CN108752208A - 咖啡酰奎宁酸类化合物的提取方法及其产物和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及天然药物化学技术领域，特别涉及咖啡酰奎宁酸类化合物的提取方法，并涉及4种咖啡酰奎宁酸类化合物，还涉及这4种咖啡酰奎宁酸类化合物在制备治疗乙型肝炎药物中的应用。本发明提供的咖啡酰奎宁酸类化合物的提取方法操作简单，经济环保；并且，本发明提供的咖啡酰奎宁酸类化合物a～d作为天然小分子化合物，对正常细胞毒性较低，副作用较小；在其细胞毒性浓度以下，能够表现出显著的抗乙肝病毒作用，从而能够为肝炎患者提供新的治疗药物及治疗途径，所述咖啡酰奎宁酸类化合物a～d具有有效剂量适中，疗效显著，毒副作用小等优点，因此，具有很好的药用前景。

Description

咖啡酰奎宁酸类化合物的提取方法及其产物和应用
技术领域
本发明涉及天然药物化学技术领域，特别涉及咖啡酰奎宁酸类化合物的提取方法，并涉及4种咖啡酰奎宁酸类化合物，还涉及这4种咖啡酰奎宁酸类化合物在制备治疗乙型肝炎药物中的应用。
背景技术
乙型病毒性肝炎(hepatitis B)是由于乙型嗜肝性DNA病毒(hepatitis B virus，HBV)感染引起的疾病，这是一种世界范围内的传染性疾病，严重威胁人类健康。乙型病毒性肝炎不仅可以导致急、慢性乙肝感染，还与75％～90％的原发性肝癌相关。HBV主要存在于肝细胞内，并损害肝细胞，引起肝细胞炎症、坏死、纤维化，严重时可导致肝硬化和肝细胞癌等，从而带来巨大的社会经济负担。
根据世界卫生组织的调查报告显示，全球有超过20亿的人口感染过乙型肝炎病毒，其中有约3.6亿人为慢性乙型肝炎患者，而每年约有65万人死于与慢性乙型肝炎相关的疾病。在中国，现有9300万HBV携带者和2000万慢性感染者，据统计，每年因HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和肝癌死亡病例约28万，占因病死亡人数中的3.7％。
目前，对HBV的控制主要是以接种疫苗预防为主，尽管疫苗效果明显，但是乙肝病毒感染仍然是威胁公众健康的难题，目前的药物治疗效果不能满足实际需求。目前，美国食品和药品监督管理局(FDA)已经批准的用于慢性乙肝病毒治疗的西药分为两类：一类是免疫调节剂，包括干扰素α(IFN-α)和聚乙二醇干扰素α，其通过激活JAK-STAT信号通路抑制病毒复制，然而，此类药物存在皮下给药频繁、不良反应多和费用高等缺点，因此，临床上现已很少使用；另一类是核苷类似物和核苷酸类似物前体药，前者包括阿糖腺苷、拉米夫定、泛昔洛韦、阿地福韦、替比夫定和恩替卡韦，后者包括阿德福韦酯和富马酸替诺福韦酯等；该类药物可直接作用于病毒逆转录酶，阻断乙肝病毒复制。然而，核苷类药物虽然近期疗效较好，但疗程不明确，停药后容易复发，需要终身治疗。这是因为核苷类似物是在胞质环境中抑制乙肝病毒复制，而对核内ccc DNA库没有影响，且长期用药又会导致病毒的变异和耐药性等问题。此外，有研究证明已经西医上市的药物拉米夫定治疗一年的基因耐药率是14％～32％，治疗2年、3年和4年后分别上升到38％、49％和66％。因此，在临床医学上，亟需研究和开发出安全有效的新型抗HBV药物。
众所周知，与化学药物不同，天然药物具有天然无毒、调节免疫、多靶点的特性，从天然产物中寻找出靶点疗效高且毒性低、作用原理独特的药物是临床上治疗乙型肝炎的重点研发方向之一。
