CN101760487B

CN101760487B - 一种淫羊藿苷元的制备方法

Info

Publication number: CN101760487B
Application number: CN2009101842824A
Authority: CN
Inventors: 贾晓斌; 贾东升; 孙娥
Original assignee: Jiangsu Provincial Insititute of Traditional Chinese Medicine
Current assignee: Jiangsu Provincial Insititute of Traditional Chinese Medicine
Priority date: 2009-08-18
Filing date: 2009-08-18
Publication date: 2012-04-04
Anticipated expiration: 2029-08-18
Also published as: CN101760487A

Abstract

一种淫羊藿苷元的制备方法，它是将干燥的淫羊藿粉碎或切段，加入浓度为30-95％的乙醇或30-100％甲醇回流提取，提取液减压浓缩得膏状物，所得的膏状物以每克加入10-100毫升的比例加入pH＝3.5-9.0的醋酸-醋酸钠缓冲液，按酶/膏状物＝0.05～5的质量比加入蜗牛酶进行水解，反应的温度为15-80℃，反应时间为2-72h，将反应液离心，取沉淀用有机溶剂溶解，过滤取滤液，蒸去溶剂，即得淫羊藿苷元粗品，重结晶后即得纯品。本发明的特点是利用蜗牛酶的强酶解力，直接将淫羊藿提取物一步转化得到高纯度苷元，简化了操作步骤，目的性强、转化率高、具有无污染及能进行大规模生产的优点。克服了现有技术所存在的对苷元破坏性大、污染严重、目的性差、转化率低、分离纯化困难等缺点。

Description

一种淫羊藿苷元的制备方法

技术领域：

本发明属于天然药物领域，涉及淫羊藿苷元的制备方法。

背景技术：

淫羊藿始载于《神农本草经》，具有补肾壮阳、祛风除湿、强筋健骨等作用，临床上用于治疗多种原因所致的骨质疏松症。实验表明淫羊藿黄酮组分是其抗骨质疏松的有效部位，其中有效成分淫羊藿苷元作用最为明显，在体外具有促进成骨细胞活性，抑制破骨细胞活性的作用，因此制备淫羊藿苷元对研制抗骨质疏松新药有巨大的价值。

淫羊藿苷元，全称3，5，7-三羟基-4′-甲氧基-8-异戊烯基黄酮，又名淫羊藿素，英文名为Icaritin，是一类多羟基黄酮类化合物，具有抗骨质疏松、抗氧化及激素样生物活性。其结构式如下：

淫羊藿黄酮类成分在植物淫羊藿中多以苷类化合物形式存在，而淫羊藿苷元在原植物中含量很低，难以直接分离纯化得到，因此可以通过水解淫羊藿黄酮苷类化合物中糖苷键的方法制备淫羊藿苷元。已报道的水解糖苷键的方法有：(1)化学方法，如酸、碱水解法。酸水解法多用盐酸、硫酸或硝酸，碱水解法多用氢氧化钠或氢氧化钾。此法多采用水解淫羊藿苷3-鼠李糖糖苷键和7-葡萄糖糖苷键从而获得淫羊藿苷元，这些研究以淫羊藿苷为反应底物，由于淫羊藿苷本身成本较高，其制备方法难以推广，且化学方法反应条件剧烈，容易破坏产物，往往得不到完整的苷元，另外化学方法对环境污染大，不适合工业化大生产。(公开号：CN 101200743A水合淫羊藿素的制备方法；公开号：CN 1919191A环淫羊藿苷元作为制备防治器官移植排斥反应药物的应用；公开号：CN 101316573A一种含有淫羊藿苷的水解产物的化妆品组合物)。(2)生物转化法，如以淫羊藿为细菌、霉菌、酵母菌的发酵产酶诱导物，制备含霉菌液，再用此菌液将淫羊藿黄酮苷类化合物转化为低糖苷或苷元(公开号：CN1473938A酶法水解淫羊藿甙糖基制备低糖淫羊藿甙或甙元的方法)，由于淫羊藿黄酮苷类化合物种类很多，其糖苷键结构十分复杂，主要由α-L-鼠李糖糖苷键、β-D-葡萄糖糖苷键、β-D-木糖糖苷键等单糖糖苷键以及由他们组成的二糖糖苷键构成，加上酶催化水解的高度专一性，这些含酶菌液无法彻底将糖苷键脱去，因此无法得到纯度较高的淫羊藿苷元。另外，此法操作复杂，耗时多，目的性不强，多得到低糖苷，难以得到苷元，且转化率低，分离纯化难，不利于工业化生产。

