CN104083423A - 一种紫锥菊酊剂及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种紫锥菊酊剂及其制备方法和应用，所述酊剂的原料为紫锥菊和浓度为30-90％的乙醇，本发明提供的酊剂对鸡有较好的免疫增强和促生长等作用。该紫锥菊酊剂制备方法简便，得到的紫锥菊酊剂长期稳定有效，具有良好的应用和推广前景。

Description

一种紫锥菊酊剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及紫锥菊的制剂，具体涉及一种紫锥菊酊剂及其制备方法和应用。

背景技术

紫锥菊(Echinacea purpurea)为菊科紫锥菊属多年生草本植物，原产自北美洲的中西部地区，我国部分省市已有引种。是一种免疫促进剂和免疫调节剂，也能抗病毒、抗炎、抗肿瘤、治疗感冒和急慢性上呼吸道感染。研究结果表明，其花及带花枝叶及根中含有大量咖啡酸衍生物、烷基酰胺类、多糖类、生物碱类等物质，咖啡酸衍生物包括菊苣酸、绿原酸、海胆苷、咖啡酒石酸和洋蓟苷等，其中菊苣酸为主要的生理活性成分。研究发现，紫锥菊可促进T淋巴细胞和B淋巴细胞的产生，并增强其活性；增强巨噬细胞的吞噬功能，激活脾细胞并提高其增殖率。紫锥菊在体外可抑制病毒的复制。有资料表明，紫锥菊对微生物感染性的疾病能发挥其优良的生理效应，与抗生素联用能加速严重感染性疾病的痊愈；紫锥菊能通过激活免疫从而达到治疗病毒性感染的目的。与抗生素相比，紫锥菊在使用中不会产生耐药性，无复发，无药物残留，安全性更高。研究结果表明，将紫锥菊添加于鸡饲料中可以提高鸡新城疫和法氏囊疫苗免疫的抗体水平，对新城疫强毒的攻击具有良好的保护能力，也有研究表明紫锥菊散剂内服对肉鸡血浆中总蛋白、白蛋白含量有明显促进作用；将紫锥菊散添加于猪饲料中能提高猪免疫水平，促进仔猪生长发育，提高饲料转化率；紫锥菊能刺激马的免疫活性，提高血红素水平，增加红细胞数量从而提高血液的质量，通过提高生理学参数发挥他们在输氧细胞的作用。以上研究结果证明，紫锥菊是一种良好的动物免疫增强药物。

经报道，紫锥菊药材中含有多酚氧化酶，较容易氧化其中的菊苣酸等有效成分。目前，国内外紫锥菊制剂多为固体制剂，例如紫锥菊药材粉碎后做散剂、直接压片或装入胶囊，或者紫锥菊药材经提取后得到浸膏，浸膏干燥粉碎后制成胶囊或片剂。做成固体制剂有利于有效成分的相对稳定，但固体制剂较适用于人，对于动物，尤其是规模化养殖动物，固体制剂给药相对复杂，不如液体制剂给药方便。紫锥菊合剂的稳定性问题较难解决，需要加入抗氧剂、稳定剂等才能使其相对稳定。将紫锥菊制备成酊剂后，氧化酶失活，菊苣酸等有效成分较稳定，且其制备方法简单，具有较为广阔的市场前景。

发明内容

本发明的目的是提供一种紫锥菊酊剂及其制备方法和应用，将紫锥菊制成口服酊剂，对鸡有较好的免疫增强和促生长等作用。该紫锥菊酊剂制备方法简便，得到的紫锥菊酊剂长期稳定有效，具有良好的应用和推广前景。

