CN114894944B - 一种外来药药味的认定方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种外来药药味的认定方法，选择五种单一药味的多种药材饮片与待测外来药材分别制得样品溶液；利用电子舌分别多次扫描检测，得到采集数据；对采集数据进行数据预处理，采用人工神经网络ANN模型进行模式识别后获得外来药材滋味；再选择包含有所得外来药材滋味的多种药材，进一步采用电子鼻测定，得到各样品采集数据并进行预处理，采用人工神经网络ANN模型进行模式识别后获得外来药材气味；进而得到外来药材的药味。本发明对选择的药材与外来药材分别通过电子舌和电子鼻的检测与采集，再通过所构建的人工神经网络ANN模型识别出外来药材滋味，实现了外来药材的快速表征与认定，有助于在具有相同药味的外来药材中进一步研究和推广。

Description

一种外来药药味的认定方法

技术领域

本发明涉及中药技术领域，具体涉及一种外来药药味的认定方法。

背景技术

中药五味药性理论是中药药性理论的核心理论之一，其与四气、升降浮沉、归经、有毒无毒、配伍等共同构成中药药性理论基本内容。“五味”原指中药“辛、甘、酸、苦、咸”5种真实的滋味和气味。随着中医学的不断发展，五味逐渐与阴阳、五行、五脏等理论相结合，演变为药物功能分类的标志，如辛“能散、能行”，甘“能补、能缓、能和”，酸“能收、能涩”，苦“能泄、能燥、能坚”，咸“能下、能软”。

随着中药材社会需求的不断増长，部分中药材资源已供不应求。拓展药用新资源迫在眉睫，外来药的引入是拓展药用新资源的重要方式之一。外来药是指那些从我国疆域外传入或者从域外引种进入中国，具有悠久的药用历史、丰富的资源的域外药材，如辣木叶、巴西人参、水飞蓟、玛卡等。在药用新资源的拓展研究中，我们除了要开展化学和药理学的现代研究外，还要解决外来药材的“中药化”科学问题。如何根据外来药材的实际情况，采用现代科学技术，探索符合中医药特点、切实可行的药味鉴别方法，是外来药“中药化”研究中的瓶颈问题。气、味是中药重要的药味特征，是中药性状鉴别、品质评价的重要依据，如传统经验评价以味酸为佳的山楂，以味甜为佳的甘草，以味苦为佳的黄连等。但传统的鼻闻口尝法存在个体差异，主观性强且无法数据化，难以满足中药现代化的发展。近年来发展起来的电子鼻、电子舌是一种能够快速、准确检测分析混合气体、液体的嗅觉和味觉仿生传感器技术，现已广泛用于中药气、味的研究中，为丰富和发展中药传统的药味鉴别方法提供了技术支持。但目前的中药药味鉴别模型仅局限于对中药单一真实味的判断，尚未见到可用于中药兼味(多种真实药味)鉴别的相关研究。

现阶段外来药材的药味研究多为药性理论推测，采用现代技术开展外来药材药味的实验研究尚处于空白。中药的“气”“味”是中药材内在化学成分的外在表现，而质量又与化学成分密切相关。为此，本发明在前人的药味研究基础上，对研究方法进行不断完善，采用智能感官技术结合多种模式识别方法数值化地表征了外来药材的药味特征并进行物质基础的认定，形成一种快速、科学、客观、全面的中药药味及其物质基础的研究新模式。

发明内容

为了克服现有技术中的不足，实现对其他外来药材的药味识别，全面解析其药味的物质基础，为此，本发明提供了一种快速准确的外来药药味的认定方法。

所采用的技术方案如下：

一方面，本发明提供了一种外来药药味的认定方法，所述方法包括如下步骤：

步骤1，从《中国药典》中选择具有酸、甘、苦、辛、咸单一药味的多种药材饮片与待测外来药材分别制得样品溶液；

步骤2，利用电子舌对所制备的各样品溶液分别进行多次扫描检测，得到各样品溶液的采集数据；

步骤3，对采集数据进行数据预处理，采用所构建的人工神经网络ANN模型进行模式识别后获得外来药材滋味；

步骤4，从《中国药典》中选择包含有步骤3中所得外来药材滋味的多种药材，将待测外来药材和所选取的各药材粉碎后分别制得相应的药材粉末样品，并对各药材粉末样品进行多次电子鼻测定，得到各样品采集数据；