蜗牛酶是从蜗牛的嗉囊和消化道中提取的一种很有价值的混合酶，目前已明确其含有纤维素酶、果胶酶、淀粉酶、蛋白酶等20多种酶，具有很强的生物转化能力，已广泛用于饲料加工业、食品加工业以及细胞生物学和基因工程学的研究。针对淫羊藿黄酮苷类化合物中糖苷键的复杂性，以及蜗牛酶的特殊性，本发明成功地将蜗牛酶应用于水解糖苷键制备淫羊藿苷元，利用蜗牛酶的强酶解力，可直接将淫羊藿黄酮苷类化合物转化为苷元，简化了操作步骤，此方法具有目地性强、转化率高、无污染、可大规模生产的优点。目前未见用蜗牛酶制备淫羊藿苷元的报道。

发明内容

本发明提供了一种淫羊藿苷元的制备方法。

本发明技术方案如下：

一种淫羊藿苷元的制备方法，其特征是它包括下列步骤：

步骤1、将干燥的淫羊藿粉碎或切段，加入浓度为30-95％的乙醇或30-100％甲醇回流提取，提取液减压浓缩得膏状物；

步骤2、在步骤1所得的膏状物以每克加入10-100毫升的比例加入pH＝3.5-9.0的醋酸-醋酸钠缓冲液，按酶/膏状物＝0.05～5的质量比加入蜗牛酶进行水解，反应的温度为15-80℃，反应时间为2-72h；

步骤3、将反应液离心，取沉淀用有机溶剂溶解，过滤取滤液，蒸去溶剂，即得淫羊藿苷元粗品。

上述的制备方法，步骤1中所述的回流提取可以是两次回流提取，第一次加入8-20倍淫羊藿质量的溶剂回流提取，第二次加入6-15倍淫羊藿质量的溶剂回流提取，合并两次提取液，减压浓缩。

上述的制备方法，步骤2中所述的醋酸-醋酸钠缓冲液，可用Tris-HCl缓冲液、醋酸-醋酸钾缓冲液、醋酸-醋酸铵缓冲液、磷酸-三乙胺或磷酸盐缓冲液代替。

上述的制备方法，步骤3中所述的有机溶剂可以是乙醇、甲醇、乙酸乙酯、丙酮、二氯甲烷或氯仿。

上述的制备方法，所得的淫羊藿苷元粗品可用乙醇、甲醇、乙酸乙酯或丙酮重结晶法纯化，或者用D101大孔树脂、AB-8树脂、聚酰胺树脂或硅胶柱层析纯化，得高纯度淫羊藿苷元。

上述的制备方法，所述的用D101大孔树脂、AB-8树脂、聚酰胺树脂或硅胶柱层析纯化是以2g/mL的淫羊藿苷元粗品上样，静置2-3h，待树脂充分吸附后，用40％乙醇洗脱至洗脱液无色，弃去，再用95％乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇，干燥得高纯度淫羊藿苷元。

本发明与现有技术相比，最大的特点是采用蜗牛酶水解淫羊藿黄酮苷类化合物制备苷元，利用蜗牛酶的强酶解力，直接将淫羊藿提取物一步转化得到高纯度苷元，简化了操作步骤，目的性强、转化率高、具有无污染及能进行大规模生产的优点。克服了现有技术所存在的对苷元破坏性大、污染严重、目的性差、转化率低、分离纯化困难等缺点。

