CN103055006A - 鱼腥草有效部位及其提取方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种鱼腥草有效部位，其选自鱼腥草挥发油、鱼腥草乙酸乙酯部位和鱼腥草乙醇部位中的一种或两种以上的混合物。所述鱼腥草有效部位的提取方法包括下述步骤：将用水浸泡过的鱼腥草进行水蒸气蒸馏，收集蒸馏液，蒸馏液静置冷却分层后，取上层的油层即得鱼腥草挥发油；将用水提取过的鱼腥草渣晾干或烘干后依次用石油醚、乙酸乙酯和乙醇回流提取，提取液挥干溶剂后即分别得到鱼腥草乙酸乙酯部位和鱼腥草乙醇部位。该鱼腥草有效部位对人肝癌细胞HepG2、人乳腺癌细胞MCF-7、人肺癌细胞A549及人淋巴瘤细胞Raji均有较好的抗肿瘤效果，可用于制备抗肿瘤药物。
Description
技术领域
本发明属于中药技术领域，具体涉及一种植物鱼腥草的有效部位提取物、提取方法和其在制备抗肿瘤药物方面的应用。
背景技术
鱼腥草(Houttuynia cordata Thunb)为三白草科蕺菜属植物，原名“蕺”，始载于《名医别录》，列为下品。分布于长江流域以南地区，主产于浙江、江苏、安徽、福建、河南等省。药用其带根全草，性辛，味微寒，入肺经。具有清热解毒、消痈排脓、利尿通淋等功能，用于肺痈吐脓、痰热喘咳、热淋、热痢、痈肿疮毒、咽喉乳蛾、痔疮脱肛等症，被誉为“中药中的广谱抗生素”。《本草纲目》记载：“其叶腥气，故俗称鱼腥草。”鱼腥草为药食两用的植物。
恶性肿瘤的发生率逐年增高，已经成为威胁人类健康的一大杀手。由于中药的多靶点和副作用小等优点，从传统药物中寻找抗肿瘤活性物质已成为目前的研究方向和热点。
现代药理学研究证明，鱼腥草具有解热、抗炎、抗菌、抗病毒、增强机体免疫功能、抗过敏、镇咳、抗抑郁、改善胰岛素抵抗、降糖、改善心室重构等作用。目前尚未有鱼腥草挥发油、乙酸乙酯部位或乙醇部位具有抗肿瘤作用的相关报道。
发明内容
本发明目的在于提供一种鱼腥草有效部位及其提取方法，该鱼腥草有效部位具有抗肿瘤作用，可以用来制备抗肿瘤药物。
为实现上述目的，本发明采取如下技术方案：
一种鱼腥草有效部位，其选自鱼腥草挥发油、鱼腥草乙酸乙酯部位和鱼腥草乙醇部位中的一种或两种以上的混合物。
所述鱼腥草有效部位的提取方法，其包括下述步骤：将用水浸泡过的鱼腥草进行水蒸气蒸馏，收集蒸馏液，蒸馏液静置冷却分层后，取上层的油层即得鱼腥草挥发油；将用水提取过的鱼腥草渣晾干或烘干后依次用石油醚、乙酸乙酯和乙醇回流提取，提取液挥干溶剂后即分别得到鱼腥草乙酸乙酯部位和鱼腥草乙醇部位。
具体的，可将干燥的鱼腥草粉碎，用其重量8－15倍的水浸泡8－15h（用以使鱼腥草充分浸润），然后将鱼腥草及浸泡液进行水蒸气蒸馏，蒸馏时间6－10h。
将用水提取过的鱼腥草渣晾干或烘干后依次用15－20倍（ml/g）的石油醚、乙酸乙酯和95%乙醇回流提取1－4h。
所述鱼腥草有效部位在制备抗肿瘤药物方面的应用。
鱼腥草挥发油可按本领域常规技术直接或者包合后制成多种剂型，如：溶液剂（如芳香水剂、醑剂、乳剂等）、注射剂、胶囊剂、片剂、颗粒剂、滴丸、缓释制剂及纳米制剂等。也可以鱼腥草挥发油为活性物质，与医学上可接受的药用辅料、赋形剂等混配、组合，制成上述各种剂型。或者还可以与鱼腥草乙酸乙酯部位和/或乙醇部位或其他抗肿瘤药物共同作为活性物质，与医学上可接受的药用辅料、赋形剂等混配、组合，制成上述各种剂型。
本发明鱼腥草有效部位的提取方法简单，经体外细胞试验证明：所得鱼腥草挥发油、鱼腥草乙酸乙酯部位和乙醇部位具有较强的抗肿瘤活性，可用于制备抗肿瘤药物。
具体实施方式
以下通过具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围并不局限于此。
实施例1
一种鱼腥草有效部位，其选自鱼腥草挥发油、鱼腥草乙酸乙酯部位和鱼腥草乙醇部位中的一种或两种以上的混合物。
