CN113740474A - 一种结合抗新冠病毒效应的金银花和山银花鉴别模型及其构建方法和应用 - Google Patents
一种结合抗新冠病毒效应的金银花和山银花鉴别模型及其构建方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种结合抗新冠病毒效应的金银花和山银花鉴别模型及其构建方法和应用，所述构建方法包括以下步骤：(1)建立金银花、山银花液相色谱指纹图谱；(2)对金银花、山银花抑制新冠病毒Mpro的活性进行测定，根据测定结果及步骤(1)中的指纹图谱进行相关分析，筛选出具有抗新冠病毒效应的活性成分；(3)利用步骤(1)中的指纹图谱进行特征提取，筛选出能表征整体化学信息的特征性成分，整合步骤(2)得到的活性成分进行偏最小二乘‑判别分析，构建模式识别模型。本发明提供的金银花和山银花鉴别模型能反映抗新冠病毒效应，预测性好，准确度高，检测速度快。
Description
技术领域
本发明属于中药分析领域，具体涉及一种结合抗新冠病毒效应的金银花和山银花鉴别模型及其构建方法和应用，尤其涉及一种准确、能够反映抗新冠病毒效应的金银花和山银花鉴别模型及其构建方法和应用。
背景技术
SARS-CoV-2 在入侵细胞后，会立即利用细胞内的物质，合成两条超长复制酶多肽，并编码主蛋白酶(Main protease，Mpro)，对复制酶多肽进行加工，生成SARS-CoV-2 转录复制所需的蛋白。其中，Mpro作为一种关键的辅酶，在介导SARS-CoV-2 复制和转录的过程中起着关键作用，是抑制SARS-CoV-2的重要靶标。
金银花为忍冬科(Caprifoliaceae)植物忍冬的干燥花蕾或带初开的花，是大宗常用中药材。金银花的传统功效为清热解毒，疏散风热，用于风热感冒，温病发热等。同时，金银花也是目前用于新冠肺炎的连花清瘟胶囊和金花清感方的重要组成部分。研究发现，金银花水提取对于Mpro具有显著的抑制作用，显示出抗新冠病毒活性。但是，在金银花的生产流通过程中，由于资源短缺或价格等因素，掺伪混用、等级混乱、以次充好的现象时有发生。抽检中药材、饮片及中成药质量分析报告均指出同属近缘品种金银花和山银花存在混用现象，甚至在金银花中掺入非药用部位。
CN108445108A公开了一种金银花和山银花的鉴别方法：待检样品提取液使用液相色谱仪和DAD检测器进行检测。此方法具有简便、高效、经济、环保等优点，无需任何对照物质或高毒有机化学试剂。该方法不但可以用于中药材，也可以用于含金银花制剂中的金银花真伪或掺伪检验，具有很高的应用价值。
CN109030666A公开了一种利用高效液相色谱鉴别金银花和山银花的方法，当待测物为金银花或山银花中的一种或两种时，通过高效液相色谱检测待测物干燥品中断马钱子酸的重量百分比来鉴别金银花和山银花，当测待测物干燥品中断马钱子酸含量小于1.5％，判定为非金银花；断马钱子酸含量大于1.0％，判定为非山银花。断马钱子酸含量小于等于1.5％，且大于等于1.0％时，判定为金银花或山银花的混合物。该发明通过高效液相色谱检测金银花和山银花干燥品中断马钱子酸的重量百分比来鉴别金银花和山银花，快捷、准确，为药品的生产、流通、使用过程中提供了一种鉴别真假的依据。
由于金银花的生产流通过程存在掺伪混用、等级混乱、以次充好等问题。因此，如何提供一种准确的金银花和山银花的鉴别方法，成为重大疫情防控用药中亟待解决的问题。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种结合抗新冠病毒效应的金银花和山银花鉴别模型及其构建方法和应用，尤其提供一种准确的、能够反映抗新冠病毒效应的金银花和山银花鉴别模型及其构建方法和应用。本发明提供的金银花和山银花鉴别模型能反映抗新冠病毒效应，预测性好，准确度高，检测速度快。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种结合抗新冠病毒效应的金银花和山银花鉴别模型的构建方法，所述构建方法包括以下步骤：