附图说明：

图1为实例1所得淫羊藿苷元MS图谱。

图2为实例1所得淫羊藿苷元¹H NMR图谱。

图3为实例1所得淫羊藿苷元¹³CNMR图谱。

图4为淫羊藿苷元对照品HPLC图谱。

图5为实例1所得淫羊藿苷元HPLC图谱。

图6为实例2所得羊藿苷元HPLC图谱。

图7为实例3所得淫羊藿苷元HPLC图谱。

图8为实例4所得淫羊藿苷元HPLC图谱。

图9为实例5所得淫羊藿苷元HPLC图谱。

图10为实例6所得淫羊藿苷元HPLC图谱。

图11为实例7所得淫羊藿苷元HPLC图谱。

图12为实例8所得淫羊藿苷元HPLC图谱。

图13为实例9所得淫羊藿苷元HPLC图谱。

图14为实例10所得淫羊藿苷元HPLC图谱。

图15为实例11所得淫羊藿苷元HPLC图谱。

图16为实例12所得淫羊藿苷元HPLC图谱。

图17为实例13所得淫羊藿苷元HPLC图谱。

具体实施方式：

通过以下实例进一步详细说明本发明，但应注意本发明的范围并不受这些实例的任何限制。

实施例1：

将干燥的淫羊藿药材100g，粉碎，加入溶剂回流提取两次，第一次加入10倍量的70％的乙醇回流提取2h，第二次加入8倍量的70％的乙醇回流提取2h，减压浓缩得膏状物20.3g；向膏状物中加入1000mL的醋酸-醋酸钠缓冲液(pH5.7)，加蜗牛酶2g，放入恒温振荡气浴锅内，于37℃、100r/min反应48小时。离心取沉淀，用纯净水洗涤三次，每次100mL，再用无水乙醇溶解，过滤取滤液，挥去无水乙醇，即得1.12g淫羊藿苷元粗品，再用无水乙醇重结晶得纯度大于90％的淫羊藿苷元。性状：黄色粉末，ESI-MS正谱给出m/z369[M+H]⁺，熔点：232-233℃，¹H NMR(DMSO，400MHz，30℃)，δ1.2(3H，s，CH3-4″)，1.6(3H，s，CH3-5″)，2.5(2H，s，OH)，3.4(2H，d，J＝6.8Hz，H-11)，3.8(3H，s，4′-OCH₃)，5.1(1H，t，J＝6.8Hz，H-2″)，6.3(1H，s，H-6)，7.1(2H，d，J＝8.4Hz，H-3′，H-5′)，8.1(2H，d，J＝8.4Hz，H-2′，H-6′)，9.4(1H，s，OH-3)，10.7(1H，s，OH-7)，12.3(1H，s，OH-5)；¹³C NMR(DMSO，100MHz，30℃)，δ153.9(C-2)，136.3(C-3)，176.7(C-4)，160.9(C-5)，98.3(C-6)，161.7(C-7)，103.5(C-8)，146.6(C-9)，106.0(C-10)122.9(C-1′)，129.6(C-2′，6′)，114.5(C-3′，5′)，158.7(C-4′)，21.6(C-1″)，124.0(C-2″)，131.4(C-3″)，25.9(C-4″)，18.3(C-5″)，55.8(4′-OCH3)。MS、¹H NMR、¹³C NMR图谱见图1、2和3，IT对照品及实例1HPLC图谱见图4、5【HPLC检测，色谱条件：ZORBAX-C18(4.6×150mm，5μm)，流动相为乙腈-水(0.1％冰醋酸)＝69∶31流速1mL/min进样20μL，检测波长270nm。】。

实施例2：

将干燥的淫羊藿药材100g，切段，加入溶剂回流提取两次，第一次加入8倍量的95％的乙醇回流提取2h，第二次加入6倍量的95％的乙醇回流提取2h，减压浓缩得膏状物20.1g；向膏状物中加入201mL的醋酸-醋酸钠缓冲液(pH3.5)，加蜗牛酶100.5g，放入恒温振荡气浴锅内，于15℃、100r/min反应72小时。离心取沉淀用纯净水洗涤三次，每次100mL，再用无水乙醇溶解，过滤取滤液，挥去无水乙醇，即得淫羊藿苷元1.10g。用D101大孔树脂(南开大学化工厂提供)柱层析，40％乙醇洗脱至洗脱液无色，弃去，再用95％乙醇洗脱淫羊藿苷元，回收乙醇，干燥得0.93g淫羊藿苷元，与实例1为同一化合物，经HPLC检测淫羊藿苷元纯度大于95％，熔点：232-233℃。

