CN105277721A - 一种区分金银花和山银花的鉴别方法 - Google Patents
一种区分金银花和山银花的鉴别方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种区分金银花和山银花的鉴别方法，包括以下步骤：以山银花或含山银花原料的制剂为对照；构建急性口腔炎症模型；通过比较供试品和对照标准品对急性口腔炎症模型细胞中炎症因子TNF-α、IL-6、IL-8和IL-10表达水平的影响，鉴别区分金银花和山银花或其复方制剂。利用该方法不仅可以对金银花、山银花药材进行区分，还可以对复方成方制剂中金银花、山银花的使用情况进行鉴别。本方法技术稳定，鉴别标准与药效直接相关联，对指导临床用药具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及一种从药效学角度区分金银花和山银花的鉴别方法。
背景技术
金银花和山银花自2005版《中华人民共和国药典》起分列为两种药材。由于二者原植物种属相近、药材外观形态相似，难以区分，因此市场上金银花和山银花药材品种混乱、来源不清、质量良莠不齐的现象极为突出，进而直接影响到药材及其制剂的疗效。
现有的金银花、山银花品种鉴别方法均存在一些不足之处，如传统的外观形态鉴别依赖经验、主观性大；化学成分分析法对几种主要化学成分进行检测，难以体现药材整体质量；DNA分子鉴定法技术复杂、成本高，结果重复性差。这些方法虽然可以在一定程度上对近缘品种进行区分，但无法对药效的优劣进行评价。
同时，金银花是许多中药方剂的原料药材，现有方法很难对中药制剂中原料的投料情况进行考察。口炎清颗粒由山银花、玄参、麦冬、天冬、甘草5味药材组成，临床用于治疗阴虚火旺的口腔炎症疾病。
本发明克服上述技术的不足，首次采用口腔炎症模型，从药效作用方面对金银花、山银花进行评价和区分；并对以金银花和山银花为原料的口炎清复方制剂进行鉴别。
发明内容
本发明提供了一种以抗炎药效学为判断指标，从药效作用方面区别金银花和山银花的鉴别方法。方法同样适用于区别以金银花或山银花为原料的复方制剂，特别是口炎清颗粒或其他口炎清复方制剂。
本发明包括以下步骤：
(1)以山银花或以山银花为原料的制剂为对照标准，制备对照标准品；
(2)构建急性口腔炎症模型；
(3)比较供试品和对照标准品对急性口腔炎症模型细胞中炎症因子TNF-α、IL-6、IL-8和IL-10表达水平的影响；若供试品与对照标准品相比，包括TNF-α表达水平在内，有三种或以上的炎症因子调控作用显著弱于对照标准品，则判断该供试品为金银花或以金银花为原料的制剂；没有显著性差异，则认为是山银花或以山银花为原料的制剂。
所述对照标准品的制备方法建议参照《中华人民共和国药典》2010年版口炎清颗粒标准生产工艺，制备原料浸膏后制备对照标准品，和供试品。
所述急性口腔炎症模型的方法可用香烟提取物刺激人口腔表皮样癌细胞，造成急性口腔炎症模型。具体为抽取适量充分燃烧的香烟烟雾，使其完全溶于无血清RPMI-1640培养基，用0.22μm滤膜过滤，除菌，制备100％香烟烟雾提取物待用。
然后将人口腔表皮样癌细胞培养于含10％胎牛血清的RPMI-1640完全培养基中，在37℃、5％CO2培养箱中孵育；用含10％胎牛血清的培养液配成单个细胞悬液，接种到孔板；培养24h，待细胞长至80％密度时，以含对照标准品或供试品的无胎牛血清培养基替换原培养基，预处理30分钟后用6％的香烟提取物刺激人口腔表皮样癌细胞造模，继续孵育24小时，终止培养，用孔内上清液，用Elisa试剂盒进行检测所述炎症因子的浓度。
本发明采用细胞学方法，可以从药效作用层面对金银花、山银花以及成方制剂中金银花、山银花的使用情况进行区分。相对于现有技术所得结果与抗炎活性直接相关联，更能直接、地监控生产过程中原料药材、半成品、成品的质量，对指导临床用药具有重要意义。
附图说明
图1是CSE对KB细胞存活率的影响(n＝6)。
图2是金银花对KB细胞存活率的影响(n＝6)。
图3是山银花对KB细胞存活率的影响(n＝6)。
图4是口炎清(金银花)对KB细胞存活率的影响(n＝6)。
图5是口炎清(山银花)对KB细胞存活率的影响(n＝6)。
图6是金银花和山银花的抗炎活性差异试验中KB细胞炎性因子TNF-α蛋白表达量(n＝6)。
图7是金银花和山银花的抗炎活性差异试验中KB细胞炎性因子IL-10蛋白表达量(n＝6)。
