CN100595200C - 脱氢卡维丁类化合物及其在医药中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属医药技术领域。具体为一种从中药岩黄连中分离提取的脱氢卡维丁类化合物及其医药中的新用途。该化合物的结构式为：见右式，式中，R₁、R₂为氢、C_1-18烷基、C_1-18羟烷基、可被任意取代的芳酰基；R₃、R₄、R₅、R₆为氢、C_1-4烷基或C_1-4羟烷基。此类化合物具有抗甲肝病毒、抗乙肝病毒作用、肝损伤保护作用及端粒酶抑制活性，可用于制备治疗肝病、抗肿瘤、抗病毒类的药物，剂型包括冻干粉针剂、小针剂、注射液、胶囊剂、软胶囊、片剂、颗粒剂、冲剂、滴丸、微丸、口服液等。

Description

脱氢卡维丁类化合物及其在医药中的应用

技术领域

本发明属医药技术领域，具体涉及一种从中药岩黄连中分离提取的脱氢卡维丁(dehydrocavidine)类化合物及其在医药中的应用。

背景技术

肝炎是目前世界上危害最为严重的传染性疾病之一，且又与肝癌发生密切相关。据世界卫生组织的统计，目前，全球约有3.5亿人为慢性肝炎患者或为无症状病毒感染者。这些慢性肝炎的病人有转为肝硬化，肝癌的高危险性，每年有100多万人死于和肝炎、肝硬化及肝癌有关的疾病。我国是肝炎病高发地区，据统计，肝癌患者中有90％有肝炎病毒感染的背景，而目前肝癌已占肿瘤致死率的第二位。为预防和治疗这一常见病、多发病、难治病，多年来国内外有关研究人员一直关注与从事着保肝解毒的临床和药理研究。大多数国家治疗慢性乙型肝炎采用的药物是α-干扰素(IFN)，其作用主要是免疫调节。目前，医学界对乙型和丙型病毒性肝炎的治疗尚缺乏专属性较强的治疗药物，抗乙肝病毒的药物多数为抗HIV逆转酶抑制剂和抗疱疹病毒DNA聚合酶抑制剂，这两种病毒酶的抑制剂也是抗乙肝病毒的靶点；而用于抗丙肝病毒的药物多数为广谱抗病毒药或RNA病毒抑制剂以及具有抗病毒活性的免疫调节剂，但现在的抗肝炎药物普遍存在耐药性的问题。

人类细胞染色体末端含有长达7～15千TTAGGG重复序列。这些重复序列和与之结合在一起的蛋白质(telomeric repeat-binding factors，TRFs)构成一种特殊结构称之为端粒。正常人类体细胞由于“末端复制问题”，随着细胞不断分裂，端粒呈现渐进性缩短，细胞每分裂一个周期，端粒长度就要减少30～120bp。当端粒减少到一定程度，细胞发生永久性不可逆转的生长停滞，即所谓“细胞老化”。这种端粒缩短所造成的“细胞老化”将细胞的分裂次数和寿命限制在一定范围之内，防止了他们的无限增殖，这一过程被认为是人类进化过程中获得的特有抗肿瘤机制。此外，端粒的DNA序列与结构可抵抗各种DNA限制型内切酶，连接酶的作用，从而保护染色体免受损害或畸变性重组，维护遗传学或基因组的稳定及完整。因为细胞遗传学的改变与癌症发生密切相关，所以端粒的这一功能同样对预防癌变有着重要意义。

端粒缩短是如何触发细胞老化程序尚不十分明了。近期研究显示过度缩短的端粒因失去与之结合的TRFs(特别是TRF2)，不能维持他们的D和T环结构，导致末端TTAGGG序列外露。这些裸露在外的端粒DNA，本质上相当于断裂的双链DNA(Double-stranded DNABreaks，DSB)，能够激活DNA损伤监控通路(DNA Damage Response Pathway，DDRP)。已有证据表明DDRP通路的ATM，p53在端粒缩短诱导细胞老化过程中至关重要。此外，肿瘤抑制因子p16，Rb亦同样发挥关键作用。众所周知，p53或Rb等具有肿瘤抑制活性的蛋白功能失活极易导致肿瘤发生，其中一个重要原因即端粒缩短诱导细胞老化的效应减弱甚或消失。