HPLC检测，色谱条件：ZORBAX-C18(4.6×150mm，5μm)，流动相为乙腈-水(0.1％冰醋酸)＝69∶31流速1mL/min进样20μL，检测波长270nm。HPLC图谱见图6，

实施例3：

将干燥的淫羊藿药材100g，粉碎，加入溶剂回流提取两次，第一次加入20倍量的30％的乙醇回流提取2h，第二次加入15倍量的30％的乙醇回流提取2h，减压浓缩得膏状物18.3g；向膏状物中加入1830mL的醋酸-醋酸钠缓冲液(pH9.0)，加蜗牛酶91.5g，放入恒温振荡气浴锅内，于15℃、100r/min反应2小时。离心取沉淀用纯净水洗涤三次，每次100mL，再用无水乙醇溶解，过滤取滤液，挥去无水乙醇，即得淫羊藿苷元粗品1.02g，再用乙酸乙酯重结晶，干燥得0.91g淫羊藿苷元，与实例1为同一化合物，经HPLC检测淫羊藿苷元纯度高于90％，熔点：232-233℃。HPLC图谱见图7。

实施例4：

将干燥的淫羊藿药材100g，粉碎，加入溶剂回流提取两次，第一次加入8倍量的100％的甲醇回流提取2h，第二次加入6倍量的100％的甲醇回流提取2h，减压浓缩得膏状物19.2g；向膏状物中加入1920mLpH3.5的醋酸-醋酸铵缓冲液，加蜗牛酶0.96g，放入恒温振荡气浴锅内，于80℃、100r/min反应72小时。离心取沉淀用纯净水洗涤三次，每次100mL，弃去滤液，再用甲醇溶解，挥去甲醇，得淫羊藿苷元粗品1.01g。再用甲醇重结晶，干燥得0.90g淫羊藿苷元，与实例1为同一化合物，经HPLC检测淫羊藿苷元纯度高于92％，熔点：232-233℃。HPLC图谱见图8。

实施例5：

将干燥的淫羊藿药材100g，切段，加入溶剂回流提取两次，第一次加入8倍量的95％乙醇回流提取2h，第二次加入6倍量的95％乙醇回流提取2h，减压浓缩得膏状物21.6g；向膏状物中加入216mLpH 9.0的醋酸-醋酸铵缓冲液，加蜗牛酶1.08g，放入恒温振荡气浴锅内，于80℃、100r/min反应2小时。离心取沉淀用纯净水洗涤三次，每次100mL，再用甲醇溶解，过滤取滤液，挥去甲醇，即得淫羊藿苷元粗品1.09g，用D101树脂(天津农药股份有限公司树脂分公司提供)柱层析，40％乙醇洗脱至洗脱液无色，弃去，再用95％乙醇洗脱淫羊藿苷元，回收乙醇，干燥得0.95g淫羊藿苷元，与实例1为同一化合物，经HPLC检测淫羊藿苷元纯度高于96％，熔点：232-233℃。HPLC图谱见图9。

实施例6：

将干燥的淫羊藿药材100g，切段，加入溶剂回流提取两次，第一次加入20倍量的30％甲醇回流提取2h，第二次加入15倍量的30％甲醇回流提取2h，减压浓缩得膏状物19.8g；向膏状物中加入1980mLpH 9.0的磷酸-三乙胺缓冲液，加蜗牛酶99g，放入恒温振荡气浴锅内，于80℃、100r/min反应2小时。离心取沉淀用纯净水洗涤三次，每次100mL，再用乙酸乙酯溶解，过滤取滤液，挥去乙酸乙酯，即得淫羊藿苷元粗品0.97g，用聚酰胺树脂(湖南岳阳中国石化聚酰胺技术开发中心)柱层析，40％乙醇洗脱至洗脱液无色，弃去，再用95％乙醇洗脱淫羊藿苷元，回收乙醇，干燥得0.89g淫羊藿苷元，与实例1为同一化合物，经HPLC检测淫羊藿苷元纯度高于95％，熔点：232-233℃。HPLC图谱见图10。