金银花(Flos Lonicerae Japonicae)是忍冬科忍冬属植物忍冬(Lonicerajaponica Thunb.)的干燥花蕾或带初开的花，药用历史悠久，首载于梁代陶弘景的《名医别录》，为常用中药品种之一。并且，金银花在日常生活中还可用于食疗，如人们经常饮用的金银花茶等。据中医记载，本品味甘、性寒，归肺、心、胃经，具有清热解毒、疏散风热的功能。临床上，金银花被广泛用于治疗上呼吸道病毒感染，疗效显著。特别是，在抗“SARS”病毒和禽流感病毒的中医处方中，一半以上的药方中都含有金银花。此外，现代药理实验表明，金银花对流感病毒、禽流感病毒、伪狂犬病毒、呼吸道合胞病毒、豚鼠巨细胞病毒、疱疹病毒以及艾滋病病毒等多种病毒具有抑制作用。化学成分研究表明，金银花含有的丰富的咖啡酰奎宁酸类成分可能是其抗各种病毒的有效成分。
发明内容
本发明旨在从金银花中提取活性成分，分别得到了4种新的天然咖啡酰奎宁酸类化合物，通过一系列实验证实，这4种新的天然咖啡酰奎宁酸类化合物都具有优异的抗乙肝病毒作用，并且表现出高效、低毒的优点，从而今后可用于制备新的抗乙肝病毒药物。
具体地，本发明第一方面提供了咖啡酰奎宁酸类化合物的提取方法，其包括以下步骤：
S1：在室温下，用75％乙醇对金银花进行多次冷浸、渗漉提取，合并提取液后，减压回收溶剂，浓缩得到乙醇浸膏；
S2：将所述乙醇浸膏混悬于水，然后分别用环己烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取，以分别制得环己烷浸膏LJH，乙酸乙酯浸膏LJE，正丁醇浸膏LJB；
S3：将所述乙酸乙酯浸膏LJE用氯仿和甲醇溶解，用柱层析硅胶进行拌样后，装柱，上样，再实施梯度洗脱；采用TLC分析，合并相同流分后获得20个组分LJE1～LJE20；
S4：取组分LJE16，用10％甲醇溶解，并进行ODS(55×280mm)柱层析，实施梯度洗脱；采用TLC分析，合并相同流分后获得6个组分LJE16-1～LJE16-6；S5：取组分LJE16-4，用甲醇溶解、过滤，然后过RP-18制备液相色谱柱，依次在平均相对保留时间13.9min和16.6min处得到咖啡酰奎宁酸类化合物a和咖啡酰奎宁酸类化合物b；
其中，HPLC色谱条件包括：
RP-18制备液相色谱柱规格：Cosmosil 5C18-MS-II，5μm，20×250mm；
检测波长：330nm；
流动相：体积比48：52的甲醇-水，流速为8mL/min；
S6：取组分LJE16-5，用甲醇溶解、过滤，然后过RP-18制备液相色谱柱，在平均相对保留时间54.1min处得到咖啡酰奎宁酸类化合物c；
其中，HPLC色谱条件包括：
RP-18制备液相色谱柱规格：Cosmosil 5C18-MS-II，5μm，20×250mm；
检测波长：330nm；
流动相：体积比40：60的甲醇-水，流速为8mL/min；
S7：取组分LJE16-6，用甲醇溶解、过滤，然后过RP-18制备液相色谱柱，在平均相对保留时间13.1min处得到咖啡酰奎宁酸类化合物d；
其中，HPLC色谱条件包括：
RP-18制备液相色谱柱规格：Cosmosil 5C18-MS-II，5μm，20×250mm；
检测波长：330nm；
流动相：体积比60：40的甲醇-水，流速为8mL/min。
优选地，在上述提取方法中，在S3中所述的梯度洗脱为：依次用二氯甲烷、体积比为100：1的二氯甲烷-甲醇、体积比为50：1的二氯甲烷-甲醇、体积比为25：1的二氯甲烷-甲醇、体积比为15：1的二氯甲烷-甲醇、体积比为5：1的二氯甲烷-甲醇、体积比为2：1的二氯甲烷-甲醇、甲醇实施洗脱。
