CN104244963A - 制备忍冬纯化提取物的方法以及用于预防和治疗败血症和败血性休克的含该提取物的组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于制备忍冬的纯化提取物的方法以及用于预防和治疗败血症和败血性休克的含有该提取物的组合物。忍冬的纯化提取物显示出在重度败血症CLP模型试验中有效的抗败血症活性，对MODS的效果，和对各种促炎性细胞因子如TNF-α、IL-1β、IFN-γ、HMGB-1等的抑制效果，同时，在与可商业获得的抗菌剂、例如广谱抗生素组合的情况下，它还出乎本领域技术人员意料地显示出对败血症和败血性休克的治疗的协同效应，因此，它可以作为药物和健康功能食品用于治疗和预防败血症和败血性休克。

Description

制备忍冬纯化提取物的方法以及用于预防和治疗败血症和败血性休克的含该提取物的组合物
技术领域
本发明涉及一种制备忍冬(Lonicera Japonica THUNBERG)的纯化提取物的方法以及用于预防和治疗败血症和败血性休克的含有该提取物的组合物。
背景技术
重度败血症是致命的疾病，其具有由伴随有器官功能衰竭和灌注不足的败血症病情引起的高死亡率，所述灌注不足导致系统需氧和供氧之间的不平衡，这迅速进展成败血性休克和多器官功能障碍综合征(MODS)。该疾病的典型症候群为高热、低体温症、正性变时(positive chronotrophy)、增加的心输出量、降低的体循环抵抗力、呼吸性碱中毒、不正常增加或减少量的WBC等，这引起导致致命死亡的迅速的器官功能障碍。已经报道患有重度败血症和败血性休克的患者的死亡率在美国为29％，在欧洲为27％，这是重症监护病房的患者中的主要死亡原因(Jean-Louis Vincent，EdwardAbraham，The Last 100years of Sepsis，Am J Respir Crit Care Med，2006，173，第256-263页)。在美国，每年多于750000名患者患有败血性综合征，其中每年多于210000患者死于该疾病。而且，在欧洲在重症监护病房住院的约37％的患者患有重度败血症，15％的患者患有败血性休克，在韩国由重度败血症导致的死亡率为65％。
败血症可能会因非传染性来源，例如除传染性来源如细菌、病毒、真菌等之外的创伤而恶化，并加重成败血性休克或MODS(Deitch，E.A.Multiple organ failure.Pathophysiology and potential future therapy，Ann.Surg.，1992，216(2)，第117-134页)。败血症发病机理的最明显的特征为在初始阶段体内炎症系统的过度活化，即识别外来污染物如细菌内毒素并被该外来污染物激活的促炎性细胞因子的过度分泌，这被称为“细胞因子风暴”并从败血症发病起维持10至12小时。在细胞因子中，在血液中在初始阶段最开始所检测到的细胞因子TNG-α不仅刺激其他细胞因子如IL-5、IL-8的分泌，也促进中性粒细胞和血管内皮细胞中的细胞黏附分子以及导致炎症反应加重的其他细胞因子的表达(Wada H.等人，Increasedplasma level of interleukin-6in disseminated intravascular coagulation，BloodCoagul.Fibrinolysis，1993，4(4)；第583-590页；Qin,S.等，Role of HMGB1in apoptosis-mediated sepsis lethality，J.Exp.Med.，2006，203(7)，第1637-1642页)。从淋巴细胞和单核细胞分泌的炎性细胞因子IL-6在败血症发病后6小时达到最高水平(Hotchkiss，R.S.,等，Apoptosis and caspases regulate deathand inflammation in sepsis.Nat.Rev.Immunol.，2006，6(11)，第813-822页)。
因此，已经有抑制伴随并刺激炎症的炎性介质如TNF-α、IL-6、IL-1、IL-8等的大量尝试，例如抗炎剂如NSAIDS；或者抑制细胞因子的释放的大量尝试，例如TLR4选择性抑制剂如来自Takeda Pharm.Company Limited的和来自Eisai Co.Ltd.的但是治疗具有一些缺点，例如有限的功效等。
最近美国和欧洲批准的重度败血症的单一治疗剂(Eli lilly andcompany)已经用来治疗重度败血症，但是它也具有缺点，例如有限的适应症和功效、不良反应如严重的出血或中风等(R.Phillip Dellinger等，Important issues in the design and reporting of cinical trilas in severe sepsis asacute lung injury，Journal of Critical Care.，23，第493-499页，2008；www.fda.gov。)
因此，目前仍需要开发具有强效和较小毒性的新的抗败血症药物，并且尝试由在韩国因为无毒性而频繁被开处方和使用的自然资源开发有效的药物。
已经报道分布于韩国的忍冬的花包含木犀草素、肌醇、皂苷、单宁、异绿原酸、绿原酸等(B.S.CHUNG等，Dohaehyangyakdaesajeon，Youngrimpress，第939-940页，1998)。
但是，在以上所引用文献的任何一个中都未报道或公开忍冬的纯化花提取物对败血症的治疗性效果或改善性效果，上述文献的公开通过引用并入本文。
为了研究用于制备含有大量活性成分、如绿原酸及其衍生物的忍冬的纯化花提取物的新方法，和研究忍冬的纯化花提取物对败血症的治疗效果，本发明的发明人已经深入地进行了组分分析以及一些动物模型试验，例如重度败血症CLP模型试验，对MODS的效果，对各种促炎性细胞因子如TNF-α、IL-1β、IFN-γ、HMGB-1等的抑制效果，最终通过确认花提取物的纯化提取物包含大量活性成分并显示出对败血症和败血性休克有效地治疗效果完成了本发明。
通过下文中提供的本发明的详细公开，本发明的这些及其他目的会变得明显。
发明内容
技术问题