图8是金银花和山银花的抗炎活性差异试验中KB细胞炎性因子IL-6蛋白表达量(n＝6)。
图9是金银花和山银花的抗炎活性差异试验中KB细胞炎性因子IL-8蛋白表达量(n＝6)。
图10是以金银花和山银花为原料的口炎清颗粒抗炎活性差异试验中KB细胞炎性因子TNF-α蛋白表达量(n＝6)。
图11是以金银花和山银花为原料的口炎清颗粒抗炎活性差异试验中KB细胞炎性因子IL-10蛋白表达量(n＝6)。
图12是以金银花和山银花为原料的口炎清颗粒抗炎活性差异试验中KB细胞炎性因子IL-8蛋白表达量(n＝6)。
图13是以金银花和山银花为原料的口炎清颗粒抗炎活性差异试验中KB细胞炎性因子IL-6蛋白表达量(n＝6)。
具体实施方式
以下通过具体的实施例对本发明作进一步说明。
一、香烟提取物诱导口腔急性炎症模型及各药物的抗炎活性差异研究
1、实验材料
1.1实验药品与试剂
金银花浸膏、山银花浸膏、以金银花为原料的口炎清浸膏、以山银花为原料的口炎清浸膏(均由广州白云山和记黄埔中药有限公司提供)；椰树牌香烟(广东中烟工业有限责任公司，含有一氧化碳13mg，焦油11g，烟碱1mg)；KB细胞(人口腔表皮样癌细胞，广州弗尔博生物科技有限公司)；TNF-α、IL-8、IL-6、IL-10Elisa试剂盒(武汉优尔生公司，货号：SEA133Hu，SEA080Hu，SEA079Hu，SEA056Hu)；RPMI-1640培养基(美国GIBCO，货号：C11875500BT)；胎牛血清(美国GIBCO，货号：1420768)；MTT(美国SigmaAldrich，货号：M2128)；地塞米松(中国药品生物制品检定所，批号：100129-201105)；二甲基亚砜(上海凌峰化学试剂有限公司，批号：20140909)；磷酸盐缓冲溶液(美国Hyclone，货号：SH30256.01B)。
1.2实验仪器
(25cm2和75cm2)细胞培养瓶(德国Corning公司，货号：430639)；6孔细胞培养板(广州JETBIOFIL，货号：TCP001006)；96孔细胞培养板(广州JETBIOFIL，货号：TCP001096)；50mL一次性医用注射器；紫外分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司，型号：TU-1901)；自动高压蒸汽灭菌器(中国厦门致微仪器有限公司，型号：GR60DA)；电热恒温水浴锅(上海一恒科技有限公司，型号：HWS24)；细胞培养箱(美国赛默飞世尔科技公司，型号：Forma3111)；超净工作台(苏州净化安泰技术有限公司，型号：HT-840)；倒置显微镜(福建Motic实业公司，型号：AE21)；超速离心机(德国Eppendorf公司，型号：5430R)；电子天平(美国ACCΜLAB公司，型号：ALC-210-4)；超低温冰箱(青岛海尔公司，型号：DW-86L486)；多孔超微量核酸蛋白分析仪(美国BiotekEpoch)；超微量紫外/可见光分光光度计(美国赛默飞世尔科技公司，型号：Nanodrop2000c)；0.22μm无菌过滤器(美国密理博，货号：SLGP033RB)。
2、实验方法
2.1香烟烟雾提取物的配制
制备香烟烟雾提取物装置时，将1.5mL离心管接上香烟，将其底部剪开，然后套上橡胶软管，同时橡胶软管的另一端连接上50mL注射器。将10mL无血清RPMI-1640培养基转移至50mL注射器中，并将注射器中剩余空气完全排出后待用。将香烟点燃，将装置连接设置好，并确保装置不漏气即可开始实验：先连接一只空的50mL注射器，反复抽取3次，观察抽取的香烟烟雾，确保香烟已充分燃烧，然后连接装有10mL无血清RPMI-1640的50mL注射器，抽取50mL充分燃烧的香烟烟雾到注射器中，充分震荡，确保烟雾与培养基充分混匀，反复抽取6次，共计300mL香烟烟雾，待烟雾完全溶于培养基后用0.22μm滤膜过滤后除菌即可得到100％香烟烟雾提取物母液(100％CSE)。为验证CSE母液的稳定性，设置6组平行重复，检测A320下的吸光度值，得到RSD值为1.68％，说明该方法所制备的CSE母液质量稳定可靠。
2.2样品的制备