优选地，在上述提取方法中，在S4中所述的梯度洗脱为：依次用体积比为10：90的甲醇-水、体积比为30：70的甲醇-水、体积比为50：50的甲醇-水、体积比为75：25的甲醇-水、体积比为85：15的甲醇-水、甲醇实施洗脱。
优选地，在上述提取方法中，所述柱层析硅胶为100～200目的柱层析硅胶。
同时，本发明第二方面提供了一种咖啡酰奎宁酸类化合物a，其通过第一方面所述的提取方法制得，且具有以下结构式(I)：
根据结构式(I)可知，咖啡酰奎宁酸类化合物a可被命名为4-O-反式咖啡酰基-5-O-[3-羟基-3-(3,4-二羟基苯基)-丙酰基]奎宁酸甲酯。
本发明第三方面提供了一种咖啡酰奎宁酸类化合物b，其通过第一方面所述的提取方法制得，且具有以下结构式(II)：
根据结构式(II)可知，咖啡酰奎宁酸类化合物b可被命名为4-O-反式咖啡酰基-5-O-[3-甲氧基-3-(3,4-二羟基苯基)-丙酰基]奎宁酸甲酯。
本发明第四方面提供了一种咖啡酰奎宁酸类化合物c，其通过第一方面所述的提取方法制得，且具有以下结构式(III)：
其中，R1＝trans-咖啡酰基，R2＝cis-咖啡酰基。
根据结构式(III)可知，咖啡酰奎宁酸类化合物c可被命名为4-O-反式咖啡酰基-5-O-顺式咖啡酰基奎宁酸甲酯。
本发明第五方面提供了一种咖啡酰奎宁酸类化合物d，其通过第一方面所述的提取方法制得，且具有以下结构式(IV)：
其中，R1＝cis-咖啡酰基，R2＝trans-咖啡酰基。
根据结构式(IV)可知，咖啡酰奎宁酸类化合物d可被命名为3-O-顺式咖啡酰基-4-O-反式咖啡酰基奎宁酸甲酯。
此外，本发明第六方面提供了咖啡酰奎宁酸类化合物在制备治疗乙型肝炎药物中的应用，其中，所述咖啡酰奎宁酸类化合物选自以下任一种或多种的组合：第二方面所述的咖啡酰奎宁酸类化合物a，第三方面所述的咖啡酰奎宁酸类化合物b，第四方面所述的咖啡酰奎宁酸类化合物c，第五方面所述的咖啡酰奎宁酸类化合物d。
最后，本发明第七方面还提供了一种治疗乙型肝炎的药物组合物，其包含有效量的第二方面所述的咖啡酰奎宁酸类化合物a或/和第三方面所述的咖啡酰奎宁酸类化合物b或/和第四方面所述的咖啡酰奎宁酸类化合物c或/和第五方面所述的咖啡酰奎宁酸类化合物d，以及药学上可接受的载体。
总之，本发明提供的咖啡酰奎宁酸类化合物的提取方法操作简单，经济环保；并且，本发明提供的4种新的天然咖啡酰奎宁酸类化合物还具有以下有益效果：
咖啡酰奎宁酸类化合物a～d作为天然小分子化合物，对正常细胞毒性较低，副作用较小；在其细胞毒性浓度以下，能够表现出显著的抗乙肝病毒作用，从而能够为肝炎患者提供新的治疗药物及治疗途径，所述咖啡酰奎宁酸类化合物a～d具有有效剂量适中，疗效显著，毒副作用小等优点，因此，具有很好的药用前景。
附图说明
图1为咖啡酰奎宁酸类化合物a的核磁共振1H NMR图；
图2为咖啡酰奎宁酸类化合物a的核磁共振13C NMR图；
图3为咖啡酰奎宁酸类化合物a的二维核磁共振1H-1H COSY图；
图4为咖啡酰奎宁酸类化合物a的HMQC谱图；
图5为咖啡酰奎宁酸类化合物a的HMBC谱图；
图6为咖啡酰奎宁酸类化合物a的NOESY谱图；
图7为咖啡酰奎宁酸类化合物a的HR-MS谱图；
图8为咖啡酰奎宁酸类化合物b的核磁共振1H NMR图；
图9为咖啡酰奎宁酸类化合物b的核磁共振13C NMR图；
图10为咖啡酰奎宁酸类化合物b的二维核磁共振1H-1H COSY图；
图11为咖啡酰奎宁酸类化合物b的HMQC谱图；
图12为咖啡酰奎宁酸类化合物b的HMBC谱图；
