CN112121181A - 一种评价保健品增强免疫力功效的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于检测技术领域。本发明公开了一种评价保健品增强免疫力功效的方法，其包括采用斑马鱼设置模型对照组和供试品组、荧光拍照并分析斑马鱼尾部巨噬细胞荧光强度S及利用荧光强度S计算增强免疫力作用。本发明不用进行试剂的浓度摸索，采用的试剂都较为稳定可以减少实验步骤；斑马鱼增强免疫力模型实验周期相对于小鼠实验更短，仅需24小时；由于斑马鱼饲养成本低、体积小、发育周期短、单次产卵数量高的特点能同时进行多个样品的评价；以斑马鱼尾部巨噬细胞荧光强度总和S为判断标准，只要供试品组斑马鱼与模型对照组比有显著性差异即可判断为具有增强免疫力的作用；用到的诱导剂长春瑞滨是一种常见的化疗药，毒性作用较小。
Description
技术领域
本发明涉及检测技术领域，尤其是涉及一种评价保健品增强免疫力功效的方法。
背景技术
目前评价增强免疫力功能检测方法一般采用哺乳动物模型(小鼠)，采用近交系小鼠，单一性别，18-22g，每组10-15只，以人体推荐的10倍为其中一个剂量组，另设二个剂量组。受试样本给予时间为30天，必要时可延长至45天。测试项目为：体重、脏器/体重比值测定、细胞免疫功能测定、体液免疫功能测定、单核-巨噬细胞功能测定、NK细胞活性测定。
一、脏器/体重比值测定：实验终末，称重后处死小鼠，取出胸腺和脾脏，电子分析天平上称重，计算脏/体比值。
二、细胞免疫功能测定：
1)ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验：
①MTT法：实验需先配置试剂包括完全培养液、ConA液、无菌Hank’s液、MTT液、酸性异丙醇溶液；随后配置脾细胞悬浊液：无菌取脾，置于无菌Hank’s液平皿中制成单个细胞悬液，用筛网过滤，Hank’s液洗涤并离心，将细胞悬浮于1mL完全培养液并调整细胞浓度为3×106个/mL；再进行淋巴细胞增殖反应：将每份脾细胞悬浊液分两孔加入24孔培养板，一孔加75μLConA液，另一孔作为对照，置于37℃5％的CO2孵箱中培养72h。培养结束前4h，每孔吸去上清0.7mL，加入0.7mL不含小牛血清的RPMI1640培养液，同时加入MTT 50μL/孔，继续培养4h。培养结束后，每孔加入1mL酸性异丙醇，吹打使紫色晶体完全溶解，随后分装到96孔板，每个孔作3个平行孔，用酶标仪在570nm波长测定光密度值。
②同位素掺入法：无菌取脾，置于无菌Hank’s液平皿中制成单个细胞悬液，用筛网过滤，Hank’s液洗涤并离心，将细胞悬浮于2mL完全培养液，最后用RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为5×106个/mL；再进行淋巴细胞增殖反应：将每份脾细胞悬浊液加入到96孔培养板中，200μL/孔，每份脾细胞悬液分装6个孔，3孔加ConA(5μg/mL)，另3个孔不加ConA作为对照，置于37℃5％的CO2孵箱中培养72h。培养结束前6h，每孔加入3H-TdR 20μL。用多头细胞收集器将细胞取集于玻璃纤维滤纸上。滤纸片充分干燥后置测量瓶中，加入7mL闪烁液，用液闪仪测定每分钟脉冲数(cpm)。
2)迟发型变态反应(DTH)：
①二硝基氟苯诱导小鼠DTH(耳肿胀法)：先配置新鲜DNFB溶液，再将小鼠腹部皮肤用硫化钡脱毛约3cm×3cm，用DNFB均匀涂抹致敏，5天后，再用DNFB均匀涂抹小鼠右耳(两面)进行攻击，攻击24h后颈椎脱臼处死小鼠，减下左右耳壳，用打孔器取下直径8mm的耳片，称重。
②绵阳红细胞(SRBC)诱导小鼠DTH(足跖增厚法)：小鼠用2％(v/v)SRBC腹腔注射或静脉免疫，每只鼠注射0.2mL，免疫后4天，测量左后足跖部厚度，然后在测量部位皮下注射20％(v/v)SRBC，每只鼠20μL。注射后于24h测量左后足跖部厚度，同一部位测量三次，取平均值。
三、体液免疫功能测定：
1)抗体生成细胞检测(Jerne改良玻片法)：