金银花浸膏、山银花浸膏、以金银花为原料的口炎清浸膏、以山银花为原料的口炎清浸膏均委托广州白云山和记黄埔中药有限公司，按照现有的口炎清颗粒标准生产工艺制备。其中口炎清颗粒原处方即使用山银花，配比为，山银花：玄参：麦冬：天冬：甘草为26：21：21：21：11，含金银花的口炎清颗粒用金银花代替山银花制得。给药时用培养基配成不同浓度的溶液。
2.3细胞培养
将KB细胞培养于含10％胎牛血清的RPMI-1640完全培养基(pH7.2，青霉素100U/ml，链霉素100μg/ml)中，在37℃、5％CO2培养箱中孵育。
(1)传代：用吸管吸弃旧培养基，更换吸管，于非细胞培养面加入等量磷酸盐缓冲液(PBS)，轻轻摇晃使其覆盖整个瓶底，吸弃PBS，更换吸管，重复洗涤一次；加入少量细胞消化液，37℃镜下观察消化；当细胞明显回缩后，加入少量新鲜细胞培养基终止消化，轻柔吹打底面2～3次后收集所有液体入新离心管中；1200转/分钟离心8分钟，弃上清，细胞沉淀用适量新鲜培养基悬浮；加入到新培养瓶中，标记瓶号与细胞批次。
(2)铺板：MTT测定时用完全培养基调整细胞密度为1×104个/mL，并铺96孔板，每孔200μL；ELISA测定时用完全培养基调整细胞密度为4×105个/mL，并铺24孔板，每孔0.5mL。细胞培养24h后，待密度至80％可给药。
2.4CSE及各样品对KB细胞存活率的影响
取生长状态良好的KB细胞，用含10％胎牛血清的培养液配成单个细胞悬液，以每孔1000－10000个细胞接种到96孔板，每孔体积200μl，在37℃、5％CO2条件下培养1-2天；实验前，将培养板中旧的培养基移除，换成新鲜的无血清RPMI-1640培养基处理过夜。将100％香烟烟雾提取物用无血清RPMI-1640培养基稀释成一系列梯度的CSE溶液(1％、5％、10％、15％、20％、25％、50％、75％)，金银花浸膏、山银花浸膏、金银花口炎清浸膏及山银花口炎清浸膏配制成一系列梯度溶液(1μg/ml、10μg/ml、100μg/ml、1000μg/ml)后加入96孔板的细胞中，37℃、5％CO2条件下孵育24h；每孔加入MTT溶液(5mg/ml用pH＝7.4的PBS配制)20μL，37℃培养箱中继续孵育4h，弃去上清后每孔加入200μLDMSO，然后将96孔板置于摇床上轻微摇动5min使紫色结晶充分溶解，用超微量紫外/可见光分光光度计于490nm波长下检测96孔板的OD值。考察浓度梯度的CSE对KB细胞的毒性，根据公式：存活率＝给药组OD值/空白组OD值，可计算出相应的存活率。
2.5考察各药物对香烟提取物诱导的急性口腔炎症的抗炎作用
(1)细胞培养及药物处理
将KB细胞培养于含10％胎牛血清的RPMI-1640完全培养基(pH7.2，青霉素100U/ml，链霉素100μg/ml)中，在37℃、5％CO2培养箱中孵育；用含10％胎牛血清(FBS)的培养液配成单个细胞悬液，以每孔5000个细胞接种到24孔板；培养24h，待细胞长至80％密度时，以含各药物的无FBS培养基替换原培养基，预处理30分钟后用6％CSE刺激KB细胞造模。
实验共设置空白对照组、模型组(6％CSE)、阳性对照组(1μM地塞米松)、金银花浸膏不同剂量组(0.1532，1.532，15.32，153.19，306.38，612.77μg/ml)、山银花浸膏不同剂量组(0.1645，1.645，16.45，164.54，329.08，658.16μg/ml)、金银花口炎清不同剂量组(0.822，8.22，82.2，822.2μg/ml)、山银花口炎清不同剂量组(1，10，100，1000μg/ml)。
(2)样品中IL-6、IL-8、TNF-α和IL-10蛋白含量检测
细胞给药24h后收集细胞上清，4℃下1500rpm离心5min后，弃去底部沉淀留上清，按试剂盒说明采用Elisa法测定IL-6、IL-8、TNF-α和IL-10含量，实验具体方法为：首先，设标准曲线蛋白孔，每孔依次加入不同浓度的标准蛋白溶液(1000pg/ml、500pg/ml、250pg/ml、125pg/ml、62.5pg/ml、31.2pg/ml、15.6pg/ml、标准蛋白稀释液)100μl；其次，加样孔中每孔加入100μl样品蛋白，每个样品设置6个重复孔，加样后标记，酶标板覆膜，37℃下孵育2h；弃去孔内液体，甩干，不用洗涤；每孔加100μL提前配好的检测工作液A，孵育1h；弃去孔内液体，用自动洗板机重复洗板3次，洗完后把孔内的洗涤液尽量甩干；每孔加100μl提前配好的检测工作液B，温育30min；弃去孔内液体，甩干，洗板5次；酶标板内每孔加入底物反应溶液90μL，37℃避光待其标准蛋白溶液显色(反应时间在15-25min之间)，当标准蛋白孔的前4个孔颜色出现明显梯度，后4个孔也出现明显蓝色时，即可终止；每孔小心加入反应终止液50μl，避免产生气泡影响光密度测量，此时蓝色的溶液转变为黄色；立即用多孔酶标仪测量A450下的的光密度(O.D值)。