步骤5，对步骤4中所得样品采集数据进行预处理，采用所构建的人工神经网络ANN模型进行模式识别后获得外来药材气味；

步骤6，将步骤4中所得外来药材滋味和步骤5中所得外来药材气味相结合，得到外来药材的药味。

进一步地，所述步骤4中所选择的多种药材为具有除步骤3所得外来药材滋味之外的单一滋味药材和具有步骤3所得外来药材滋味的兼味药材的集合。

更进一步地，所述步骤4中所选择的多种药材中包含有步骤1中所选择的部分药材饮片。

所述步骤3和步骤5中，对采集数据进行预处理的方法是：以外来药材响应值为参比进行归一化预处理；对归一化预处理后的数据进行偏最小二乘法判别分析，排除与已知药味药材的分布距离相距较远的药材和相应味道传感器，得到n×c或m×c的数据集，n×1或m×1的分组信息，其中n表示所有样品数量；m为不包括待测外来药材，仅为构建模型药材的数量；c为排除后保留下的传感器数量。

所述步骤3和步骤5中的人工神经网络ANN模型构建方法是：

通过神经模式识别工具箱导入m×c的数据集，属性为“Inputs”；

导入m×1的分组信息，属性为“Outputs”；

设置模型中的训练集、验证集和测试集比例，通过训练集数据对训练模型进行训练；

再通过训练好的模型对待测外来药材进行滋味或气味的判断，得到待测外来药材的预测药味及概率。

优选地，所述步骤2和步骤4中对所制备的样品测定5～7次，每次测定时间100s～120s，并取后3次测定数据的均值进行计算。

再进一步地，所述方法还包括对外来药材物质基础的认定步骤7；

分别获得待测外来药材中的非挥发性成分和挥发性成分；并将所得非挥发性成分和挥发性成分分别与所得待测外来药材的嗅味觉蛋白进行分子对接，根据分子对接的结合能数值明确待测外来药材的药味物质基础。

所述步骤7中，外来药材的非挥发性成分和挥发性成分的获取方法是：对于非挥发性成分采用溶剂法提取后，采用超高效液相色谱-四极杆-飞行时间串联质谱技术对其进行测定和鉴定；对于挥发性成分采用水蒸汽蒸馏法提取后，采用气相色谱-质谱联用技术对其进行测定和鉴定。

其中的所述对接方法包括如下步骤：

选择与待测外来药材所包含药味相同的味觉蛋白，在对应的味觉蛋白数据库下载相应味觉受体分子的三维结构文件，并进行受体蛋白分子的预处理，保存为pdbqt格式；

通过有机小分子生物活性数据库搜索得到外来药材成分的小分子sdf格式的三维结构文件，将其作为配体小分子，经预处理后保存为pdbqt格式；

采用分子对接方式对预处理后的受体蛋白分子和配体小分子进行半柔性分子对接；

利用Pymol和DS软件对对接结果进行二维相互作用关系和三维空间分布位置的可视化分析，得到配体与受体的亲和能力。

优选地，所述步骤1中，从《中国药典》中选取代表性药材饮片为未添加辅料炮制的药材或饮片，五种味道的药材或饮片包括：

酸味药材：北五味子、诃子、马齿苋、木瓜、南五味子、山楂、山茱萸、乌梅；

苦味药材：黄芩、板蓝根、大黄、山豆根、厚朴、大青叶、芦荟、苦参、黄连、黄柏；

甘味药材：甘草、党参、芦根、玉竹、番泻叶、火麻仁、银柴胡、黄芪、金银花；

辛味药材：芥子、川芎、白芷、莱菔子、葶苈子；

咸味药材：青黛、昆布、石决明、氯化钠、芒硝。

进一步优选地，所述步骤3中得到的外来药药材气味为辛、滋味为苦和甘时，所述步骤4中所选取的未添加辅料炮制的代表性药材包括；

辛味药材：芥子、白芷、川芎、细辛、紫苏叶；

辛苦味药材：葶苈子、厚朴、远志、桔梗、陈皮；

辛甘味药材：莱菔子、当归、桂枝、防风、葛根。

本发明技术方案具有如下优点：

A.本发明通过从《中国药典》中选择具有“五味”的药材与外来药材分别通过电子舌对其配置样品溶液进行检测与数据采集，再通过所构建的人工神经网络ANN模型进行识别后得到外来药材滋味，再通过选择与外来药材滋味相同的药材，经粉碎后通过电子鼻测得数据，最后经人工神经网络ANN模型进行识别后得到外来药材气味，进而得到外来药材所具有的药味，同时实现了外来药材嗅味觉的快速检测，全面得到外来药材所具有的多种药味特征。