图13为咖啡酰奎宁酸类化合物b的NOESY谱图；
图14为咖啡酰奎宁酸类化合物b的HR-MS谱图；
图15为咖啡酰奎宁酸类化合物c的核磁共振1H NMR图；
图16为咖啡酰奎宁酸类化合物c的核磁共振13C NMR图；
图17为咖啡酰奎宁酸类化合物c的二维核磁共振1H-1H COSY图；
图18为咖啡酰奎宁酸类化合物c的HMQC谱图；
图19为咖啡酰奎宁酸类化合物c的HMBC谱图；
图20为咖啡酰奎宁酸类化合物c的NOESY谱图；
图21为咖啡酰奎宁酸类化合物c的HR-MS谱图；
图22为咖啡酰奎宁酸类化合物d的核磁共振1H NMR图；
图23为咖啡酰奎宁酸类化合物d的核磁共振13C NMR图；
图24为咖啡酰奎宁酸类化合物d的二维核磁共振1H-1H COSY图；
图25为咖啡酰奎宁酸类化合物d的HMQC谱图；
图26为咖啡酰奎宁酸类化合物d的HMBC谱图；
图27为咖啡酰奎宁酸类化合物d的NOESY谱图；
图28为咖啡酰奎宁酸类化合物d的HR-MS谱图；
图29示出了四种咖啡酰奎宁酸类化合物对HepG 2细胞和HepG 2.2.15细胞的抑制作用(实验重复次数n＝6)；其中(A)对应HepG 2细胞的存活率；(B)对应HepG 2.2.15细胞的存活率；其中，化合物1、2、3、4分别指咖啡酰奎宁酸类化合物a、b、c、d(下同)；
图30示出了稳定转染HBV基因的HepG 2.2.15细胞上清抗原指标；其中，(A)表示HBsAg的含量；(B)表示HBeAg的含量；(C)表示HBV DNA的含量；
图31示出了四种咖啡酰奎宁酸类化合物实验第3天的体外抗HBV活性；其中，(A)表示HBsAg的相对水平含量；(B)表示HBeAg的相对水平含量；(C)表示HBV DNA的相对水平含量；
图32示出了四种咖啡酰奎宁酸类化合物实验第6天的体外抗HBV活性；其中，(A)表示HBsAg的相对水平含量；(B)表示HBeAg的相对水平含量；(C)表示HBV DNA的相对水平含量；
图33示出了四种咖啡酰奎宁酸类化合物实验第9天的体外抗HBV活性；其中，(A)表示HBsAg的相对水平含量；(B)表示HBeAg的相对水平含量；(C)表示HBV DNA的相对水平含量。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步阐述，但本发明并不限于以下实施方式。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从公开商业途径获得。
实施例1四种新的天然咖啡酰奎宁酸类化合物的提取
在室温下，取晾干的金银花6.5kg，用75％乙醇进行多次冷浸、渗漉提取，合并提取液，接着，55℃下减压回收溶剂，浓缩得乙醇浸膏1500g；将所述乙醇浸膏混悬于水，然后分别用环己烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取，以分别制得130.3g环己烷浸膏LJH，93.7g乙酸乙酯浸膏LJE，199.8g正丁醇浸膏LJB。
取83.0g所述乙酸乙酯浸膏LJE，用氯仿和甲醇溶解，用120g柱层析硅胶(100-200目)进行拌样后，用二氯甲烷溶解该硅胶装柱，并用二氯甲烷平衡柱子至硅胶面不再下降，干法上样，再依次用二氯甲烷、体积比为100：1的二氯甲烷-甲醇、体积比为50：1的二氯甲烷-甲醇、体积比为25：1的二氯甲烷-甲醇、体积比为10：1的二氯甲烷-甲醇、体积比为5：1的二氯甲烷-甲醇、体积比为2.5：1的二氯甲烷-甲醇、体积比为1：1的二氯甲烷-甲醇、甲醇实施梯度洗脱；控制流速在1000ml/h，每接500ml作为一个流分，采用TLC(即薄层层析)分析，合并相同流分后获得20个组分LJE1～LJE20。
