CN101919872B - 景酮糖酐在制备抗乙肝药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了景酮糖酐在制备抗乙肝病毒药物中的应用。景酮糖酐，结构式为：

Description

景酮糖酐在制备抗乙肝药物中的应用

技术领域

本发明涉及景酮糖酐的用途，尤其涉及其医药用途。

背景技术

乙肝是危害人类健康的重要传染病之一，国内约有10％的人携带乙肝表面抗原。目前治疗乙肝的药品虽发展很快，但多具有停药反跳的现象。上世纪七十年代传入我国的干扰素，公认的疗效只有30％，经过多方的剂型改进和治疗方法的提高，均不过40％左右，其后发展起来的核苷类药物，如阿糖胞苷，阿昔洛韦，拉米夫丁，阿德福韦，恩替卡韦等等，疗效虽有较大的提高，但均存在不同程度的停药反跳现象，以至于乙肝治疗中出现了“停药即复发”的现象，仍需寻找新药。

本发明源于上世纪七十年代后期，山东部分地区有流传中药瓦松(《中国药典》一九七七年版收载品种)抗癌的情况，经过调查并无确实符合科学要求的资料，但仍然对其药用效果进行了研究，经研究发现，其提取物对乙肝病人具有明显疗效。有关基础研究发表了简报(左春旭著：《中草药》1985年16卷6期第3页)，乙肝临床研究发表了论文(王金声著：《新药与临床》1988年7月；7(4)，211页)。

专利号为96115901.4，申请日为1996年7月26号的中国专利公开了一种新的抗病毒活性化合物，其是从景天科植物中(如瓦松、八宝或长药八宝)提取、分离到景酮糖酐，再与丙酮一步缩合得到具有活性的化合物八宝素，经结构鉴定为异丙叉景酮糖酐(I sopropylidene Sedoheptulosan)，结构式为：

其中从景天科植物中提取、分离到的景酮糖酐，经结构鉴定，其结构式如下所示：

专利号为99112550.9，申请日为1996年7月26号的中国专利公开了上述异丙叉景酮糖酐在制备抗乙型肝炎药物中的应用，但是，上述景酮糖酐在制备抗乙肝药物中的应用尚未见明确。本发明是在现有技术的基础上，通过用景酮糖酐的药理实验及其结果来说明其在制药领域中的新用途。