(1)建立金银花(Lonicera japonica Thunb.)、山银花(Lonicera macranthoidesHand.-Mazz)液相色谱指纹图谱；
(2)对金银花、山银花抑制新冠病毒Mpro(SARS-CoV-2Mpro)的活性进行测定，根据测定结果及步骤(1)中的指纹图谱进行相关分析，筛选出具有抗新冠病毒效应的活性成分；
(3)利用步骤(1)中的指纹图谱进行特征提取，筛选出能表征整体化学信息的特征性成分，整合步骤(2)得到的效应成分进行偏最小二乘-判别分析，构建模式识别模型。
本发明将液相色谱指纹图谱与抑制新冠病毒Mpro的活性相结合，建立得到的模型能够对金银花和山银花进行有效区分，预测性好，准确度高，检测速度快。
优选地，步骤(1)所述建立金银花、山银花液相色谱指纹图谱包括以下步骤：
(1’)将金银花或山银花分别用水浸泡，之后回流提取、浓缩、干燥，得到金银花水提取物和山银花水提取物；
(2’)将步骤(1’)得到的金银花水提取物和山银花水提取物分别溶解、过滤，得到滤液，之后分别进样进行超高效液相色谱检测，根据结果建立所述液相色谱指纹图谱。
优选地，步骤(1’)所述金银花或山银花与水的料液比为1:(20-30)g/mL。
优选地，步骤(1’)所述浸泡的时间为0.8-1.2h。
优选地，步骤(1’)所述回流提取的次数为2-4次。
优选地，步骤(2’)所述滤液的浓度为8-12mg/mL。
优选地，步骤(2’)所述超高效液相色谱检测的柱温为13-17℃，流速为0.7-1.1mL/min，进样量为4-6μL。
优选地，步骤(2’)所述超高效液相色谱检测的流动相包括流动相A和流动相B，所述流动相A包括质量分数0.08-0.12％的甲酸水溶液，所述流动相B 包括乙腈。
其中，金银花或山银花与水的料液比可以是1:20g/mL、1:22g/mL、1:24 g/mL、1:26g/mL、1:28g/mL或1:30g/mL等，浸泡的时间可以是0.8h、0.9h、 1h、1.1h或1.2h等，回流提取的次数可以是2次、3次或4次等，滤液的浓度可以是8mg/mL、9mg/mL、10mg/mL、11mg/mL或12mg/mL等，柱温可以是13℃、14℃、15℃、16℃或17℃等，流速可以是0.7mL/min、0.8mL/min、 0.9mL/min、1mL/min或1.1mL/min等，进样量可以是4μL、4.5μL、5μL、5.5 μL或6μL等，甲酸水溶液的质量分数可以是0.08％、0.09％、0.1％、0.11％或 0.12％等，但不限于以上所列举的数值，上述数值范围内其他未列举的数值同样适用。
优选地，步骤(2’)所述超高效液相色谱检测的洗脱程序如下：
第0-5min时，流动相A与流动相B的体积比为(4-6):(94-96)；
第5-10min时，流动相A与流动相B的体积比由(4-6):(94-96)匀速变化至 (9-11):(89-91)；
第10-15min时，流动相A与流动相B的体积比为(9-11):(89-91)；
第15-25min时，流动相A与流动相B的体积比由(9-11):(89-91)匀速变化至 (19-21):(79-81)；
第25-40min时，流动相A与流动相B的体积比由(19-21):(79-81)匀速变化至(29-31):(69-71)；
优选地，步骤(2’)所述超高效液相色谱检测的色谱柱为Agilent Poroshell SB-C18，规格为4.6mm×150mm×2.7μm。