因此，本发明的一个目的是提供一种用于制备忍冬的纯化提取物的方法，其包括以下步骤：在第一步骤，利用提取溶剂对忍冬的干花材料进行提取；在第二步骤，使粗制提取物经受选自过滤法、离心或其组合的至少一种处理，优选过滤法以提供忍冬的粗制提取物；在第三步骤，通过添加水使粗制提取物悬浮于水中以制备悬浮溶液，然后将该溶液分级成非极性溶剂可溶部分和极性溶剂可溶部分以除去非极性可溶物质并通过收集剩余物提供第一纯化提取物；在第四步骤，将水添加至第一纯化提取物以使其经受选自使用与水的量相等的量的吸附树脂的吸附色谱、离子柱色谱或其组合的至少一种纯化过程，和用清洗溶剂反复地清洗以提供忍冬的第二纯化提取物；和真空下对该提取物进行浓缩，并干燥以提供忍冬的纯化提取物，所述提取物含有大量的活性成分，具体地，含有基于干燥的纯化提取物的重量的2.0％至30.0％(重量/重量)、优选5.0％至20.0％(重量/重量)、更优选7.0％至15.0％(重量/重量)的量的绿原酸及其衍生物。
在本发明的一个优选实施方案中，上述方法中第一步骤的提取溶剂包括基于花材料重量的约1至100倍、优选2至20倍、更优选5至15倍体积(体积/重量)的至少一种溶剂，该至少一种溶剂选自水、酒精制剂、甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、己烷、乙酸乙酯、环己烷、DMSO、氯仿和二氯甲烷，优选地选自水、甲醇、乙醇、丙醇和丁醇，更优选水，最优选使基于花材料的重量的0.1％至5％、优选0.2％至2％重量(重量/重量)的量的弱碱如NaHCO3、NaCO3等溶解于水中以提高提取效率的碱性溶液。
在本发明的一个优选实施方案中，通过选自热水回流提取、花香提取、索氏提取、超声波提取及其组合的至少一种方法，优选在20℃至120℃、优选30℃至100℃持续约1至72小时、优选2至12小时的热水回流提取来进行上述方法中第一步骤的提取过程。
在本发明的一个优选实施方案中，通过选自过滤法、离心或其组合的至少一种处理，优选过滤法来进行上述方法中第二步骤的提供忍冬的粗制提取物的处理。
在本发明的一个优选实施方案中，通过以下过程来进行上述方法中第三步骤的提供第一纯化提取物的过程：添加约0.005至5倍体积、优选0.05至3倍体积的水(体积/重量，基于粗提取物的重量)以制备悬浮溶液；和通过添加约0.1至50倍体积、优选0.5至10倍体积的非极性溶剂(体积/体积，基于悬浮溶液的体积)将溶液分级成非极性溶剂可溶部分和极性溶剂可溶部分以除去非极性可溶物质，所述非极性溶剂例如是己烷、二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯等，优选己烷、二氯甲烷、或乙酸乙酯，更优选己烷或二氯甲烷。
通过第三步骤的纯化过程，可以从提取物中有效地移出提取物中的非极性可溶物质，例如精油如十六烷酸、亚油酸甲酯、芳樟醇、香芹酚、棕榈酸甲酯等，和甾醇类化合物如β谷甾醇等。
在本发明的一个优选实施方案中，通过以下过程来进行上述方法中第四步骤的提供忍冬的第二纯化提取物的过程：将1至30倍重量、优选2至15倍重量、更优选5至10倍重量的水(重量/重量，基于第一纯化提取物的重量)添加至第一纯化提取物以使其经受吸附色谱来进一步纯化，所述吸附色谱使用与水的量相等的量的吸附树脂，优选选自SP207、HP20SS、Diaoion HP 20、SP-850树脂、活性炭、或Amberlite XAD-2,4的至少一种树脂，更优选选自Diaion HP 20、SP-850树脂或Amberlite XAD-2,4的至少一种树脂。
在本发明的一个优选实施方案中，通过经受离子柱色谱来进行上述方法中第四步骤的提供忍冬的第二纯化提取物的过程，所述离子柱色谱使用与水的量相等的量的离子树脂，例如，选自AG 50W-x8、Amberlte IR-120、Amberlite IRA-400、Dowex 50W-x8或SK1B的至少一种强酸性树脂，或者选自Amberlte IRC-50、Bio-Rex 70、Duolite-436或WK40的至少一种弱酸性树脂，或者选自Amberlte IR-67或Dowex 3-x4的至少一种弱碱性树脂，优选选自Amberlte IR-120、Amberlite IRA-400或SK1B的至少一种强酸性树脂，更优选选自Amberlte IR-120或Amberlite IRA-400的至少一种强酸性树脂。
在本发明的一个优选实施方案中，通过重复地用选自水、甲醇、乙醇、丙醇、丁醇或其混合物的至少一种清洗溶剂，优选水与甲醇的混合溶剂清洗吸附到树脂的吸附物质来进行上述方法中第四步骤的提供忍冬的第二纯化提取物的清洗过程。
通过第四步骤的纯化，可以从提取物中有效地移出不显示药理活性的非活性物质，例如氨基酸如脯氨酸等，和糖类如葡萄糖、蔗糖、肌醇等。
在本发明的一个替代实施方案中，优选进行除上述方法中第四步骤的纯化步骤外的另外的纯化步骤，例如葡聚糖凝胶柱色谱，葡聚糖凝胶柱色谱使用选自Sephadex LH-20树脂、Sephadex G15树脂或Sephadex G35等的至少一种葡聚糖凝胶树脂。
在本发明的一个优选实施方案中，通过以下过程进行上述方法中第五步骤的提供忍冬的纯化提取物的浓缩过程和干燥过程以提供忍冬提取物的创造性纯化提取物(下文中表示为“HS-23提取物”)：在10℃至80℃的温度、优选小于60℃的温度，在真空下浓缩提取物，并通过选自室温干燥法、冷冻干燥法、热空气干燥法或其组合的至少一种干燥方法，优选冷冻干燥法来干燥提取物。
通过以上的创造性纯化过程，本发明人已经发现，通过上述方法制备的忍冬的创造性纯化提取物含有大量的活性成分，具体地，约5.8倍产率的绿原酸和约5.2倍产率的包括绿原酸及其衍生物的总绿原酸衍生物，例如基于干燥纯化提取物的重量的2.0％至30.0％(重量/重量)、优选5.0％至20.0％(重量/重量)、更优选7.0％至15.0％(重量/重量)的量的3,5-O-咖啡酰奎宁酸、3,5-二-O-咖啡酰奎宁酸甲酯等，其产率是通过本领域中用于制备忍冬提取物的众所周知的提取方法的产率的5倍以上。
此外，HS提取物显示出在重度败血症CLP模型试验中的抗败血症活性、对MODS的效果、和对各种促炎性细胞因子如TNF-α、IL-1β、IFN-γ、HMGB-1等的抑制效果，同时，对于本领域技术人员，在与可商业获得的抗菌剂、例如广谱抗生素组合的情况下，它还出乎本领域技术人员意料地显示出对败血症和败血性休克的治疗的协同效应(在诱发重度败血症的动物模型中，与单一治疗组相比约120％增加的存活率)。
技术方案
因此，本发明的一个目的是一种忍冬的纯化HS-23提取物，其含有基于干燥的纯化提取物的重量的2.0％至30.0％(重量/重量)、优选5.0％至20.0％(重量/重量)、更优选7.0％至15.0％(重量/重量)的量的绿原酸及其衍生物，所述干燥的纯化提取物是通过以下步骤制备的：在第一步骤，利用提取溶剂对忍冬的干花材料进行提取；在第二步骤，使粗提取物经受选自过滤法、离心或其组合的至少一种处理，优选过滤法以提供忍冬的粗提取物；在第三步骤，通过添加水使粗提取物悬浮于水中以制备悬浮溶液，然后将该溶液分级成非极性溶剂可溶部分和极性溶剂可溶部分以除去非极性可溶物质并通过收集剩余物提供第一纯化提取物；在第四步骤，将水添加至第一纯化提取物以使其经受选自使用与水的量相等的量的吸附树脂的吸附色谱、离子柱色谱或其组合的至少一种纯化过程，和用清洗溶剂反复地清洗以提供忍冬的第二纯化提取物；和真空下对该提取物进行浓缩，并干燥以提供用于治疗和预防败血症、MODS或败血性休克的忍冬的纯化提取物。