取组分LJE16(37.0g)(由二氯甲烷-甲醇5：1洗脱得到)，用10％甲醇溶解，并进行ODS(55×280mm)柱层析，依次用体积比为10：90的甲醇-水、体积比为30：70的甲醇-水、体积比为50：50的甲醇-水、体积比为75：25的甲醇-水、体积比为85：15的甲醇-水、甲醇实施梯度洗脱；控制流速在500ml/h，每接500ml作为一个流分，采用TLC分析，合并相同流分后获得6个组分LJE16-1～LJE16-6。
取组分LJE16-4，用甲醇溶解、过滤，然后过RP-18制备液相色谱柱(Cosmosil 5C18-MS-II，5μm，20×250mm，流速：8mL/min，波长：330nm)，流动相为甲醇：水(48：52,v/v)，依次在平均相对保留时间为13.9min和16.6min处得到咖啡酰奎宁酸类化合物a(32.2mg)和咖啡酰奎宁酸类化合物b(64.2mg)。
取组分LJE16-5，用甲醇溶解、过滤，然后过RP-18制备液相色谱柱(Cosmosil 5C18-MS-II，5μm，20×250mm，流速：8mL/min，波长：330nm)，流动相为甲醇：水(40：60,v/v)，在平均相对保留时间为54.1min处得到咖啡酰奎宁酸类化合物c(3.5mg)。
取组分LJE16-6，用甲醇溶解、过滤，然后过RP-18制备液相色谱柱(Cosmosil 5C18-MS-II，5μm，20×250mm，流速：8mL/min，波长：330nm)，流动相为甲醇：水(60：40,v/v)，在平均相对保留时间为13.1min处得到咖啡酰奎宁酸类化合物d(8.0mg)。
当然，本发明所述的咖啡酰奎宁酸类化合物a、b、c、d还可由其它提取工艺或化学合成方法制得。
实施例2咖啡酰奎宁酸类化合物a、b、c、d的表征
咖啡酰奎宁酸类化合物a的表征
本发明所提供的咖啡酰奎宁酸类化合物a为黄色无定型粉末，参见图7，HR-ESI-MS(negative)给出准分子离子峰[M-H]-m/z 547.1627，提示分子量为548；结合1H和13C NMR确定其分子式为C26H28O13，计算不饱和度为18。
参见图1～6，结合表1，在1H NMR上，δH 3.76(1H,s),5.03(1H,m),5.14(1H,m)与δH1.98(3H,m)和2.16(1H,d,J＝11.0Hz)以及δH 3.60(3H,m)提示该化合物为4,5-二取代的奎宁酸甲酯衍生物，13C NMR上的δC 72.90(C-1),35.46(C-2),67.47(C-3),71.07(C-4),70.33(C-5),34.82(C-6),174.10(C-7),52.11(7-OCH3)位移信号也证实了上述判断。此外，1H NMR上，ABX系统的δH 7.05(1H,s),7.00(1H,d,J＝8.0Hz),6.77(1H,d,J＝6.8Hz)与反式双键信号δH 7.49(1H,d,J＝15.9Hz)和6.24(1H,d,J＝15.9Hz)说明其中一个取代基为反式咖啡酰基。