如上所述，正常人类体细胞因进行性端粒缩短最终激活DDRP而停止生长。然而，恶性细胞最显著特征之一恰是他们的无限增殖能力。根据上述端粒缩短控制细胞寿命学说，细胞永生或无限分裂的先决条件是维持他们的恒定端粒长度。大量试验及临床研究表明，绝大多数肿瘤细胞(近90％)通过激活一种特殊的逆转录酶即所谓端粒酶而达此目的。端粒酶作为蛋白质-核酸复合体，主要由RNA模板(telomerase RNA，hTER)，端粒酶相关蛋白(telomerase associated protein，hTEPs)，和催化亚单位即端粒酶逆转录酶(telomerasereverse transcriptase，hTERT)组成，他能够利用自身的RNA模板合成TTAGGG序列，延长端粒，从而补偿由细胞分裂所致的端粒DNA丢失，进而赋予细胞持续生长的潜能。大多数正常人类体细胞通常缺乏端粒酶活性(干细胞及活化的淋巴细胞除外)，他们的端粒自然随细胞分裂而缩短。近期的体外试验发现，当肿瘤细胞的端粒酶活性受抑，他们会因无法保持端粒长度而发生生长停滞，凋亡并失去致瘤性，说明端粒酶表达确系维持肿瘤细胞恶性表达及无限增殖所必须。因此，抑制端粒酶活性被认为是一种全新的极具前途的肿瘤治疗手段。确实，当肿瘤细胞被导入并表达突变后无活性的hTERT(Dominant negativehTERT，DN-hTERT)，端粒酶活性受抑制，端粒进行性缩短，细胞最终生长停滞，凋亡并失去致瘤性。此外，许多研究采用不同的策略阻断端粒酶活性，亦获类似结论。

一种安全有效的端粒酶抑制剂可以被用来治疗所有类型的肿瘤，是一全新的肿瘤治疗的靶点，也是近年来国内外研究的热点。虽然寻求端粒酶抑制剂的研究在全球十分活跃，许多实验室发明不同的策略阻断/抑制端粒酶活性，但至今尚缺乏有应用前景并适于临床的端粒酶抑制剂。

开发创新药物是我国目前的一项紧迫任务。从中药中寻找有效的活性成分是一条有效的途径，也是我国创新药物研制的优势所在。我国中医药学具有悠久的历史，用中草药治疗恶性肿瘤也积累了丰富的经验，在这些植物有效成分中，推测极有可能存在抑制端粒酶活性的物质。所以，从天然产物中筛选具有端粒酶抑制活性的先导化合物不失为一理想途径；进而通过进行先导化合物的结构修饰及全合成，再从一系列衍生化合物中筛选活性较强的单体，并结合端粒酶抑制活性的构效关系研究，最终发现具有临床应用前景的药物。

岩黄连为罂粟科紫堇属植物石生黄堇(Corydalis saxicola Bunting[C.thalictrifolia Franch.non Jameson ex Regel])的全草，又名岩胡(贵州)、岩连(四川、云南)、菊花黄、土黄连(广西)。广西民间用其根止痛消肿，拔毒，治疗疥疮肿毒。现代临床用其总生物碱提取物治疗肝炎和肝硬化等疾病(国家中医药管理局《中华本草》编委会.中华本草(第三卷)：638-640.上海：上海科学技术出版社)。

陈重阳等在1982年，研究了岩黄连主要成分脱氢卡维丁(dehydrocavidine)的药理活性，实验结果表明脱氢卡维丁(dehydrocavidine)对中枢神经系统有镇静作用，对肠道平滑肌有解痉作用，在体外对多种细菌有效，对正常小鼠血糖无影响，并能增加肝糖元的生成。叶琦莉于1984年研究了脱氢卡维丁(dehydrocavidine)的体外抗菌活性，实验证明脱氢卡维丁(dehydrocavidine)对革兰阳性菌株有一定抑制作用。1996年，谢沛珊等的抗肿瘤实验证实岩黄连总碱在1.6mg/kg水平对S180肉瘤抑制率可达到30％。近10年来，又有研究表明岩黄连总碱对小鼠免疫功能有增强作用，对大鼠脑中的DA和5-HT的代谢有一定抑制作用。

岩黄连在临床上用作肝炎辅助治疗药物，任仲轩等应用岩黄连注射液治疗病毒性肝炎患者33例，结果显示岩黄连注射液可以有效的改善急慢性肝炎患者的临床症状。岩黄连注射液合并生脉注射液对肝硬化有明显疗效，岩黄连注射液与丹参注射液合用可有效改善肝功能，减轻和抑制肝纤维化的发生。

迄今为止尚未见脱氢卡维丁(dehydrocavidine)类化合物单体成分肝保护及抗肝炎病毒活性的研究报道，亦未见将脱氢卡维丁(dehydrocavidine)类化合物单体成分用于肝炎治疗的报道；同时经过文献检索及跟踪，亦未见国内外将脱氢卡维丁(dehydrocavidine)类化合物单体成分用于端粒酶抑制剂的报道。

发明内容

本发明的目的提出一种从中药岩黄连中分离提取的脱氢卡维丁类化合物、以该类化合物为活性成分的药物组合物，以及它们在治疗急性和慢性病毒性肝炎、肝损伤、流感、肿瘤、AIDS、心律失常的药物中的应用。

本发明通过体内及体外药理活性跟踪筛选，从岩黄连分离纯化得到具有肝损伤保护活性、抗乙肝病毒活性及端粒酶抑制活性的单体化合物成分。通过光谱数据(¹H-NMR、¹³C-NMR、DEPT、MS、UV)，此单体化合物经鉴定结构为脱氢卡维丁(dehydrocavidine)。通过化学合成方法，我们合成了一系列脱氢卡维丁(dehydrocavidine)类化合物。多种药理试验结果证明，该类化合物是较有发展前途的抗肝炎及抗肿瘤天然产物，可用于制备治疗肝病及肿瘤的药物。