因此，本发明的一个目的是提供一种药物组合物，其包含通过上述方法纯化的忍冬的纯化HS-23提取物作为用于治疗和预防败血症、MODS或败血性休克的活性成分。
具有与通过众所周知的提取方法制备的提取物相比更有效的药理学作用的创造性纯化HS-23提取物可以含有基于干燥纯化提取物的重量的2.0％至30.0％(重量/重量)、优选5.0％至20.0％(重量/重量)、更优选7.0％至15.0％(重量/重量)的量的绿原酸及其衍生物。
本发明的一个目的是提供通过上述方法纯化的忍冬的纯化HS-23提取物用于制备用于治疗和预防包括人类的哺乳动物的败血症、MODS或败血性休克的治疗剂的用途。
本发明的一个目的是提供一种治疗或预防包括人类的哺乳动物的败血症、MODS或败血性休克的方法，其包括向所述哺乳动物施用有效量的通过上述方法纯化的忍冬的纯化HS提取物以及其药学可接受的载体。
本文中所公开的术语“败血症”包括但不限于各种败血症，例如中度败血症，重度败血症，或由烧伤、急性咽喉炎、溃疡性结肠炎、IBS(肠道易激综合征)、风湿性关节炎、退行性关节炎、急性肝炎、慢性肝炎等引起的败血症或感染症状，优选地，中度败血症、重度败血症、或由烧伤引起的败血症或感染症状。
本文中所公开的术语“MODS(多器官功能障碍综合征)”包括但不限于发生在受损器官中的各种MODS，例如发生在由中度败血症、重度败血症、或由烧伤引起的败血症或感染症状，优选重度败血症导致的选自肝、肾、心脏、肺、小肠、大肠、十二指肠、胃、胰、脾等的受损器官中，优选肝、肾、或心脏中的MODS。
在本文中所公开的术语“败血性休克”包括但不限于各种败血性休克，例如由中度败血症、重度败血症、或由烧伤引起的败血症或感染症状导致的败血性休克。
显示有效抗败血症活性的HS提取物可以与可商业获得的抗菌剂组合以获得治疗和预防败血症、MODS或败血性休克的协同效应。
因此，本发明的另一个目的是提供一种药物组合物，其包含通过上述方法纯化的忍冬的纯化HS-23提取物与可商业获得的抗菌剂的组合作为用于治疗和预防败血症、MODS或败血性休克的活性成分。
本发明的一个目的是提供通过上述方法纯化的忍冬的纯化HS-23提取物与可商业获得的抗菌剂的组合用于制备用于治疗和预防包括人类的哺乳动物的败血症、MODS或败血性休克的治疗剂的用途。
本发明的一个目的是提供一种治疗或预防包括人类的哺乳动物的败血症、MODS或败血性休克的方法，其包括向所述哺乳动物施用有效量的通过上述方法纯化的忍冬的纯化HS-23提取物与可商业获得的抗菌剂的组合以及其药学可接受的载体。
本文中所公开的术语“通过上述方法纯化的忍冬的纯化HS-23提取物与可商业获得的抗菌剂的组合”包括(a)通过上述方法纯化的忍冬的纯化HS-23提取物与(b)可商业获得的抗菌剂以按重量计0.1至10:0.1至10(重量/重量)、优选按重量计1至10:1至10(重量/重量)、更优选按重量计1至5:1至5(重量/重量)的混合比混合的的组合。
本文中所公开的术语“可商业获得的抗菌剂”包括但不限于各种可商业获得的抗菌剂，例如选自以下的至少一种抗菌剂：抗生素，如青霉素、喹诺酮、氨曲南(monobactam)、氨基糖苷类、头孢菌素、四环素、糖肽类、碳青霉烯等；抗炎剂，如甲灭酸、吲哚美辛、异丁苯丙酸、吡罗昔康、双氯芬酸等；抗真菌剂，如两性霉素B、制真菌素、灰黄霉素、唑类抗真菌剂等；抗过敏剂，如西替利嗪、非索非那定、氯苯吡胺(chlroropeniramine)等；优选选自抗生素如青霉素、喹诺酮、氨曲南、氨基糖苷类、头孢菌素、四环素、糖肽类、碳青霉烯等的抗菌剂；更优选选自阿莫西林、氨苄西林、万古霉素、阿米卡星、亚胺培南(imipenam)等的抗菌剂。
本发明的药物组合物可以含有基于组合物总重量的约0.01重量％至50重量％的上述提取物。
根据本领域中众所周知的使用方法，该创造性组合物可以另外包含常规的载体、佐剂或稀释剂。优选的是所述载体是根据使用和应用方法作为合适的物质使用的，但其不受限制。在Remington’s Pharmaceutical Science(Mack Publishing co，Easton PA)的书面文本中列出了合适的稀释剂。
在下文中，以下配制方法及赋形剂仅仅是示例性的，并且不以任何方式限制本发明。
含有本组合物的药物制剂可以以任何形式制备，例如口服给药形式，如作为固体口服制剂的冻干剂型、散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、软胶囊剂、酏剂药丸、袋装制剂等，作为液体口服制剂的悬浮剂、溶液、乳剂、糖浆、含水药物等；局部用剂型，如霜剂、药膏剂、洗剂、凝胶剂、香膏剂、贴剂、糊剂、喷雾溶液、气雾剂等；或肠胃外给药形式，例如栓剂或可注射剂型，如无菌溶液、悬浮剂、冻干剂型、无水型注射剂、或含水型注射剂，优选无菌的可注射剂型。
根据本发明的组合物可以作为药物组合物提供，所述药物组合物含有药学可接受的载体、佐剂或稀释剂，例如乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤藓醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、海藻酸、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油。制剂可以另外包括溶剂、添加剂、稀释剂、缓冲剂、等渗剂、稳定剂、抗氧化剂、镇痛剂、乳化剂、填充剂、抗凝剂、润滑剂、湿润剂、调味剂、防腐剂等。特别地，所述溶剂、添加剂、或稀释剂包括无菌蒸馏水、生理盐水溶液、pH调节剂、白蛋白、氯化钠、甘露醇、林格氏溶液(Ringer’s solution)、葡萄糖等。固体口服制剂，如散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、软胶囊剂、酏剂药丸、袋装制剂等可以通过将创造性提取物与至少一种佐剂混合来制备，所述佐剂例如是淀粉、碳酸钙、蔗糖、乳糖、明胶等，如果必要的话，与作为将被配制的另一添加剂的润滑剂如硬脂酸镁、滑石等混合。液体口服制剂，如悬浮剂、溶液、乳剂、糖浆、含水药物等可以通过将创造性提取物与待配制的至少一种佐剂混合来制备，所述佐剂例如是湿润剂、调味剂、甜味剂、防腐剂，而不与待配制的常用稀释剂如水或液态石蜡混合来制备。作为肠胃外给药形式，例如，在本发明中，可注射剂型，如无菌溶液、悬浮剂、冻干剂型、无水型注射剂、或含水型注射剂可以使用丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油、可注射的酯如油酸乙酯(ethyl olate)等作为基体；而栓剂可以使用whitepsol、macrogol、吐温(tween)61、可可油、月桂油、甘油明胶等作为基体。