为解决上述技术问题，本发明采用下述技术方案予以实现。

本发明提供的一种紫锥菊酊剂，所述酊剂的原料为紫锥菊和乙醇。

具体的，所述酊剂的原料为以下重量比的成分：紫锥菊与乙醇的重量体积比为1：5-15。

优选地，所述酊剂的原料为以下重量比的成分：紫锥菊与乙醇的重量体积比g/ml为1：10。

上述酊剂中：

所述紫锥菊为紫锥菊全草，或紫锥菊的茎、叶、花或根的单一或混合物；

所述乙醇的浓度为30-90％，优选为70-90％，进一步优选为80％。

本发明还提供了上述紫锥菊酊剂的制备方法，该方法包括以下步骤：

1)紫锥菊的粉碎：将紫锥菊药材适度粉碎，备用；

2)加入紫锥菊重量1-3倍体积的乙醇溶液均匀湿润，密闭放置2-4小时后，装入渗漉器；

3)往渗漉器中再加入紫锥菊重量3-5倍量体积的乙醇溶液，浸渍12-60小时后进行渗漉，收集紫锥菊药材10倍量的渗漉液；

4)低温冷藏，过滤，充入氮气保护，即得紫锥菊酊剂。

优选地，该方法包括以下步骤：

1)先将紫锥菊药材粉碎，过15目筛，备用；

2)加紫锥菊重量2倍体积的乙醇溶液与紫锥菊粗粉混合，密闭放置2小时后，再加入紫锥菊重量4倍体积的乙醇，浸渍72小时，收集渗漉液，冷藏，过滤，充氮气，即得紫锥菊酊剂。

本发明还提供了上述紫锥菊酊剂在制备动物免疫增强剂及治疗各种细菌性、病毒性疾病的药物或饲料方面的应用。

临床试验结果显示，本发明的紫锥菊酊剂增强鸡新城疫疫苗免疫效果良好。其用法用量为：

(1)预防疾病混饮：每100L水，紫锥菊酊剂用量：鸡0.5L；猪2.5-5L，连用10天。

(2)治疗疾病混饮：每100L水，紫锥菊酊剂用量：鸡1L；猪7.5-12.5L，连用5天。

本发明提供的酊剂具有以下优点：

1、本发明制备的紫锥菊酊剂，稳定性较高，方法简单可行，适合于紫锥菊的工业化生产。

2、现有技术如钟英杰，李亮等在《紫锥菊中菊苣酸的提取工艺和含量测定》一文中得到的紫锥菊的最佳提取工艺为12倍量60％乙醇提取3次，每次1.5h，另外，吴启林,袁其朋等在《紫锥菊中菊苣酸提取纯化工艺研究》得到的紫锥菊的最佳提取工艺为用15倍的40％乙醇溶液加热回流提取3次,每次为2h，本发明提供的方法可以解决现有技术存在的提取有效成分得率低，提取时间长，溶剂使用量大，提取温度较高，有效成分降解多的问题，是一种提取效率高，稳定性好的方法。

3、本发明紫锥菊酊剂用于提高动物免疫功能，适用于免疫功能低下动物，提高疫苗免疫效果，配合其他药物治疗各种细菌性、病毒性疾病。

4、本发明在最后增加充入氮气保护，使其稳定性得到进一步提高。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1：紫锥菊酊剂的制备方法

1)将紫锥菊药材粉碎，过15目筛，称取100g；

2)加200mL浓度为80％的乙醇溶液与紫锥菊粗粉混合，密闭放置2小时后，装入渗漉器中，再加入浓度为80％的乙醇400mL，浸渍72小时，收集渗漉液1000mL，冷藏，过滤，充氮气，即得紫锥菊酊剂，每1mL药液含紫锥菊生药0.1g。

3)外观：本品为棕红色澄明液体。

实施例2：紫锥菊酊剂的制备方法

1)将紫锥菊药材粉碎，过15目筛，得到紫锥菊粗粉，称取100g；

2)加200mL浓度为70％的乙醇溶液与紫锥菊粗粉混合，密闭放置2小时后，装入渗漉器中加入浓度为70％的乙醇400mL，浸渍60小时，收集渗漉液1000mL，冷藏，过滤，充氮气，即得紫锥菊酊剂，每1mL药液含紫锥菊生药0.1g。

3)外观：本品为棕红色澄明液体。

实施例3：紫锥菊酊剂的制备方法

1)先将紫锥菊药材粉碎，过20目筛，得到紫锥菊粗粉，称取100g；

2)加200mL浓度为90％的乙醇溶液与紫锥菊粗粉混合，密闭放置2小时后，装入渗漉器中加入浓度为90％的乙醇400mL，浸渍48小时，收集渗漉液1000mL，冷藏，过滤，充氮气，即得紫锥菊酊剂，每1mL药液含紫锥菊生药0.1g。

