KR102159686B1 - 도토리 화분 추출물을 유효성분으로 함유하는 당뇨병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품 - Google Patents
도토리 화분 추출물을 유효성분으로 함유하는 당뇨병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 도토리 화분(Pollen of Quercus sp.) 추출물을 유효성분으로 함유하는 당뇨병(diabetes)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는, 도토리 화분 에탄올 추출물의 헥센 분획물, 에틸아세테이트 분획물 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 하는 α-글루코시다아제(α-glucosidase) 및 β-아밀라아제(β-amylase) 저해 활성을 통한 당뇨병의 예방 또는 치료/개선용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품에 관한 것이다. 본 발명의 당뇨병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품의 유효성분으로서의 도토리 화분 추출물은 α-글루코시다아제 및 β-아밀라아제 저해 활성을 통한한 강력한 항당뇨 활성을 나타냄과 동시에, 열 안정성이 우수하고, pH 2의 산성 조건 및 혈장 내에서도 항당뇨 활성의 손실이 나타나지 않으므로, 당뇨병, 특히 제2형 당뇨병의 예방 및 치료용으로 사용할 수 있을 것으로 기대되며, 상기 유효성분은 추출액, 분말, 환, 정 등의 다양한 형태로 가공되어 상시 복용이 가능한 형태로 조제할 수 있는 뛰어난 효과가 있으므로 제약 산업 및 식품 산업상 매우 유용한 발명인 것이다.
Description
본 발명은 도토리 화분(Pollen of Quercus sp.) 추출물을 유효성분으로 함유하는 당뇨병(diabetes)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는, 도토리 화분 에탄올 추출물의 헥센 분획물, 에틸아세테이트 분획물 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 하는 α-글루코시다아제(α-glucosidase) 및 β-아밀라아제(β-amylase) 저해 활성을 통한 당뇨병의 예방 또는 치료/개선용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품에 관한 것이다.
현대인에게 가장 흔한 질병 중 하나인 당뇨병은 인슐린의 분비량이 부족하거나 정상적인 기능이 이루어지지 않는 등의 대사 질환의 일종으로서 혈중 포도당 농도가 높은 것이 특징이며, 고혈당으로 인하여 여러 증상 및 징후를 일으킨다. 당뇨병은 제1형과 제2형으로 구분되는데, 제1형 당뇨병은 유전적 영향에 의해 인슐린을 전혀 생산하지 못하는 것이 원인이 되어 발생하며, 제2형 당뇨병은 인슐린 기능이 떨어져 인슐린 저항성(insulin resistance)이 원인으로 알려져 있다. 특히, 제2형 당뇨병은 식생활의 서구화에 따른 고열량, 고지방, 고단백의 식단, 운동부족, 스트레스 등 환경적인 요인이 크게 작용하는 것으로 알려져 있다. 당뇨병의 치료를 위해서는 제1형 당뇨병의 경우에는 인슐린 주사가 필수적이며, 제2형 당뇨병의 경우에는 생활습관 교정 및 약물치료가 필요하며, 대표적으로 인슐린 분비 촉진제(예, 레파글리나이드, 미티글이나이드) 및 소장에서의 탄수화물 흡수 지연제[글루코바이: 성분명-아카보즈(acarbose), 베이슨: 성분명-보글리보스(voglibose)] 등이 이용되고 있다.
한편, 도토리(acorn)는 참나무속에 속하는 나무열매의 총칭으로 보다 구체적으로는 상수리나무(Quercus acutissima), 굴참나무(Quercus variabilis), 돌참나무(신갈나무, Quercus mongolica), 갈참나무(Quercus aliena), 졸참나무(Quercus serrata), 물참나무, 떡갈나무(Quercus dentata)등의 참나무 열매를 말하며, 이러한 참나무속 식물의 꽃으로부터 벌에 의해 생산된 화분을 도토리 화분이라 한다. 도토리 화분은 다른 충매 화분과 마찬가지로, 일벌에 의해 화분(꽃가루), 꿀, 효소가 혼합된 상태로 경단처럼 뭉쳐진 상태이며, 인류는 이를 오래전부터 건강식품으로 이용하여 왔다.
또한, 화분(Pollen)은 종자를 만드는 유관속 식물의 생식 기관으로, 수컷 배우체를 보호하기 위해 견고한 껍질로 둘러싸여 있는 구조이며, 주로 바람이나 곤충에 의해 운반되어 암컷 배우체에 도달하여 수정한 후 종자를 형성한다. 화분은 곤충에 의해 매개되는 충매 화분과 바람에 의해 매개되는 풍매 화분이 있으며, 충매 화분은 도토리 화분, 도토리 화분과 같은 단일 식물 화분 및 다양한 식물 화분이 모인 잡화분으로 구분하며, 풍매 화분은 대표적으로 송화분을 들 수 있다.
통상 화분은 조단백 20~25%, 조지질 7~15%, 조회분 2~5%, 조탄수화물 20~50%, 수분 10~15%를 포함하고 있어 영양적으로 우수하며, 다양한 생리 활성 물질을 포함하여 영양보조제와 전통 의약품으로 사용되어 왔다. 그러나, 화분은 스포로폴레닌(sporopollenin)이라는 두꺼운 층으로 구성된 외피(extine)와 내피(intime)로 구성되어 있어 그 자체로는 소화, 분해가 되지 않아 생체 이용률은 10~15%로 낮다는 문제점이 있으며(Pyeon HI, 2018, Journal of Life Science 28: 605~614), 다양한 식물로부터 기인하여 미생물학적 오염이 나타날 수 있으며, 쉽게 부패하는 단점도 있다. 또한, 서양 지치꽃 화분에서 간독성, 폐독성 및 발암성이 의심되는 독성 물질(1,2-dehydro pyrollizidine alkaloids)이 확인된 바도 있다(Boppre, M 등, J. Agric. Food Chem. 53, 594-600).
따라서, 기존의 화분에 대한 연구는 화분의 영양학적 특성과 견고한 외피를 분해하여 소화흡수를 증진시키기 위한 추출조건, 전처리 방법 개발에 주로 집중되어 있다. 최근에는 유용 생리활성에 대한 연구가 진행되고 있으며, 혈관 및 순환계, 소화계, 신진대사계, 노화 등 다양한 질환에 효과가 있다고 알려지고 있으며, 항균 및 항산화 효능, 면역증강 효과, 전립선 비대증 및 전립선염 치료 효과 등이 보고되었다(최 등, 2007, Korean J. Food preserv. 14, 87-93; Abouda et al., 2011, J. Microbiol. 6, 376-384; Li et al., 2009, Carbohydrate Polymers 78, 80-88; 홍인표 외, 2016, Journal of Apiculture 31, 219-225; 홍인표, 2014, Journal of Apiculture 29, 137-142; 박용기 외, 2015. Journal of Apiculture 30, 299-306; 김석중 외, 2005, 한국식품과학회지 37, 833-837).
한편, 참나무속 식물의 열매(도토리) 및 잎의 다양한 성분연구와 효능연구는 광범위하게 진행되어 왔으나, 도토리 화분과 관련된 연구는 거의 전무한 상태이다. 도토리 화분과 관련된 연구로는 도토리 화분(꽃가루)의 물리적 처리에 의한 성분 변화(홍인표, 2013. Korean J. Apiculture 28, 217-221), 도토리 화분 발아액의 항균활성(최준혁, 2007, 한국식품저장유통학회지, 14, 87-93) 및 항산화 활성(홍인표, 2014, Journal of Apiculture 29, 137-142) 등이 알려져 있으며, 도토리 화분과 관련된 기타 활성은 알려진 바 없다.
또한, 도토리 화분과 관련된 특허로는 대한민국 등록특허 제10-1237215호에 [장염 예방 또는 치료용 약학 조성물]이 알려져 있으며, 기타 생리활성에 관련된 특허는 알려져 있지 않다.