先制备SRBC：绵羊颈静脉取血，放入有玻璃珠的灭菌锥形瓶中，朝一个方向摇动，以脱纤维；再制备补体，采集豚鼠血分离血清，将1mL压积SRBC加入到5mL豚鼠血清中，用时以SA缓冲液按1：8-15稀释；制备玻片：在清洁玻片上刷一薄层琼脂糖，干后长期保存备用；免疫动物造模：取脱纤维的羊血，用生理盐水洗涤3次，每次离心10min，计数细胞，每只鼠经腹腔或静脉注射SRBC 5×107-2×108个；制备脾细胞悬液：将SRBC免疫4-5天后的小鼠颈椎脱臼处死，取出脾脏，置于无菌Hank’s液平皿中制成单个细胞悬液，用筛网过滤，Hank’s液洗涤并离心，用RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为5×106个/mL；空斑的测定：将表层培养基加热溶解后，放45-50℃水浴保温，与等量pH7.2-7.4 2倍浓度的Hand’s液混合，分装小试管，每管0.5mL，再向管内加50μL 10％SRBC(v/v，用SA缓冲液制备)，20μL脾细胞悬液混匀，倾倒于已刷琼脂糖薄层的玻璃片，做平行片。待琼脂凝固后，将玻片水平扣放在片架上，放入二氧化碳培养箱中孵育1-1.5h，然后用SA缓冲液稀释的补体(1：8)加入到玻片架凹槽内，继续温育1-1.5h后，计数溶血空斑数。
2)血清溶血素的测定：
①血凝法：先制备SRBC(同上)，对动物进行免疫造模及血清分离：取羊血，用生理盐水洗涤3次，每次离心10min。将压积SRBC用生理盐水配成2％(v/v)的细胞悬液，每只鼠腹腔注射0.2mL进行免疫。4-5天后，摘除眼球取血于离心管内，放置约1h，将凝固血与管壁剥离，使血清充分析出，2000r/min离心10min，收集血清；凝集反应：用生理盐水将血清倍比稀释，将不同稀释度的血清分别置于微量血凝实验板内，每孔100μL，再加入100μL 0.5％(v/v)的SRBC悬液，混匀，装入湿润的平盘内加盖，于37℃孵育3h。观察血清凝集程度。
②半数溶血值(HC50)的测定：SRBC、补体的制备同上；对动物免疫造模及血清分离与血凝法一致；溶血反应：取血清用SA缓冲液稀释(一般为200-500倍)。将稀释后的血清1mL置于试管内，依次加入10％(v/v)SRBC 0.5mL，补充1mL(用SA液按1：8稀释)。另设不加血清的对照管(以SA缓冲液代替)。置于37℃恒温水浴中保温15-30min后，冰浴终止反应。2000r/min离心10min。取上清液1mL，加都氏试剂3mL，同时取10％(v/v)SRBC 0.25mL加都氏试剂至4mL，充分混匀，放置10min后，于540nm处以对照管作空白，分别测定各管光密度值。
四、单核-巨噬细胞功能测定：
1)小鼠碳廓清实验：
按体重从小鼠尾静脉注入稀释的印度墨汁(100mL/kg)，待墨汁注入，立即计时，注入墨汁后2-10min，分别从内毗静脉丛取血20μL，并立即将其加到2mL 0.1％Na2CO3溶液作空白对照。用721分光光度计在600nm波长处测光密度值(OD)，以Na2CO3溶液作空白对照。将小鼠处死，取肝脏和脾脏，用滤纸吸干脏器表面血污，分别称重。
2)小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验：
①小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验(滴片法)：先配置3％琼脂、1％鸡红细胞悬液、Giemsa染液以及Giemsa染液脱色液；小鼠巨噬细胞的激活：实验前4天给每只小鼠腹腔注射2％压积羊血红细胞0.2mL。用脊椎脱臼法处死小鼠，腹腔注射加小牛血清的Hank’s液4mL/只，轻轻按揉腹部20次，以充分洗出腹腔巨噬细胞。然后将腹壁剪开一个小口，用胶头吸管吸取腹腔洗液2mL于试管内。用1mL加样器吸取腹腔洗液0.5mL加入盛有0.5mL 1％鸡血红细胞悬液的试管内，混匀。用注射器吸取0.5mL混合液，加入玻片的琼脂圈内。放置37℃孵箱孵育15-20min。孵育结束后迅速用生理盐水将未贴壁细胞冲掉，于甲醇液中固定1min，Giemsa液染色15min。用蒸馏水冲洗干净，晾干，用40×显微镜计数吞噬率和吞噬指数。