3)外观：本品为棕红色澄明液体。

实验例1：紫锥菊酊剂的稳定性试验

为了考察比较紫锥菊酊剂的稳定性，特设计以下稳定性试验。

1、样品的制备：以实施例1提供的酊剂为例，样品1：将其渗漉液回收乙醇，加水定容至原体积；样品2：渗漉液，低温冷藏后，过滤；样品3：样品2充氮气。

2、检测条件及方法：在温度30℃，相对湿度75％条件下放置6个月，检测其形状，具体检测方法为：

1)性状：本品为棕红色澄明液体；气香，味微苦。

2)鉴别：取菊苣酸对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法试验，本品和对照品各5μl，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以乙酸乙酯-加酸-水(6：0.5:0.5)为展开剂，展开，取出晾干，置紫外灯365nm下检视。供试品色谱中，在与对照色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

3)检查：乙醇量应为50％-80％。

甲醇量不得过0.05％(ml/ml)

4)含量测定：照高效液相色谱法(附录35页)测定。

色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B，按下表进行梯度洗脱；检测波长330nm。理论板数按菊苣酸峰计算应不低于3000。

时间(分钟)	流动相A(％)	流动相B(％)
			0～10	10	90
10～11	10→16	90→84
			11～17	16→17	84→83
17～25	17→23	83→77

25～30

23→10

77→90

对照品溶液的制备精密称取菊苣酸对照品适量，加70％甲醇制成每1ml含20μg的溶液，即得。

供试品溶液的制备：精密量取本品1ml，置10ml量瓶中，加70％甲醇稀释至刻度，摇匀，取续滤液，即得。

测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

3、检测结果：

表1：加速试验试验结果

表1结果发现，在温度30℃，相对湿度75％条件下放置6个月，样品1菊苣酸的含量降低36.8％，样品2菊苣酸的含量降低15.8％，样品3中菊苣酸的含量降低5.2％。

同样，对本发明其他实施例进行检测，结果与实施例1相同。

结果表明：乙醇溶液作为溶剂菊苣酸的稳定性明显提高，通过增加充氮气步骤，菊苣酸的稳定性得到进一步提高。

实验例2：对雏鸡免疫功能试验

1、实验动物：180只10日龄蛋公鸡。

2、分组：将180只公鸡随机分为6组，每组30只，即实验例1中提到的样品1、实施例1组(0.5％)、实施例2组(0.5％)、实施例3组(0.5％)，药物对照组(盐酸左旋咪唑-黄芪多糖可溶性粉0.1％混饮)，疫苗对照组(不用药)和健康对照组(不用药)，连续用药10天。

3、给药方法：除健康对照组外，10日龄用新城疫IV系苗滴鼻点眼免疫，2头份/只，21日龄开始重复以上用药，24日龄进行二免。

4、通过鸡新城疫HI抗体效价和对鸡外周血淋巴细胞增殖、转化的影响(MTT法)评价紫锥菊口服液增强免疫的效果。具体实验方法为：

1)鸡新城疫HI抗体效价影响试验分别于7、17、24、32、29日龄每组选10只鸡采血，分离血清做新城疫HI抗体效价测定，具体方法见紫锥菊口服液增强雏鸡免疫功能的临床用药剂量筛选试验。