현재까지 화분의 항당뇨 효과는 민간에서 일부 인정하고 있으나, 일부에서는 화분의 많은 당 함유로 인해 오히려 당뇨 환자가 피해야 할 식품원료로 이해되고 있어 상반된 의견이 존재하고 있다. 양봉 부산물 중, 로얄젤리와 프로폴리스에서는 항당뇨 효과가 보편적으로 인정되고 있으나, 화분은 밀원식물의 종류에 따라 구성성분이 크게 변화하므로 현재까지는 당뇨와 관련된 활성을 이해하기는 매우 어려운 실정이다.
과학적 근거하의 화분의 항당뇨 효과는 부들 화분의 고분자 다당류(Lei X 등, 2018. J Ethnopharmacol. 224:169-176) 및 해당화 화분의 고분자 다당류(Li X et al. 2017, Molecules. 22(5): E699)에 의한 항당뇨 효과가 알려져 있으나, 이는 화분의 고분자 다당류에 의한 당뇨 합병증과 인슐린 내성 개선 효과로 제한되어 있는 실정이다. 또한, 부들 화분의 플라본 성분이 인슐린 내성을 개선함이 보고(Feng, Xiao-Tao 등, 2014, Bioscience, Biotechnology, Biochemistry 78: 1738-1742)되어 있으며, 대추야자 화분이 당혈증(glycemia)를 완화함이 알려져 있다(Mohamed, Nema A. 2018, Biomedicine & Pharmacotherapy 97: 9-18).
그러나, 현재까지 도토리 화분의 특정 지용성 성분이 강력한 α-글루코시다아제 및 β-아밀라아제 저해를 통한 항당뇨 활성을 나타냄은 알려진 바 없다.
Lei X 등, 2018. J Ethnopharmacol. 224:169-176.
Li X et al. 2017, Molecules. 22(5): E699.
Feng, Xiao-Tao 등, 2014, Bioscience, Biotechnology, Biochemistry 78: 1738-1742.
Mohamed, Nema A. 2018, Biomedicine & Pharmacotherapy 97: 9-18).
본 발명은 상기와 같은 종래 기술의 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 본 발명에서 해결하고자 하는 과제는 도토리 화분 추출물을 유효성분으로 함유하는 당뇨병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품을 제공하고자 하는 것이다.
상기와 같은 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 도토리 화분(Pollen of Quercus sp.) 추출물을 유효성분으로 함유하는 당뇨병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 약학적 조성물의 유효성분으로서 도토리 화분 추출물은 도토리 화분 에탄올 추출물의 헥센 분획물, 에틸아세테이트 분획물 또는 이들의 혼합물인 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은 도토리 화분(Pollen of Quercus sp.) 추출물을 유효성분으로 함유하는 당뇨병의 예방 또는 개선용 건강 기능 식품을 제공한다.
상기 건강 기능 식품의 유효성분으로서 상기 도토리 화분 추출물은 도토리 화분 에탄올 추출물의 헥센 분획물, 에틸아세테이트 분획물 또는 이들의 혼합물인 것이 바람직하다.
본 발명의 당뇨병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품의 유효성분으로서의 도토리 화분 추출물은 α-글루코시다아제 및 β-아밀라아제 저해 활성을 통한한 강력한 항당뇨 활성을 나타냄과 동시에, 열 안정성이 우수하고, pH 2의 산성 조건 및 혈장 내에서도 항당뇨 활성의 손실이 나타나지 않으므로, 당뇨병, 특히 제2형 당뇨병의 예방 및 치료용으로 사용할 수 있을 것으로 기대되며, 상기 유효성분은 추출액, 분말, 환, 정 등의 다양한 형태로 가공되어 상시 복용이 가능한 형태로 조제할 수 있는 뛰어난 효과가 있으므로 제약 산업 및 식품 산업상 매우 유용한 발명인 것이다.
도 1은 도토리 화분의 사진도이고,
도 2는 도토리 화분의 현미경(200배) 관찰 사진도이다.
도 2는 도토리 화분의 현미경(200배) 관찰 사진도이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명의 발명자들은 도토리 화분을 대상으로 항당뇨 효능을 검정하기 위하여, 일정 방법으로 도토리 화분 추출물을 조제하고, 이의 헥센 분획물 및 에틸아세테이트 분획물을 항당뇨 활성 성분으로 회수하였으며, 상기 헥센 분획물 및 에틸아세테이트 분획물은 열 안정성과 산 안정성이 우수한 특징을 가짐을 확인함으로써 상기 도토리 화분 추출물, 이의 헥센 분획물 및 에틸아세테이트 분획물을 당뇨병의 예방 및 치료 또는 개선용 의약 조성물 및 건강 기능 식품으로 활용하고자 하였다.