所述鱼腥草有效部位的提取方法包括下述步骤：取500g粉碎过的鱼腥草全草置于烧瓶中（烧瓶中可放入数粒沸石），加5000ml水振摇混合后浸泡12h左右，然后将鱼腥草及浸泡液进行水蒸气蒸馏（保持微沸6h），收集蒸馏液。蒸馏液静置冷却分层后，取上层的淡黄色油层（约0.5ml）即得鱼腥草挥发油；将用水提取过的鱼腥草渣晾干后依次用7500ml石油醚、7500ml乙酸乙酯和7500ml 95%乙醇回流提取3h（即石油醚回流提取结束后，将分离出来的固体鱼腥草渣添加乙酸乙酯进行回流提取，提取结束后固液分离，液相的即为乙酸乙酯提取液），所得提取液挥干溶剂，分别得到5.6g棕黑色浸膏（即乙酸乙酯部位）、13.5g棕褐色浸膏（即乙醇部位）。
实施例2
一种鱼腥草有效部位，其选自鱼腥草挥发油、鱼腥草乙酸乙酯部位和鱼腥草乙醇部位中的一种或两种以上的混合物。
所述鱼腥草有效部位的提取方法包括下述步骤：取500g粉碎过的鱼腥草全草置于烧瓶中（烧瓶中可放入数粒沸石），加6000ml水振摇混合后浸泡15h左右，然后将鱼腥草及浸泡液进行水蒸气蒸馏（保持微沸8h），收集蒸馏液。蒸馏液静置冷却分层后，取上层的淡黄色油层（约0.6ml）即得鱼腥草挥发油；将用水提取过的鱼腥草渣晾干后依次用10000ml石油醚、10000ml乙酸乙酯和10000ml 95%乙醇回流提取4h，所得提取液挥干溶剂，分别得到6.9g棕黑色浸膏（即乙酸乙酯部位）、14.8g棕褐色浸膏（即乙醇部位）。
实施例3
一种鱼腥草有效部位，其选自鱼腥草挥发油、鱼腥草乙酸乙酯部位和鱼腥草乙醇部位中的一种或两种以上的混合物。
所述鱼腥草有效部位的提取方法包括下述步骤：取500g粉碎过的鱼腥草全草置于烧瓶中（烧瓶中可放入数粒沸石），加4000ml水振摇混合后浸泡10h左右，然后将鱼腥草及浸泡液进行水蒸气蒸馏（保持微沸10h），收集蒸馏液。蒸馏液静置冷却分层后，取上层的淡黄色油层（约0.4ml）即得鱼腥草挥发油；将用水提取过的鱼腥草渣晾干后依次用9000ml石油醚、9000ml乙酸乙酯和9000ml 95%乙醇回流提取1h，所得提取液挥干溶剂，分别得到6.2g棕黑色浸膏（即乙酸乙酯部位）、14.4g棕褐色浸膏（即乙醇部位）。
实施例2所得鱼腥草有效部位的体外试验
1.供试细胞
人肝癌细胞HepG2、人乳腺癌细胞MCF-7、人肺癌细胞A549、人淋巴瘤细胞Raji均为普通市售商品。
2.主要仪器与耗材
⑴168-1000XC酶标仪， BIORAD（美国）产品；
⑵JA2003A电子天平，上海精天电子仪器厂；
⑶CO2培养箱，型号IL-161HT，施都凯仪器设备有限公司；
⑷倒置显微镜，型号XD-30，舜宇光学科技集团有限公司；
⑸空气浴恒温摇床，国华企业，ZD-85型；
⑹微量加样器， Eppendorf（德国）公司；
⑺96孔细胞培养板， Greiner bio-one（德国）公司；
⑻50ml细胞培养瓶， Corning（美国）公司；
⑼一次性滤器， Pall corporation（美国）公司。
3.主要试剂
⑴二甲基亚砜（DMSO），购自北京索莱宝生物医药科技有限公司;
⑵四甲基偶氮唑盐（methylthiazolyl tetrazolium, MTT），Sigma（美国）公司；
⑶胎牛血清，购自杭州四季青生物工程材料有限公司；
⑷1640培养基，购自北京索莱宝生物医药科技有限公司；
⑸胰蛋白酶， Gibco公司产品。
4.方法
4.1 细胞培养
人肝癌细胞HepG2、人肺癌细胞A549为贴壁细胞，用含10%胎牛血清RPMI 1640培养基于37℃、5% CO2培养箱中培养，每2天换液1次，3～5d传代培养。人乳腺癌细胞MCF-7为贴壁细胞，用含10%胎牛血清DMEM培养基于37℃、5% CO2培养箱中培养，每2天换液1次，3～5d传代培养。贴壁细胞的传代培养步骤：倒掉旧培养基，加入3ml PBS缓冲液洗去残留的旧培养基，向培养瓶加入1ml胰蛋白酶，盖好瓶盖后在倒置显微镜下观察，当细胞收回突起变圆时将胰蛋白酶倒掉，加入1ml新鲜含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基，反复吹打消化好的细胞使其脱壁并分散，分装到新培养瓶中，加入5ml含10%胎牛血清RPMI 1640培养基，于37℃、5% CO2培养箱中培养。
