组中加入1μg/mL的LPS和5个不同浓度的待测样品(20，10，5，2.5，1.25μM)，在37℃、5％CO2饱和湿度的培养箱中培养24h。取出上清液50μL,加入GriessⅠ和Ⅱ试剂30分钟后，用酶标仪570nm测定OD(光密度)值，计算相应的抑制率和IC50值。
结论：采用MTT法测定3个化合物测定LPS诱导的RAW264.7小鼠巨噬细胞NO释放的抑制作用，其中3-O-咖啡酰奎宁酸丁酯和5-O-咖啡酰奎宁酸丁酯的IC50分别为13.8μM和17.6μM，而4-O-咖啡酰奎宁酸丁酯的IC50较大，>30μM，抗炎活性弱。表明3个化合物对LPS诱导的RAW264.7小鼠巨噬细胞的NO释放表现出较好的抑制作用，具有明显的生物学意义。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种咖啡酰奎宁酸丁酯类同分异构体的制备方法，其特征在于：将青竹标药材，粉碎，利用95％乙醇加热回流提取三次，合并滤液，减压旋蒸得到青竹标粗提物；
将青竹标粗提物用水打散，分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，萃取液过滤、减压浓缩分别得到石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水萃取部位；
通过液液萃取法处理正丁醇萃取部位得到不同极性部位：先用溶剂系统A的下相溶解正丁醇萃取部位，然后加入乙酸乙酯-正丁醇-水的上相进行萃取，两相溶剂平衡后，分离出上相和下相萃取物；将所得下相萃取物减压蒸干后溶于溶剂系统B的下相中，然后加入乙酸乙酯-正丁醇-水的上相进行萃取，两相溶剂平衡后，分离出上相和下相萃取物；对上相和下相萃取物进行检测，然后将上相萃取物减压蒸干后得到的萃取物A；
利用高速逆流色谱分离的溶剂系统对萃取物A进行高速逆流色谱分离，对分离物进行检测，分别收集不同馏分并减压干燥，得到目标萃取物，即式Ⅰ所示化合物；高速逆流色谱分离的溶剂系统为氯仿-甲醇-水，氯仿、甲醇、水的体积比为4:3:2；
溶剂系统A即乙酸乙酯-正丁醇-水，乙酸乙酯、正丁醇、水的体积比为9:0:9；溶剂系统B即乙酸乙酯-正丁醇-水，乙酸乙酯、正丁醇、水的体积比为5:4:9；
所述咖啡酰奎宁酸丁酯类同分异构体，具有式Ⅰ所示的结构，
Figure FDA0003285402740000021
其中，当R1、R2、R3中的一种为
Figure FDA0003285402740000022
时，另两种为羟基。
2.根据权利要求1所述的咖啡酰奎宁酸丁酯类同分异构体的制备方法，其特征在于：当R1为
Figure FDA0003285402740000023
时，得到的同分异构体的结构式如式Ⅱ所示，
Figure FDA0003285402740000024
3.根据权利要求1所述的咖啡酰奎宁酸丁酯类同分异构体的制备方法，其特征在于：当R2为
Figure FDA0003285402740000031
时，得到的同分异构体的结构式如式Ⅲ所示，
Figure FDA0003285402740000032
(Ⅲ)。
4.根据权利要求1所述的咖啡酰奎宁酸丁酯类同分异构体的制备方法，其特征在于：当R3为
Figure FDA0003285402740000033
时，得到的同分异构体的结构式如式Ⅳ所示，
Figure FDA0003285402740000034
5.根据权利要求1所述的咖啡酰奎宁酸丁酯类同分异构体的制备方法，其特征在于：高速逆流色谱分离的溶剂系统的上相为固定相，下相为流动相，高速逆流色谱仪柱体积为300mL，上样量0.2g，分离柱转速为800rpm，流速2.0mL/min，固定相保留率57.4％，检测波长280nm。
6.根据权利要求1所述的咖啡酰奎宁酸丁酯类同分异构体的制备方法，其特征在于：利用高速逆流色谱对目标萃取物经高速逆流色谱分离后富集部位进行循环洗脱分离，分别得到式Ⅱ、式Ⅲ、式Ⅳ所示化合物；溶剂系统为氯仿-甲醇-水，氯仿、甲醇、水的体积比为4:3:2。
7.根据权利要求1所述的咖啡酰奎宁酸丁酯类同分异构体的制备方法，其特征在于：循环高速逆流色谱分离的溶剂系统的上相为固定相，下相为流动相，循环高速逆流色谱仪柱体积为300mL，上样量0.1g，分离柱转速为800rpm，流速2.0mL/min，固定相保留率38.7％，检测波长280nm，循环次数6次。
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