另一个ABX系统的δH 6.75(1H,s),6.65(1H,d,J＝8.0Hz),6.58(1H,m)与三个质子氢信号δH 4.76(1H,m),2.49(2H,m)存在耦合，NOESY谱图上可观察到H-7”(δH 4.76)与H-2”(δH6.75)、H-6”(δH 6.58)有相关，HMBC谱上也存在H-8”(δH 2.49)与79.24(C-7”),169.87(C-9”)的耦合关系，这提示另一个取代基为3-羟基-3-(3,4-二羟基苯基)-丙酰基；该化合物酯解一个取代基后的反应产物，通过HPLC比对分析可知含有4-O-反式咖啡酰基奎宁酸甲酯，这证明反式咖啡酰基取代在4位，而3-羟基-3-(3,4-二羟基苯基)-丙酰基取代在5位，因此确定咖啡酰奎宁酸类化合物a为4-O-反式咖啡酰基-5-O-[3-羟基-3-(3,4-二羟基苯基)-丙酰基]奎宁酸甲酯。
咖啡酰奎宁酸类化合物b的表征
本发明所提供的咖啡酰奎宁酸类化合物b为黄色无定型粉末，参见图14，HR-ESI-MS(negative)给出准分子离子峰[M-H]-m/z 561.1877，提示分子量为562；结合1H和13C NMR确定其分子式为C27H30O13，计算不饱和度为18。
参见图8～13，结合表1，该化合物的1H NMR谱和13C NMR谱与咖啡酰奎宁酸类化合物a的谱图十分相似，只不过该化合物比咖啡酰奎宁酸类化合物a多了一个甲氧基信号[δH3.07(3H,s)]。通过比对，并结合HMBC谱，发现该甲氧基取代在丙酰基的C-7”位上。与此同时，C-7”的位移与咖啡酰奎宁酸类化合物a的C-7”相比，也往低场位移了10ppm左右，进一步证实了甲氧基的取代位置。因此，确定咖啡酰奎宁酸类化合物b为4-O-反式咖啡酰基-5-O-[3-甲氧基-3-(3,4-二羟基苯基)-丙酰基]奎宁酸甲酯。
表1咖啡酰奎宁酸类化合物a和b在的DMSO-d6中的1H NMR(400MHz)和13C NMR(100MHz)数据
咖啡酰奎宁酸类化合物c和d的表征
咖啡酰奎宁酸类化合物c和d均为黄色无定型粉末，分别参见图21和28，可见HR-ESI-MS(negative)给出准分子离子峰[M-H]-m/z分别为529.1506和529.1573，提示分子量为530；结合1H和13C NMR确定其分子式均为C26H26O12，计算不饱和度为13。
首先，参见图15-20，结合表2，咖啡酰奎宁酸类化合物c的NMR图谱与4,5-二取代反式咖啡酰奎宁酸甲酯十分相似，只不过该化合物中的一个双键为顺式双键[δH 6.78(1H,d,J＝12.8Hz,H-7”),5.76(1H,d,J＝12.8Hz,H-8”)]，这提示我们咖啡酰奎宁酸类化合物c的取代基为反式咖啡酰基和顺式咖啡酰基。该化合物酯解一个取代基后的反应产物，通过HPLC比对分析可知含有4-O-反式咖啡酰基奎宁酸甲酯，这证明反式咖啡酰基取代在4位。因此确定咖啡酰奎宁酸类化合物c为4-O-反式咖啡酰基-5-O-顺式咖啡酰基奎宁酸甲酯。
其次，参见图22-27，结合表2，咖啡酰奎宁酸类化合物d的NMR图谱与3,4-二取代反式咖啡酰奎宁酸甲酯十分相似，只不过该化合物中的一个双键为顺式双键[6.80(1H,d,J＝12.8Hz,H-7”),5.58(1H,d,J＝12.8Hz,H-8”)]，这提示我们咖啡酰奎宁酸类化合物d的取代基为反式咖啡酰基和顺式咖啡酰基。该化合物酯解一个取代基后的反应产物，通过HPLC比对分析可知含有4-O-反式咖啡酰基奎宁酸甲酯，这证明反式咖啡酰基取代在4位。因此确定咖啡酰奎宁酸类化合物d为3-O-顺式咖啡酰基-4-O-反式咖啡酰基奎宁酸甲酯。
表2咖啡酰奎宁酸类化合物c和d在DMSO-d6中的1H NMR(400MHz)和13C NMR(100MHz)数据
实施例3咖啡酰奎宁酸类化合物a、b、c、d的体外细胞毒性实验