可以配制本发明的组合物以提供在通过采用本领域中众所周知的过程中的任何一种对患者施用活性成分后，活性成分的快速、持续或延迟的释放。
例如，本发明的组合物可以溶解于常用于制备注射剂的油、丙二醇或其他溶剂中。载体的合适的实例包括生理盐水、聚乙二醇、乙醇、植物油、肉豆蔻酸异丙酯等，但不限于此。为了局部施用，本发明的提取物可以以软膏剂和霜剂的形式配制。
药学给药形式的本发明的组合物可以以它们药学可接受的盐的形式使用，并且也可以单独使用或者以合适的组合使用，以及与其他药学活性的化合物组合使用。
创造性提取物或组合物的期望剂量根据对象的病情和体重、严重程度、药物形式、施用途径及周期而变化，本领域技术人员可以选择剂量。然而，为了获得期望的效果，通常建议施用1微克/天至5毫克/天、优选8微克/天至2毫克/天、更优选16微克/天至1毫克/天的量的本发明的创造性提取物。剂量可以每天单次施用或分成多次施用；周期性施用，例如2天至一周的周期一次，但是不打算限制于此。本发明的范围可以包括任何修改，或者给药的任何量和次数方面的变化，和本领域技术人员可想到的任何施用途径。在组合物方面，创造性提取物的量可以是基于组合物总重量的以重量计0.01％至50％、优选以重量计0.5％至40％。
本发明的药物组合物可以通过各种途径施用至对象动物，如哺乳动物(大鼠、小鼠、家畜或人类)。考虑施用的所有方式，例如施用可以是口服、经直肠、或通过静脉内注射、肌肉内注射、皮下注射、皮内注射、鞘内注射、脑膜外注射或脑室内注射来完成。
本发明的创造性提取物没有毒性和不良反应，因此，它们可以安全使用。
本发明提供了一种健康功能食品，其包含通过上述方法纯化的忍冬的纯化HS-23提取物作为用于缓解和预防败血症、MODS或败血性休克的活性成分。
本发明提供了一种健康功能食品，其包含通过上述方法纯化的忍冬的纯化HS-23提取物与可商业获得的抗菌剂的组合作为用于缓解和预防败血症、MODS或败血性休克的活性成分。
本发明还提供了一种健康功能食品，其包含通过上述方法纯化的忍冬的纯化HS-23提取物和饮食学可接受的添加剂用于缓解和预防败血症、MODS或败血性休克。
本发明还提供了一种健康功能食品，其包含通过上述方法纯化的忍冬的纯化HS-23提取物与可商业获得的抗菌剂的组合，和饮食学可接受的添加剂用于缓解和预防败血症、MODS或败血性休克。
在一个优选实施方案中，本发明的另一个目的是提供一种保健食品，其包含用于缓解或预防败血症、MODS、或败血性休克的通过上述方法纯化的忍冬的纯化HS-23提取物，以及饮食学可接受的添加剂。
在一个优选实施方案中，本发明的另一个目的是提供一种保健食品，其包含用于缓解和预防败血症、MODS或败血性休克的通过上述方法纯化的忍冬的纯化HS-23提取物与可商业获得的抗菌剂的组合，以及饮食学可接受的添加剂。
创造性健康功能食品或保健食品的粗制药物组合物是以其粉末状形式、从其中提取的形式或其干燥提取物形式使用的。
以此公开的术语“饮食学可接受的添加剂”包括可以是本领域中众所周知的可常规获得的添加剂，例如美国食品药品管理局所公布的食品添加剂列表(参见www.fda.gov/food)。
用于预防和改善目标疾病的健康功能食品可以含有基于组合物总重量的约0.01重量％至95重量％、优选0.5重量％至80重量％的上述粗制提取物。
其中上述粗制药物组合物可以添加至食品、添加剂或饮料用于预防和改善目标疾病。为了预防和改善目标疾病的目的，其中，在食品或饮料中上述粗制药物组合物的量对于健康食品组合物一般可以是食品总重量的约0.1重量％至15重量％，优选1重量％至10重量％，对于健康饮料组合物可以是100ml健康饮料组合物中1至30g，优选3至10g。
假设本发明的健康饮料组合物含有所示比例的上述提取物作为主要组分，对其他液体组分没有特别限制，其中所述其他组分可以是与常规饮料一样的各种除臭剂或天然碳水化合物等。前述天然碳水化合物的实例是单糖，如葡萄糖、果糖等；二糖，如麦芽糖、蔗糖等；常规糖，如糊精、环糊精；和糖醇，如木糖醇和赤藓醇等。至于除前述实例外的其他除臭剂，可以有力地使用天然除臭剂，如索马甜(taumatin)；甜叶菊提取物，如levaudioside A、甘草甜素等；以及合成除臭剂，如糖精、阿斯巴甜等。上述天然碳水化合物的量一般为100ml本饮料组合物中约1g至20g，优选5g至12g。
除前述组合物外的其他组分在奶酪、巧克力等的情况下是各种营养素、维生素、矿物质或和电解质、合成调味剂、着色剂和改良剂，在碳酸饮料等中使用的果胶酸及其盐、海藻酸及其盐、有机酸、保护性胶体黏合剂、pH调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、酒精、碳化剂。除前述组分外的其他组分可以是用于制备天然果汁、果汁饮料和蔬菜饮料的果汁，其中所述组分可以独立地使用或组合地使用。组分的比例不是那么重要，但一般为每100重量％本组合物约0至20重量％。
对本领域技术人员明显的是，在不脱离本发明的精神或范围的条件下，可以在本发明的组合物、用途以及制备物中进行各种修改和变化。
有益效果
本发明提供一种用于制备包含大量活性成分的忍冬的纯化提取物的方法。
本发明提供一种药物组合物，其包含有效量的忍冬的纯化提取物作为活性成分用于预防和治疗败血症和败血性休克。
本发明还提供上述提取物用于制备治疗和预防哺乳动物或人类中败血症和败血性休克的药物组合物的用途。
附图说明
根据结合附图的以下详细描述，会更清楚地理解本发明的以上和其他目的、特征和其他优势，其中：
图1示出了CGA(A)、HS-23(b)和SL-101(c)的HPLC数据(*保留时间-18分钟(CGA)，9&21分钟-CGA衍生物)；
图2示出了在重度败血症CLP模型中亚胺培南治疗组和亚胺培南与HS-23组合治疗组中存活率的变化。
具体实施方式
对本领域技术人员明显的是，在不脱离本发明的精神或范围的条件下，可以在本发明的组合物、用途以及制备物中进行各种修改和变化。
本发明提供一种用于制备包含大量活性成分的忍冬的纯化提取物的方法。
本发明提供一种药物组合物，其包含有效量的忍冬的纯化提取物作为活性成分用于预防和治疗败血症和败血性休克。
本发明还提供上述提取物用于制备治疗和预防哺乳动物或人类中败血症和败血性休克的药物组合物的用途。
通过以下实施例更具体地说明本发明。然而，应理解，本发明不以任何方式受限于这些实施例。
实施例
以下的参照实施例、实施例和实验实施例旨在进一步说明本发明而不限制其范围。
发明的实施方式
比较例1忍冬的常规粗制提取物(SL-101)的制备
将忍冬的干花添加至10倍体积的蒸馏水，用热水回流提取法在100℃进行提取3小时。过滤溶液，用真空蒸发器(EYELA N-1000，EYELA Ltd.日本)在低于60℃下浓缩滤液，并用冻干器(FDCF-12012，Operon Co.韩国)进行干燥，以获得忍冬的干燥粗制花提取物(产率：40.0％，下文中表示为“SL-101”)。该干燥粉末在以下实验中用作比较试验样品。
实施例1：忍冬的纯化提取物(HS-23a.23b)的制备
1-1.使用5倍重量的HP-20树脂(HS-23a)
将忍冬的干花添加至10倍体积的蒸馏水，用热水回流提取法在100℃进行提取3小时。过滤溶液，用真空蒸发器(EYELA N-1000，EYELA Ltd.日本)在低于60℃下浓缩滤液，并用冻干器(FDCF-12012，Operon Co.韩国)进行干燥，以获得忍冬的干燥粗制花提取物。使提取物悬浮于1.5倍体积的水中(体积/重量，基于粗制提取物的重量)，用等体积的乙酸乙酯使悬浮液分级三次以移出乙酸乙酯可溶部分以提供第一纯化提取物。向提取物添加5倍重量的水(重量/重量，基于第一纯化提取物的重量)，再向其中添加等重量的HP-2树脂(Mitsubishi Chemical)并搅拌5小时以移出水溶性物质。向剩余部分添加10倍体积的水和等量的30％甲醇作为清洗溶剂并搅拌5小时以提供第二纯化提取物。用真空蒸发器(EYELA N-1000，EYELA Ltd.日本)在低于60℃的真空下浓缩吸附的吸附物质，并用冻干器(FDCF-12012，Operon Co.韩国)进行干燥，获得忍冬的纯化花提取物(最终产率：3.1％，下文中表示为“HS-23a”)。该干燥粉末在以下实验中用作试验样品。
1-2.使用10倍重量的HP-20树脂(HS-23b)
除了HP-21树脂的使用量为水的10倍重量外(重量/重量，基于第一纯化提取物的中重量)，所有的纯化过程与实施例1-1中公开的程序相同，以获得忍冬的纯化花提取物(最终产率：3.1％，下文中表示为“HS-23b”)。该干燥粉末在以下实验中用作试验样品。
实施例2：忍冬的纯化提取物(HS-23c)的制备
将忍冬的干花添加至10倍体积的蒸馏水，用热水回流提取法在100℃进行提取3小时。过滤溶液，用真空蒸发器(EYELA N-1000，EYELA Ltd.日本)在低于60℃下浓缩滤液，并用冻干器(FDCF-12012，Operon Co.韩国)进行干燥，以获得忍冬的干燥粗制花提取物。使提取物悬浮于1.5倍体积的水中(体积/重量，基于粗制提取物的重量)，用等体积的乙酸乙酯使悬浮液分级三次以移出乙酸乙酯可溶部分以提供第一纯化提取物。向提取物添加10倍重量的水(重量/重量，基于第一纯化提取物的重量)，再向其中添加等重量的SP-850树脂(Mitsubishi Chemical)并搅拌5小时以移出水溶性物质。向剩余部分添加10倍体积的水作为清洗溶剂，同时检查剩余的水溶性物质。向剩余部分加3倍体积的10％甲醇，搅拌5小时，并用相似的方法向剩余树脂添加3倍体积的20％甲醇，在真空下进行浓缩，并干燥。使用30％甲醇重复清洗过程，洗脱液与来自使用10％、20％和30％甲醇的清洗过程的洗脱液一起收集。用真空蒸发器(EYELA N-1000，EYELA Ltd.日本)在低于60℃的真空下浓缩收集的第二纯化提取物，并将浓缩物溶解于3倍体积的30％甲醇。用Sephadex LH树脂(GE Healthcare，美国)进一步纯化溶液以移出分子量小于2.5kD的剩余无效成分，例如类固醇、萜类、脂类、多元酚、生物碱、氨基酸等。用真空蒸发器(EYELA N-1000，EYELA Ltd.日本)在低于60℃的真空下浓缩用30％甲醇溶剂作为流动相流出的剩余洗脱液，并用冻干器(FDCF-12012，Operon Co.韩国)进行干燥以获得忍冬的纯化花提取物(最终产率：1.6％，下文中表示为“HS-23c”)。该干燥粉末在以下实验中用作试验样品。
实施例3：忍冬的纯化提取物(HS-23d)的制备
将忍冬的干花添加至10倍体积的蒸馏水，用热水回流提取法在100℃提取3小时。过滤溶液，用真空蒸发器(EYELA N-1000，EYELA Ltd.日本)在低于60℃下浓缩滤液，并用冻干器(FDCF-12012，Operon Co.韩国)进行干燥，以获得忍冬的干燥粗制花提取物。使提取物悬浮于1.5倍体积的水中(体积/重量，基于粗制提取物的重量)，用等体积的乙酸乙酯使悬浮液分级三次以移出乙酸乙酯可溶部分以提供第一纯化提取物。向提取物添加10倍重量的水(重量/重量，基于第一纯化提取物的重量)，再向其中添加等重量的Amberlite-XAD-2树脂(Rohm&Haas Co.，美国)并搅拌5小时以移出水溶性物质。向剩余部分添加10倍体积的水和等量的30％甲醇作为清洗溶剂，并搅拌5小时以提供第二纯化提取物。用真空蒸发器(EYELAN-1000，EYELA Ltd.日本)在低于60℃的真空下浓缩吸附的吸附物质，并用冻干器(FDCF-12012，Operon Co.韩国)进行干燥以获得忍冬的纯化花提取物(最终产率：2.8％，下文中表示为“HS-23d”)。该干燥粉末在以下实验中用作试验样品。
实施例4组分分析
用根据表1中公开的条件的HPLC分析在比较例和实施例中制备的提取物的组分，结果示于表2。
1-1.试剂
在实验中使用了CGA(绿原酸＞96％，Aldrich C3878)、TFA(三氟乙酸，Sigma Aldrich 299537)、HP-20树脂(Mitsubishi Chemicals)、乙腈(Burdick&Jackson，HPLC用)、水(Burdick&Jackson，HPLC用)和乙酸乙酯(Junsei)。
1-2.样品处理
将100mg在比较例和实施例中制备的三种提取物溶解于70ml蒸馏水，通过超声提取进行提取。过滤提取物，将蒸馏水添加至滤液以使其为100ml，通过HPLC分析各个滤液的组分以确定各提取物中的组分模式以及活性成分的量。
[表1]HPLC条件
1-3.结果
如在表2中可看到的，已经确认：与根据本领域中常规方法制备的SL-101提取物相比，在HS-2b纯化提取物中，在绿原酸和包括绿原酸的总绿原酸衍生物的产率方面，绿原酸(CGA)及其衍生物(例如3,5-O-咖啡先奎宁酸、3,5-二-O-咖啡先奎宁酸甲酯等)的量分别大幅增加了约5.8倍和约5.2倍产率(参见图1)
[表2]HPLC结果
实验实施例1在重度败血症CLP模型中与抗生素的组合治疗
为了评价实施例中制备的纯化提取物与抗生素的组合对重度败血症的治疗活性，根据程序中公开的改良程序(Daniel Rittirsch等人，Immuodesignof Experimental sepsis by cecal ligation and puncture，Nature Protocols，第4(1)卷，第31-36页，2009)用重度败血症CLP模型进行以下实验。
将麻醉剂(盐酸氯胺酮，100mg/kg，Yuhan Pharm.Co.)腹膜内注射至小鼠(ICR雌性，23g至25g，8周大，www.dhbiolink.com)，并通过CLP(盲肠结扎穿刺)对小鼠诱发败血症诱发。切开腹腔中部，暴露盲肠以用丝线缝合(医学缝合线No.1和No.2，www.lead-care.com)来结扎末端回盲瓣。用一个线在盲肠处制造两个孔，以使得流出一定量的排泄物。将盲肠与排泄物一起放进腹腔并向其皮下注射生理盐水以诱发败血症。将实施例中制备的样品(HS-2b)静脉注射至尾巴。
特别地，改变末端回盲瓣的缝合位置，并且穿刺的数量多于2个，以增加该实验中排泄物的量来诱发重度败血症CLP模型。
确定10天内单一治疗组和组合治疗组的存活率，所述单一治疗组在重度败血症CLP模型诱发后第0小时和第24小时仅用HS-23(40mg/kg)治疗，而所述组合治疗组每12小时用HS-23(40mg/kg)和抗生素(亚胺培南，分类号I0160，Sigma-Aldrich，25mg/kg)治疗并持续4天。发现在CLP治疗组、亚胺培南单一治疗组以及在亚胺培南与HS-34的组合治疗组中第10天的最终存活率分别为8％、33％和50％，这表明与使用常规广谱抗生素的单一治疗组相比，亚胺培南与HS-23的组合治疗显示出17％的存活率增加(参见图2)。
在仅用生理盐水和PBS(磷酸盐缓冲盐水)治疗的空白组中，CLP后第1天、第2天、第3天和第4天至第10天的存活率分别为75％、33％、17％和8％。
在仅用亚胺培南(25mg/kg)治疗的单一治疗组中，CLP后第1天、第2天、第3天和第4天至第10天的存活率分别为83％、58％、50％和42％。
在用亚胺培南(25mg/kg)与HS-34(40mg/kg)的组合治疗组中，CLP后第1天、第2天、第3天和第4天至第10天的存活率分别为92％、75％、58％和50％。
实验实施例2对重度败血症CLP模型中MODS的功效的评价
为了评价实施例中制备的纯化提取物的提取物对重度败血症CLP模型中MODS的治疗活性，根据程序中公开的改良程序(Coskun A.K.等人，The effects of montelukast on antioxidant enzymes and pro-inflammatorycytokines on the heart,liver,lungs and kidneys in a rat model of cecal ligationand puncture-induced sepsis，Scientific World Journal，2011，第11卷，第1341-1356页)用重度败血症CLP模型进行以下实验。
使用自动化学分析仪(Hitachi 7600，东京，日本)通过H&E12染色法和用于评价各个器官的功能的各指标的水平观察不同器官，即肝、肾、心脏等的功能性损伤，所述指标对于肝功能为ALT(丙氨酸转氨酶)，对于肾功能为BUN(血尿素氮)和CRE(肌酸酐)，以及对于心脏为LDH(乳酸脱氢酶)。
在CLP后第1、3、6、12、24和第48小时，收集血液以分离血清。确定ALT、BUN、CRE和LDH的水平，结果示于表3。
如表3中所示，ALT、BUN、CRE和LDH的增长水平大幅下降，这表明试验样品对重度CLP模型中的MODS的有效抑制效果。
[表3]MODS试验的结果
实验实施例3在LPS诱发的炎症模型中存活率和功效的确定
为了评价实施例中制备的纯化提取物的提取物在LPS-诱发的炎症模型中的存活率和功效，根据程序中公开的改良程序(Masami Yamada等人，Discovery of Novel and Potent Small Molecule Inhibitors of NO and cytokineProduction as Antisepsis Agents:Synthesis and Biological Activity of Alkyl6-(N-substituted sulfamoyl)cyclohex-1-ene-1-carboxylate，J.Med.Chem.，2005，48，第7457-7467页)进行以下实验。
将LPS(脂多糖；E.Coli 0111:B4Sigma-Aldrich，L4130)腹膜内注射入小鼠(C57BL/6，雌性，8周大，KRIBB)并在注射后1至8小时静脉内注射HS-23来确定小鼠的存活率。
在LPS注射后一小时用HS-23治疗的组中存活率显示为，在LPS注射后第18小时的90％、在第21小时的80％和在第24至72小时的70％(参见表4)。
通过ELISA法确定通过离心从血液分离的血清中各种促炎性因子的表达水平，其中已经在LPS注射后每个小时收集所述血液，结果示于表5至表8。
通过每个小时的确定，发现TNF-α、IL-1β和IFN-γ、以及HMGB-1的表达水平分别在LPS注射后1小时、8小时和19小时达到最大水平。
[表4]LPS炎症模型中存活率试验的结果
[表5]LPS注射后TNF-α水平的变化
LPS注射后的小时数 正常 1小时 2小时 4小时 6小时
TNF-α(pg/ml) 63 7715 2485 1057 710
[表6]LPS注射后IL-1β水平的变化
LPS注射后的小时数 正常 4小时 8小时 12小时
IL-1β(pg/ml) 46 288 1341 1177
[表7]LPS注射后IFN-γ水平的变化
LPS注射后的小时数 正常 4小时 8小时 12小时
IFN-γ(pg/ml) 150 1472 29886 18283
[表8]LPS注射后HMGB-1水平的变化
LPS注射后的小时数 正常 1小时 2小时 4小时 6小时
HMGB-1(pg/ml) 787 1227 5719 8818 3900
将LPS腹膜内注射入小鼠，同时静脉内注射HS-23提取物，根据ELISA法确定促炎性因子，即TNF-α、IL-1β和IFN-γ以及HMGB-1的水平达到最大水平的时间。
结果，已经确认如表9中所示，HS-23治疗组强烈抑制增加的促炎性因子的水平。
[表9]对促炎性因子水平的效果
实验实施例4.稳定性试验
为了确定实施例中制备的纯化提取物的提取物以及含有冻干形式的HS-23提取物的注射剂型的稳定性，根据韩国食品药品管理局的稳定性指南进行以下实验。
4-1.试验步骤
根据韩国药典的规定和指南(the stipulation and guideline of KoreaPharmacopoeia)使试验物和含有冻干形式的HS-23提取物的注射剂型经受冰箱(5±3℃)中的长期稳定性试验2年。
4-2.试验结果
如表10和表11中所示，已经确认忍冬的标准物质即绿原酸(CGA)的量在稳定性试验期间没有变化，试验样品药学上非常稳定，足以通过指南的规定。
[表10]HS-23提取物的稳定性试验
[表11]含有HS-23提取物的注射剂型的稳定性试验
实验实施例5毒性试验
为了确定实施例中制备的纯化提取物的提取物的毒性，根据韩国食品药品管理局的毒性指南进行以下实验(www.kfda.go.kr)。
包括啮齿动物/非啮齿动物中的单次给药毒性试验、安全性药理学试验、基因毒性试验、4周重复给药的毒性试验等的所有毒性试验都在经GLP认证的公司进行(www.biotoxtech.com)。
如在表12中可以看到的，已经确认在单次给药毒性试验中试验样品的致死量大于500mg/kg，以及在3周重复给药的毒性试验中NOAEL的eth值大于75mg/kg。此外，在安全性药理学试验中已经证明测试样品超过100mg/kg和300mg/kg是安全的(在心血管系统、呼吸系统、CNS系统等中)。
因此，已经证明该创造性纯化提取物是安全和无毒的。
[表12]HS-23提取物的毒性试验
下文中，会描述配制方法和赋形剂种类，但本发明不限于此。如下描述代表性制备实施例。
散剂的制备
HS-23b的干燥粉末  20mg
乳糖  100mg
滑石  10mg
通过混合以上组分并填充至密封包装来制备散剂剂型。
片剂的制备
HS-23a的干燥粉末  10mg
玉米淀粉  100mg
乳糖      100mg
硬脂酸镁  2mg
通过混合以上组分并压片来制备片剂剂型。
胶囊剂的制备
HS-23c的干燥粉末  10mg
玉米淀粉  100mg
乳糖      100mg
硬脂酸镁  2mg
通过用常规明胶制备方法混合以上组分并填充明胶胶囊来制备胶囊剂剂型。
注射剂的制备
HS-23d的干燥粉末  10mg
甘露醇  180mg
用于注射的蒸馏水  2974mg
PH调节剂(Na2HPO412H2O)  适量
通过用常规注射剂制备方法溶解活性组分，调节pH至约7.5，然后将所有组分填充进2ml安瓿并灭菌来制备注射剂型。
液体药物的制备
HS-23b的干燥粉末  20mg
异构糖   10g
甘露醇   5g
蒸馏水  适量
通过用常规液体药物制备方法在棕色小瓶中将组分与合适剂量的柠檬香料一起溶解于蒸馏水，混合，并用蒸馏水调节至100ml来制备液体药物。
健康功能食品的制备
HS-23a的干燥粉末  1000mg
维生素混合物  适量
维生素A 醋酸酯70μg
维生素E 1.0mg
维生素B1 0.13mg
维生素B2 0.15mg
维生素B6 0.5mg
维生素B12 0.2μg
维生素C 10mg
生物素 10μg
酰胺烟酸  1.7mg
叶酸      50μg
泛酸钙    0.5mg
矿物质混合物   适量
硫酸亚铁       1.75mg
氧化锌         0.82mg
碳酸镁         25.3mg
磷酸二氢钾     15mg
磷酸二钙       55mg
柠檬酸钾  100mg
氯化镁    24.8mg
上述维生素和矿物质混合物可以以许多方式变化。这类变化不被认为是脱离本发明的精神和范围。
健康饮料的制备
HS-23c的干燥粉末  100mg
柠檬酸   1000mg
低聚糖   100g
杏浓缩物 2g
牛磺酸   1g
蒸馏水   900ml
通过用常规健康饮料制备方法溶解活性组分，混合，在85℃搅拌1小时，过滤，然后将所有组分填充到2L容器内并灭菌来制备健康饮料剂型。
如此描述的本发明可以以许多方式变化。这种变化不被认为是脱离本发明的精神和范围，并且对于本领域技术人员明显的所有这类修改旨在包括在以下权利要求的范围内。
这种发明将不被认为是脱离本发明的精神和范围，并且对于本领域技术人员明显的所有这种修改旨在包括在以下权利要求的范围内。
工业实用性
如在本发明中所描述的，忍冬的纯化提取物显示出在重度败血症CLP模型试验中有效的抗败血症活性，对MODS的效果，和对各种促炎性细胞因子如TNF-α、IL-1β、IFN-γ、HMGB-1等的抑制效果，同时，在与可商业获得的抗菌剂、例如广谱抗生素组合的情况下，它还出乎本领域技术人员意料地显示出对败血症和败血性休克的治疗的协同效应，因此，它可以作为药物和健康功能食品用于治疗和预防败血症和败血性休克。

Claims (27)

1.一种用于制备忍冬的纯化提取物的方法，其包括以下步骤：在第一步骤，利用提取溶剂对忍冬的干花材料进行提取；在第二步骤，使粗制提取物经受选自过滤法、离心或其组合的至少一种处理，以提供忍冬的粗制提取物；在第三步骤，通过添加水使所述粗制提取物悬浮于水中以制备悬浮溶液，和将该溶液分级成非极性溶剂可溶部分和极性溶剂可溶部分以除去非极性可溶物质并通过收集剩余物提供第一纯化提取物；在第四步骤，将水添加至所述第一纯化提取物以使其经受选自使用与水的量相等的量的吸附树脂的吸附色谱、离子柱色谱或其组合的至少一种纯化过程，和用清洗溶剂反复地清洗以提供忍冬的第二纯化提取物；和真空下对所述提取物进行浓缩，并干燥，以提供含有大量的活性成分的忍冬的纯化提取物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中第一步骤的所述提取溶剂包括基于花材料重量的1至100倍体积(体积/重量)的至少一种溶剂，所述至少一种溶剂选自水、酒精制剂、甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、己烷、乙酸乙酯、环己烷、DMSO、氯仿和二氯甲烷。
3.根据权利要求1所述的方法，其中第一步骤的所述提取溶剂包括1至100倍体积的碱性溶液，所述碱性溶液是使基于花材料重量的0.1％至5％重量(重量/重量)的量的弱碱，例如NaHCO3、NaCO3等溶解于水以提高提取效率。
4.根据权利要求1所述的方法，其中通过选自热水回流提取、花香提取、索氏提取、超声波提取及其组合的至少一种提取方法来进行第一步骤的提取过程。
5.根据权利要求1所述的方法，其中通过选自过滤法、离心或其组合的至少一种处理来进行第二步骤的提供忍冬的粗制提取物的所述处理。