人淋巴瘤细胞Raji为悬浮细胞，用含10%胎牛血清RPMI 1640培养基，于37℃、5% CO2培养箱中培养，每2天换液1次，3～5d传代培养。悬浮细胞的传代培养步骤：吸出细胞培养液，放入离心管中，1000rpm离心5分钟，吸掉上清液，加入1ml含10%胎牛血清RPMI 1640培养基，混匀后转移至新的培养瓶中，加入5ml含10%胎牛血清RPMI 1640培养基，于37℃、5% CO2培养箱中培养。
4.2 MTT法体外筛选抗肿瘤药物
取对数生长期细胞接种于96微孔板，密度为2×104个/ml（100 μL/孔）。培养24小时后，加入不同浓度药物的RPMI 1640或DMEM培养基(含10%胎牛血清)。正常对照组细胞加入含0.1% DMSO的RPMI 1640或DMEM培养基(含10%胎牛血清)。72小时后，每孔加入20 μL的MTT，37°C、5%CO2环境下孵育4小时。然后每孔加入200 μl的DMSO来溶解甲瓒。用全自动酶标仪检测在490 nm处的吸光度（A）值。细胞增殖抑制率（%）=[ 1-(实验组A490/正常对照组A490）× 100%]。
5. 结果
5.1 鱼腥草挥发油对各细胞系72h体外抑制活性结果
5.2鱼腥草乙酸乙酯部位对各细胞系72h体外抑制活性结果
5.3鱼腥草乙醇部位对各细胞系72h体外抑制活性结果
研究以HepG2、MCF-7、A549和Raji细胞为模型，对三个供试化合物的体外抗肿瘤活性进行筛选。由上述表格中的数据可以看出，以HepG2细胞为模型，鱼腥草挥发油、乙酸乙酯部位、乙醇部位的IC50分别为0.00709%、22.32μg/ml、191.45μg/ml，鱼腥草挥发油和乙酸乙酯部位的抗肿瘤活性较强。以MCF-7细胞为模型，三个供试化合物的IC50分别为0.00429%、59.75μg/ml、79.19μg/ml，鱼腥草挥发油、乙酸乙酯部位和乙醇部位的抗肿瘤活性均较好。以A549细胞为模型，三个供试化合物的IC50分别为0.00485%、7.22μg/ml、36.16μg/ml，鱼腥草挥发油、乙酸乙酯部位和乙醇部位的抗肿瘤活性均较好。以Raji细胞为模型，三个供试化合物的IC50分别为0.000302%、57.13μg/ml、76.15μg/ml，鱼腥草挥发油、乙酸乙酯部位和乙醇部位的抗肿瘤活性均较好。根据该实验结果可知：鱼腥草挥发油、乙酸乙酯部位和乙醇部位具有较好的体外抗肿瘤效果，提示可用于制备抗肿瘤药物。
Claims (5)
1.一种鱼腥草有效部位，其特征在于，选自鱼腥草挥发油、鱼腥草乙酸乙酯部位和鱼腥草乙醇部位中的一种或两种以上的混合物。
2.权利要求1所述鱼腥草有效部位的提取方法，其特征在于，包括下述步骤：将用水浸泡过的鱼腥草进行水蒸气蒸馏，收集蒸馏液，蒸馏液静置冷却分层后，取上层的油层即得鱼腥草挥发油；将用水提取过的鱼腥草渣晾干或烘干后依次用石油醚、乙酸乙酯和乙醇回流提取，提取液挥干溶剂后即分别得到鱼腥草乙酸乙酯部位和鱼腥草乙醇部位。
3.如权利2所述鱼腥草有效部位的提取方法，其特征在于，将鱼腥草粉碎后，用鱼腥草重量8－15倍的水浸泡8－15h，然后将鱼腥草及浸泡液进行水蒸气蒸馏，蒸馏时间6－10h。
4.如权利2所述鱼腥草有效部位的提取方法，其特征在于，将用水提取过的鱼腥草渣晾干或烘干后依次用15－20倍的石油醚、乙酸乙酯和95%乙醇回流提取1－4h。
5.权利要求1所述鱼腥草有效部位在制备抗肿瘤药物方面的应用。
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