脱氢卡维丁类化合物，具有如下结构通式：

其中，R₁、R₂为氢、C_1-18烷基、C_1-18羟烷基、可被任意取代的芳酰基；R₃、R₄、R₅、R₆、为氢、C_1-4烷基或C_1-4羟烷基。经实验研究证明，脱氢卡维丁类化合物具有抗乙肝病毒活性以及具有肝损伤保护作用，并可增进肝脏解毒功能，作为对抗化学毒物的肝保护剂，其效果优于苦参碱；

实验研究还证明脱氢卡维丁类化合物对人端粒酶具有抑制作用，具有抗肿瘤活性、抗病毒活性，同时具有抗心律失常作用。

本发明的药物组合物含有治疗有效量的脱氢卡维丁类化合物为活性成分，以及含有一种或多种药学上可接受的载体。

本发明的化合物和药物组合物可用于制备治疗急性和慢性病毒性肝炎、肝损伤、流感、肿瘤、AIDS、心律失常的药物。

上文所述药学上可接受的载体是指药学领域常规的药物载体，例如：稀释剂、赋形剂如水等，填充剂如淀粉、蔗糖等；粘合剂如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；湿润剂如甘油；崩解剂如琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠；吸收促进剂如季铵化合物；表面活性剂如十六烷醇；吸附载体如高岭土和皂粘土；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙和镁、和聚乙二醇等。另外还可以在组合物中加入其它辅剂如香味剂、甜味剂等。

本发明化合物可以组合物的形式通过口服、鼻吸入、直肠或肠胃外给药的方式施用于需要这种治疗的患者。用于口服时，可将其制成常规的固体制剂如片剂、粉剂、粒剂、胶囊等，制成液体制剂如水或油悬浮剂或其它液体制剂如糖浆、酏剂等；用于肠胃外给药时，可将其制成注射用的溶液、水或油性悬浮剂等。优选的形式冻干粉针剂、小针剂、注射液、胶囊剂、软胶囊、片剂、颗粒剂、冲剂、滴丸、微丸、口服液等。

本发明药物组合物的各种剂型可以按照药学领域的常规生产方法制备。例如使活性成分与一种或多种载体混合，然后将其制成所需的剂型。

本发明的药物组合物优选含有重量比为0.1％-99.5％的活性成分，最优选含有重量比为0.5％-95％的活性成分。

下面的实施例可以使本专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

具体实施方式

实施例1：天然脱氢卡维丁(dehydrocavidine)的提取

将岩黄连药材全草粉碎后，用95％乙醇回流提取，提取液放冷后过滤，滤液减压浓缩至无醇味，以盐酸调节pH值至2～3，搅拌，过滤得到酸水液，酸水液用碱调节pH值至8～10，析出沉淀，过滤得到沉淀部分，沉淀用水分散后，经氯仿、乙酸乙酯或正丁醇萃取，萃取液减压浓缩得到浸膏部分，经硅胶柱层析，以氯仿-甲醇系统梯度洗脱，收集氯仿-甲醇8∶1部分，减压浓缩得到粗品脱氢卡维丁，再以甲醇-水系统重结晶，得到棕褐色棱柱状结晶单体，经鉴定为脱氢卡维丁(dehydrocavidine)。

实施例2：脱氢卡维丁(dehydrocavidine)的结构鉴定

脱氢卡维丁，棕褐色棱柱状结晶，mp 276～278°(分解)，UVλmax(MeOH)nm：268，349；EI-MS：m/z[M⁺]351(1.46％)，337(100％)，321(27.74％)，169(12.61％)，碎片离子m/z169由B环及C环发生RDA裂解产生，初步判定分子结构含有9，10-亚甲二氧基-13-甲基取代结构；¹H-NMR显示分子中含有两个甲氧基δ3.89(s)、3.85(s)，一个甲基δ2.97(s)，一个亚甲二氧基δ6.56(s)，芳香区显示有5个芳香质子，δ7.17(s)、δ7.38(s)为1、4位芳香质子，δ9.94(s)为8位质子，两个临偶芳香质子δ8.06(d，J＝9Hz)、δ8.01(d，J＝9Hz)分别为11、12位质子；脂肪区四个质子，δ3.144(2H，t)、δ4.74(2H，t)相互偶合，为5、6位质子。脱氢卡维丁的结构见下式所示。

即对结构通式而言，R₁为H₂C，R₂为氢，R₃、R₄为H₃CO，R₅、R₆为氧。

实施例3：脱氢卡维丁(dehydrocavidine)类化合物的合成

通过大量的药理活性筛选试验结果，证明脱氢卡维丁具有很好的抗乙肝病毒、抗HIV作用、肝损伤保护作用及端粒酶抑制活性，因此我们设计合成了一系列脱氢卡维丁的类似物及衍生物，重点在于合成13位及8位取代的脱氢卡维丁(dehydrocavidine)类衍生物。