实施例7：

将干燥的淫羊藿药材100g，切段，加入溶剂回流提取两次，第一次加入20倍量的30％乙醇回流提取2h，第二次加入15倍量的30％乙醇回流提取2h，减压浓缩得膏状物20.8g；向膏状物中加入208mLpH3.5的磷酸-三乙胺缓冲液，加蜗牛酶10.4g，放入恒温振荡气浴锅内，于15℃、00r/min反应72小时。离心取沉淀用纯净水洗涤三次，每次100mL，再用乙酸乙酯溶解，过滤取滤液，挥去乙酸乙酯，即得淫羊藿苷元粗品0.96g。再用乙酸乙酯重结晶，干燥得0.87g淫羊藿苷元，与实例1为同一化合物，经HPLC检测淫羊藿苷元纯度高于90％，熔点：232-233℃。HPLC图谱见图11。

实施例8：

将干燥的淫羊藿药材100g，切段，加入溶剂回流提取两次，第一次加入8倍量的95％的乙醇回流提取2h，第二次加入6倍量的95％的乙醇回流提取2h，减压浓缩得膏状物20.1g；向膏状物中加入201mL pH3.5的Tris-HCL缓冲液，加蜗牛酶100.5g，放入恒温振荡气浴锅内，于15℃、00r/min反应2小时。离心取沉淀用纯净水洗涤三次，每次100mL，再用丙酮溶解，过滤取滤液，挥去丙酮即得1.04g淫羊藿苷元。再用丙酮重结晶，干燥得0.93g淫羊藿苷元，与实例1为同一化合物，经HPLC检测淫羊藿苷元纯度大于90％，熔点：232-233℃。HPLC图谱见图12。

实施例9：

将干燥的淫羊藿药材100g，粉碎，加入溶剂回流提取两次，第一次加入20倍量的30％的乙醇回流提取2h，第二次加入15倍量的30％的乙醇回流提取2h，减压浓缩得膏状物18.2g；向膏状物中加入1820mL pH9.0的Tris-HCL缓冲液，加91g，放入恒温振荡气浴锅内，于15℃、100r/min反应72小时。离心取沉淀用纯净水洗涤三次，每次100mL，再用丙酮溶解，挥去丙酮，即得淫羊藿苷元粗品0.98g，用D101树脂(天津农药股份有限公司树脂分公司提供)柱层析，40％乙醇洗脱至洗脱液无色，弃去，再用95％乙醇洗脱淫羊藿苷元，回收乙醇，干燥得淫羊藿苷元0.84g，与实例1为同一化合物，经HPLC检测淫羊藿苷元纯度高于95％，熔点：232-233℃。HPLC图谱见图13。

实施例10：

将干燥的淫羊藿药材100g，粉碎，加入溶剂回流提取两次，第一次加入8倍量的100％的甲醇回流提取2h，第二次加入6倍量的100％的甲醇回流提取2h，减压浓缩得膏状物19.2g；向膏状物中加入1920mL pH3.5的醋酸-醋酸钾缓冲液，加蜗牛酶96g放入恒温振荡气浴锅内，于80℃、100r/min反应2小时。离心取沉淀用纯净水洗涤三次，每次100mL，再用二氯甲烷溶解，挥去二氯甲烷，即得淫羊藿苷元粗品1.10g，用AB-8树脂(南开大学化工厂提供)柱层析，40％乙醇洗脱至洗脱液无色，弃去，再用95％乙醇洗脱淫羊藿苷元，回收乙醇，干燥得淫羊藿苷元0.94g，与实例1为同一化合物，经HPLC检测淫羊藿苷元纯度高于95％，熔点：232-233℃。HPLC图谱见图14。

实施例11：

将干燥的淫羊藿药材100g，切段，加入溶剂回流提取两次，第一次加入8倍量的95％乙醇回流提取2h，第二次加入6倍量的95％乙醇回流提取2h，减压浓缩得膏状物20.0g；向膏状物中加入2000mLpH 9.0的pH3.5的醋酸-醋酸钾缓冲液，加蜗牛酶1g放入恒温振荡气浴锅内，于80℃、100r/min反应15小时。离心取沉淀用纯净水洗涤三次，每次100mL，再用二氯甲烷溶解，过滤取滤液，蒸去二氯甲烷，即得淫羊藿苷元粗品1.09g，用D101树脂(天津农药股份有限公司树脂分公司提供)柱层析，40％乙醇洗脱至洗脱液无色，弃去，再用95％乙醇洗脱淫羊藿苷元，回收乙醇，干燥得淫羊藿苷元0.91g，与实例1为同一化合物，经HPLC检测淫羊藿苷元纯度高于95％，熔点：232-233℃。HPLC图谱见图15。