2)对鸡外周血淋巴细胞增殖、转化的影响(MTT法)分别于17、24、32、39日龄每组选10只鸡颈静脉采血，进行淋巴细胞转化率测定，具体方法如下：

a、注射器超净台内吸抗凝剂0.5ml，无菌采血3ml，吸Hank’s液3ml混匀；

b、离心管内加淋巴细胞分离液3ml，小心将血叠加在分离液上，2000rpm离心10-15min；

c、用枪头吸取白膜层加入另一离心管中，加Hank’s液，1500r/min离心2-5min，倒掉上清夜，洗两次；

d、用RPMI-1640重悬细胞，30min内测活计数，调整细胞浓度为5×10⁶个/ml；

e、将细胞悬液加入到96孔细胞培养板中，80μL/孔，每孔再加20μL ConA，每个样品重复4孔，并设RPMI-1640空白孔调零即无细胞孔；

f、置于37℃、5％CO₂培养箱中培养44h；

g、取出培养板，每孔加MTT20μL，继续培养4h；

h、取出培养板，每孔加裂解液100μL，将细胞板置于微量振荡器上振荡5min使沉淀完全溶解；

i、10min内在酶标仪上检测570nm处的吸光值(OD₅₇₀)，作为T淋巴细胞转化的指标。

5、统计方法：数据用平均数±标准差表示，用SPSS软件进行统计分析，HI抗体效价采用方差分析和LSD法多重比较，成活率用x²检验。

6、试验结果：

6.1对新城疫抗HI抗体的影响：见表2

表2：新城疫HI抗体效价(log2)

注：同列数据上标无相同字母者差异显著(P<0.05)，以下表同。

表2结果显示：免疫前各组间新城疫HI抗体效价差异不显著(p＞0.05)；在以后的3次检测中，紫锥菊样品1组、实施例1组及实施例2组及实施例3组均显著高于疫苗对照组(p＜0.05)，与药物对照组差异不显著(p＞0.05)，且实施例1、2、3组均显著高于样品1组，表明本发明的紫锥菊酊剂对提高鸡抗体滴度效果较好

6.2鸡淋巴细胞增殖转化率的影响：见表3

表3：鸡淋巴细胞增殖转化率(OD₅₇₀)

表3结果显示：32日龄和39日龄时，实施例1组、实施例2组、实施例3组的鸡淋巴细胞增殖转化变化率显著高于其余各组(p＜0.05)，24日龄后实施例1、2、3组均显著高于样品1组，表明，本发明的紫锥菊酊剂对提高鸡外周血淋巴细胞增殖转化率效果较好。

整个试验期内，各组鸡均无死亡情况。

实验结果总结：以上试验结果表明，采用本发明方法制备的紫锥菊酊剂提高新城疫疫苗免疫，效果可靠，且效果优于现有技术。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (9)

1.一种紫锥菊酊剂，其特征在于，所述酊剂的原料为紫锥菊和乙醇。

2.根据权利要求1所述的酊剂，其特征在于，所述酊剂的原料为以下重量比的成分：紫锥菊与乙醇的重量体积g/ml比为1：5-15。

3.根据权利要求1所述的酊剂，其特征在于，所述酊剂的原料为以下重量比的成分：紫锥菊与乙醇的重量体积比g/ml为1：10。

4.根据权利要求1-3任一项所述的酊剂，其特征在于，所述紫锥菊为紫锥菊全草，或紫锥菊的茎、叶、花或根的单一或混合物。

5.根据权利要求1-3任一项所述的酊剂，其特征在于，所述乙醇的浓度为30-90％。

6.根据权利要求1-3任一项所述的酊剂，其特征在于，乙醇的浓度为70-90％。

7.一种制备权利要求1-6任一项所述的酊剂的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

1)紫锥菊的粉碎：将紫锥菊药材粉碎，备用；

2)加入紫锥菊重量1-3倍体积的乙醇溶液均匀湿润，密闭放置2-4小时后渗漉；

3)加入紫锥菊药材重量3-5倍量的乙醇溶液，浸渍12-60小时后进行渗漉，收集紫锥菊药材10倍量的渗漉液；

4)低温冷藏，过滤，充入氮气保护，即得紫锥菊酊剂。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

1)先将紫锥菊药材粉碎，过15目筛，备用；

2)加紫锥菊重量2倍体积的乙醇溶液与紫锥菊粗粉混合，密闭放置2小时后，再加入紫锥菊重量4倍体积乙醇，浸渍72小时，收集渗漉液，冷藏，过滤，充氮气，即得紫锥菊酊剂。

9.权利要求1-4任一项所述的紫锥菊酊剂在制备动物免疫增强剂及治疗各种细菌性、病毒性疾病的药物或饲料方面的应用。