②小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验(半体内法)
先制备鸡红细胞悬液：取鸡血置于有玻璃珠的锥形瓶中，朝一个方向充分摇动，以脱纤维。用生理盐水洗涤2-3次，离心去上清，用生理盐水配成20％(v/v)的鸡红细胞悬液；每鼠腹腔注射20％鸡红细胞悬液1mL。间隔30min，颈椎脱臼处死动物，将其仰位固定于鼠板，正中剪开腹壁皮肤，经腹腔注入生理盐水2mL，转动鼠板1min。然后吸出腹腔洗液1mL，平均分滴于2片载玻片上，放入垫有湿纱布的搪瓷盒内，移置37℃孵箱温育30min。后于生理盐水中漂洗，以除去未贴片细胞。晾干，以1：1丙酮甲醇溶液固定，4％(v/v)Giemsa-磷酸缓冲液染色3min，再用蒸馏水漂洗晾干。油镜下计数巨噬细胞。
五、NK细胞活性测定：
1)乳酸脱氢酶测定法：
配置LDH基质液，对靶细胞进行传代(YAC-1细胞)再进行脾细胞悬液的制备(效应细胞)：无菌取脾，置于无菌Hank’s液平皿中制成单个细胞悬液，用筛网过滤，Hank’s液洗涤并离心，加0.5mL灭菌水20s，裂解红细胞后再加入0.5mL 2倍Hank’s液及8mLHang’s液，离心后用含10％小牛血清的RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为2×107个/mL。NK细胞活性检测：取靶细胞和效应细胞各100μL，加入U型96孔培养板中：靶细胞自然释放孔加靶细胞和培养液各100μL，靶细胞最大稀释孔加靶细胞和1％NP40或2.5％Triton各100μL：以上各项均设三个平行孔，于37℃5％的CO2培养箱中培养4h，然后将96孔培养板离心取上清于96孔板中，同时加入LDH基质液100μL，根据室温不同反应3-10min，每孔加入1mol/L的HCl 30μL，在酶标仪490nm处测定光密度值(OD)。
2)同位素3H-TdR测定法：
先进行靶细胞的标记：取传代后24h生长良好的YAC-1细胞按1×106个/mL YAC-1细胞悬液加3H-TdR 10uCi进行标记，于37℃5％的CO2培养箱中培养2h，每30min震荡1次。标记后的细胞用培养液洗涤3次，重悬后使细胞浓度为1×105个/mL。脾细胞悬液的制备(效应细胞)：无菌取脾，置于无菌Hank’s液平皿中制成单个细胞悬液，用筛网过滤，Hank’s液洗涤并离心，将细胞悬浮于2mL完全培养液，最后用RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为1×107个/mL。NK细胞活性测定：在96孔板中每孔加100μL标记靶细胞，实验孔加100μL效应细胞，空白对照孔加100μL培养液，最大稀释孔加100μL 2.5％Triton X-10。每个样品设3个副孔，置37℃5％的CO2培养箱内温育4h，用多头细胞收集器将细胞收集在玻璃纤维滤纸上，用液体闪烁仪进行测量。
上述现有技术存在如下技术缺陷：
1、细胞免疫力功能检测方法中用到的ConA试剂得先进行浓度摸索。ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验中，ConA的浓度太高会抑制细胞增殖，太低不能刺激足够的细胞增殖，而且不同批号的ConA都得重新进行摸索增加实验的周期。
2、受试样品的给予时间一般为30～45天，同时由于需要对小鼠进行解刨并进行细胞的培养等系列操作决定了该方法的实验周期长。
3、由于哺乳动物饲养成本高，培养细胞条件苛刻对实验室的要求更高，这就决定了本实验费用高额的特点，也由于这些原因不能进行样品的高通量筛选。
4、指标判定较为严格，增强免疫力的功能判定，只有满足在细胞免疫功能、体液免疫功能、单核-巨噬细胞功能、NK细胞活性四个方面中两个方面结果呈阳性才能判断受试样品具有增强免疫力的功能。这种判断标准决定了实验的复杂性。