发明人对四种天然咖啡酰奎宁酸类化合物实施了体外细胞毒性试验，其中使用的细胞株为HepG 2细胞和HepG 2.2.15细胞。HepG 2.2.15细胞是由HBV基因稳定转染HepG 2细胞，载有HBV全基因组，因此能够进行病毒复制并稳定分泌感染性病毒颗粒及HBsAg和HBeAg。
MTT法：将HepG 2细胞和HepG 2.2.15细胞接种于96孔细胞培养板，每孔200μL(含有10×104个肿瘤细胞)，在37℃、5％CO2培养箱中，并且在含10％FBS的DMEM培养基中，培养24h，加入不同浓度(100、50、25、12.5和6.25μg/ml)的本发明化合物(即咖啡酰奎宁酸类化合物a、b、c、d)，继续培养48h；实验结束前4h加20μL的MTT(5mg/mL)，继续在37℃、5％CO2条件下孵育4h，吸取培养液后加入二甲基亚砜150μL，振摇至结晶完全溶解，然后于酶标仪检测其吸光度，检测波长570nm，参考波长630nm，计算本发明化合物对HepG 2细胞和HepG2.2.15细胞的抑制率，实验结果如图29所示。
可见，咖啡酰奎宁酸类化合物a、b、c、d均无明显的细胞毒性。此外，下述的HBV实验药物浓度皆参考该实验结果。
实施例4咖啡酰奎宁酸类化合物a、b、c、d的体外抗乙肝病毒实验
发明人对四种天然咖啡酰奎宁酸类化合物实施了体外细胞毒性试验，其中使用的细胞株为HepG 2.2.15细胞。
将HepG 2.2.15细胞接种于24孔细胞培养板，每孔500μL(含有30×104个肿瘤细胞)，在37℃、5％CO2培养箱中，并且在含10％FBS的DMEM培养基中，培养24h，加入100μg/ml的本发明化合物，继续在37℃、5％CO2条件下培养。每三天收集一次培养基上清，同时加入新鲜含药培养基。实验共持续9天。ELISA法测定培养基上清中的HBsAg和HBeAg含量，PCR法测定HBVDNA含量，实验结果见图30。由此可见，发明人采用的HepG 2.2.15细胞能够稳定表达HBV全基因组，并于上清中分泌HBsAg和HBeAg。
进一步地，参见图31-33，可见实验结果表明，所述咖啡酰奎宁酸类化合物a、b、c、d均具有较好的体外抗HBV活性，从而能够为肝炎患者提供新的治疗药物及治疗途径。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims (10)

1.咖啡酰奎宁酸类化合物的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：在室温下，用75％乙醇对金银花进行多次冷浸、渗漉提取，合并提取液后，减压回收溶剂，浓缩得到乙醇浸膏；
S2：将所述乙醇浸膏混悬于水，然后分别用环己烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取，以分别制得环己烷浸膏LJH，乙酸乙酯浸膏LJE，正丁醇浸膏LJB；
S3：将所述乙酸乙酯浸膏LJE用氯仿和甲醇溶解，用柱层析硅胶进行拌样后，装柱，上样，再实施梯度洗脱；采用TLC分析，合并相同流分后获得20个组分LJE1～LJE20；
S4：取组分LJE16，用10％甲醇溶解，并进行ODS(55×280mm)柱层析，实施梯度洗脱；采用TLC分析，合并相同流分后获得6个组分LJE16-1～LJE16-6；
S5：取组分LJE16-4，用甲醇溶解、过滤，然后过RP-18制备液相色谱柱，依次在平均相对保留时间13.9min和16.6min处得到咖啡酰奎宁酸类化合物a和咖啡酰奎宁酸类化合物b；
其中，HPLC色谱条件包括：