6.根据权利要求1所述的方法，其中通过以下过程来进行第三步骤的提供第一纯化提取物的过程：添加约0.005至5倍体积的水(体积/重量，基于所述粗制提取物的重量)以制备所述悬浮溶液；和通过添加约0.1至50倍体积的非极性溶剂(体积/体积，基于所述悬浮溶液的体积)，例如己烷、二氯甲烷、氯仿或乙酸乙酯，将该溶液分级成非极性溶剂可溶部分和极性溶剂可溶部分以除去非极性可溶物质。
7.根据权利要求1所述的方法，其中通过以下过程来进行第四步骤的提供忍冬的第二纯化提取物的过程：将1至30倍重量的水(重量/重量，基于所述第一纯化提取物的重量)添加至所述第一纯化提取物以使其经受吸附色谱来进一步纯化，所述吸附色谱使用选自SP207、HP20SS、Diaoion HP20、SP-850树脂、活性炭、或Amberlite XAD-2,4的至少一种树脂并且吸附树脂的量与水的量相等。
8.根据权利要求1所述的方法，其中通过经受离子柱色谱来进行第四步骤的提供忍冬的第二纯化提取物的过程，所述离子柱色谱使用选自AG50W-x8、Amberlte IR-120、Amberlite IRA-400、Dowex 50W-x8或SK1B的至少一种强酸性树脂，选自Amberlte IRC-50、Bio-Rex 70、Duolite-436或WK40的至少一种弱酸性树脂，或者选自Amberlte IR-67或Dowex 3-x4的至少一种弱碱性树脂，优选选自Amberlte IR-120、Amberlite IRA-400或SK1B的至少一种强酸性树脂，并且离子树脂的量与水的量相等。
9.根据权利要求1所述的方法，其中通过重复地用选自水、甲醇、乙醇、丙醇、丁醇或其混合物的至少一种清洗溶剂清洗吸附到树脂的吸附物质来进行第四步骤的提供忍冬的第二纯化提取物的所述清洗过程。
10.根据权利要求1所述的方法，其中第四步骤的提供忍冬的第二纯化提取物的所述清洗过程进行至除第四步骤的纯化过程外的另外的葡聚糖凝胶柱色谱，所述葡聚糖凝胶柱色谱使用选自Sephadex LH-20树脂、SephadexG15树脂或Sephadex G35的至少一种葡聚糖凝胶树脂。
11.根据权利要求1所述的方法，其中通过以下过程进行第五步骤的提供忍冬的纯化提取物的浓缩过程和干燥过程以提供忍冬提取物的创造性纯化提取物：在10℃至80℃的温度在真空下浓缩所述提取物，和通过选自室温干燥法、冷冻干燥法、热空气干燥法或其组合的至少一种干燥方法来干燥所述提取物。
12.一种忍冬的纯化HS-23提取物，其含有基于干燥的纯化提取物的重量的2.0％至30.0％(重量/重量)的量的绿原酸及其衍生物，所述忍冬的纯化HS-23提取物是通过以下步骤制备的：在第一步骤，利用提取溶剂对忍冬的干花材料进行提取；在第二步骤，使粗制提取物经受选自过滤法、离心或其组合的至少一种处理以提供忍冬的粗制提取物；在第三步骤，通过添加水使粗提取物悬浮于水中以制备悬浮溶液，和将该溶液分级成非极性溶剂可溶部分和极性溶剂可溶部分以除去非极性可溶物质并通过收集剩余物提供第一纯化提取物；在第四步骤，将水添加至第一纯化提取物以使其经受选自使用与水的量相等的量的吸附树脂的吸附色谱、离子柱色谱或其组合的至少一种纯化过程，和用清洗溶剂反复地清洗以提供忍冬的第二纯化提取物；和真空下对所述提取物进行浓缩，并干燥以提供用于治疗和预防败血症、MODS或败血性休克的忍冬的纯化提取物。
13.一种药物组合物，其包含通过根据权利要求1所述的方法制备的忍冬的纯化HS-23提取物作为用于治疗和预防败血症、MODS或败血性休克的活性成分。
14.根据权利要求13所述的药物组合物，其中所述败血症是中度败血症，重度败血症，或由烧伤、急性咽喉炎、溃疡性结肠炎、IBS(肠道易激综合征)、风湿性关节炎、退行性关节炎、急性肝炎、慢性肝炎引起的败血症或感染症状。
15.根据权利要求13所述的药物组合物，其中所述MODS发生在由中度败血症、重度败血症、或由烧伤引起的败血症或感染症状导致的受损器官中，所述器官选自肝、肾、心脏、肺、小肠、大肠、十二指肠、胃、胰、脾。
16.根据权利要求13所述的药物组合物，其中所述败血性休克是由中度败血症、重度败血症、或由烧伤引起的败血症或感染症状导致的败血性休克。
17.一种药物组合物，其包含通过根据权利要求1所述的方法制备的忍冬的纯化HS-23提取物与可商业获得的抗菌剂的组合作为用于治疗和预防败血症、MODS或败血性休克的活性成分。
18.根据权利要求17所述的药物组合物，其中所述组合是(a)通过根据权利要求1所述的方法纯化的忍冬的纯化HS提取物与(b)可商业获得的抗菌剂以按重量计0.1至10:0.1至10(重量/重量)的混合比混合的组合。
19.根据权利要求17所述的药物组合物，其中所述可商业获得的抗菌剂是选自以下的至少一种抗菌剂：抗生素，如青霉素、喹诺酮、氨曲南、氨基糖苷类、头孢菌素、四环素、糖肽类、碳青霉烯等；抗炎剂，如甲灭酸、吲哚美辛、异丁苯丙酸、吡罗昔康、双氯芬酸等；抗真菌剂，如两性霉素B、制真菌素、灰黄霉素、唑类抗真菌剂等；抗过敏剂，如西替利嗪、非索非那定、氯苯吡胺等。
20.一种健康功能食品，其包含通过根据权利要求1所述的方法纯化的忍冬的纯化HS-23提取物作为用于缓解和预防败血症、MODS或败血性休克的活性成分。
21.一种健康功能食品，其包含通过根据权利要求1所述的方法纯化的忍冬的纯化HS-23提取物与可商业获得的抗菌剂的组合作为活性成分，其用于缓解和预防败血症、MODS或败血性休克。
22.一种保健食品，其包含用于缓解和预防败血症、MODS或败血性休克的通过根据权利要求1所述的方法纯化的忍冬的纯化HS-23提取物以及饮食学可接受的添加剂。
23.一种保健食品，其包含用于缓解和预防败血症、MODS或败血性休克的通过根据权利要求1所述的方法纯化的忍冬的纯化HS-23提取物与可商业获得的抗菌剂的组合以及饮食学可接受的添加剂。
24.通过根据权利要求1所述的方法纯化的忍冬的纯化HS-23提取物用于制备用于治疗和预防包括人类的哺乳动物的败血症、MODS或败血性休克的治疗剂的用途。
25.通过根据权利要求1所述的方法纯化的忍冬的纯化HS-23提取物与可商业获得的抗菌剂的组合用于制备用于治疗和预防包括人类的哺乳动物的败血症、MODS或败血性休克的治疗剂的用途。
26.一种治疗或预防包括人类的哺乳动物的败血症、MODS或败血性休克的方法，其包括向所述哺乳动物施用有效量的通过根据权利要求1所述的方法纯化的忍冬的纯化HS提取物以及其药学可接受的载体。
27.一种治疗或预防包括人类的哺乳动物的败血症、MODS或败血性休克的方法，其包括向所述哺乳动物施用有效量的通过根据权利要求1所述的方法纯化的忍冬的纯化HS-23提取物与可商业获得的抗菌剂的组合以及其药学可接受的载体。
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