B.本发明通过对外来药材所具有的嗅味觉特征进一步通过成分测定，在此基础上，还建立了一种快速预测外来药材药味的物质基础的方法，分别与外来药材具有相同嗅味觉的味觉、嗅觉蛋白进行分子对接，通过分子对接的结合能数值，进一步明确外来药材真实味的物质基础，实现了外来药材的快速表征与认定，有助于在具有相同药味的外来药材中进一步研究和推广。

C.本发明对电子舌和电子鼻所采集数据采用以外来药材响应值为参比的归一化预处理，运用偏最小二乘法判别分析和人工神经网络ANN模型进行外来药材的滋味与气味识别，快速准确地获知外来药材所包含的单一和兼有味道特征。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式，下面将对具体实施方式中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明所提供的外来药材药味认定方法框图；

图2是本发明所提供的电子舌测定全部数据的PLS-DA图；

图2中标识中表达的含义：1：北五味子、2：诃子、3：马齿苋、4：木瓜、5：南五味子、6：山楂、7：山茱萸、8：乌梅、9：黄芩、10：板蓝根、11：大黄、12：山豆根、13：厚朴、14：大青叶、15：芦荟、16：苦参、17：黄连、18：黄柏、19：甘草、20：党参、21：芦根、22：玉竹、23：番泻叶、24：火麻仁、25：银柴胡、26：黄芪、27：金银花、28：芥子、29：川芎、30：白芷、31：莱菔子、32：葶苈子、33：青黛、34：昆布、35：石决明、36：氯化钠、37：芒硝、38：辣木叶(PKM1)、39：辣木叶(PKM2)、40：辣木叶(YD)、41：辣木叶(HH))。

图3是本发明所提供的电子舌数据剔除酸、咸信息的PLS-DA图；

图4a是本发明所提供的人工神经网络的混淆矩阵图；

图4b是本发明所提供的人工神经网络的ROC曲线图；

图5是本发明所提供的电子鼻测定全部数据的PLS-DA图；

图5中标识中表达的含义：1：芥子、2：白芷、3：川芎、4：细辛、5：紫苏叶、6：葶苈子、7：厚朴、8：远志、9：桔梗、10：陈皮、11：莱菔子、12：当归、13：桂枝、14：防风、15：葛根、16：辣木叶(PKM1)、17：辣木叶(PKM2)、18：辣木叶(YD)、19：辣木叶(HH).

图6a是本发明所提供的人工神经网络的混淆矩阵图；

图6b是本发明所提供的人工神经网络的ROC曲线图；

图7是本发明所提供的包含物质基础认定的外来药材药味认定方法流程图。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

如图1所示，本发明提供了一种外来药药味的认定方法，包括如下步骤：

S1，从《中国药典》中选择具有酸、甘、苦、辛、咸单一药味的多种药材饮片与待测外来药材分别制得样品溶液。这里优选采用未经辅料炮制的药材或饮片。

从2020版《中国药典》中优选选取代表性药味药材37种，其中酸味药材8种(北五味子、诃子、马齿苋、木瓜、南五味子、山楂、山茱萸、乌梅)，苦味药材10种(黄芩、板蓝根、大黄、山豆根、厚朴、大青叶、芦荟、苦参、黄连、黄柏)，甘味药材9种(甘草、党参、芦根、玉竹、番泻叶、火麻仁、银柴胡、黄芪、金银花)，辛味药材5种(芥子、川芎、白芷、莱菔子、葶苈子)，咸味药材5种(青黛、昆布、石决明、氯化钠、芒硝)，其中氯化钠(分析纯，批号20120206)购于国药集团化学试剂有限公司，其余药材饮片购自北京同仁堂或由中国中医科学院中药资源中心提供。其中的外来药材以辣木叶为例，采集四种辣木叶，具体为：编号：PKM1，来源：云南天佑科技开发有限公司；编号：PKM2，来源：云南杞道农业科技发展有限公司；编号：YD，来源：云南昆佰堂生物科技有限公司；编号：HH，来源：红河谷辣木产业有限公司。