(3)统计分析
使用SPSS19.0软件统计分析实验结果，采用方差分析法对不同给药组间差异进行统计分析，各组实验结果均以平均数±标准差(mean±S.D)表示，p<0.05说明两者间有显著性差异，p<0.01说明两者间有极显著性差异。
3、实验结果
3.1CSE及各样品对KB细胞存活率的影响。
由图1可知：1％CSE刺激KB细胞24h后与空白组没有显著区别，存活率为0.98；10％CSE条件下，KB细胞的存活率下降至0.79，与空白组有极显著差异(**P<0.01)，更高浓度CSE刺激下细胞存活率持续降低。由图2、3、4、5可知：各样品的系列梯度溶液对KB细胞的存活率并无明显影响。
实验结果小结：四种样品对KB细胞均无毒性，CSE在10％浓度时对KB细胞有明显毒性。
3.2利用CSE诱导急性口腔炎症模型考察金银花、山银花的抗炎活性差异
(1)促炎因子TNF-α水平
由图6可知：在6％CSE刺激24h后，KB细胞促炎因子TNF-α蛋白表达量显著增加，模型组蛋白表达量是空白组的5倍，说明造模成功。金银花、山银花对TNF-α的分泌都具有抑制作用，且呈剂量依赖关系。整体看来，山银花对TNF-α升高的抑制作用强于金银花，在浓度3、4、5、6组中二者的抑制作用具有显著性差异(P<0.01，P<0.05)。图6的实验结果以mean±S.D表示。与正常组比较，##P<0.01；与模型组比较，**P<0.01；两组之间比较，ΔP<0.05，ΔΔP<0.01。
(2)抗炎因子IL-10水平
由图7可知：在6％CSE刺激24h后，KB细胞抗炎因子IL-10分泌量显著降低。而金银花、山银花对CSE刺激引起的IL-10分泌减少都具有改善作用，且呈剂量依赖关系。山银花对IL-10分泌的促进作用均强于金银花，在浓度6组中二者的作用具有显著性差异(P<0.05)。
图7实验结果以mean±S.D表示。与正常组比较，##P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01；两组之间比较，ΔP<0.05。
(3)促炎因子IL-6水平
由图8可知：在6％CSE刺激24h后，KB细胞促炎因子IL-6分泌量显著升高。而金银花、山银花对CSE诱导的IL-6分泌都具有抑制作用，且呈剂量依赖关系。并且山银花的抑制作用均强于金银花，在浓度6组中二者的作用具有极显著差异(P<0.01)。图8实验结果以mean±S.D表示。与正常组比较，##P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01；两组之间比较，ΔΔP<0.01。
(4)促炎因子IL-8水平
由图9可知：在6％CSE刺激24h后，KB细胞促炎因子IL-8蛋白水平显著升高。而金银花、山银花都能抑制CSE诱导的IL-8表达水平上升。浓度5、浓度6组对IL-8升高有显著抑制作用(P<0.05)。图9实验结果以mean±S.D表示。与正常组比较，##P<0.01；与模型组比较，*P<0.05。
3.2分别以金银花和山银花为原料的口炎清颗粒对CSE诱导急性口腔炎症的抗炎活性差异。
(1)促炎因子TNF-α水平
由图10可知：在6％CSE刺激24h后，KB细胞促炎因子TNF-α蛋白表达量显著增加，模型组蛋白表达量是空白组的5倍，说明造模成功。金银花口炎清、山银花口炎清对TNF-α的分泌都具有抑制作用，且呈剂量依赖关系。山银花口炎清对TNF-α升高的抑制作用明显强于金银花口炎清，在浓度2、3组中二者的抑制作用具有显著性差异(P<0.01，P<0.05)。图10实验结果以mean±S.D表示。与正常组比较，##P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01；两组之间比较，ΔP<0.05，ΔΔP<0.01。
(2)抗炎因子IL-10水平