구체적으로, 본 발명자들은 항염증, 간보호, 항고혈압 효과가 있다고 알려진 도토리 화분을 이용하여 항당뇨 조성물을 개발하기 위하여, 도토리 화분을 대상으로 에탄올 추출물을 조제하고, 상기 에탄올 추출물을 대상으로 순차적 유기용매 분획물을 조제한 후, 이의 α-알파글루코시다아제 및 β-아밀라아제에 대한 저해 활성을 평가한 결과, 도토리 화분 추출물의 헥센 분획물 및 에틸아세테이트 분획물에서 강력한 상기 효소 저해 활성을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 도토리 화분(Pollen of Quercus sp.) 추출물을 유효성분으로 함유하는 당뇨병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 약학적 조성물의 유효성분으로서 도토리 화분 추출물은 도토리 화분 에탄올 추출물의 헥센 분획물, 에틸아세테이트 분획물 또는 이들의 혼합물인 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은 도토리 화분(Pollen of Quercus sp.) 추출물을 유효성분으로 함유하는 당뇨병의 예방 또는 개선용 건강 기능 식품을 제공한다.
상기 건강 기능 식품의 유효성분으로서 상기 도토리 화분 추출물은 도토리 화분 에탄올 추출물의 헥센 분획물, 에틸아세테이트 분획물 또는 이들의 혼합물인 것이 바람직하다.
이하에서는, 본 발명의 도토리 화분 추출물 및 각 활성 분획물의 제조 방법 및 효능 실험 등을 보다 구체적으로 설명한다.
본 발명은 도토리 화분으로부터 추출물을 조제하는 단계; 도토리 화분 에탄올 추출물로부터 헥센, 에틸아세테이트, 부탄올의 순차적 유기용매 분획물 조제 및 이후 얻어지는 물 잔류물의 조제 단계; 상기 추출물 및 분획물의 항혈전 활성 평가 단계; 및 활성을 나타내는 추출물 및 분획물의 안정성 조사 단계를 포함한다.
본 발명의 조성물에 포함되는 "도토리 화분 추출물"은 도토리 화분을 유기용매로 추출하는 단계 및 상기 추출액을 0.06mm 이하의 여과망을 사용하여 여과하고, 이를 감압농축하는 단계에 의해 수득될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 유기용매는 물(냉수, 열수), 주정, 탄소수 1~4의 무수 또는 함수 저급 알코올(메탄올, 에탄올, 주정, 프로판올, 부탄올 등), 상기 저급알코올과 물과의 혼합용매 등을 이용할 수 있으며, 열수, 또는 95% 에탄올 추출이 가장 바람직하다.
바람직한 구체예로서, 본 발명의 도토리 화분 추출물은 도토리 화분을 열수 또는 에탄올로 추출하여 사용할 수 있다. 여기에서, 상기 열수 또는 에탄올 추출물은 헥센, 에틸아세테이트 및 부탄올의 유기용매로 순차 또는 각각 분획하여 헥센 분획물, 에틸아세테이트 분획물 및 부탄올 분획물 및 물 잔류물을 추가적으로 수득할 수 있다.
본 발명의 도토리 화분 추출물 및 이의 활성 분획 물질들은 감압건조 및 동결건조, 또는 분무건조 등과 같은 통상적인 분말화 과정을 거쳐 분말로 제조될 수 있다. 이들은 혈장 내의 다양한 분해효소에 분해되지 않으며, 100℃의 열처리와 pH 2의 인체 위 내의 pH에서도 활성을 유지한다.
본 발명의 유효성분은 당뇨병 및 당뇨 합병증의 예방 또는 치료용으로 사용될 수 있다. 상기 당뇨병은 제1형 당뇨병 또는 제2형 당뇨병일 수 있고, 상기 당뇨 합병증은 당뇨병성 망막증 또는 당뇨병성 신증일 수 있다.