RP-18制备液相色谱柱规格：Cosmosil 5C18-MS-II，5μm，20×250mm；
检测波长：330nm；
流动相：体积比48：52的甲醇-水，流速为8mL/min；
S6：取组分LJE16-5，用甲醇溶解、过滤，然后过RP-18制备液相色谱柱，在平均相对保留时间54.1min处得到咖啡酰奎宁酸类化合物c；
其中，HPLC色谱条件包括：
RP-18制备液相色谱柱规格：Cosmosil 5C18-MS-II，5μm，20×250mm；
检测波长：330nm；
流动相：体积比40：60的甲醇-水，流速为8mL/min；
S7：取组分LJE16-6，用甲醇溶解、过滤，然后过RP-18制备液相色谱柱，在平均相对保留时间13.1min处得到咖啡酰奎宁酸类化合物d；
其中，HPLC色谱条件包括：
RP-18制备液相色谱柱规格：Cosmosil 5C18-MS-II，5μm，20×250mm；
检测波长：330nm；
流动相：体积比60：40的甲醇-水，流速为8mL/min。
2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，在S3中所述的梯度洗脱为：依次用二氯甲烷、体积比为100：1的二氯甲烷-甲醇、体积比为50：1的二氯甲烷-甲醇、体积比为25：1的二氯甲烷-甲醇、体积比为15：1的二氯甲烷-甲醇、体积比为5：1的二氯甲烷-甲醇、体积比为2：1的二氯甲烷-甲醇、甲醇实施洗脱。
3.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，在S4中所述的梯度洗脱为：依次用体积比为10：90的甲醇-水、体积比为30：70的甲醇-水、体积比为50：50的甲醇-水、体积比为75：25的甲醇-水、体积比为85：15的甲醇-水、甲醇实施洗脱。
4.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述柱层析硅胶为100～200目的柱层析硅胶。
5.一种咖啡酰奎宁酸类化合物a，其特征在于，通过根据权利要求1-4中任一项所述的提取方法制得，且具有以下结构式(I)：
6.一种咖啡酰奎宁酸类化合物b，其特征在于，通过根据权利要求1-4中任一项所述的提取方法制得，且具有以下结构式(II)：
7.一种咖啡酰奎宁酸类化合物c，其特征在于，通过根据权利要求1-4中任一项所述的提取方法制得，且具有以下结构式(III)：
其中，R1＝trans-咖啡酰基，R2＝cis-咖啡酰基。
8.一种咖啡酰奎宁酸类化合物d，其特征在于，通过根据权利要求1-4中任一项所述的提取方法制得，且具有以下结构式(IV)：
其中，R1＝cis-咖啡酰基，R2＝trans-咖啡酰基。
9.咖啡酰奎宁酸类化合物在制备治疗乙型肝炎药物中的应用，其特征在于，所述咖啡酰奎宁酸类化合物选自以下任一种或多种的组合：根据权利要求5所述的咖啡酰奎宁酸类化合物a，根据权利要求6所述的咖啡酰奎宁酸类化合物b，根据权利要求7所述的咖啡酰奎宁酸类化合物c，根据权利要求8所述的咖啡酰奎宁酸类化合物d。
10.一种治疗乙型肝炎的药物组合物，其特征在于，包含有效量的根据权利要求5所述的咖啡酰奎宁酸类化合物a或/和根据权利要求6所述的咖啡酰奎宁酸类化合物b或/和根据权利要求7所述的咖啡酰奎宁酸类化合物c或/和根据权利要求8所述的咖啡酰奎宁酸类化合物d，以及药学上可接受的载体。
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