其中所用到的设备包括：Centrifuge 5810R台式高速冷冻离心机(德国艾本德eppendorf)；电磁炉(C21-WT2112T广东美的生活电器制造有限公司)；SPS 202F电子天平(美国奥豪斯仪器有限公司)。样品溶液的制备，具体方法如下，

常规类药材(芒硝和氯化钠之外的药材)：称取药材16.00g加入200mL纯净水，先浸泡30min，后煎煮60min(功率1000W)。放冷至室温，滤过，收集滤液并稀释至200mL，高速离心(12000r/min)两次，每次离心15min。取上清液用娃哈哈纯净水稀释4倍，得到浓度为20mg/mL的稀释液，过0.22μm微孔滤膜，用于电子舌分析。

后下类药材(芒硝)：称取药材4.00g加入200mL煮沸的纯净水，煎煮10min(功率1000W)。放冷至室温，滤过，收集滤液并稀释至200mL，高速离心(12000r/min)两次，每次离心15min，得到浓度为20mg/mL的溶液，过0.22μm微孔滤膜，用于电子舌分析。

其它(氯化钠)：称取4.00g加入200mL的纯净水，用玻璃棒搅拌溶解，得到浓度为20mg/mL的溶液，过0.22μm微孔滤膜，用于电子舌分析。

S2，利用电子舌对所制备的各样品溶液分别进行多次扫描检测，得到各样品溶液的采集数据。

电子舌是利用溶液中化合物与传感器之间产生的电势差从而实现对味道的检测，其共有7根传感器和Ag/AgCl参比电极，采用的Astree II电子舌(法国Alpha Mos公司)，每根传感器均可对各种味道产生相应，但因传感器材料差异而对不同味道的敏感度不同：AHS对酸味敏感、CTS对咸味敏感、NMS对鲜味敏感、ANS对甘味敏感，SCS对苦味敏感，CPS、PKS是通用传感器。

电子舌开机后活化传感器，建立样品分析表，样品溶液体积100mL，在样品盘上添加完样品后进行电子舌扫描检测，每秒采样1次，传感器进入超纯水清洗1次。每个样品重复测定7次；电子舌传感器在每个样品中的采集时间为120s，每秒采集1个数据。为保证批次间样品数据的可比性，以PKM1品种辣木叶样品作为随行对照。

S3，对采集数据进行数据预处理，采用所构建的人工神经网络ANN模型进行模式识别后获得外来药材滋味。

预处理方法是：以PKM1品种辣木叶进行归一化处理(以PKM1品种辣木叶归一化，使不同味道批次下测试的辣木叶传感器数值均为1)后，可以减弱或消除非目标因素引起的日间差异性，体现在不同批次下PKM1辣木叶分布位置一致。

对预处理后的数据采用SMICA软件进行偏最小二乘法判别分析，筛选原则为以同类药材组间差异较小、不同类药材组间差异大为筛选原则。确定归一化预处理方式后，进行特征值的提取：对传感器、取值时间、取值次数进行筛选，三者两两组合。数据特征以所有传感器、每次测定时间100s～120s，重复检测5～7次，采用取后3次测定数据的均值。

本发明基于上述归一化预处理后的数据进行偏最小二乘法判别分析，如图2所示，说明辣木叶不属于酸、咸味，故为优化数据结构，增强模型的判别能力，剔除距离较远的酸、咸味药材和相应的酸味传感器AHS、咸味传感器CTS进行后续特征值的提取，如图3所示。