본 발명의 유효 성분을 포함하는 약학적 조성물은 각각의 사용 목적에 맞게 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구 제형, 멸균 주사용액의 주사제 등 다양한 형태로 제형화하여 사용할 수 있으며, 경구 투여하거나 정맥 내, 복강 내, 피하, 직장, 국소 투여 등을 포함한 다양한 경로를 통해 투여될 수 있다.
이러한 약학적 조성물에는 추가적으로 담체, 부형제 또는 희석제 등이 더 포함될 수 있으며, 포함될 수 있는 적합한 담체, 부형제 또는 희석제의 예로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리쓰리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 비정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 들 수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 충전제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 더 포함할 수도 있다.
바람직한 구체예로서, 경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 상기 약학적 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 혼합하여 제형화한다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 등과 같은 윤활제가 사용될 수도 있다.
바람직한 구체예로서, 경구용 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 예시될 수 있으며, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면, 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
바람직한 구체예로서, 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액제, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제, 좌제 등을 예시할 수 있다. 비수성용제, 현탁제에는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 포함될 수 있다. 주사제에는 용해제, 등장화제, 현탁화제, 유화제, 안정화제, 방부제 등과 같은 종래의 첨가제가 포함될 수 있다.
본 발명의 유효 성분은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에서, "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
바람직한 구체예로서, 본 발명의 약학적 조성물에서 유효성분의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 ㎏ 당 1 내지 5,000mg, 바람직하게는 100 내지 3,000mg을 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 투여 경로, 질병의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 약학적 조성물은 다양한 경로를 통하여 대상에 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관 내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.
본 발명에서 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 제공하는 것을 의미하며, 본 발명의 약학적 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 일반적인 모든 경로를 통하여 경구 또는 비경구 투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 유효성분을 표적 세포로 전달할 수 있는 임의의 장치를 이용해 투여될 수도 있다.
본 발명에서 "대상"은, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어, 인간, 원숭이, 소, 말, 양, 돼지, 닭, 칠면조, 메추라기, 고양이, 개, 마우스, 쥐, 토끼 또는 기니아 피그를 포함하고, 바람직하게는 포유류, 보다 바람직하게는 인간을 의미한다.
또한, 본 발명의 건강 기능 식품은 당뇨병, 예를 들어, 제1형 당뇨병 또는 제2형 당뇨병 및 당뇨 합병증, 예를 들어, 당뇨병성 망막증 또는 당뇨병성 신증의 예방 또는 개선에 효과적인 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있다.
본 발명의 유효성분을 포함하는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있고, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있다.
본 발명의 유효성분은 일반적으로 전체 식품 중량의 0.01 내지 15중량%로 가할 수 있으며, 건강음료 조성물은 100ml를 기준으로 0.02 내지 10g, 바람직하게는 0.3 내지 1g의 비율로 가할 수 있다.
본 발명의 건강 기능 식품은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 화합물을 함유하는 것 외에 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제, 예컨대, 천연 탄수화물 및 다양한 향미제 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.
상기 천연 탄수화물의 예로는 포도당, 과당 등의 단당류, 말토오스, 수크로오스 등의 이당류 및 덱스트린, 시클로덱스트린 등의 다당류와 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등의 당알코올이 있다.