发明内容

本发明的目的在于提供景酮糖酐在制备抗乙肝药物中的应用。

抗乙肝病毒化合物景酮糖酐的制备方法是：

从景天科植物瓦松、八宝或长药八宝的鲜草中提取、分离得到景酮糖酐化合物。

上述抗乙肝病毒化合物景酮糖酐的制备方法包括以下操作步骤：

1、粉碎景天科植物八宝、瓦松或长药八宝的鲜草，用沸水浸取；

2、浓缩浸取液后，加等量乙醇作定容调节；

3、取上清液，依次用强酸型离子交换树脂柱分离；

4、流出液蒸除乙醇得到浸膏；

5、浸膏以硅藻土和酸性氧化铝拌料制成氧化铝柱，以乙醇洗脱，回收洗脱液，放冷，可得到景酮糖酐结晶，然后重结晶提纯，得纯晶，其结构式为：

通用名：景酮糖酐

英文名：Sedoheptulosan

景酮糖酐主要理化性质：景酮糖酐为白色柱状结晶，分子式：C₇H₁₂O₆，mp.一水合物99～100℃，无水物为，150～151℃。

质谱：分子式为C₇H₁₂O₆

本品的13C-NMR和1H-NMR结果如表1所示。

表1500兆核磁共振仪测得13C-NMR和1H-NMR表及二维谱解析情况

溶剂用的事D₂O和DMSO-d₆

本品的HMBC相关峰：C-2和H-1，H-6；C-3和H-1，H-5；C-4和H-3，H-6；C-5和H-6，H-7；C-6和H-5；

COSY相关峰：H-3和H-5；H-4和H-6；H-5，H-7；H-6

以上数据进一步证明了该化合物的结构。

经实验研究表明景酮糖酐具有显著的抗乙肝病毒活性，且初步显示具有抑制停药反跳的特性。

为了更好地说明本发明的实质，下面将用景酮糖酐的药理实验及其结果来说明其在制药领域中的新用途。

具体实施方式

一、景酮糖酐的制备工艺

取原料(八宝鲜草)切碎后放入提取罐中，加入8倍量的水，加热沸腾后回流提取1小时，提取两次，提取液浓缩至比重1.07，浓缩液放冷至室温，加入95％乙醇使浓缩液醇度达50％，放置，取上清液，乙醇上清液通过强酸型阳离子交换树脂柱，流出液回收至比重为1.15，放料稠膏放冷，加入4倍量的纯化水搅拌均匀，放置12小时，滤过，得到滤液，将滤渣在加入1倍量的水洗涤，过滤，所得滤液与之前滤液合并，然后将合并的滤液通过酸性氧化铝脱色去杂，流出液回收至比重1.25，加入95％乙醇溶解后，再用酸性氧化铝拌料，所得湿颗粒80℃烘干，干颗粒置索式提取罐用丙酮提取24h，提取液回收至原体积的1/10，浓缩液室温放置，析出结晶，抽滤、干燥、得到粗品。

粗品用95％乙醇结晶，得到一次结晶品，用稀盐酸液(PH值约为3)热回流水解12小时，水解液回收至原体积1/4，加入2倍量无水乙醇，放置12小时，析出晶品，所得晶品经无水乙醇重结晶(加入活性炭)，在80℃下干燥，得到景酮糖酐纯品。上述景酮糖酐可直接作为制剂原料使用，制备针剂或口服制剂，也可制备其他临床需要的剂型。

二、景酮糖酐在2.2.15细胞内对人乙型肝炎病毒(HBV)DNA的抑制作用

1.药物：取上述景酮糖酐纯品，室温保存，临用前用2.2.15细胞培养液配成所需浓度。

2.2.2.15细胞：实验细胞采用的2.2.15细胞是乙型肝炎病毒(HBV)DNA克隆转染人肝癌细胞(Hep G2)细胞系，美国Mount Sinai医学中心构建。2.2.15细胞培养液为Eagle’s MEM培养液，每100ml含胎牛血清10ml，质量百分比浓度为3％的谷氨酰胺溶液1ml，G418 380ug/ml，卡那霉素50U/ml。细胞消化液为含质量百分比为0.25％胰酶溶液，用Hanks液配置。

3.2.2.15细胞培养方法：在长满2.2.15细胞的培养瓶中加入细胞消化液37℃消化3分钟，加培养液吹打，1∶3传代，10天长满，加入细胞计数板计数，配置成每毫升10万个细胞接种细胞培养板，96孔板每孔0.2mL24孔板每孔1ml，37℃，5％CO2培养24小时，细胞长成单层后进行后续实验。

4.试剂及仪器：放射性同位素α32P dCTP为亚辉生物医学工程公司，比活度：111TBq/nmol；探针标记用的缺口标记试剂盒购自Promerga公司。酶标仪：BIO-RAO3550型；γ-计数仪为美国DPC公司产品。

5.景酮糖酐在2.2.15细胞培养内对HBV DNA抑制实验

景酮糖酐4mg/ml，2mg/ml，1mg/ml，0.5mg/ml分别加入2.215细胞中培养。实验设1μM的拉米夫定(3TC)对照及细胞对照。第8天后取各浓度组及对照组的2.2.15细胞上清液，按分子克隆实验技术方法提取其HBV DNA、各样品斑点杂交、放射自显影、测量各杂交点的A值后，计算抑制率。对HBV DNA的抑制效果见表2

表2景酮糖酐在2.2.15细胞中第8天后对HBV DNA抑制作用

结论：景酮糖酐在2.2.15细胞中培养8天，无毒浓度4mg/ml对HBV DNA抑制率为43.1±3.2％，其IC₅₀为3.20±0.30mg/ml，阳性药1μM的拉米夫定(3TC)对HBV DNA抑制率三批实验平均为89.0±0.13％

6.景酮糖酐在鸭体内对乙型肝炎病毒感染的治疗效果

为了证明本发明对乙型肝炎病毒的治疗效果，以目前国内外公认的动物实验模型在乙型肝炎病毒感染鸭体内进行治疗效果实验。实验采用一日龄北京鸭静脉注射乙型肝炎病毒，7天后开始对感染鸭随机分组进行药物治疗实验，每组6只。第一批实验：给药组三个剂量，分别为：75，150，300mg/kg，第二批实验：给药组四个剂量，分别为：75，150，300，600mg/kg，第三批实验：给药组四个剂量，分别为：75，150，300，600mg/kg。景酮糖酐用生理盐水配制，腹腔注射，一天2次，治疗10天。设病毒对照组(DHBV)，以生理盐水代替药物；阳性药物对照组，阳性药物采用拉米夫定(3TC)，口服给药50mg/kg，1天2次，给药10天。在感染后第7天即用药前(T0)，用药第5天(T5)，用药第10天(T10)和停药后第3天(P3)，分别自鸭腿胫静脉取血，分离血清，按缺口翻译试剂盒说明书方法测定血清杂交斑点OD值，并按下式计算血清DHBV-DNA的抑制率。