其中，第0-5min时，流动相A与流动相B的体积比中，流动相A的份数可以是4份、5份或6份等，流动相B的份数可以是94份、95份或96份等；第5-10min时，流动相A与流动相B的体积比中，流动相A的份数变化至可以是9份、10份或11份等，流动相B的份数变化至可以是89份、90份或91份等；第10-15min时，流动相A与流动相B的体积比中，流动相A的份数可以是9份、10份或11份等，流动相B的份数可以是89份、90份或91份等；第 15-25min时，流动相A与流动相B的体积比中，流动相A的份数变化至可以是19份、20份或21份等，流动相B的份数变化至可以是79份、80份或81份等；第25-40min时，流动相A与流动相B的体积比中，流动相A的份数变化至可以是29份、30份或31份等，流动相B的份数变化至可以是69份、70份或71份等，但不限于以上所列举的数值，上述数值范围内其他未列举的数值同样适用。
上述洗脱参数能够将样品特征峰充分分离，提高了模型的预测性和鉴别的准确度。
优选地，步骤(2)所述对金银花、山银花抑制新冠病毒Mpro的活性进行测定具体包括以下步骤：分别测定金银花和山银花抑制新冠病毒Mpro的IC50值，之后在两者之间选择任一浓度为测试浓度，以该测试浓度分别测定金银花和山银花对新冠病毒Mpro的抑制率。
优选地，步骤(2)所述筛选具体包括以下步骤：将步骤(1)建立的金银花、山银花液相色谱指纹图谱与步骤(2)得到的金银花和山银花对新冠病毒 Mpro的抑制率进行灰色关联分析，得到具有抑制新冠病毒Mpro活性的效应成分。
优选地，步骤(2)所述效应成分的关联度不低于0.965。
优选地，步骤(2)所述筛选出具有抗新冠病毒效应的活性成分后还包括以下步骤：取金银花样品和山银花样品作为训练集和试验集，以步骤(1)得到的训练集中的金银花、山银花液相色谱指纹图谱为基础，进行全谱PLS-DA分析，筛选出变量重要性投影值大于1的变量，对其进行组间t检验，最终筛选出显著性差异P低于0.01的峰，并将其与步骤(2)中的效应成分进行比较，确定构建模型成分。
优选地，步骤(3)所述进行模式识别模型构建后还包括以下步骤：对模型进行置换检验。
优选地，步骤(3)所述进行模式识别模型构建后还包括以下步骤：对模型进行试验集外部验证。
第二方面，本发明提供了如上所述的结合抗新冠病毒效应的金银花和山银花鉴别模型的构建方法构建得到的金银花和山银花鉴别模型。
第三方面，本发明提供了一种结合抗新冠病毒效应的金银花和山银花鉴别模型的构建系统，所述金银花和山银花鉴别模型的构建系统包括以下单元
液相色谱单元，用于检测、收集金银花、山银花液相色谱数据并制作金银花、山银花液相色谱指纹图谱；
活性测定单元，用于检测金银花、山银花抗新冠病毒效应；
效应成分筛选单元，用于将金银花、山银花液相色谱指纹图谱与金银花、山银花对新冠病毒Mpro的抑制率进行灰色关联分析，筛选得到效应成分；
特征性成分筛选单元，用于对金银花、山银花液相色谱指纹图谱进行特征提取，筛选出能表征整体化学信息的特征性成分；
模型构建单元，用于将效应成分与特征性成分进行偏最小二乘-判别分析，构建金银花和山银花鉴别模型。
第四方面，本发明还提供了一种金银花和山银花鉴别方法，所述鉴别方法包括以下步骤：将待测样品以如上所述中的检测流程进行液相色谱检测，之后将检测结果代入如上所述的金银花和山银花鉴别模型中，根据结果判断待测样品为金银花或山银花。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种结合抗新冠病毒效应的金银花和山银花鉴别模型，通过将液相色谱指纹图谱与抑制新冠病毒Mpro的活性相结合，建立得到的模型能够对金银花和山银花进行有效区分，预测性好，准确度高，检测速度快。
附图说明
图1是实施例1中的UHPLC指纹图谱；
图2是实施例1中的样品对SARS-CoV-2Mpro的抑制率结果图；
图3是实施例1中的变量重要性投影值结果图；
图4是实施例1中的对训练集药材数据的PLS-DA分析结果图；
图5是实施例1中的栽培金银花项的置换检验的结果图；
图6是实施例1中的野生金银花项的置换检验的结果图；