1、13位取代脱氢卡维丁(dehydrocavidine)类化合物的合成，路线如下：

R＝CH₃，C₂H₅，CH(CH₃)₂，CH₂COOCH₃，CH₂CONH₂，CH₂CONHC₂H₅，或CH₂CON(C₂H₅)₂

R，R₁为CH₃，C₂H₅，CH(CH₃)₂，CH₂COOCH₃，CH₂CONH₂，CH₂CONHC₂H₅，CH₂CON(C₂H₅)₂CH₂CONHC₂H₅，或CH₂CON(C₂H₅)₂，等等。

2、8位取代脱氢卡维丁(dehydrocavidine)类化合物的合成，路线如下：

R为CH₃、C₂H₅、CH(CH₃)₂或CH₂C₆H₅

以脱氢卡维丁为先导化合物，共设计合成脱氢卡维丁类化合物共33个，其结构式如下：

即对结构通式而言，R₄为H₃CO，R_，5、R₆为氧。

表1脱氢卡维丁类化合物结构式

实施例4：

片剂：活性成分      10mg

乳糖                187mg

玉米淀粉            50mg

硬脂酸镁            3mg

制备方法：将活性成分(即前述33个化合物之一种或若干种作为活性成分，下同)、乳糖和淀粉混合，用水均匀湿润，把湿润后的混合物过筛并干燥，再过筛，加入硬脂酸镁，然后将混合物压片，每片重250mg，活性成分含量为10mg。

实施例5：

安瓿剂：活性成分       2mg

氯化钠                 9mg

制备方法：将活性成分和氯化钠溶解于适量的注射用水中，过滤所得溶液，在无菌条件下装入安瓿瓶中。

实施例6：脱氢卡维丁(dehydrocavidine)类化合物对试验性肝损伤的保护作用的动物验证

(一)硫代乙酰胺致小鼠急性肝损伤模型

1、试验动物：昆明种小鼠，性别不限，体重19～22g，随意进食及饮水，室温(23±2℃)，自然光照。

2、试验方法：将小鼠随机分成7组，除正常对照组外，其余各组均以硫代乙酰胺(TAA)30mg/Kg，i.p，中毒后3h、6h、9h，连续给药3次，最后一次给药后24小时，即第二天取血，测定如下指标，同时称肝重，并进行病理学检查。结果见表2。

表2 各组试药对硫代乙酰胺致小鼠急性肝损伤模型各指标的影响(X±SD，n＝20)

*与阴性对照组比较：P＜0.05；P＜0.01

结果：与阴性对照组比较，脱氢卡维丁类化合物可显著降低硫代乙酰胺致小鼠急性肝损伤模型造成的肝损害。

(二)四氯化碳致大鼠急性肝中毒模型

1、试验动物：成年SD大鼠，性别不限，体重在250～350g左右，喂饲普通颗粒饲料，随意饮水。

2、试验方法：将大鼠随机分成6组，除正常对照组外，其余各组均以50％四氯化碳0.5ml/100g，皮下注射中毒，同时给药一次，中毒后4h、8h各给药一次，最后一次给药后12小时，取血测定ALT，AST等指标的变化，处死动物称肝重，并进行病理学检查。结果见表3。

表3 各组试药对四氯化碳致大鼠急性肝损伤模型各指标的影响(X±SD，n＝20)

*与阴性对照组比较：

P＜0.05；

P＜0.01

结果：与阴性对照组比较，脱氢卡维丁类化合物可显著降低四氯化碳致大鼠急性肝中毒模型造成的肝损害。

(三)D-氨基半乳糖致大鼠肝中毒模型

1、试验动物：成年SD大鼠，性别不限，体重在250～350g左右，喂饲普通颗粒饲料，随意饮水。

2、试验方法：将大鼠随机分成4组，除正常对照组外，其余各组均以D-氨基半乳糖800mg/Kg，腹腔注射中毒，同时给药一次，给药后12小时，取血测定SGPT，TBIL等指标的变化，处死动物称肝重，并进行病理学检查。结果见表4。

表4 各组试药对D-氨基半乳糖致大鼠肝中毒模型各指标的影响(X±SD，n＝20)

*与阴性对照组比较：

P＜0.05；

P＜0.01

结果：与阴性对照组比较，脱氢卡维丁类化合物可显著降低D-氨基半乳糖致大鼠肝中毒模型造成的肝损害。

(四)四氯化碳诱导肝纤维化模型

1、试验动物：雄性Wistar大鼠，试验开始时体重100～150g，饲育22℃室温，光照周期12h：12h环境中，随意进食及饮水。

2、试验方法：雄性Wistar大鼠，皮下注射0.3ml/100g体重CCl4(溶于花生油中，CCl4体积比为40％)，每周2次，注射12周形成肝纤维化，均为IV期。随后将肝纤维化大鼠随机分为以下各组：生理盐水对照组，各样品组，阳性对照组。每日肌肉注射样品1次，共8周。生理盐水对照组每日肌肉注射0.2ml生理盐水，共进行8周。于治疗8周后从下腔静脉采血作生化测定，然后处死动物，取右叶肝组织，用10％的中性甲醛溶液固定，用于组织学检查。结果见表5：

表5 各组试药对四氯化碳致大鼠慢性肝中毒模型各指标的影响(X±SD，n＝20)(连续11周后)

组别	ALT	AST	肝羟脯氨酸
				脱氢卡维丁	1113.4±247.6	987.3±237.9	0.162±0.013
脱氢阿扑卡维丁	973.2±273.5	1057.1±338.7	0.175±0.018
				SUB-3	1461.2±268.8	1157.9±484.6	0.183±0.025
SUB-4	1263.6±237.9	1049.9±522.7	0.152±0.013
				SUB-5	1821.1±239.4	1834.6±897.4	0.183±0.021
SUB-6	1329.3±264.7	1385.3±681.4	0.195±0.017
				SUB-7	1163.3±279.8	1454.7±536.9	0.192±0.021
SUB-8	1638.4±232.5	1136.0±594.2	0.185±0.017
				SUB-9	937.4±373.6	1985.3±791.8	0.201±0.014
SUB-10	764.6±284.2	1004.0±473.6	0.168±0.018
				SUB-11	1649.1±264.2	1511.2±680.9	0.173±0.026
SUB-12	1183.9±374.5	1214.5±652.4	0.193±0.018
				SUB-13	1849.3±283.2	1104.2±421.5	0.187±0.016
SUB-14	1264.3±374.9	1167.9±542.7	0.197±0.018
				SUB-15	1952.6±227.4	1056.9±488.5	0.188±0.021

SUB-16	1713.7±338.2	1301.9±508.6	0.192±0.012
				SUB-17	1183.4±346.5	1392.2±586.5	0.163±0.014
SUB-18	1794.4±238.8	1463.8±784.4	0.0195±0.017
				SUB-19	1848.4±349.3	1431.8±373.6	0.168±0.013
SUB-20	1148.6±164.2	1699.6±670.0	0.176±0.015
				SUB-21	1279.6±195.9	1586.0±517.1	0.182±0.011
SUB-22	1918.5±207.8	1085.6±445.4	0.152±0.017
				SUB-23	1149.2±261.8	1541.7±508.9	0.172±0.021
SUB-24	1434.7±363.5	1786.9±750.6	0.184±0.016
				SUB-25	1061.4±227.1	1697.6±452.1	0.179±0.014
SUB-26	1839.7±245.9	1237.0±571.8	0.188±0.017
				SUB-27	1332.9±205.8	1903.0±688.7	0.219±0.023
SUB-28	1037.1±161.8	1020.7±343.9	0.214±0.018
				SUB-29	1369.7±264.6	1468.6±559.7	0.205±0.015
SUB-30	1217.4±160.2	1069.0±344.7	0.215±0.018
				SUB-31	1559.2±283.6	1987.3±587.2	0.158±0.013
SUB-32	1723.8±104.7	1057.1±408.1	0.175±0.017
				SUB-33	1792.6±347.2	1157.9±599.3	0.195±0.015
NS对照组	2284.2±273.6	2949.9±1572.4	0.195±0.024
				阳性对照组	1644.7±158.3	1834.6±836.4	0.217±0.040
正常对照组	989.6±180.8	1085.3±437.7	0.169±0.018

*与阴性对照组比较：

P＜0.05；

P＜0.01

结果：与阴性对照组比较，脱氢卡维丁类化合物可显著降低四氯化碳致大鼠慢性肝中毒模型造成的肝损害。

实施例7：脱氢卡维丁(dehydrocavidine)类化合物对肝炎病毒的抑制作用

1.试验材料

1.1 受试药

样品，溶剂及配制方法：实验时根据所设计剂量组浓度用DMEM培养液配制。保存条件：4′C冰箱保存。

1.2 2.2.15细胞：乙型肝炎病毒(HBV)DNA克隆转染人肝癌细胞(Hep G2)的2.2.15细胞系，美国Mount Sinai医学中心构建，我室引进后自行传代培养。

1.3 试剂：DMEM干粉、G-418(Geneticin)，美国GIBCO公司产品；胎牛血清，美国HycloneLab公司产品：HBsAg、HBeAg固相放免测定盒，中国同位素公司北方免疫试剂研究所；卡那霉素，中国生物制品检定所标准晶。

1.4 实验用品及仪器：培养瓶，丹麦Tunclon TM；培养板96孔板、24孔板、6孔板美国Coming公司产品；二氧化碳孵箱，美国Shel-Lab产品；γ计数仪，德国BECKMAN产品；

2.试验方法

2.1 2.2.15细胞培养

在长满2.2.15细胞的培养瓶内加0.25％胰酶，37℃消化3分钟，加培养液吹散，1∶3传代，10天长满。

2.2 药物对细胞毒性试验

实验分无药物细胞对照组和不同药物浓度药物组。细胞消化，配制成每毫升20万个细胞，接种培养板，96孔板每孔100～t1，37′C 5％CO2培养24小时，细胞长成单层后进行实验。各样品分别根据不同溶解度用培养液配制，分别稀释为不同浓度加入96孔细胞培养板，每浓度3孔，每4天换同浓度药液，以观察细胞病变为指标，8天显微镜下观察细胞病变，完全破坏为4；75％为3；50％为2；25％为1；无病变为0。计算每浓度药液平均细胞病变程度和抑制％。按Reed-Muench法计算半数有毒浓度(TC50)和最大无毒浓度(TC0)。

$\mathrm{TC}50=\mathrm{Anti}\log (B+\frac{50-B}{A-B}\×C)$

A＝log＞50％药物浓度  B＝log＜50％药物浓度  C＝log稀释倍数

2.3对HBeAg、HBsAg抑制试验

试验设HBsAg、HBeAg阳性对照组，阴性对照组，细胞对照组及不同药物浓度药物组。2.2.15细胞每毫升100万个接种24孔细胞培养板，每孔1ml，37℃ 5％ CO2培养24小时，试验药液无毒浓度以下2倍稀释，5个稀释度，每浓度3孔，37℃ 5％ CO2培养，每4天换原浓度药液培养，第8天时收获培养液，-20℃冰冻保存。分别测定HBsAg和HBeAg。用γ计数仪测定每孔cpm值。

脱氢卡维丁类化合物对Hep G2 2.2.15细胞的毒性情况及对HBeAg、HBsAg的抑制情况结果如表6：

表6 脱氢卡维丁类化合物对Hep G22.2.15细胞的毒性情况及对HBeAg、HBsAg的抑制情况

样品	浓度(μmol/ml)	细胞毒性	HBeAg抑制率(％)	HBsAg抑制率(％)
					脱氢卡维丁	0.4	-	57.2	34.6
	0.2	-	21.6	31.4
						0.1	-	20.5	28.4

脱氢阿朴卡维丁	0.4	+	/	/
						0.2	-	42.7	22.8
	0.1	-	38.6	20.6
					SUB-7	0.4	+	/	/
	0.2	-	55.29	27.3
						0.1	-	27.2	22.1
SUB-8	0.4	+	/	/
						0.2	-	73.2	28.9
	0.1	-	38.1	22.7
					SUB-9	0.4	+	/	/
	0.2	-	64.3	22.8
						0.1	-	17.3	9.3
SUB-10	0.4	+	/	/
						0.2	-	40.8	8.2
	0.1	-	28.9	0
					SUB-12	0.8	+	/	/
	0.4	-	29.12	10.4
						0.2	-	21.10	6.7
SUB-13	0.4	+	/	/
						0.2	-	42.6	20.1
	0.1	-	20.15	12.7
					SUB-18	0.4	+	/	/
	0.2	-	33.2	28.4
						0.1	-	16.2	5.8
SUB-20	0.4	+	/	/
						0.2	-	19.6	0
	0.1	-	8.2	0
					SUB-25	0.4	+	/	/
	0.2	-	36.1	10.1
						0.1	-	17.2	4.1
SUB-26	0.8	+	/	/
						0.4	-	45.5	17.2
	0.2	-	28.9	15.9
					SUB-27	0.8	+	/	/
	0.4	-	78.2	48.2
						0.2	-	47.7	22.1
SUB-28	0.4	+	/	/
						0.2	-	55.2	19.2
	0.1	-	17.6	6.9
					SUB-30	0.4	+	/	/
	0.2	-	38.3	23.1
						0.1	-	28.1	13.7
SUB-31	0.4	+	/	/
						0.2	-	67.8	21.5

	0.1	-	44.8	19.7
					SUB-32	0.4	+	/	/
	0.2	-	47.2	27.1
						0.1	-	32.8	19.4
SUB-33	0.8	+	/	/
						0.4	-	62.5	19.6
	0.2	-	18.7	7.4
					3TC	1.0	-	30.1	34.2

-：“未见明显毒性”指用MTT法检测细胞存活率≥75％

+：“显示毒性”指细胞存活率≤75％。

结果：脱氢卡维丁(dehydrocavidine)类化合物对HBeAg和HBsAg具有一定的抑制作用，且对HBeAg的抑制作用高于对HBsAg的抑制作用。

实施例8：脱氢卡维丁(dehydrocavidine)类化合物对端粒酶的抑制作用

采用无细胞系统从中草药有效成分中初步筛选出具有端粒酶抑制活性的先导化合物。从端粒酶阳性肿瘤细胞中提取含端粒酶的蛋白，以Telomeric Repeat AmplificationProtocol(TRAP)标准方法检验每种植物有效成分对端粒酶活性的影响。TRAP方法系测定端粒酶活性的标准方法。将各有效成分(10～100μmol)与肿瘤细胞提取物共育一定时间(10～20min)，然后进行TRAP检测并计算其半数抑制浓度IC₅₀，结果如表7：