实施例12：

将干燥的淫羊藿药材100g，切段，加入溶剂回流提取两次，第一次加入20倍量的30％甲醇回流提取2h，第二次加入15倍量的30％甲醇回流提取2h，减压浓缩得膏状物22g；向膏状物中加入220mLpH 9.0的磷酸盐缓冲液，加蜗牛酶1.1g放入恒温振荡气浴锅内，于15℃、100r/min反应72小时。离心取沉淀用纯净水洗涤三次，每次100mL，沉淀用氯仿溶解，过滤取滤液，挥去氯仿，即得淫羊藿苷元粗品0.97g，用聚酰胺树脂(湖南岳阳中国石化聚酰胺技术开发中心)柱层析，40％乙醇洗脱至洗脱液无色，弃去，再用95％乙醇洗脱淫羊藿苷元，回收乙醇，干燥得淫羊藿苷元0.89g，与实例1为同一化合物，经HPLC检测淫羊藿苷元纯度高于95％，熔点：232-233℃。HPLC图谱见图16。

实施例13：

将干燥的淫羊藿药材100g，切段，加入溶剂回流提取两次，第一次加入8倍量的95％乙醇回流提取2h，第二次加入6倍量的95％乙醇回流提取2h，减压浓缩得膏状物20.6g；向膏状物中加入2060mLpH3.5的磷酸盐缓冲液，加蜗牛酶1.03g，放入恒温振荡气浴锅内，于15℃、100r/min反应2小时。离心取沉淀用纯净水洗涤三次，每次100mL，再用氯仿洗涤，过滤取滤液，挥去氯仿，即得淫羊藿苷元粗品0.99g，用硅胶(湖南岳阳中国石化聚酰胺技术开发中心)柱层析，40％乙醇洗脱至洗脱液无色，弃去，再用95％乙醇洗脱淫羊藿苷元，回收乙醇，干燥得0.84g淫羊藿苷元，与实例1为同一化合物，经HPLC检测淫羊藿苷元纯度高于95％，熔点：232-233℃。HPLC图谱见图17。

Claims

1.一种淫羊藿苷元的制备方法，其特征是它包括下列步骤：

步骤2、在步骤1所得的膏状物以每克加入10-100mL的比例加入pH＝3.5-9.0的醋酸-醋酸钠缓冲液，按酶/膏状物＝0.05～5的质量比加入蜗牛酶进行水解，反应的温度为15-80℃，反应时间为2-72h；

步骤3、将反应液离心，取沉淀用有机溶剂溶解，过滤取滤液，蒸去溶剂，即得淫羊藿苷元粗品，所述的有机溶剂是乙醇、甲醇、乙酸乙酯、丙酮、二氯甲烷或氯仿。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是：步骤1中所述的回流提取是两次回流提取，第一次加入8-20倍淫羊藿质量的溶剂回流提取，第二次加入6-15倍淫羊藿质量的溶剂回流提取，合并两次提取液，减压浓缩。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是：步骤2中所述的醋酸-醋酸钠缓冲液，用Tris-HCl缓冲液、醋酸-醋酸钾缓冲液、醋酸-醋酸铵缓冲液、磷酸-三乙胺或磷酸盐缓冲液代替。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是：所得的淫羊藿苷元粗品用乙醇、甲醇、乙酸乙酯或丙酮重结晶纯化，或者用D101大孔树脂、AB-8树脂、聚酰胺树脂或硅胶柱层析纯化，得高纯度淫羊藿苷元。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征是：所述的用D101大孔树脂、AB-8树脂、聚酰胺树脂或硅胶柱层析纯化是以2g/mL的淫羊藿苷元粗品上样，静置2-3h，待树脂充分吸附后，用40％乙醇洗脱至洗脱液无色，弃去，再用95％乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇，干燥得高纯度淫羊藿苷元。