5、实验操作复杂：前期不仅需要饲养小鼠，后期还要进行细胞的传代、培养等。同时每个实验的细胞浓度需要进行适当稀释才能进行后续实验；用到的试剂种类繁多，配置方法复杂。
6、实验毒性较大：在MTT实验具有致癌性；迟发型变态反应(DTH)中二硝基氟苯(DNFB)有较强毒性，不能接触皮肤。
发明内容
本发明的目的是优化实验流程减少实验步骤，缩短实验周期提高实验效率，寻找能进行高通量分析受式物的实验方法，简化增强免疫力功能的实验判断标准，寻找操作更为简单的实验方法，选用毒副作用更低的试剂，为此本发明提供了一种评价保健品增强免疫力功效的方法。为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种评价保健品增强免疫力功效的方法，包括以下步骤：
a)采用斑马鱼设置模型对照组及供试品组；
b)在荧光显微镜下对模型对照组及供试品组的斑马鱼进行拍照并分析模型对照组及供试品组斑马鱼的尾部荧光强度S；
c)利用斑马鱼的尾部荧光强度S计算供试品的增强免疫力作用，
其中，模型对照组由以下方法设置：随机选取斑马鱼，以水溶方式给予含有长春瑞滨的培养液，处理20-28小时
供试品组由以下方法设置：随机选取斑马鱼，以水溶方式给予含有相应浓度的供试品和长春瑞滨的培养液，然后处理20-28小时。
作为优选，斑马鱼为受精后两天的斑马鱼。
作为优选，斑马鱼为转基因中性粒巨噬细胞绿色荧光的斑马鱼。
作为优选，模型对照组和供试品组中各组都选取30尾斑马鱼。
作为优选，步骤a)中，模型对照组及供试品组设置时，将斑马鱼置于六孔板中，并且每孔中设置30尾斑马鱼，添加培养液3mL。
作为优选，步骤a)中，模型对照组及供试品组设置时，添加的长春瑞滨的浓度为350μg/mL。
作为优选，步骤a)中，设置模型对照组及供试品组后，处理24小时。
作为优选，步骤a)中，长春瑞滨使用前先配制成15～20mg/mL的母液。
因此，本发明具有以下有益效果：
1.不用进行试剂的浓度摸索，本实验所用到的试剂都较为稳定可以减少实验步骤；
2.斑马鱼增强免疫力模型实验周期相对于小鼠实验(30-45天)更短，仅需24小时，可以缩短实验周期；
3.由于斑马鱼饲养成本低，体积小，发育周期短、单次产卵次数高的特点能同时进行多个受试样品的评价；
4.采用新的模式生物——转基因中性粒巨噬细胞绿色荧光斑马鱼，斑马鱼作为重要的新型模式动物，是水生实验动物的代表性品种，被广泛地用于免疫学、发育生物学、肿瘤学、药物学、毒理与环境检测等方面的研究；巨噬细胞是一种吞噬细胞，在脊椎动物体内参与非特异性防卫(先天性免疫)和特异性防卫(细胞免疫)；以斑马鱼尾部巨噬细胞荧光强度总和(S)为判断标准，只要受试样品组斑马鱼与模型对照组比有显著性差异即可判断为具有增强免疫力的作用；
5.用到的诱导剂长春瑞滨是一种常见的化疗药，毒性作用较小。
附图说明
图1为总统牌灵芝西洋参口服液、华信牌富硒康口服液处理后斑马鱼表型图；
图2为康富来牌蛋白粉处理后斑马鱼表型图；
图3为螺旋藻咀嚼片、养生堂牌天然维生素C咀嚼片处理后斑马鱼表型图；
图4为蜂胶胶囊、益天健牌大豆异黄酮软胶囊处理后斑马鱼表型图；
图5为阿胶当归浆、金日牌灵芝孢子粉处理后斑马鱼表型图；
图6为合生元牌益生菌冲剂、乃捷尔牌初乳素胶囊、总统牌北京同仁堂蜂王浆口服液处理后斑马鱼表型图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明的技术方案作进一步的说明。
显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
总实施例
一种评价保健品增强免疫力功效的方法，包括以下步骤：
a)采用受精后两天转基因中性粒巨噬细胞绿色荧光的斑马鱼设置模型对照组及供试品组，模型对照组和供试品组中各组都选取30尾斑马鱼；
b)在荧光显微镜下对模型对照组及供试品组的斑马鱼进行拍照并分析模型对照组及供试品组斑马鱼的尾部荧光强度S；
c)利用斑马鱼的尾部荧光强度S计算供试品的增强免疫力作用，
其中，模型对照组由以下方法设置：随机选取斑马鱼于六孔板中，并且每孔中设置30尾斑马鱼，添加培养液3mL，以水溶方式给予含有长春瑞滨的培养液，添加的长春瑞滨的浓度为350μg/mL，处理20-28小时；