表7 脱氢卡维丁类化合物对端粒酶的抑制作用

组别	半数抑制浓度IC<sub>50</sub>(mmol)
		脱氢卡维丁	17
脱氢阿扑卡维丁	10
		SUB-3	19
SUB-4	21
		SUB-5	42
SUB-6	37
		SUB-7	44
SUB-8	63
		SUB-9	21
SUB-10	26
		SUB-11	38
SUB-12	45
		SUB-13	73
SUB-14	-
		SUB-15	26
SUB-16	63
		SUB-17	-

SUB-18	-
		SUB-19	44
SUB-20	-
		SUB-21	26
SUB-22	52
		SUB-23	37
SUB-24	16
		SUB-25	34
SUB-26	28
		SUB-27	-
SUB-28	-
		SUB-29	-
SUB-30	26
		SUB-31	37
SUB-32	28
		SUB-33	53

-：“未见抑制活性”指用TRAP法检测半数抑制浓度≥100mmol

结果：脱氢卡维丁(dehydrocavidine)类化合物对端粒酶具有一定的抑制作用。

实施例9：脱氢卡维丁(dehydrocavidine)类化合物对HIV病毒的抑制作用

1、试验材料

1.1 受试药

样品，溶剂及配制方法：实验时根据所设计剂量组浓度用DMSO配制。保存条件：4℃冰箱保存。AZT(zidouvdine)做为阳性对照药。

1.2 细胞和病毒：HIV-1 III B引自美国；MT4细胞株引自日本；

1.3化台物对细胞的毒性测定：将MT4细胞2×105/ml接种于96孔板中，每孔0.1ml，加入验证化合物、对阳性对照药AZT，同时设正常细胞对照，DMSO溶剂对照及空白MT4细胞对照，置37℃、5％CO2培养箱内培养6d。MTT法测定细胞活性，确定TC50值。

1.4 化合物对HIV诱导MT4细胞病变的抑制作用：病毒毒力测定用10倍稀释8个浓度HIV，在培养液RPMI-1640中观察细胞病变，计算TCID50为10-6。同时设正常细胞对照和病毒对照，然后分别加入2倍稀释5个浓度的样品及AZT 100ul，每个样品浓度均设3个平行孔，置37℃、5％ CO2培养箱内培养，72h后在倒置显微镜下观察细胞病变(CPE)，计算IC50及选择指数SI(TC50/IC50)，结果如表8：

表8 脱氢卡维丁类化合物对HIV病毒的抑制作用

组别	IC<sub>50</sub>(ug/ml)	TC<sub>50</sub>(ug/ml)	SI
				脱氢卡维丁	12.5	＞1000	＞80

脱氢阿扑卡维丁	6.25	250	40
				SUB-3	25	500	20
SUB-4	12.5	500	40
				SUB-5	25	1000	40
SUB-6	25	1000	40
				SUB-7	12.5	1000	80
SUB-8	12.5	1000	80
				SUB-9	50	1000	20
SUB-10	25	＞1000	＞40
				SUB-11	50	＞1000	＞20
SUB-12	25	1000	40
				SUB-13	25	250	10
SUB-14	12.5	250	20
				SUB-15	25	500	20
SUB-16	25	250	10
				SUB-17	50	1000	20
SUB-18	12.5	250	20
				SUB-19	12.5	500	40
SUB-20	25	250	10
				SUB-21	25	1000	40
SUB-22	12.5	1000	80
				SUB-23	-	-	-
SUB-24	25	1000	40
				SUB-25	25	250	10
SUB-26	12.5	500	40
				SUB-27	-	-	-
SUB-28	50	＞1000	＞20
				SUB-29	50	＞1000	＞20
SUB-30	50	＞1000	＞20
				SUB-31	100	＞1000	＞10
SUB-32	50	＞1000	＞20
				SUB-33	100	＞1000	＞10
AZT	0.1	500	5000

注：IC₅₀为半数有效浓度；TC₅₀为半数无毒浓度；51为选择指数，-为无效

结果：脱氢卡维丁(dehydrocavidine)类化合物对HIV病毒具有一定的抑制作用。

实施例10：脱氢卡维丁(dehydrocavidine)类化合物对流感病毒抑制作用

1、试验材料

1.1 受试药

样品，溶剂及配制方法：实验时根据所设计剂量组浓度用DMEM培养液配制。保存条件：4℃冰箱保存。利巴韦林做为阳性对照药。

1.2 MDCK(Madin darby canin kidney)细胞、甲1流感病毒：购自中国预防医学科学院病毒所。

1.3 MDCK细胞生长液、细胞维持液、Versene溶液和消化液：按文献(郭元吉，程小雯；1997)方法配制。

2.试验方法

2.1 MDCK细胞传代和流感病毒培养：按文献(郭元吉，程小雯；1997)方法进行。

2.2 细胞毒性试验：将样品加入已长成单层细胞的细胞板内0.1mL/孔，并加细胞维持液至1mL/孔，37℃、5％CO2孵箱内培养72h，观察细胞病变。同时设MDCK细胞对照。实验重复2次。结果表明：样品对MDCK细胞没有产生非特异性细胞病变(CPE)。

2.3 样品抗流感病毒试验：96孔MDCK细胞培养板培养细胞，分别设细胞对照组、病毒对照组、阳性对照组和试验组。将甲1流感病毒加入病毒对照组和试验组，37℃吸附2h，吸出病毒。将不同浓度样品分别加入到各试验组，37℃、5％CO2培养3天，观察试验结果，并计算不同药物对病毒的50％抑制浓度(IC50)，结果如表9：

表9 脱氢卡维丁类化合物对流感病毒的抑制作用

组别	IC<sub>50</sub>(mmol/L)
		脱氢卡维丁	7.4
脱氢阿扑卡维丁	4.2
		SUB-3	6.8
SUB-4	7.2
		SUB-5	7.4
SUB-6	6.8
		SUB-7	9.2
SUB-8	5.1
		SUB-9	3.5
SUB-10	3.2
		SUB-11	6.8
SUB-12	6.2
		SUB-13	4.3
SUB-14	6.5
		SUB-15	6.8
SUB-16	8.3
		SUB-17	5.1
SUB-18	5.3
		SUB-19	4.9
SUB-20	4.5
		SUB-21	4.9
SUB-22	5.2
		SUB-23	4.8
SUB-24	3.8

SUB-25	6.9
		SUB-26	4.6
SUB-27	3.2
		SUB-28	6.3
SUB-29	4.1
		SUB-30	8.2
SUB-31	8.1
		SUB-32	6.3
SUB-33	6.2
		利巴韦林	3.2

试验结果表明，脱氢卡维丁类化合物对流感病毒具有明显的抑制作用。

实施例11：脱氢卡维丁(dehydrocavidine)类化合物对心律失常拮抗作用

1.脱氢卡维丁(dehydrocavidine)类化合物对乌头碱诱导心律失常的拮抗作用

1.1 试验样品：样品用生理盐水加热溶解至所需浓度，溶剂生理盐水同时作为对照液，心律平为阳性对照药。

1.2 试验方法：Wistar大鼠，雌雄兼用，随机分组。ip乌拉坦1.2g/kg麻醉，记录II导联心电图。

分别股静脉缓慢注射化合物(5mg/kg，如有效可降至2.5mg/kg)5min后，心律平(7mg/kg)5min后，对照液(2ml/kg)5min后，以0.08ml/min的速度iv恒速注入乌头碱溶液(5ug/ml)，记录发生室性早博(VP)、室速(VT)、室颤(VF)时乌头碱的用量，并记录心电图。根据各次实验引起VF所耗乌头碱量回归计算得出ED50(VF)值，结果见表10：

表10 脱氢卡维丁类化合物ED50(VF)值

组别	ED<sub>50(VF)</sub>值(10<sup>-6</sup>mol/Kg)
		脱氢卡维丁	7.33
脱氢阿扑卡维丁	4.26
		SUB-3	6.18
SUB-4	5.23
		SUB-5	7.29
SUB-6	6.24
		SUB-7	8.18
SUB-8	10.82
		SUB-9	4.28
SUB-10	8.92
		SUB-11	9.42
SUB-12	4.28

SUB-13	14.92
		SUB-14	17.23
SUB-15	9.82
		SUB-16	4.02
SUB-17	7.44
		SUB-18	6.81
SUB-19	12.43
		SUB-20	15.22
SUB-21	8.25
		SUB-22	9.21
SUB-23	5.28
		SUB-24	9.27
SUB-25	3.28
		SUB-26	8.33
SUB-27	6.17
		SUB-28	7.98
SUB-29	7.49
		SUB-30	6.55
SUB-31	8.32
		SUB-32	5.38
SUB-33	5.19

静脉注射受试化合物后，均可增加乌头碱的用量，推迟VT和(或)VF的出现时间，结果说明脱氢卡维丁类化合物对乌头碱诱发的心律失常有一定的预防作用。

Claims (6)

1、一种脱氢卡维丁类化合物，其特征在于具有如下结构式：

2、如权利要求1所述的脱氢卡维丁类化合物在制备治疗急性和慢性病毒性肝炎、肝损伤、流感、肿瘤、AIDS、心律失常的药物中的应用。

3、一种药物组合物，其特征在于含有权利要求1所述的脱氢卡维丁类化合物为活性成份以及含有一种或多种药学可接受的载体。

4、根据权利要求3所述的药物组合物，其特征在于所述药学上可接受的载体包括稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂。

5、根据权利要求3所述的药物组合物，其特征在于活性成分的重量含量为0.5-95％。

6、根据权利要求3所述的药物组合物，其特征在于剂型包括冻干粉针剂、小针剂、注射液、胶囊剂、片剂、颗粒剂、冲剂、滴丸、微丸、口服液。