상기 향미제로는 타우마틴, 레바우디오시드 A 또는 글리시르히진과 같은 스테비아 등의 천연 향미제 및 사카린, 아스파르탐 등의 합성 향미제를 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 건강 기능 식품 100ml당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g을 사용한다. 상기 외에 본 발명의 건강 기능 식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물, 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 건강 기능 식품은 천연 과일 주스 및 과일 주스 음료 및 야채 음료 등의 제조를 위한 과육을 함유할 수도 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 본 발명의 유효성분 100중량부 당 0.01 내지 약 20중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
이하에서는 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 하기 실시예는 본 발명의 바람직한 일 구체예일 뿐이며, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예의 범위로 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1: 도토리 화분의 이화학적 특성
2018년 국내에서 수확한 도토리 화분을 구입하여 실험에 사용하였으며, 실험에 사용한 도토리 화분은 짙은 노랑색 과립으로 명도 40.18, 적색도 3.58, 황색도는 20.29를 나타내어 국내에서 대량 생산되는 다래 화분보다 선명한 노랑색을 나타내었다. 또한, 도토리 화분은 pH 4.6, brix 52.0, 산도 0.74를 나타내어 다래 화분의 pH 5.6, brix 40.0, 산도 0.68보다 더욱 높은 당도와 산도를 나타내었다. 수분함량은 11.5%로 매우 건조된 상태로, 장시간 실온에 방치시 수분을 다시 흡습할 수 있는 상태였다(도 1, 표 1). 현미경(200배) 관찰 결과, 도토리 화분은 단립의 장구형(prolate)으로, 극면상은 원형이며, 표면은 과립상 또는 미립상으로 돌기가 확인되었다(도 2).
[표 1] 도토리 화분의 이화학적 특성 및 색차 분석
영양성분 분석결과 조단백 25.1%, 조지방, 12.5%, 조탄수화물 48.0%를 나타내어 404.9kcal/100g으로 매우 우수하였으며, 회분 함량도 1.9%를 나타내어 다양한 미네랄을 대량으로 포함하고 있었다(표 2). 이는 다래 화분의 조단백 35.6%, 조지방, 8.1%, 조탄수화물 48.3% 함량과 비교할 때, 보다 많은 조지방을 포함하고 있음을 알 수 있다.
[표 2] 도토리 화분의 영양 성분 분석
실시예 2: 도토리 화분 추출물, 분획물 제조 및 이들의 유용 성분 분석
2018년 국내에서 수확한 도토리 화분을 구입하여 열수 및 에탄올 추출물 제조에 사용하였다. 구체적으로, 도토리 화분 시료에 대해 10배의 에탄올을 가하고, 상온에서 2회 반복 추출한 후 추출액을 모아 필터링한 후, 감압 농축하여 분말로 제조하여 에탄올 추출물을 제조하였으며, 도토리 화분 열수 추출물의 경우에는 도토리 화분 시료에 대해 10배의 멸균 증류수를 가하고 100℃에서 1시간 2회 반복 추출한 후 상기와 동일하게 여과, 농축하였다. 조제된 도토리 화분 추출물 중, 에탄올 추출물을 대상으로 헥센, 에틸아세테이트, 부탄올로 순차적 유기용매 분획하였으며, 최종적으로 물 잔류물을 회수하였다. 이들의 분획 효율과 성분 분석 결과는 표 3에 나타내었다.
도토리 화분 추출물 및 분획물들의 성분 분석으로 총 폴리페놀, 총 플라보노이드, 총 당 및 환원당 함량을 측정하였다. 총 폴리페놀 함량은 추출 검액 400μl에 50μl의 Folin-ciocalteau, 100μl의 Na2CO3 포화용액을 넣고 실온에서 1시간 방치한 후 725nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준시약으로는 tannic acid를 사용하였다. 총 플라보노이드 함량은 각각의 시료를 18시간 메탄올 교반 추출하고, 여과한 추출 검액 400μl에 90% diethylene glycol 4ml를 첨가하고 다시 1 N NaOH 40μl를 넣고 37℃에서 1시간 반응 후 420nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준시약으로는 rutin을 사용하였다. 환원당은 DNS법으로, 총 당은 phenol-sulfuric acid법을 이용하여 정량하였다.
[표 3] 도토리 화분 추출물 및 분획물의 추출효율 및 유용성분 분석
표 3에 나타낸 바와 같이, 도토리 화분 에탄올 추출물의 추출효율은 46.4%로 열수 추출물의 추출효율(56.5%)보다 낮았으나, 에탄올 추출물의 총 폴리페놀 함량은 열수 추출물에 비해 1.5배 높았으며, 총 당 및 환원당 함량은 열수 추출물이 에탄올 추출물보다 1.3배 및 1.36배 높게 나타났다. 반면, 총 플라보노이드 함량은 열수 추출물 및 에탄올 추출물에서 유사하게 나타났다.
한편, 도토리 화분 추출물 중 가장 많은 부분은 부탄올 분획(64.8%)으로 이행되었으며, 물 잔류물은 추출물의 25.1%를 차지하였다. 가장 작은 수율을 나타낸 에틸아세테이트 분획물은 도토리 화분 추출물의 4.9%를 나타내어, 도토리 화분 100g 당 2.27g을 회수할 수 있었다. 한편, 총 폴리페놀 및 총 플라보노이드 함량 분석 결과, 에틸아세테이트 분획물에서 가장 높은 함량의 폴리페놀 함량(225.0mg/g) 및 플라보노이드 함량(222.1mg/g)을 나타내었다. 이는 가장 낮은 함량을 보인 물 잔류물에 비해 2,250배의 높은 폴리페놀 함량 및 158.6배의 높은 플라보노이드 함량이었다. 따라서, 도토리 화분 추출물의 에틸아세테이트 분획물은 다양한 생리활성을 나타내리라 예상되었으며, 실제 분석결과, 상기 분획물은 강력한 항산화 활성 및 nitrite 소거능을 나타내었다. 따라서 도토리 화분의 에틸아세테이트 분획물은 우수한 항산화 활성, 발암억제 활성을 나타내어 혈행개선 및 항당뇨 활성에 부가적으로 기여하리라 예상된다.
실시예 3: 도토리 화분 추출물 및 분획물의 항당뇨 활성 평가
실시예 2에서 제조된 도토리 화분 추출물 및 이의 분획물의 항당뇨 활성을 평가하기 위하여, in-vitro β-amylase 저해 활성 및 α-glucosidase 저해 활성을 각각 측정하였다. 먼저, β-amylase(4-alpha-D-glucan maltohydrolase) 저해 활성은 시료 2.5μl와 50mM phosphate buffer(pH 6.8)로 희석한 α-amylase(0.25U/ml) 25μl를 혼합하여 37℃에서 10분간 1차 반응한 후, 0.5% soluble starch(Samchun Chemicals Co., Korea) 25μl를 가하여 37℃에서 10분간 2차 반응한 후 100℃에서 5분간 가열하여 반응을 정지시켰으며, 반응액에 150μl의 DNS(3,5-dinitrosalicylic acid, Sigma Co., st. Louis, USA) 용액을 가하여 100℃에서 5분간 가열하여 발색한 후 상온에서 방냉하였다. 발색액은 540nm에서 흡광도를 측정하여 저해율을 계산하였다.
저해율 (%) = [1-(시료 첨가구 효소활성/대조구 첨가구 효소활성)] x 100
α-glucosidase 저해 활성은 pNPG(p-nitrophenol glucoside; Sigma Co., USA)를 이용하여 평가하였으며, 생강 추출물 시료 2.5μl와 50mM Sodium acetate buffer(pH 5.6)로 희석한 α-glucosidase(0.25U/ml) 25μl를 혼합하여 37℃에서 10분간 1차 반응하고, 1mM pNPG 용액 25μl를 가하여 60℃에서 10분간 2차 반응하였다. 이후, 1M NaOH 25μl를 가하여 반응을 정지시키고, 405nm에서 흡광도를 측정하여 저해율을 계산하였다.
저해율 (%) = [1-(시료 첨가구 효소활성/대조구 첨가구 효소활성)] x 100
[표 4] 도토리 화분 추출물 및 이의 분획물의 항당뇨 활성
그 결과, 표 4에 나타낸 바와 같이, 임상에서 당뇨병 치료제로 사용하고 있는 acarbose는 농도 의존적으로 강력한 β-amylase 저해 활성 및 α-glucosidase 저해 활성을 나타내었다. 반면, 도토리 화분 추출물의 경우, 열수 및 에탄올 추출물 모두에서 β-amylase 및 α-glucosidase 저해 활성이 전혀 나타나지 않았으나, 에탄올 추출물의 헥센 분획물 및 에틸아세테이트 분획에서는 0.5mg/ml 농도에서 매우 강력한 β-amylase 저해를 나타내었으며, 특히 에틸아세테이트 분획에서는 0.5mg/ml 농도에서 57.1%의 β-amylase 저해 및 13.0%의 α-glucosidase 저해를 동시에 나타내었다. 이러한 도토리 화분 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획물의 항당뇨 활성은 고농도 처리 시에 보다 강력하게 나타나, 농도 의존적인 저해 활성을 보였다. 따라서, 도토리 화분 추출물의 헥센 분획물 및 에틸아세테이트 분획물은 당뇨병, 특히 제2형 당뇨병의 예방 및 치료에 이용 가능함을 확인하였다.