由图11可知：在6％CSE刺激24h后，KB细胞抗炎因子IL-10分泌量显著降低。而金银花口炎清、山银花口炎清对CSE刺激引起的IL-10分泌减少都具有改善作用，且呈剂量依赖关系。山银花口炎清对IL-10分泌的促进作用强于金银花口炎清，且均有显著性差异(P<0.05)。图11实验结果以mean±S.D表示。与正常组比较，##P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01；两组之间比较，ΔP<0.05。
(3)促炎因子IL-8水平
由图12可知：在6％CSE刺激24h后，KB细胞促炎因子IL-8蛋白水平显著升高。而金银花口炎清、山银花口炎清都能抑制CSE诱导的IL-8表达水平上升。并且山银花口炎清的抑制作用均强于金银花口炎清，在浓度1、3、4组中二者的作用具有显著差异(P<0.01，P<0.05)。
图12实验结果以mean±S.D表示。与正常组比较，##P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01；两组之间比较，ΔP<0.05，ΔΔP<0.01。
(4)促炎因子IL-6水平
由图13可知：在6％CSE刺激24h后，KB细胞促炎因子IL-6分泌量显著升高。而金银花口炎清、山银花口炎清对CSE诱导的IL-6分泌都具有抑制作用，且呈剂量依赖关系。山银花口炎清的抑制作用均强于金银花口炎清。图13实验结果以mean±S.D表示。与正常组比较，##P<0.01；与模型组比较，**P<0.01。
4、小结
本实验首先采用了一种稳定便捷的香烟烟雾提取物溶液制备方法，这种方法和其他大型制备装置相比，香烟烟雾能更充分溶于培养液中，香烟烟雾提取溶液质量均一稳定，且实验过程具有很好的可操作性和重复性。由于香烟烟雾提取溶液完成后最好在一小时内使用，而采用大型装置提取的香烟烟雾提取溶液量比较大，容易造成浪费和实验误差，采取本实验的方法在节约资源，避免浪费的同时，使实验更为精确可靠。使用50ml注射器重复抽取六次共300ml烟雾，剧烈摇晃使烟雾充分混匀于10ml培养基中，并用紫外分光光度法检测320nm处波长的方法，对香烟烟雾提取物溶液的质量进行全面验证，以保证制备的香烟提取物质量稳定，确保模型组数据稳定可靠。
此外，通过MTT细胞毒性实验，考察了浓度梯度的CSE及各样品对KB细胞存活率的影响。结果表明，6％的CSE剂量对于KB细胞的存活率没有显著影响，可以用于造模。而各样品不同浓度对KB细胞活性影响的MTT实验结果表明：在1000μg/ml及以下的剂量时，各样品对KB细胞的存活率都不会产生显著影响。
在炎症诱发的免疫应答过程中，细胞因子起着重要的调节作用，如促炎细胞因子IL-8、IL-6、TNF-α，以及抗炎症因子IL-10等。在本实验中，用6％CSE刺激KB细胞24h后，可以显著诱导细胞内炎性因子TNF-α、IL-6、IL-8和IL-10分泌，造成急性口腔炎症模型效果显著。随后，利用此模型对金银花、山银花的抗炎作用进行了分析和比较，结果表明金银花和山银花对TNF-α、IL-6和IL-10的调控作用均具有显著差异，山银花的作用强于金银花；同时也考察了分别以金银花和山银花为原料的复方制剂口炎清颗粒，结果显示以山银花为原料的口炎清对炎性因子TNF-α、IL-6、IL-8和IL-10的调控作用显著强于金银花口炎清，具有统计学差异。说明利用本方法可以对金银花、山银花以及成方制剂中金银花、山银花的使用情况进行区分，同时所得结果与抗炎活性直接相关联，对指导临床用药具有重要意义。
二、鉴别实验
(一)鉴别六批次金银花或山银花原材料。
取金银花原材料和山银花原材料各3批次，按本具体实施方式第一部分2.2项下制备供试样品和山银花标准对照品。香烟提取物刺激人口腔表皮样癌细胞(KB细胞)，构建急性口腔炎症模型。将KB细胞培养于含10％胎牛血清的RPMI-1640完全培养基(pH7.2，青霉素100U/ml，链霉素100μg/ml)中，在37℃、5％CO2培养箱中孵育；用含10％胎牛血清(FBS)的培养液配成单个细胞悬液，以每孔5000个细胞接种到24孔板；培养24h，待细胞长至80％密度时，以含供试品和标准品的无FBS培养基替换原培养基，预处理30分钟后用6％CSE刺激KB细胞造模。细胞给药24h后收集细胞上清，4℃下1500rpm离心5min后，弃去底部沉淀留上清，按试剂盒说明采用Elisa法测定IL-6、IL-8、TNF-α和IL-10含量。比较含量结果表明，3批山银花原材料的IL-6、IL-8、TNF-α和IL-10含量与标准品无显著差别，3批金银花原材料的TNF-α含量与标准品有显著差别，且IL-6和IL-8含量的差别显著。因此，可以验证本发明方法可行。