图7是实施例1中的山银花项的置换检验的结果图；
图8是实施例1中的试验集数据对模型进行验证的结果图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
以下实施例中，栽培金银花、野生金银花和山银花来源如下：
实施例1
本实施例提供了一种金银花和山银花的鉴别方法，具体步骤如下：
取栽培金银花样品30批、野生金银花样品10批、山银花(灰毡毛忍冬)9 批作为以下检测使用。
准确称取干燥的金银花或山银花6.00g，加入150mL超纯水，浸泡1h后，进行回流提取，提取3次，每次提取1h，合并每次实验的提取液，过滤后浓缩干燥，即得样品水提取物。
将上述样品水提取物100mg置于10mL容量瓶中，用水溶解定容后，得到 10mg·mL-1的溶液，经0.22μm的微孔滤膜过滤，取续滤液，进行指纹图谱分析。采用超高效液相色谱仪，色谱柱Agilent Poroshell SB-C18(4.6mm×150mm，2.7 μm)，柱温15℃，流速0.9mL/min，检测波长240nm，进样量5μL，流动相质量分数0.1％甲酸水溶液，乙腈(B)，梯度洗脱，第0-5min时，流动相A与流动相B的体积比为5:95；第5-10min时，流动相A与流动相B的体积比由5:95匀速变化至10:90；第10-15min时，流动相A与流动相B的体积比为10:90；第15-25min时，流动相A与流动相B的体积比由10:90匀速变化至20:80；第 25-40min时，流动相A与流动相B的体积比由20:80匀速变化至30:70；第40-45 min时，流动相A与流动相B的体积比由30:70匀速变化至40:60。将结果制作成UHPLC指纹图谱，如图1所示，并将其中指纹峰进行标记。
新型冠状病毒的Mpro是病毒转录复制所需的关键蛋白，是抗病毒药物研发的理想靶点。在SARS-CoV-2Mpro天然底物的两端连接荧光基团，当SARS-CoV-2 Mpro切割其底物时，可检测到荧光；当反应体系中加入SARS-CoV-2Mpro抑制剂，荧光的生成会被抑制，荧光强度与抑制剂的抑制效果成反比，进而可以检测金银花/山银花对SARS-CoV-2Mpro的抑制效果。
首先摸索金银花与山银花抑制新冠病毒Mpro的IC50值，为进一步测定所有药材对新冠病毒Mpro的抑制率提供数据基础。分别配制系列浓度为30、100、300、600、1000、1200μg/mL的栽培金银花、野生金银花和山银花水溶液，采用新型冠状病毒Mpro/3CLpro抑制剂筛选试剂盒(碧云天生物技术有限公司)进行新冠病毒Mpro的抑制能力测定实验。结果表明栽培金银花的IC50为831.30μg/mL，野生金银花的IC50为528.9μg/mL，山银花的IC50为495.70μg/mL。因此，将所有药材配制为600μg/mL，进行SARS-CoV-2Mpro的抑制率测定。
采用新型冠状病毒Mpro/3CLpro抑制剂筛选试剂盒(碧云天生物技术有限公司)测定上述49批金银花/山银花样品对SARS-CoV-2Mpro的抑制率，作为对新冠病毒抑制作用的评价指标，结果如图2所示。整合上述测定的49批药材的全谱指纹峰数据，进行灰色关联分析，计算所有指纹峰与新冠病毒抑制率的关联度。遴选关联度大于等于0.965，与抗新冠病毒效应显著相关的成分作为特征性成分，结果如下所示：
将49批样品分为训练集(栽培金银花样品15批、野生金银花样品5批、山银花(灰毡毛忍冬)5批)和试验集(栽培金银花样品15批、野生金银花样品5批、山银花(灰毡毛忍冬)4批)
以25批训练集(其中栽培金银花15批，野生金银花15批，山银花5批) 样本的整体指纹图谱数据为基础，进行全谱PLS-DA分析。筛选出变量重要性投影值(Variableimportance in project，VIP)＞1的变量，共23个，结果如图3 所示。对其进行组间t检验，最终筛选出具有非常显著的差异(P值＜0.01)的 8个峰，分别为峰23、60、32、27、28、59、9、22。