供试品组由以下方法设置：随机选取斑马鱼于六孔板中，并且每孔中设置30尾斑马鱼，添加培养液3mL，以水溶方式给予含有相应浓度的供试品和长春瑞滨的培养液，添加的长春瑞滨的浓度为350μg/mL，然后处理20-28小时；
其中，长春瑞滨使用前先配制成15～20mg/mL的母液再进行使用。
实施例
1.试验准备
1.1供试品信息：
乃捷尔牌初乳素胶囊，胶囊内淡黄色粉末，2020年3月收样，用标准稀释水制成2mg/mL，现配现用；
总统牌灵芝西洋参口服液，棕色液体，2020年3月收样，阴凉干燥处保存；
总统牌北京同仁堂蜂王浆口服液，棕色液体，2020年3月收样，阴凉干燥处保存；
合生元牌益生菌冲剂(儿童型)，白色粉末，2020年3月收样，用标准稀释水制成2.5mg/mL，现配现用；
华信牌富硒康口服液，白色液体，2020年4月收样，阴凉干燥处保存；
康富来牌蛋白粉，淡黄色粉末，2020年3月收样，用标准稀释水制成5mg/mL，现配现用；养生堂牌天然维生素C咀嚼片，淡橙色片状，2020年3月收样，用标准稀释水制成1mg/mL，现配现用；
螺旋藻咀嚼片，深绿色片状，2020年3月收样，用标准稀释水制成2mg/mL，现配现用；益天健牌大豆异黄酮软胶囊，胶囊内褐色粘稠胶状液体，2020年3月收样，用标准稀释水制成1mg/mL，现配现用；
蜂胶胶囊，胶囊内棕色粘稠胶状液体，2020年3月收样，用标准稀释水制成10mg/mL，现配现用；
金日破壁灵芝孢子粉胶囊，胶囊内深棕色粉末，2019年收样，用标准稀释水制成1mg/mL，现配现用；
阿辉阿胶当归浆，深棕色液体，2019年收样，阴凉干燥处保存。
1.2实验动物：
转基因中性粒巨噬细胞绿色荧光斑马鱼，受精后2天，2250尾，每个实验组30尾。
1.3主要仪器和试剂：
解剖显微镜(SZX7，OLYMPUS，Japan)；CCD相机(VertA1，上海土森视觉科技有限公司)；
电动聚焦连续变倍荧光显微镜(AZ100，Nikon，Japan)；精密电子天平(CP214，OHAUS，America)；6孔板(Nest Biotech)；
长春瑞滨，淡黄色粉末，批号C10946321，上海麦克林生化科技有限公司，4℃冰箱保存。临用时用养鱼用水配制成终浓度为20mg/mL的母液。
2.模型制作：
2.1原理：水溶给予/静脉注射长春瑞滨诱导斑马鱼免疫力低下模型。大剂量长春瑞滨骨髓抑制明显，导致血小板、红细胞及白细胞数目(粒细胞、T细胞、B细胞和NK细胞)减少和贫血，最终导致免疫力低下。
2.2方法：随机选取2dpf转基因中性粒巨噬细胞绿色荧光斑马鱼于六孔板中，3mL/30尾/孔，水溶给予阳性对照药百令胶囊15μg/mL和相应浓度的供试品，除正常对照组外长春瑞滨以水溶方式给药终浓度为350μg/mL，建立斑马鱼免疫力低下模型；样品处理24h后，在荧光显微镜下对斑马鱼进行拍照分析尾部荧光强度S；
2.3检测指标：
斑马鱼尾部荧光强度总和(S)。
2.4浓度确定依据：
根据增强免疫力产品剂量换算确定斑马鱼的实验浓度，并按照2倍的组间系数向上和向下设置实验浓度。
3.实验组别：
3.1总统牌灵芝西洋参口服液、华信牌富硒康口服液增强免疫力作用评价实验：
实验1组 正常对照组：养鱼用水处理；
实验2组 模型对照组：350 μg/mL浓度长春瑞滨处理；
实验3组 阳性对照组：百令胶囊15μg/mL；
实验4组 总统牌灵芝西洋参口服液：0.35μL/mL；
实验5组 总统牌灵芝西洋参口服液：0.7μL/mL；
实验6组 总统牌灵芝西洋参口服液：1.4μL/mL；
实验7组 总统牌灵芝西洋参口服液：2.8μL/mL；
实验8组 总统牌灵芝西洋参口服液：5.6μL/mL；
实验9组 华信牌富硒康口服液：1.1μL/mL；
实验10组 华信牌富硒康口服液：2.1μL/mL；
实验11组 华信牌富硒康口服液：4.2μL/mL；
实验12组 华信牌富硒康口服液：8.5μL/mL；
实验13组 华信牌富硒康口服液：16.9μL/mL；