(二)鉴别三批次口炎清颗粒。
取三批次口炎清颗粒，由广州白云山和记黄埔中药有限公司提供。以确定含山银花的口炎清颗粒制备标准对照品，参照(一)所述的方法进行鉴别，结果显示，三批次口炎清颗粒的IL-6、IL-8、TNF-α和IL-10含量与标准品无显著差别，可判断，此三批次口炎清颗粒中的原材料使用的是山银花，符合用药要求。
Claims (6)
1.一种区分金银花和山银花的鉴别方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)以山银花或以山银花为原料的制剂为对照标准，制备对照标准品；
(2)构建急性口腔炎症模型；
(3)比较供试品和对照标准品对急性口腔炎症模型细胞中炎症因子TNF-α、IL-6、IL-8和IL-10表达水平的影响；若供试品与对照标准品相比，包括TNF-α表达水平在内，有三种或以上的炎症因子调控作用显著弱于对照标准品，则判断该供试品为金银花或以金银花为原料的制剂；没有显著性差异，则认为是山银花或以山银花为原料的制剂。
2.如权利要求1所述的鉴别方法，其特征在于所述的步骤(1)对照标准品的制备方法具体为：参照《中华人民共和国药典》2010年版口炎清颗粒标准生产工艺，制备原料浸膏后制备对照标准品。
3.如权利要求1所述的鉴别方法，其特征在于，所述步骤(2)中急性口腔炎症模型的构建方法为：用香烟提取物刺激人口腔表皮样癌细胞，构建急性口腔炎症模型。
4.如权利要求3所述的鉴别方法，其特征在于：
所述香烟提取物的制备方法为：抽取适量充分燃烧的香烟烟雾，使其完全溶于无血清RPMI-1640培养基，用0.22μm滤膜过滤，除菌，制备100％香烟烟雾提取物；
所述香烟提取物刺激人口腔表皮样癌细胞，造成急性口腔炎症模的具体方法为：将人口腔表皮样癌细胞培养于含10％胎牛血清的RPMI-1640完全培养基中，在37℃、5％CO2培养箱中孵育；用含10％胎牛血清的培养液配成单个细胞悬液，接种到孔板；培养24h，待细胞长至80％密度时，以含对照标准品或供试品的无胎牛血清培养基替换原培养基，预处理30分钟后用6％的香烟提取物刺激人口腔表皮样癌细胞造模，继续孵育24小时，终止培养，用孔内上清液进行检测所述炎症因子的水平。
5.如权利要求1所述的鉴别方法，其特征在于所述的步骤(3)中炎症因子TNF-α、IL-6、IL-8和IL-10表达水平的测定方法为：用Elisa试剂盒检测所述炎症因子TNF-α、IL-6、IL-8和IL-10的浓度。
6.如权利要求1或3或4或5所述的鉴别方法，其特征在于，所述的山银花为原料的制剂包括口炎清颗粒或其他口炎清制剂。
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| CN (1) | CN105277721B (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113740474A (zh) * | 2021-08-27 | 2021-12-03 | 深圳市药品检验研究院（深圳市医疗器械检测中心） | 一种结合抗新冠病毒效应的金银花和山银花鉴别模型及其构建方法和应用 |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101520444A (zh) * | 2009-02-24 | 2009-09-02 | 广州白云山和记黄埔中药有限公司 | 一种鉴别华南忍冬和金银花的方法及其应用 |
| US20130029923A1 (en) * | 2009-12-30 | 2013-01-31 | Allan Sik-Yin Lau | Materials and Methods for Prevention and Treatment of Viral Infections |
| EP2591776A1 (en) * | 2010-04-27 | 2013-05-15 | The First Affiliated Hospital, Third Military Medical Universty, PLA | Use of kukoamine a and kukoamine b |