对基于化学信息筛选出的8个峰与抗新冠病毒效应显著相关的15个成分进行分析，发现二者基本吻合，进而确定15个成分为既能对栽培金银花、野生金银花和山银花进行区分的成分，又能体现金银花/山银花抑制新冠病毒Mpro活性的特征性成分。因此，以此15个成分为基础进行模式识别模型构建。
采用SIMCA14.1软件对训练集药材数据进行PLS-DA分析，结果如图4所示。结果显示，第一主成分贡献率为49.0％，第二主成分贡献率为25.7％，前两个主成分的累积贡献率为74.7％，可表征大部分化学成分信息。R2Y＝0.819， Q2＝0.784，均大于0.5，表明模型性质良好，能对三类样品进行较好的区分。
对模型进行置换检验，设置置换次数为200，结果如图5-7所示，显示在栽培金银花、野生金银花及山银花项下，回归线左端任何一个R2均小于右端R2的值，左端任何一个Q2值均小于右端Q2值，表明原始模型的预测能力大于任何一次随机排列变量的预测能力。另外，在各项下，R2<0.4，Q2<0.05，表明该模型具有很好的可预测性和拟合优度，能够用于此类别的判别分析。
进一步采用试验集数据对模型进行验证，结果如图8和下表所示，显示栽培金银花、野生金银花和山银花的判别结果与实际相同，进一步证明了模型的准确可靠。
之后另取9批未知样品，按上述方法进行超高效液相色谱检测，将检测结果代入上述模型中，判别结果与样品性状鉴别结果相符，如下：
以上结果表明本发明通过将液相色谱指纹图谱与抗新冠病毒效应相结合，并通过建立模型对金银花和山银花进行有效区分，有效区分了金银花和山银花，准确度高，检测速度快。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的结合抗新冠病毒效应的金银花和山银花鉴别模型及其构建方法和应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
Claims (10)
1.一种结合抗新冠病毒效应的金银花和山银花鉴别模型的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括以下步骤：
(1)建立金银花、山银花液相色谱指纹图谱；
(2)对金银花、山银花抑制新冠病毒Mpro的活性进行测定，根据测定结果及步骤(1)中的指纹图谱进行相关分析，筛选出具有抗新冠病毒效应的活性成分；
(3)利用步骤(1)中的指纹图谱进行特征提取，筛选出能表征整体化学信息的特征性成分，整合步骤(2)得到的活性成分进行偏最小二乘-判别分析，构建模式识别模型。
2.根据权利要求1所述的结合抗新冠病毒效应的金银花和山银花鉴别模型的构建方法，其特征在于，步骤(1)所述建立金银花、山银花液相色谱指纹图谱包括以下步骤：
(1’)将金银花或山银花分别用水浸泡、回流提取、浓缩、干燥，得到金银花水提取物和山银花水提取物；
(2’)将步骤(1’)得到的金银花水提取物和山银花水提取物分别溶解、过滤，取续滤液进样进行超高效液相色谱检测，根据结果建立所述液相色谱指纹图谱；
优选地，步骤(1’)所述金银花或山银花与水的料液比为1:(20-30)g/mL；
优选地，步骤(1’)所述浸泡的时间为0.8-1.2h；
优选地，步骤(1’)所述回流提取的次数为2-4次。
3.根据权利要求2所述的结合抗新冠病毒效应的金银花和山银花鉴别模型的构建方法，其特征在于，步骤(2’)所述滤液的浓度为8-12mg/mL；
优选地，步骤(2’)所述超高效液相色谱检测的柱温为13-17℃，流速为0.7-1.1mL/min，进样量为4-6μL；
优选地，步骤(2’)所述超高效液相色谱检测的流动相包括流动相A和流动相B，所述流动相A包括质量分数0.08-0.12％的甲酸水溶液，所述流动相B包括乙腈；
优选地，步骤(2’)所述超高效液相色谱检测的洗脱程序如下：
第0-5min时，流动相A与流动相B的体积比为(4-6):(94-96)；
第5-10min时，流动相A与流动相B的体积比由(4-6):(94-96)匀速变化至(9-11):(89-91)；
第10-15min时，流动相A与流动相B的体积比为(9-11):(89-91)；
第15-25min时，流动相A与流动相B的体积比由(9-11):(89-91)匀速变化至(19-21):(79-81)；
第25-40min时，流动相A与流动相B的体积比由(19-21):(79-81)匀速变化至(29-31):(69-71)；
优选地，步骤(2’)所述超高效液相色谱检测的色谱柱为Agilent Poroshell SB-C18，规格为4.6mm×150mm×2.7μm。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的结合抗新冠病毒效应的金银花和山银花鉴别模型的构建方法，其特征在于，步骤(2)所述对金银花、山银花抑制新冠病毒Mpro的活性进行测定具体包括以下步骤：分别测定金银花和山银花抑制新冠病毒Mpro的IC50值，之后在两者之间选择任一浓度为测试浓度，以该测试浓度分别测定金银花和山银花对新冠病毒Mpro的抑制率。
5.根据权利要求4所述的结合抗新冠病毒效应的金银花和山银花鉴别模型的构建方法，其特征在于，步骤(2)所述筛选具体包括以下步骤：将步骤(1)建立的金银花、山银花液相色谱指纹图谱与步骤(2)得到的金银花和山银花对新冠病毒Mpro的抑制率进行灰色关联分析，得到具有抗新冠病毒效应的活性成分。
6.根据权利要求5所述的结合抗新冠病毒效应的金银花和山银花鉴别模型的构建方法，其特征在于，所述效应成分的关联度不低于0.965。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的结合抗新冠病毒效应的金银花和山银花鉴别模型的构建方法，其特征在于，步骤(2)所述筛选出具有抗新冠病毒效应的活性成分后还包括以下步骤：取金银花样品和山银花样品作为训练集和试验集，以步骤(1)得到的训练集中的金银花、山银花液相色谱指纹图谱为基础，进行全谱PLS-DA分析，筛选出变量重要性投影值大于1的变量，对其进行组间t检验，最终筛选出显著性差异P低于0.01的峰，并将其与步骤(2)中的活性成分进行比较，确定构建模型成分；
优选地，步骤(3)所述进行模式识别模型构建后还包括以下步骤：对模型进行置换检验；
优选地，步骤(3)所述进行模式识别模型构建后还包括以下步骤：对模型进行试验集外部验证。
8.一种根据权利要求1-7中任一项所述的结合抗新冠病毒效应的金银花和山银花鉴别模型的构建方法构建得到的金银花和山银花鉴别模型。
9.一种结合抗新冠病毒效应的金银花和山银花鉴别模型的构建系统，其特征在于，所述金银花和山银花鉴别模型的构建系统包括以下单元：
液相色谱单元，用于检测、收集金银花、山银花液相色谱数据并制作金银花、山银花液相色谱指纹图谱；
活性测定单元，用于检测金银花、山银花对新冠病毒Mpro活性的抑制效果；
活性成分筛选单元，用于将金银花、山银花液相色谱指纹图谱与金银花、山银花对新冠病毒Mpro活性的抑制效果进行灰色关联分析，筛选得到活性成分；
特征性成分筛选单元，用于对金银花、山银花液相色谱指纹图谱进行特征提取，筛选出能表征整体化学信息的特征性成分；
模型构建单元，用于将效应成分与特征性成分进行偏最小二乘-判别分析，构建金银花和山银花鉴别模型。
10.一种金银花和山银花鉴别方法，其特征在于，所述鉴别方法包括以下步骤：将待测样品以权利要求2或3中的检测流程进行液相色谱检测，之后将检测结果代入权利要求9所述的金银花和山银花鉴别模型中，根据结果判断待测样品为金银花或山银花。
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