上述实验组3～13，还分别添加长春瑞滨处理使其浓度为350μg/mL。
3.2康富来牌蛋白粉增强免疫力作用评价实验：
实验1组 正常对照组：养鱼用水处理；
实验2组 模型对照组：350 μg/mL浓度长春瑞滨处理；
实验3组 阳性对照组：百令胶囊15μg/mL；
实验4组 康富来牌蛋白粉：208μg/mL；
实验5组 康富来牌蛋白粉：417μg/mL；
实验6组 康富来牌蛋白粉：833μg/mL；
实验7组 康富来牌蛋白粉：1667μg/mL；
上述实验组3～7，还分别添加长春瑞滨处理使其浓度为350μg/mL。
3.3螺旋藻咀嚼片、养生堂牌天然维生素C咀嚼片增强免疫力作用评价实验：
实验1组 正常对照组：养鱼用水处理；
实验2组 模型对照组：350μg/mL浓度长春瑞滨处理；
实验3组 阳性对照组：百令胶囊15μg/mL；
实验4组 螺旋藻咀嚼片：62.5μg/mL；
实验5组 螺旋藻咀嚼片：125μg/mL；
实验6组 螺旋藻咀嚼片：250μg/mL；
实验7组 螺旋藻咀嚼片：500μg/mL；
实验8组 螺旋藻咀嚼片：1000μg/mL；
实验9组 养生堂牌天然维生素C咀嚼片：17.7μg/mL；
实验10组 养生堂牌天然维生素C咀嚼片：35.4μg/mL；
实验11组 养生堂牌天然维生素C咀嚼片：70.8μg/mL；
实验12组 养生堂牌天然维生素C咀嚼片：141.5μg/mL；
实验13组 养生堂牌天然维生素C咀嚼片：283.3μg/mL；
上述实验组3～13，还分别添加长春瑞滨处理使其浓度为350μg/mL。
3.4蜂胶胶囊、益天健牌大豆异黄酮软胶囊增强免疫力作用评价实验：
实验1组 正常对照组：养鱼用水处理；
实验2组 模型对照组：350μg/mL浓度长春瑞滨处理；
实验3组 阳性对照组：百令胶囊15μg/mL；
实验4组 蜂胶胶囊：20.8μg/mL；
实验5组 蜂胶胶囊：41.7μg/mL；
实验6组 蜂胶胶囊：83.3μg/mL；
实验7组 益天健牌大豆异黄酮软胶囊：5.2μg/mL；
实验8组 益天健牌大豆异黄酮软胶囊：10.4μg/mL；
实验9组 益天健牌大豆异黄酮软胶囊：20.8μg/mL；
实验10组 益天健牌大豆异黄酮软胶囊：41.6μg/mL；
实验11组 益天健牌大豆异黄酮软胶囊：83.3μg/mL；
上述实验组3～11，还分别添加长春瑞滨处理使其浓度为350μg/mL。
3.5阿胶当归浆、金日牌灵芝孢子粉增强免疫力作用评价实验：
实验1组 正常对照组：养鱼用水处理；
实验2组 模型对照组：350μg/mL浓度长春瑞滨处理；
实验3组 阳性对照组：百令胶囊15μg/mL；
实验4组 阿胶当归浆：0.7μL/mL；
实验5组 阿胶当归浆：1.4μL/mL；
实验6组 阿胶当归浆：2.8μL/mL；
实验7组 阿胶当归浆：5.6μL/mL；
实验8组 阿胶当归浆：11.2μL/mL；
实验9组 金日牌灵芝孢子粉：21.9μg/mL；
实验10组 金日牌灵芝孢子粉：43.75μg/mL；
实验11组 金日牌灵芝孢子粉：87.5μg/mL；
实验12组 金日牌灵芝孢子粉：175μg/mL；
实验13组 金日牌灵芝孢子粉：350μg/mL；
上述实验组3～13，还分别添加长春瑞滨处理使其浓度为350μg/mL。
3.6合生元牌益生菌冲剂、乃捷尔牌初乳素胶囊、总统牌北京同仁堂蜂王浆口服液增强免疫力作用评价实验：
实验1组 正常对照组：养鱼用水处理；
实验2组 模型对照组：350μg/mL浓度长春瑞滨处理；
实验3组 阳性对照组：百令胶囊15μg/mL；
实验4组 合生元牌益生菌冲剂：31.25μg/mL；
实验5组 合生元牌益生菌冲剂：62.5μg/mL；
实验6组 合生元牌益生菌冲剂：125μg/mL；
实验7组 合生元牌益生菌冲剂：250μg/mL；
实验8组 合生元牌益生菌冲剂：500μg/mL；
实验9组 乃捷尔牌初乳素胶囊：18.75μg/mL；
实验10组 乃捷尔牌初乳素胶囊：37.5μg/mL；
实验11组 乃捷尔牌初乳素胶囊：75μg/mL；
实验12组 乃捷尔牌初乳素胶囊：150μg/mL；
实验13组 乃捷尔牌初乳素胶囊：300μg/mL；
实验14组 总统牌北京同仁堂蜂王浆口服液：0.35μL/mL；
实验15组 总统牌北京同仁堂蜂王浆口服液：0.7μL/mL；
实验16组 总统牌北京同仁堂蜂王浆口服液：1.4μL/mL；
实验17组 总统牌北京同仁堂蜂王浆口服液：2.8μL/mL；
实验18组 总统牌北京同仁堂蜂王浆口服液：5.6μL/mL；
上述实验组3～18，还分别添加长春瑞滨处理使其浓度为350μg/mL。
4检测结果
4.1总统牌灵芝西洋参口服液、华信牌富硒康口服液增强免疫力作用评价实验结果如图1及下表1所示；
表1总统牌灵芝西洋参口服液、华信牌富硒康口服液各实验组增强免疫力作用评价(n＝10)
与模型对照组比较，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
由图1及表1中可知，大剂量长春瑞滨会诱导斑马鱼免疫低下，从而导致模型对照组巨噬细胞数量减少，故模型对照组斑马鱼尾部荧光强度总和会变低，供试品总统牌灵芝西洋参口服液和华信牌富硒康口服液处理后，斑马鱼免疫力得到提升，故巨噬细胞数量增多，斑马鱼荧光强度总和较模型对照组升高。
4.2康富来牌蛋白粉增强免疫力作用评价实验结果如图2及下表2所示；
表2.康富来牌蛋白粉实验组增强免疫力作用评价(n＝10)
与模型对照组比较，***p<0.001。
由图2及表2中可知，大剂量长春瑞滨会诱导斑马鱼免疫低下，从而导致模型对照组巨噬细胞数量减少，故模型对照组斑马鱼尾部荧光强度总和会变低，供试品康富来牌蛋白粉处理后，斑马鱼免疫力得到提升，故巨噬细胞数量增多，斑马鱼荧光强度总和较模型对照组升高。
4.3螺旋藻咀嚼片、养生堂牌天然维生素C咀嚼片增强免疫力作用评价实验结果如图3及下表3所示；
表3.螺旋藻咀嚼片、养生堂牌天然维生素C咀嚼片各实验组增强免疫力作用评价(n＝10)
与模型对照组比较，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
由图3及表3中可知，大剂量长春瑞滨会诱导斑马鱼免疫低下，从而导致模型对照组巨噬细胞数量减少，故模型对照组斑马鱼尾部荧光强度总和会变低，供试品螺旋藻咀嚼片和养生堂牌天然维生素C咀嚼片处理后，斑马鱼免疫力得到提升，故巨噬细胞数量增多，斑马鱼荧光强度总和较模型对照组升高。
4.4蜂胶胶囊、益天健牌大豆异黄酮软胶囊增强免疫力作用评价实验结果如图4及下表4所示；
表4.蜂胶胶囊、益天健牌大豆异黄酮软胶囊各实验组增强免疫力作用评价(n＝10)
与模型对照组比较，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
由图4及表4中可知，大剂量长春瑞滨会诱导斑马鱼免疫低下，从而导致模型对照组巨噬细胞数量减少，故模型对照组斑马鱼尾部荧光强度总和会变低，供试品蜂胶胶囊和益天健牌大豆异黄酮软胶囊处理后，斑马鱼免疫力得到提升，故巨噬细胞数量增多，斑马鱼荧光强度总和较模型对照组升高。
4.5阿胶当归浆、金日牌灵芝孢子粉增强免疫力作用评价实验结果如图5及下表5所示；
表5.阿胶当归浆、金日牌灵芝孢子粉各实验组增强免疫力作用评价(n＝10)
与模型对照组比较，*p<0.05，***p<0.001。
由图5及表5中可知，大剂量长春瑞滨会诱导斑马鱼免疫低下，从而导致模型对照组巨噬细胞数量减少，故模型对照组斑马鱼尾部荧光强度总和会变低，供试品阿胶当归浆和金日牌灵芝孢子粉处理后，斑马鱼免疫力得到提升，故巨噬细胞数量增多，斑马鱼荧光强度总和较模型对照组升高。
4.6合生元牌益生菌冲剂、乃捷尔牌初乳素胶囊、总统牌北京同仁堂蜂王浆口服液增强免疫力作用评价实验结果如图6及下表6所示；
表6.合生元牌益生菌冲剂、乃捷尔牌初乳素胶囊、总统牌北京同仁堂蜂王浆口服液各实验组增强免疫力作用评价(n＝10)
与模型对照组比较，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