结果如表3所示：

表3景酮糖酐治疗组与病毒对照组的鸭乙型肝炎病毒感染鸭体内的鸭血清DHBV-DNA水平抑制率比较

统计处理：*P＜0.05，**P＜0.01

实验结果表明：

第一批实验选用3个剂量组，分别为75、150和300mg/kg组，在给药前(T0)与给药后第5天(T5)、10天(T10)及停药后3天(P3)，取鸭血，分离血清，检测DHBV-DNA IOD值，做自身比较，计算抑制％，并与病毒对照组抑制％对比做统计处理。结果表明：75/kg组，在给药后第10天和停药后3天，鸭血清DHBV-DNA与给药前比较，配对分析，有显著性和非常显著性意义(P＜0.05，0.01)；与病毒对照组成组对比做统计处理，无统计学意义的差别。150mg/kg组，在给药后第5和10天，鸭血清DHBV-DNA水平与给药前比较，配对分析，有非常显著性意义；与病毒对照组成组对比做统计处理，给药后10天，有统计学意义的差别。300mg/kg组，在给药后第5天，10天和停药后3天，鸭血清DHBV-DNA与给药前比较，配对分析，有显著性和非常显著性意义(P＜0.05，0.01)；与病毒对照组成组对比做统计处理，给药后第10天，抑制率有显著性意义(P＜0.05)。

第二批实验选用4个剂量组，分别为75、150、300和600mg/kg组，在给药前(T0)与给药后第5天(T5)、10天(T10)及停药后3天(P3)，取鸭血，分离血清，检测DHBV-DNAIOD值，做自身比较，计算抑制％，并与病毒对照组抑制％对比做统计处理。结果表明：75/kg组，在给药后第5、10天和停药后3天，鸭血清DHBV-DNA与给药前比较，配对分析与成组对比，均无统计学意义的差别。150mg/kg组，在给药后第10天，鸭血清DHBV-DNA水平与给药前比较，配对分析，有显著性意义(P＜0.05)；与病毒对照组成组对比做统计处理，无统计学意义。300mg/kg组，在给药后第5天，10天和停药后3天，鸭血清DHBV-DNA与给药前比较，配对分析，有显著性和非常显著性意义(P＜0.05，0.01)；与病毒对照组成组对比做统计处理，无统计学意义。600mg/kg组，在给药后第5天，10天和停药后3天，鸭血清DHBV-DNA与给药前比较，配对分析，有显著性和非常显著性意义(P＜0.05，0.01)；与病毒对照组成组对比做统计处理，无统计学意义。

第三批实验选用4个剂量组，分别为75、150、300和600mg/kg组，在给药前(T0)与给药后第5天(T5)、10天(T10)及停药后3天(P3)，取鸭血，分离血清，检测DHBV-DNA IOD值，做自身比较，计算抑制％，并与病毒对照组抑制％对比做统计处理。结果表明：75/kg组，在给药后第5、10天和停药后3天，鸭血清DHBV-DNA与给药前比较，配对分析与成组对比，均无统计学意义的差别。150mg/kg组，在给药后第10天，鸭血清DHBV-DNA水平与给药前比较，配对分析，有非常显著性意义(P＜0.01)；与病毒对照组成组对比做统计处理，无统计学意义。300mg/kg组，在给药后第5天，10天和停药后3天，鸭血清DHBV-DNA与给药前比较，配对分析，有显著性和非常显著性意义(P＜0.05，0.01)；与病毒对照组成组对比做统计处理，无统计学意义。600mg/kg组，在给药后第5天，10天和停药后3天，鸭血清DHBV-DNA与给药前比较，配对分析，有显著性和非常显著性意义(P＜0.05，0.01)；与病毒对照组成组对比做统计处理，无统计学意义。

综上所述，300和600mg/kg组抑制DHBV-DNA作用，DHBV-DNA水平与给药前比较，配对分析，效果可重复；150mg/kg组抑制DHBV-DNA作用T10在三批实验内可重复，有一定抑制活性；75mg/kg组抑制DHBV-DNA作用不明显。

Claims (2)

1.景酮糖酐在制备抗乙肝药物中的应用。

2.按权利要求1所述的景酮糖酐在制备抗乙肝药物中的应用，其特征在于，景酮糖酐用于制备抗乙肝病毒的针剂或口服制剂。