실시예 4: 도토리 화분 추출물 및 이의 분획물의 인간 적혈구 용혈 활성
도토리 화분은 식품원료로 등록되어 안전성이 확보된 식품이다. 도토리 화분 에탄올 추출물 및 이의 분획물의 급성독성 가능성을 평가하기 위해 인간 적혈구 용혈 활성을 평가하였으며, 그 결과는 표 5에 나타내었다. 이때, 용혈 활성은 기존의 보고(손호용, 2014년 ㆍKorean J. Microbiol. Biotechnol. 42: 285-292)에 준해 평가하였으며, 간단하게는 PBS로 3회 수세한 인간 적혈구 100μl를 96-well microplate에 가하고 다양한 농도의 시료용액 100μl를 가한 다음 37℃에서 30분간 반응시켰으며, 이후, 반응액을 10분간 원심분리(1,500rpm)하여 상등액 100μl를 새로운 microtiter plate로 옮긴 후 용혈에 따른 헤모글로빈 유출 정도를 414nm에서 측정하였다. 시료의 용매 대조구로는 DMSO(2%)를 사용하였으며, 적혈구 용혈을 위한 실험 대조구로는 Triton X-100(1mg/ml)를 사용하였다. 용혈 활성은 다음의 수식을 이용하여 계산하였다.
[표 5] 도토리 화분 추출물 및 이의 분획물의 인간 적혈구 용혈 활성
먼저, 대조구로 사용된 DMSO와 물은 용혈 활성이 없었으며, triton X-100은 1mg/ml 농도에서 적혈구를 100% 용혈시킴을 확인하였다. 또한 항암제, 항진균제로 사용되고 있는 amphotericin B의 경우 0.00625mg/ml 농도에서 50%의 적혈구를 용혈시킴을 확인하였다. 본 발명의 도토리 화분 에탄올 추출물은 헥센 분획물을 제외한 분획물들에서 1mg/ml 농도까지 전혀 적혈구 용혈 현상이 나타나지 않아 급성 독성 및 적혈구 용혈 활성은 없음을 확인하였다. 헥센 분획물은 1mg/ml 농도에서 89.9%, 0.5mg/ml에서 53.5%, 0.25mg/ml에서 7.5%의 적혈구 용혈 활성을 나타내어 급성독성 가능성이 있을 것으로 판단되었다.
실시예 5: 도토리 화분 추출물 및 이의 활성 분획물의 혈장, 산 및 열 안정성 평가
상기 실시예 2에서 얻은 도토리 화분 에탄올 추출물 및 이의 헥센 분획물 및 에틸아세테이트 분획물을 대상으로 항당뇨 활성에 대한 혈장 안정성, 열 안정성 및 산 안정성을 확인하였다. 도토리 화분 에탄올 추출물 및 이의 활성 분획물은 100℃에서 1시간 열 처리, pH 2(0.01M HCl)에서의 1시간 처리, 혈장에서 1시간 처리시에도 β-amylase 및 α-glucosidase 저해 활성의 감소가 거의 나타나지 않았다. 따라서, 도토리 화분 추출물 및 이의 활성 분획물은 내산성, 내열성을 가진 항당뇨 활성 물질을 포함하고 있음을 확인하였다.
Claims (4)
- 도토리 화분(Pollen of Quercus sp.) 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 함유하는 당뇨병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
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- 도토리 화분(Pollen of Quercus sp.) 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 함유하는 당뇨병의 예방 또는 개선용 건강 기능 식품.
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KR1020180159296A KR102159686B1 (ko) | 2018-12-11 | 2018-12-11 | 도토리 화분 추출물을 유효성분으로 함유하는 당뇨병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품 |
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