由图6及表6中可知，大剂量长春瑞滨会诱导斑马鱼免疫低下，从而导致模型对照组巨噬细胞数量减少，故模型对照组斑马鱼尾部荧光强度总和会变低，供试品合生元牌益生菌冲剂、乃捷尔牌初乳素胶囊和总统牌北京同仁堂蜂王浆口服液处理后，斑马鱼免疫力得到提升，故巨噬细胞数量增多，斑马鱼荧光强度总和较模型对照组升高。
5.检测结论
在本实验浓度条件下，由江苏天美健大自然生物工程有限公司于2020年03月提供的乃捷尔牌初乳素胶囊，由北京同仁堂健康药业股份有限公司于2020年03月提供的总统牌灵芝西洋参口服液和总统牌北京同仁堂蜂王浆口服液，由合生元(广州)健康产品有限公司于2020年03月提供的合生元牌益生菌冲剂(儿童型)，由安徽省华信生物药业股份有限公司于2020年04月提供的华信牌富硒康口服液，广东康富来药业有限公司于2020年03月提供的康富来牌蛋白粉，由养生堂药业有限公司于2020年03月提供的养生堂牌天然维生素C咀嚼片，由汤臣倍健股份有限公司于2020年03月提供的螺旋藻咀嚼片，由广州健原生物科技有限公司于2020年03月提供的益天健牌大豆异黄酮软胶囊，由山东东阿古胶阿胶系列产品有限公司于2019年提供的阿辉阿胶当归浆，由威海紫光科技园有限公司于2020年03月提供的蜂胶胶囊和金日制药(中国)有限公司于2019年提供的金日破壁灵芝孢子粉胶囊均对免疫力低下斑马鱼有明显的增强免疫力作用。
应当理解的是，对于本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
Claims (8)
1.一种评价保健品增强免疫力功效的方法，其特征在于：
a)采用斑马鱼设置模型对照组及供试品组；
b)在荧光显微镜下对模型对照组及供试品组的斑马鱼进行拍照并分析模型对照组及供试品组斑马鱼的尾部荧光强度S；
c)利用斑马鱼的尾部荧光强度S计算供试品的增强免疫力作用，
其中，模型对照组由以下方法设置：随机选取斑马鱼，以水溶方式给予含有长春瑞滨的培养液，处理20-28小时；
供试品组由以下方法设置：随机选取斑马鱼，以水溶方式给予含有相应浓度的供试品和长春瑞滨的培养液，然后处理20-28小时。
2.根据权利要求1所述的一种评价保健品增强免疫力功效的方法，其特征在于：
所述斑马鱼为受精后两天的斑马鱼。
3.根据权利要求1或2所述的一种评价保健品增强免疫力功效的方法，其特征在于：
所述斑马鱼为转基因中性粒巨噬细胞绿色荧光的斑马鱼。
4.根据权利要求1所述的一种评价保健品增强免疫力功效的方法，其特征在于：
所述模型对照组和供试品组中各组都选取30尾斑马鱼。
5.根据权利要求1或4所述的一种评价保健品增强免疫力功效的方法，其特征在于：
所述步骤a)中，模型对照组及供试品组设置时，将斑马鱼置于六孔板中，并且每孔中设置30尾斑马鱼，添加培养液3mL。
6.根据权利要求1所述的一种评价保健品增强免疫力功效的方法，其特征在于：
所述步骤a)中，模型对照组及供试品组设置时，添加的长春瑞滨的浓度为350μg/mL。
7.根据权利要求1所述的一种评价保健品增强免疫力功效的方法，其特征在于：
所述步骤a)中，设置模型对照组及供试品组后，处理24小时。
8.根据权利要求1所述的一种评价保健品增强免疫力功效的方法，其特征在于：
所述步骤a)中，长春瑞滨使用前先配制成15～20mg/mL的母液。
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|---|---|---|---|---|
| CN113583941A (zh) * | 2021-06-23 | 2021-11-02 | 北京中医药大学 | 一种补气养血活性评价模型的建立方法 |
Citations (1)
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|---|---|---|---|---|
| CN110669099A (zh) * | 2018-10-09 | 2020-01-10 | 杏辉天力（杭州）药业有限公司 | 一种芝麻肽粉及其制备方法和用途 |
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