对归一化预处理后的数据剔除酸、咸味相关信息后得到n×c或m×c的XX数据集，n×1或m×1的YY分组信息(n表示所有样品数量；m为不包括待测药材，仅为构建模型药材的数量；c为排除后保留下的传感器数量)。将m×c的数据集导入matlab中神经模式识别工具箱，以样品的归一化预处理后的传感器数值为输入变量，m×1分组信息为输出变量。输入变量中Training训练集、validaton验证集、testing测试集分别设置为70％、15％、15％；隐藏层个数：3个；其它参数选择默认值然后选择“Train”训练模型，结果为模型的准确率、ROC曲线及混淆矩阵图。将训练好的人工神经网络模型导出为“net”，根据代码对待测药材进行滋味的判断，结果可以得到辣木叶预测滋味和可能概率，代码为：result＝sim(net,DC)。如图4a和图4b所示，结果表明全部集合的准确率分别为83.3％；AUC均大于0.5。说明模型建立较好，可对未知样本进行预测。将辣木叶数据导入作为预测变量，利用代码对其预测，结果为：PKM1品种(苦味，99.93％)、PKM2品种(甘味，99.98％)、YD品种(甘味，100.00％)、HH品种(甘味，96.32％)。由混淆矩阵图可知，辣木叶为苦、甘、辛味。

S4，从《中国药典》中选择包含有步骤3中所得外来药材滋味的多种药材，将待测外来药材和所选取的各药材粉碎后分别制得相应的药材粉末样品，并对各药材粉末样品进行多次电子鼻测定，得到各样品采集数据。

这里所选取的药材为具有单一药味的药材及具有电子舌所测外来药材滋味的兼味药材。从2020版《中国药典》中选取代表性药味药材15种，均为未加任何辅料炮制而成，其中单一辛味药材5种(芥子、白芷、川芎、细辛、紫苏叶)；兼味药材包括辛苦味药材5种(葶苈子、厚朴、远志、桔梗、陈皮)，辛甘味药材5种(莱菔子、当归、桂枝、防风、葛根)。当然，这里还可以选取步骤S1中的部分药材或饮片。

所采用的设备如下：FW80高速万能粉碎机(天津泰斯特仪器有限公司)，Heracles快速气相电子鼻(法国Alphamos公司)，40目药典筛(浙江省上虞市纱筛厂)。

将所有药材粉碎后，过40目筛，分别制得各样品粉末用于电子鼻测定。具体的电子鼻测定方法如下：

称取约1g药材粉末于20mL的顶空进样瓶中，压盖密封；将样品瓶置于进样器托盘上，每种药材重复制备5次，每个样品瓶重复检测1次。电子鼻的参数设置为：数据采集时间110s，进样速度125μL/s，进样体积3mL，进样口温度300℃，进样持续时间29s，孵化时间50℃，孵化时间30min，振荡器速度500r/min，捕集阱初始温度50℃，捕集阱分流速度10min，捕集持续时间34s，捕集阱最终温度240℃，柱温初始时间50℃，程序升温程序2℃/s升至250℃,检测器温度260℃。电子鼻系统包含2根极性不同的色谱柱(MXT-5为弱极性色谱柱，MXT-1701为中极性色谱柱)，实现同时对不同极性化合物的一次性分析。

S5，对步骤S4中所得样品采集数据进行预处理，采用所构建的人工神经网络ANN模型进行模式识别后获得外来药材气味。

电子鼻仪器自带软件将两根不同极性传感器采集到化合物的保留时间转换为Kovats保留指数后，同AroChemBase数据库进行信息比对后获得化合物的序号，将其作为后期数据处理的自变量；采集到气相色谱图中色谱峰面积作为数据处理的因变量。利用步骤S3中的电子舌数据处理方法，取后三次均值，得到以辣木叶归一化作为模式识别的分析数据，如图5所示。

对归一化预处理后的数据剔除酸、咸味相关信息后得到n×c或m×c的XX数据集，n×1或m×1的YY分组信息(n表示所有样品数量；m为不包括待测药材，仅为构建模型药材的数量；c为排除后保留下的传感器数量)。将m×c的数据集导入matlab中神经模式识别工具箱，以样品的归一化预处理后的传感器数值为输入变量，m×1分组信息为输出变量。输入变量中Training训练集、validaton验证集、testing测试集分别设置为70％、15％、15％；隐藏层个数：3个；其它参数选择默认值然后选择“Train”训练模型，结果为模型的准确率、ROC曲线及混淆矩阵图。将训练好的人工神经网络模型导出为“net”，根据代码对待测药材进行滋味的判断，结果可以得到辣木叶预测滋味和可能概率，代码为：result＝sim(net,DC)。

如图6a和图6b所示，通过人工神经网络ANN模型的评价指标表明，以全部集合的准确率均为100％；AUC均大于等于0.5。说明模型建立较好，可对未知样本进行预测。将辣木叶数据导入作为预测变量，预测结果为PKM1品种(辛味，99.91％)、PKM2品种(辛甘味，99.98％)、YD品种(辛味，100.00％)、HH品种(辛味，100.00％)。

综上，人工神经网络判定辣木叶气味可能为辛(甘)味。

S6，将步骤S4中所得外来药材滋味和步骤5中所得外来药材气味相结合，得到外来药材的药味。

如图7所示，还包括对外来药材物质基础的认定，提供了一种快速预测外来药材药味的物质基础的方法。

S7a，通过对外来药材的挥发性成分和非挥发性成分分别进行了鉴定，其具体的获取方法是：对于非挥发性成分采用溶剂法提取后，采用超高效液相色谱-四极杆-飞行时间串联质谱技术对其进行测定和鉴定；对于挥发性成分采用水蒸汽蒸馏法提取后，采用气相色谱-质谱联用技术对其进行测定和鉴定。

采用UPLC-Q-TOF-MS(超高效液相色谱-四极杆-飞行时间串联质谱)技术对4种辣木叶的70％甲醇提取物进行分析，根据一级、二级的高分辨质谱信息，结合文献数据，共鉴定出4种辣木叶中20个共有非挥发性成分，其中包括有机酸及其酯类化合物5个，生物碱类化合物1个，硫苷类化合物4个，黄酮及其衍生物类10个。

采用水蒸汽蒸馏法提取4种辣木叶中挥发油成分，利用GC-MS技术对其进行分析，通过与质谱工作站NIST Version 1.7数据库比对，鉴定出4种辣木叶中19个共有挥发性成分，包含醛类化合物7个、酮类化合物4个、烷烃类化合物3个、有机酸类化合物2个、萜类化合物1个、腈类化合物1个、生物碱类化合物1个。上述所采用的仪器均为现有技术，具体的检测方法这里不再赘述。

S7b，将鉴定出的化学成分分别与外来药材通过上述方法所得到的味觉、嗅觉蛋白进行分子对接，根据分子对接的结合能数值，明确待测外来药材的药味物质基础。

根据电子舌和电子鼻的检测和处理结果，推测辣木叶为苦、甘、辛味，故分别选择苦、甘、辛三种嗅味觉蛋白进行分子对接。本发明选择了选择苦味受体(T2R10、T2R14、T2R38)、甘味受体(T1R2、T1R3)和辛味受体(TRPV1、OR7D4)，开展辣木叶的嗅味觉蛋白的分子对接。

受体分子的预处理如下：

利用苦味受体蛋白数据库下载苦味受体分子pdb格式的三维结构文件；利用APSD下载甘味和辛味受体分子pdb格式的三维结构文件；然后利用pymol软件删除受体的原配体，多聚体的蛋白质只保留一条蛋白质链；最后利用ADT软件进行去水、加氢、调整电荷、设置原子类型结构操作，保存为pdbqt格式。

配体分子的预处理如下：

首先，根据所测辣木叶所含成分，通过Pubchem数据库搜索得到其成分的小分子sdf格式的三维结构文件，用OpenBableGUI软件转换为pdb格式；Pubchem数据库中没有的化合物用ChemDraw软件画出结构式，保存为cdxml格式，然后用Chem3D能量最小化后转换为pdb格式。然后，利用ADT软件对小分子加氢、调整电荷、设置为配体、检测旋转键、设置旋转键一系列操作，保存为pdbqt格式。

分子对接步骤如下：

利用AutoDockTools软件中Grid模块进行能量格点的计算，对接范围覆盖整个蛋白质，每个小网格点的距离为1nm，具体对接的受体、配体及相应参数见表1。然后用AutoDock Vina软件对预处理后的受体蛋白和配体小分子进行半柔性分子对接，其中作用能间距等级(energy_range)设置为4，计算复杂度(exhaustiveness)设置为8，保留最优构象，其它参数选择默认设置。对接完成后，利用Pymol和Discovery Studio软件对结果进行二维相互作用关系和三维空间分布位置的可视化分析。其中，对接结果中结合能代表配体与受体的亲和能力，结合能越小代表亲和能力越强，一般认为结合能≤-5.0kcal/mol时结合能力较好。

表1分子对接的味觉受体蛋白及配体信息表

结合苦味蛋白、甘味蛋白和辛味蛋白分别与辣木叶中的相应化合物的结合位置图，辣木叶中非挥发性成分与味觉受体蛋白的对接结果表明，硫苷(4-O-(α-L-乙酰鼠李糖吡喃基氧基)-硫代葡萄苷异构体Ⅱ和4-O-(α-L-乙酰鼠李糖吡喃基氧基)-硫代葡萄苷异构体Ⅲ、)和黄酮(牡荆素、维采宁-2、异槲皮苷和山柰酚乙酰糖苷)类成分是产生苦味的主要物质基础；硫苷(4-O-(α-L-鼠李糖基氧基)-苄基硫代葡萄糖苷、4-O-(α-L-乙酰鼠李糖基吡喃基氧基-硫代葡萄苷异构体Ⅰ、4-O-(α-L-乙酰鼠李糖基吡喃基氧基-硫代葡萄苷异构体Ⅱ和4-O-(α-L-乙酰鼠李糖基吡喃基氧基-硫代葡萄苷异构体Ⅲ)、黄酮(维采宁-2、牡荆素、异槲皮苷、槲皮素丙二酰已糖、槲皮素-羟基-甲基戊二酰糖苷、槲皮素乙酰糖苷、紫云英苷、山柰酚丙二酰已糖、山柰酚-羟基-甲基戊二酰糖苷和山柰酚乙酰糖苷)、有机酸(苹果酸)和生物碱(腺苷)类成分是产生甘味的主要物质基础；硫苷(4-O-(α-L-乙酰鼠李糖基吡喃基氧基-硫代葡萄苷异构体Ⅱ)、醛类(2,3-二氢-2,2,6-三甲基苯甲醛)、酮类(香叶基丙酮、大马酮和β-紫罗酮)萜类(氧化芳樟醇)、腈类(苯乙腈)、酸类(壬酸和棕榈酸)、烷烃类(正二十一烷、正二十烷和正二十五烷)和生物碱类(油酸酰胺)类成分是产生辛味的主要物质基础。

本发明通过从《中国药典》中选择具有“五味”的药材与外来药材分别通过电子舌对其配置样品溶液进行检测与数据采集，再通过所构建的人工神经网络ANN模型进行识别后得到外来药材滋味，再通过选择与外来药材滋味相同的药材，经粉碎后通过电子鼻测得数据，最后再经人工神经网络ANN模型进行识别后得到外来药材气味，进而得到外来药材所具有的药味，同时实现了外来药材嗅味觉的快速检测，全面得到外来药所具有的多种药味特征。同时通过外来药材成分与嗅味觉蛋白进行成分对接，准确诠释其药味的物质基础。

本发明未述之处适用于现有技术。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。

Claims (8)

1.一种外来药药味的认定方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

步骤1，从《中国药典》中选择具有酸、甘、苦、辛、咸单一药味的多种药材饮片与待测外来药材分别制得样品溶液；

步骤2，利用电子舌对所制备的各样品溶液分别进行多次扫描检测，得到各样品溶液的采集数据；

步骤3，对采集数据进行数据预处理，采用所构建的人工神经网络ANN模型进行模式识别后获得外来药材滋味；

步骤4，从《中国药典》中选择包含有步骤3中所得外来药材滋味的多种药材，将待测外来药材和所选取的各药材粉碎后分别制得相应的药材粉末样品，并对各药材粉末样品进行多次电子鼻测定，得到各样品采集数据；

步骤5，对步骤4中所得样品采集数据进行预处理，采用所构建的人工神经网络ANN模型进行模式识别后获得外来药材气味；

步骤6，将步骤3中所得外来药材滋味和步骤5中所得外来药材气味相结合，得到外来药材的药味；

所述步骤4中所选择的多种药材为具有步骤3所得外来药材滋味的单一滋味药材和具有步骤3所得外来药材滋味的兼味药材的集合；

所述步骤3和步骤5中，对采集数据进行预处理的方法是：以外来药材响应值为参比进行归一化预处理；对归一化预处理后的数据进行偏最小二乘法判别分析，排除与已知药味药材的分布距离相距较远的药材和相应味道传感器，得到n×c和m×c的数据集，n×1和m×1的分组信息，其中n表示所有样品数量；m为不包括待测外来药材，仅为构建模型药材的数量；c为排除后保留下的传感器数量；

所述步骤3和步骤5中的人工神经网络ANN模型构建方法是：

通过神经模式识别工具箱导入m×c的数据集，属性为“Inputs”；

导入m×1的分组信息，属性为“Outputs”；

设置模型中的训练集、验证集和测试集比例，通过训练集数据对训练模型进行训练；

再通过训练好的模型对待测外来药材进行滋味或气味的判断，得到待测外来药材的预测药味及概率。

2.根据权利要求1所述的外来药药味的认定方法，其特征在于，所述步骤4中所选择的多种药材中包含有步骤1中所选择的部分药材饮片。

3.根据权利要求1所述的外来药药味的认定方法，其特征在于，

所述步骤2和步骤4中对所制备的样品测定5～7次，每次测定时间100 s～120 s，并取后3次测定数据的均值进行计算。

4.根据权利要求1-3任一所述的外来药药味的认定方法，其特征在于，

所述方法还包括对外来药材物质基础的认定步骤7；

分别获得待测外来药材中的非挥发性成分和挥发性成分；并将所得非挥发性成分和挥发性成分分别与所得待测外来药材的嗅味觉蛋白进行分子对接，根据分子对接的结合能数值明确待测外来药材的药味物质基础。

5.根据权利要求4所述的外来药药味的认定方法，其特征在于，所述步骤7中，外来药材的非挥发性成分和挥发性成分的获取方法是：对于非挥发性成分采用溶剂法提取后，采用超高效液相色谱-四极杆-飞行时间串联质谱技术对其进行测定和鉴定；对于挥发性成分采用水蒸汽蒸馏法提取后，采用气相色谱-质谱联用技术对其进行测定和鉴定。

6.根据权利要求5所述的外来药药味的认定方法，其特征在于，

对接方法包括如下步骤：

选择与待测外来药材所包含药味相同的味觉蛋白，在对应的味觉蛋白数据库下载相应味觉受体分子的三维结构文件，并进行受体蛋白分子的预处理，保存为pdbqt格式；

通过有机小分子生物活性数据库搜索得到外来药材成分的小分子sdf格式的三维结构文件，将其作为配体小分子，经预处理后保存为pdbqt格式；

采用分子对接方式对预处理后的受体蛋白分子和配体小分子进行半柔性分子对接；

利用Pymol和DS软件对对接结果进行二维相互作用关系和三维空间分布位置的可视化分析，得到配体与受体的亲和能力。

7.根据权利要求1所述的外来药药味的认定方法，其特征在于，所述步骤1中，从《中国药典》中选取代表性药材饮片为未添加辅料炮制的药材或饮片，五种味道的药材或饮片包括：

酸味药材：北五味子、诃子、马齿苋、木瓜、南五味子、山楂、山茱萸、乌梅；

苦味药材：黄芩、板蓝根、大黄、山豆根、厚朴、大青叶、芦荟、苦参、黄连、黄柏；

甘味药材：甘草、党参、芦根、玉竹、番泻叶、火麻仁、银柴胡、黄芪、金银花；

辛味药材：芥子、川芎、白芷、莱菔子、葶苈子；

咸味药材：青黛、昆布、石决明、氯化钠、芒硝。

8.根据权利要求7所述的外来药药味的认定方法，其特征在于，所述步骤3中得到的外来药药材气味为辛、滋味为苦和甘时，所述步骤4中所选取的未添加辅料炮制的代表性药材包括：

辛味药材：芥子、白芷、川芎、细辛、紫苏叶；

辛苦味药材：葶苈子、厚朴、远志、桔梗、陈皮；

辛甘味药材：莱菔子、当归、桂枝、防风、葛根。