| CN104244963A (zh) * | 2012-04-27 | 2014-12-24 | 休恩有限公司 | 制备忍冬纯化提取物的方法以及用于预防和治疗败血症和败血性休克的含该提取物的组合物 |
| WO2015009325A1 (en) * | 2013-07-18 | 2015-01-22 | Al-Qahtani Ahmed H | Skin cream |
| CN105477006A (zh) * | 2015-10-14 | 2016-04-13 | 广州白云山和记黄埔中药有限公司 | 口炎清活性成分群及其指纹特征图谱的构建和质量检测方法 |
-
2015
- 2015-10-14 CN CN201510665071.8A patent/CN105277721B/zh active Active
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101520444A (zh) * | 2009-02-24 | 2009-09-02 | 广州白云山和记黄埔中药有限公司 | 一种鉴别华南忍冬和金银花的方法及其应用 |
| US20130029923A1 (en) * | 2009-12-30 | 2013-01-31 | Allan Sik-Yin Lau | Materials and Methods for Prevention and Treatment of Viral Infections |
| EP2591776A1 (en) * | 2010-04-27 | 2013-05-15 | The First Affiliated Hospital, Third Military Medical Universty, PLA | Use of kukoamine a and kukoamine b |
| CN104244963A (zh) * | 2012-04-27 | 2014-12-24 | 休恩有限公司 | 制备忍冬纯化提取物的方法以及用于预防和治疗败血症和败血性休克的含该提取物的组合物 |
| WO2015009325A1 (en) * | 2013-07-18 | 2015-01-22 | Al-Qahtani Ahmed H | Skin cream |
| CN105477006A (zh) * | 2015-10-14 | 2016-04-13 | 广州白云山和记黄埔中药有限公司 | 口炎清活性成分群及其指纹特征图谱的构建和质量检测方法 |
Non-Patent Citations (6)
| Title |
|---|
| JIN AH RYUK ET AL: "Discrimination of Lonicera japonica and Lonicera confusa using chemical analysis and genetic marker", 《THE KOREA JOURNAL OF HERBOLOGY》 * |
| YUAN YUAN ET AL: "Convenient, Sensitive and High-Throughput Method for Screening Botanic Origin", 《SCIENTIFIC REPORTS》 * |
| 康帅等: "金银花与山银花的生药学鉴别研究", 《药物分析杂志》 * |
| 李泮霖等: "金银花和山银花抗急性口腔炎症作用比较", 《中山大学学报（自然科学版）》 * |
| 林永强等: "金银花与山银花的鉴别方法研究", 《药学研究》 * |
| 陈玉琴等: "快速鉴别金银花的质量", 《临床合理用药》 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113740474A (zh) * | 2021-08-27 | 2021-12-03 | 深圳市药品检验研究院（深圳市医疗器械检测中心） | 一种结合抗新冠病毒效应的金银花和山银花鉴别模型及其构建方法和应用 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |